專利名稱：具有生物相容性和溫敏性的半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物相容性和環(huán)境敏感的高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種既具有良好生物相容性又具有溫敏性的半互穿納米復(fù)合水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聚合物水凝膠因其在食品和生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如食品添加劑、 藥物控制釋放和生物組織填充材料等等，受到人們的普遍關(guān)注和研究。其中，溫度敏感型聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)水凝膠由于存在體積相轉(zhuǎn)變溫度而被廣泛用于組織工程領(lǐng)域。由于PNIPAm大分子鏈上同時(shí)具有親水性的基團(tuán)和疏水性的基團(tuán)，在溫度高于32 V 時(shí)，分子鏈與水分子之間的氫鍵遭到破壞，疏水作用占優(yōu)勢，高分子鏈發(fā)生相轉(zhuǎn)變產(chǎn)生體積收縮，水凝膠表面表現(xiàn)為疏水性，利于細(xì)胞的貼附和增殖；當(dāng)溫度低于32 °C時(shí)，分子鏈與水形成氫鍵，親水作用占優(yōu)勢，高分子鏈伸展，水凝膠表面表現(xiàn)為親水性，可使生長在其表面的細(xì)胞或細(xì)胞片快速自動(dòng)脫附。此法避免了使用胰酶消化對細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)造成的破壞，保持細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)及其功能的完整性。通過自然脫附得到的細(xì)胞片可以直接用于組織工程的移植，避免使用其他載體或支架，對降低移植風(fēng)險(xiǎn)和提高移植成功率十分有利。然而，傳統(tǒng)的溫敏性水凝膠強(qiáng)度低韌性差，只能夠用于對凝膠強(qiáng)度要求很低的領(lǐng)域；此外，傳統(tǒng)溫敏性水凝膠的生物相容性以及細(xì)胞或細(xì)胞片的自動(dòng)脫附速率都亟待進(jìn)一步提高。雖然有專利報(bào)道(中國專利CN101367947A，CN101328251A, CN1284811C, CN101177487C與CN100341484C)采用具有生物相容性的殼聚糖、葡聚糖、明膠、聚磷酸脂及魔芋葡甘聚糖等制備得到了生物相容性較高的水凝膠，但由于所得凝膠機(jī)械性能仍較差并且易碎而限制了其的應(yīng)用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Adv. Mater. , 2002, 14:1120-1124)，Haraguchi 等將鋰藻土 (Laponite)納米粒子分散在水中，使異丙基丙烯酰胺(NIPAm)單體在Laponite分散液中原位自由基聚合，Laponite納米顆粒起到多官能度交聯(lián)劑的作用，從而得到了聚異丙基丙烯酰胺/Laponite 納米復(fù)合水凝膠(PNIPAm/Laponite Nanocomposite Hydrogel，簡稱NC凝膠)。NC凝膠具有高強(qiáng)高韌的力學(xué)性能。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Biomacromocules，2006， 7:3267-327 ，此類高強(qiáng)高韌的NC凝膠可用于人體肝瘤細(xì)胞、人體真皮纖維原細(xì)胞以及人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及通過降溫可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞片的自動(dòng)脫附。但迄今為止，僅有丙烯酰胺類單體能成功制備鋰藻土納米復(fù)合水凝膠，同時(shí)，NC凝膠表面細(xì)胞的粘附和增殖受鋰藻土含量影響較大，只有在特定鋰藻土含量時(shí)細(xì)胞才表現(xiàn)出快速增殖，因此其生物相容性受到較大限制。就生物相容性而言，海藻酸是從天然褐藻中提取的一種多糖，其無毒、無臭并且具有良好的生物相容性，原料豐富、易得且價(jià)格低廉。它不僅在食品、紡織、造紙、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，更重要的是它在藥物控釋、細(xì)胞移植和組織工程等領(lǐng)域都有著重要的用途。鈣-海藻酸凝膠可用作組織工程的三維支架，增強(qiáng)細(xì)胞的聚集性，還可以有助于保持細(xì)胞的活性，被用作體內(nèi)細(xì)胞傳輸?shù)妮d體。因此，我們將海藻酸或海藻酸鹽弓丨入到高強(qiáng)高韌的NC凝膠中，在保持NC凝膠良好的力學(xué)性能和溫度敏感性的基礎(chǔ)上，再通過引入線性高聚物海藻酸或海藻酸鹽制備半互穿網(wǎng)絡(luò)得到在較寬的鋰藻土含量范圍內(nèi)都具有良好生物相容性的NC凝膠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的和內(nèi)容在于針對現(xiàn)有NC凝膠材料的缺陷和不足，提供具有生物相容性和溫敏性的半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。該凝膠既具有良好的力學(xué)性能和溫敏性，又在較寬的鋰藻土含量范圍內(nèi)具有良好生物相容性，通過降低環(huán)境溫度還可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或細(xì)胞片從用于細(xì)胞培養(yǎng)的該水凝膠表面上快速自動(dòng)脫附。本發(fā)明所制備的具有良好生物相容性和溫敏性的半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠，是由異丙基丙烯酰胺(NIPAm)單體、鋰藻土 Laponite和具有生物相容性的線性高分子海藻酸或海藻酸鹽溶于水通過NIPAm單體原位自由基聚合反應(yīng)制備而成。本發(fā)明的目的和內(nèi)容還在于提供所述水凝膠的制備方法與細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞片的快速脫附。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下。具有生物相容性和溫敏性的半互穿納米復(fù)合水凝膠的制備方法，該方法將鋰藻土分散于水中，攪拌得到均勻透明的分散液，加入海藻酸或海藻酸鹽水溶液，再加入異丙基丙烯酰胺單體(NIPAm)，鋰藻土的添加量為Λ/-異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量的20% 95%，海藻酸或海藻酸鹽的用量為異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量的1% 10%，攪拌均勻后除氧加入質(zhì)量為異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量0. 1% 4%的引發(fā)劑，將反應(yīng)液裝入模具中并密封；然后將反應(yīng)體系置于15 25 °C下反應(yīng)即