專利名稱：殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然高分子技術(shù)領(lǐng)域，也屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
殼聚糖又稱可溶性甲殼素、脫乙?；讱に亍ぬ前?、幾丁聚糖，其是以蝦蟹殼為原料，先制得甲殼素，然后在濃堿作用下脫去甲殼素分子中的乙?；频玫囊环N天然高分子化合物，其在自然界中的含量僅次于纖維素。由于殼聚糖分子中含有活潑的羥基和氨基等極性基團(tuán)，主鏈上可發(fā)生水解反應(yīng)，C 一 2位上的氨基和C - 6位上的羥基可以發(fā)生乙酰化、羥乙酰化、羧甲基化、氰乙基化、硫酸酯化、氧化、黃原酸化等化學(xué)修飾。在雙官能團(tuán)的醛或酸酐等交聯(lián)劑作用下，可進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。在Y —射線或催化劑作用下，乙烯基單體和丙烯酸類單體可與殼聚糖進(jìn)行接枝共聚反應(yīng)，加上它不僅具有很好的生物相容性，而且無毒、易生物降解，使得其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、紡織、印染、造紙、催化、食品、日用化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。在醫(yī)藥工業(yè)中，由殼聚糖制得的手術(shù)縫合線機(jī)械強(qiáng)度好，可長期存放，能用常規(guī)方法消毒，能被人體內(nèi)組織液降解而吸收，傷口愈合后無須拆除手術(shù)線，免除了患者拆線的痛苦。由殼聚糖制成的人造皮膚，具有柔軟、舒適的特點(diǎn)，覆蓋在燒傷面上能減輕患者痛苦，加速傷口愈合、促進(jìn)皮膚再生。在實(shí)施手術(shù)時(shí)，血管內(nèi)注入高粘度的殼聚糖， 可起凝血?jiǎng)┑淖饔茫_(dá)到止血的目的。殼聚糖還具有抑制胃酸、抗?jié)?、降低膽固醇和甘油三酯吸收等作用，用其制成的藥物可用來治療膽囊炎、冠心病和各種胃肝病以及減肥。殼聚糖與二價(jià)鐵離子配合而成的復(fù)合物可用于治療缺鐵癥。殼聚糖與硫酸反應(yīng)生成的硫酸化產(chǎn)物具有與肝素類似的分子結(jié)構(gòu)，作為抗凝血?jiǎng)?，具有良好的抗凝血性和?jīng)濟(jì)實(shí)用的效果。此外，殼聚糖還可用于微型膠囊的制備和疫苗的緩釋，用作消炎眼膏的載體用于制造隱形眼鏡等?；覙浠ǎ置惾~多孔菌[Polyporus frondosus]，俗稱云蕈，日本人稱舞茸，是一種新開發(fā)的名貴食、藥用菌?；覙浠ㄖ饕钚猿煞菔腔覙浠ǖ鞍锥嗵牵嗵墙M份中以葡聚糖為主，以具有β - (1 — 6)分支的β - (1 — 3)葡聚糖為基本結(jié)構(gòu)，含少量的木糖和甘露糖?；覙浠ǘ嗵侵饕ㄟ^增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能而發(fā)揮其抗腫瘤作用，在基因水平上，灰樹花多糖有較強(qiáng)的抗化學(xué)誘變作用。硫酸化灰樹花多糖具有類肝素結(jié)構(gòu)，因而具有類肝素的促創(chuàng)面愈合作用。由于純殼聚糖凍干海綿狀材料性能呈片層狀結(jié)構(gòu)，有一定的機(jī)械強(qiáng)度但其柔韌性不足；此外，由于其親水性能較差，細(xì)胞相容性不好。鑒于此，通過水溶性硫酸化灰樹花多糖引入改性，使得海綿材料具備良好的柔韌性能。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿及其制備方法、應(yīng)用。本發(fā)明殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿具有良好的力學(xué)性能、微孔徑可控和良好的生物相容性以及良好的透氣性能和可降解性能，且生產(chǎn)過程簡單、方便?？捎米鰟?chuàng)面止血、組織工程材料等，具有良好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿，其包含以下質(zhì)量百分比成份殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%。優(yōu)選的，海綿材料的孔徑在20 - 500 μ m,既具有均勻連通微孔，又具有不均勻連通大孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還公開了以殼聚糖和硫酸化灰樹花多糖為原料，通過冷凍一凍干方法制備多孔海綿材料的方法，并采用物理化學(xué)方法交聯(lián)改性，該制備方法按以下步驟進(jìn)行
一、將灰樹花多糖溶于濃硫酸或氯磺酸，采用濃硫酸或氯磺酸與灰樹花多糖制備硫酸化灰樹花多糖，其硫酸化位點(diǎn)在于2，3,6-羥基上；(優(yōu)選的，采用氯磺酸；濃硫酸采用 98. 3%的濃硫酸；)
二、采用冰水浴，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速500-1000rpm，硫酸化時(shí)間為20-120分鐘，經(jīng)低溫下與堿中和后經(jīng)無水乙醇沉淀，透析，凍干純化后可獲得磺化度為50% -100%的硫酸化灰樹花多糖；(優(yōu)選的，硫酸化時(shí)間為40分鐘；)
三、配制殼聚糖的酸性溶液，將殼聚糖溶于有機(jī)酸或無機(jī)酸中，獲得質(zhì)量百分比0.5 -10%的溶液；將步驟二制備得的硫酸化灰樹花多糖配制成0. 1 - 10%溶液；將殼聚糖酸性溶液與硫酸化灰樹花多糖水溶液按照質(zhì)量百分比殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖 2%-80%(即比例98 2-20 80)混合；將混和液加入制得海綿總質(zhì)量0. 0001 — 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二縮水甘油醚，混和液澆鑄冷凍，凍干得海綿材料。(優(yōu)選的，殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖溶液采用80 20比例混和；京尼平或(聚)乙二醇二縮水甘油醚占總質(zhì)量的 0. 05% (即不超過海綿總質(zhì)量的0.5%)；冷凍溫度為一 5°C—一 80°C，最佳為一 20°C。)
優(yōu)選的，第三步，有機(jī)酸是抗壞血酸，蘋果酸，乳酸，檸檬酸，麩酸，琥珀酸，酒石酸，順丁烯二酸或富馬酸；無機(jī)酸是乙酸或鹽酸。優(yōu)選的，第三步，殼聚糖原料分子量為15萬一200萬，脫乙酰度70%—95%。優(yōu)選的，第一步，灰樹花多糖純度選用多糖含量>30%。優(yōu)先的，第二步，低溫為-15°C 10°C。當(dāng)然，在前述技術(shù)方案中，殼聚糖酸性溶液與硫酸化灰樹花多糖水溶液的制備步驟可以同步進(jìn)行，或者先制備其中之一，后制備另一溶液，也可以達(dá)到相應(yīng)的技術(shù)效果。因此，本發(fā)明還可以采取以下技術(shù)方案殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿的制備方法，其按如下步驟
一、將殼聚糖溶于有機(jī)酸或無機(jī)酸中，制得質(zhì)量百分比為0.5 - 10%的溶液；
二、將灰樹花多糖溶于濃硫酸或氯磺酸，其磺化位點(diǎn)在于2，3，6-羥基上；采用冰水浴， 機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速500-1000rpm，磺化時(shí)間為20-120分鐘，經(jīng)低溫(_15°C 10°C )下與堿中和后無水乙醇沉淀，透析，凍干純化后可獲得磺化度為50% -100%的硫酸化灰樹花多糖；將硫酸化灰樹花多糖配制成質(zhì)量百分比為0. 1 - 10%溶液；
三、將第一步的殼聚糖酸性溶液與第二步的硫酸化灰樹花多糖水溶液按照質(zhì)量百分比殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%混合，經(jīng)5-20秒超聲振蕩混均后，加入制得海綿材料總質(zhì)量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二縮水甘油醚，混和液澆鑄冷凍，凍干得海綿材料。在上述技術(shù)方案中，第一步與第二步可以互換，或者可以合并成同一步，都可以達(dá)到相應(yīng)的技術(shù)效果。本發(fā)明的凍干海綿用作止血敷料。本發(fā)明的凍干海綿用作組織工程材料。本發(fā)明采用天然動(dòng)物多糖與植物多糖為原料，具有良好的生物安全性與可降解性能，其材料來源廣泛，成本低廉。采用冷凍一凍干方法可通過酸種類，濃度，冷凍溫度，交聯(lián)劑用量控制凝膠海綿的微結(jié)構(gòu)及其降解速率。本發(fā)明的多孔海綿材料可用于創(chuàng)口止血材料，心瓣膜，硬腦膜，硬脊膜，深度燙傷材料等，可促受損組織迅速愈合。


圖1為殼聚糖與抗壞血酸形成復(fù)合物結(jié)構(gòu)的過程圖。圖2為海綿多糖的掃描電鏡圖譜。圖3為海綿在不同pH條件下M小時(shí)的吸水率圖。圖4為植入多孔海綿20天后創(chuàng)面愈合情況HE染色切片。從圖1可知，殼聚糖上伯氨基發(fā)生質(zhì)子化而與抗壞血酸形成復(fù)合物。從圖2中可知，多糖海綿的孔徑范圍在20 - 500 μ m，有利于成纖維細(xì)胞的長入，從而促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。 由圖3可知，該海綿在酸性條件下(pH<4)吸水率較高而在中性及堿性(pH>7)條件下吸水率較低，故可以滿足中性及偏堿性創(chuàng)面的使用要求。由圖4結(jié)果說明，20天后，有豐富血管長入，說明本海綿的促創(chuàng)面愈合能力很強(qiáng)。
具體實(shí)施例下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例作詳細(xì)說明。實(shí)施例1
將40克灰樹花多糖(多糖含量>30% )緩慢加入30mL氯磺酸中，冰水浴冷卻，SOOrpm 高速攪拌。40分鐘后，將反應(yīng)液緩慢倒入50mL冷藏過的2mol/LNa0H中，控制溫度不超過 40°C。調(diào)節(jié)pH值至中性，將水溶液采用無水乙醇沉淀，過濾。將沉淀物溶于20mL去離子水中，透析，凍干，獲得100%取代度的硫酸化灰樹花多糖。將1. 6克殼聚糖(分子量80萬，脫乙酰度90% )高速攪拌溶于80mL2%的抗壞血酸水溶液中，加入0. 4克硫酸化灰樹花多糖溶于20mL去離子水配制成溶液，加入0. 0001克京尼平，攪拌混和均勻，倒入模具中，放入一 20°C冰箱冷凍。將冷凍模具放入冷凍干燥機(jī)真空干燥，獲得多孔多糖海綿。
實(shí)施例2
將20克灰樹花多糖(多糖含量>30 % )緩慢加入15mL濃硫酸中，冰水浴冷卻，IOOOrpm 高速攪拌。60分鐘后，將反應(yīng)液緩慢倒入30mL冷藏過的Im0VLNa2CO3中，控制溫度不超過 45°C。調(diào)節(jié)pH值至中性，將水溶液采用無水乙醇沉淀，過濾。將沉淀物溶于20mL去離子水中，透析，凍干，獲得90%取代度的硫酸化灰樹花多糖。將1. 2克殼聚糖(分子量100萬，脫乙酰度92%)高速攪拌溶于75mL2%的蘋果酸水溶液中，加入0. 8克硫酸化灰樹花多糖溶于25mL去離子水配制成溶液，加入0. 005克聚乙二醇二縮水甘油醚，攪拌混和均勻，倒入模具中，放入一 5°C冰箱冷凍。將冷凍模具放入冷凍干燥機(jī)真空干燥，獲得多孔多糖海綿。
實(shí)施例3
將30克灰樹花多糖(多糖含量>20% )緩慢加入20mL濃硫酸中，冰水浴冷卻，500rpm 高速攪拌。20分鐘后，將反應(yīng)液緩慢倒入30mL冷藏過的Im0VLNa2CO3中，控制溫度不超過 30°C。調(diào)節(jié)pH值至中性，將水溶液采用無水乙醇沉淀，過濾。將沉淀物溶于IOmL去離子水中，透析，凍干，獲得80%取代度的硫酸化灰樹花多糖。將0. 8克殼聚糖(分子量60萬，脫乙酰度90% )高速攪拌溶于SOmLO. 2%的乳酸水溶液中，加入1. 2克硫酸化灰樹花多糖溶于20mL去離子水配制成溶液，加入0. 008克乙二醇二縮水甘油醚，攪拌混和均勻，倒入模具中，放入一 30°C冰箱冷凍。將冷凍模具放入冷凍干燥機(jī)真空干燥，獲得多孔多糖海綿。
實(shí)施例4
將15克灰樹花多糖(多糖含量>30% )緩慢加入20mL氯磺酸中，冰水浴冷卻，600rpm 高速攪拌。25分鐘后，將反應(yīng)液緩慢倒入60mL冷藏過的3mol/LK2C03中，控制溫度不超過 40°C。調(diào)節(jié)pH值至中性，將水溶液采用無水乙醇沉淀，過濾。將沉淀物溶于25mL去離子水中，透析，凍干，獲得100%取代度的硫酸化灰樹花多糖。將0. 6克殼聚糖(分子量120萬，脫乙酰度85%)高速攪拌溶于90mLl%的檸檬酸水溶液中，加入0. 2克硫酸化灰樹花多糖溶于IOmL去離子水配制成溶液，加入0. 002克乙二醇二縮水甘油醚，攪拌混和均勻，倒入模具中，放入一 10°C冰箱冷凍。將冷凍模具放入冷凍干燥機(jī)真空干燥，獲得多孔多糖海綿。
實(shí)施例5
將25克灰樹花多糖(多糖含量>30 % )緩慢加入20mL濃硫酸中，冰鹽浴冷卻，1200rpm 高速攪拌。35分鐘后，將反應(yīng)液緩慢倒入SOmL冷藏過的4mol/LNaHC03中，控制溫度不超過 30°C。調(diào)節(jié)pH值至中性，將水溶液采用無水乙醇沉淀，過濾。將沉淀物溶于30mL去離子水中，透析，凍干，獲得98. 5%取代度的硫酸化灰樹花多糖。將1. 8克殼聚糖(分子量140萬，脫乙酰度95%)高速攪拌溶于95mLl%的琥珀酸水溶液中，加入0. 2克硫酸化灰樹花多糖溶于5mL去離子水配制成溶液，加入0. 001克京尼平，攪拌混和均勻，倒入模具中，放入一 25°C冰箱冷凍。將冷凍模具放入冷凍干燥機(jī)真空干燥，獲得多孔多糖海綿。本發(fā)明采用天然多糖及其衍生物殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖為原料，通過冷凍一凍干方法，京尼平或(聚)乙二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑制備出具有微結(jié)構(gòu)可控，適宜降解速率，可迅速完成血管化的多孔海綿材料，該海綿材料的制備原料來源廣泛，制備工藝簡易，所制備材料可用于創(chuàng)傷、燒傷及潰瘍等難愈合創(chuàng)面的修復(fù)。
權(quán)利要求
1.殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿，其特征是包含以下質(zhì)量百分比成份殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿，其特征是 所述海綿材料的孔徑在20 - 500 μ m。
3.殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿的制備方法，其特征是按如下步驟一、將灰樹花多糖溶于濃硫酸或氯磺酸，其磺化位點(diǎn)在于2，3，6-羥基上；二、采用冰水浴，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速500-1000rpm，磺化時(shí)間為20-120分鐘，經(jīng)低溫下與堿中和后無水乙醇沉淀，透析，凍干純化后可獲得磺化度為50% -100%的硫酸化灰樹花多糖；三、將殼聚糖溶于有機(jī)酸或無機(jī)酸中，制得質(zhì)量百分比為0.5 - 10%的溶液；將步驟二制備得的硫酸化灰樹花多糖配制成質(zhì)量百分比為0. 1 - 10%溶液；將前述殼聚糖酸性溶液與硫酸化灰樹花多糖水溶液按照質(zhì)量百分比殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%混合，經(jīng)5-20秒超聲振蕩混均后，加入制得海綿材料總質(zhì)量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚) 乙二醇二縮水甘油醚，混和液澆鑄冷凍，凍干得海綿材料。
4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于第三步，所述的有機(jī)酸是抗壞血酸， 蘋果酸，乳酸，檸檬酸，麩酸，琥珀酸，酒石酸，順丁烯二酸或富馬酸；所述的無機(jī)酸是乙酸或鹽酸。
5.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于第三步，凍干的冷凍溫度為一 5 0C——80 "C。
6.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于第三步，殼聚糖原料分子量為15 萬一200萬，脫乙酰度70%—95%。
7.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于第一步，灰樹花多糖的多糖含量 >30%。
8.殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿的制備方法，其特征是按如下步驟一、將殼聚糖溶于有機(jī)酸或無機(jī)酸中，制得質(zhì)量百分比為0.5 - 10%的溶液；二、將灰樹花多糖溶于濃硫酸或氯磺酸，其磺化位點(diǎn)在于2，3，6-羥基上；采用冰水浴， 機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速500-1000rpm，磺化時(shí)間為20-120分鐘，經(jīng)低溫下與堿中和后無水乙醇沉淀， 透析，凍干純化后可獲得磺化度為50% -100%的硫酸化灰樹花多糖；將硫酸化灰樹花多糖配制成質(zhì)量百分比為0. 1 - 10%溶液；三、將第一步的殼聚糖酸性溶液與第二步的硫酸化灰樹花多糖水溶液按照質(zhì)量百分比殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%混合，經(jīng)5-20秒超聲振蕩混均后，加入制得海綿材料總質(zhì)量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二縮水甘油醚，混和液澆鑄冷凍，凍干得海綿材料。
9.權(quán)利要求書1所述的凍干海綿用作止血敷料。
10.權(quán)利要求書1所述的凍干海綿用作組織工程材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿及其制備方法和用途。殼聚糖與硫酸化灰樹花多糖共混凝膠凍干海綿包含以下質(zhì)量百分比成份殼聚糖20%-98%、硫酸化灰樹花多糖2%-80%。本發(fā)明采用天然動(dòng)物多糖與植物多糖為原料，具有良好的生物安全性與可降解性能，其材料來源廣泛，成本低廉。采用冷凍－凍干方法可通過酸種類，濃度，冷凍溫度，交聯(lián)劑用量控制凝膠海綿的微結(jié)構(gòu)及其降解速率。本發(fā)明的多孔海綿材料可用于創(chuàng)口止血材料，心瓣膜，硬腦膜，硬脊膜，深度燙傷材料等，可促受損組織迅速愈合。
文檔編號(hào)C08B37/02GK102167847SQ20111002550
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者劉彩鳳, 周盛華, 楊學(xué)佳, 陳壁輝, 黃愛賓 申請(qǐng)人:杭州電子科技大學(xué)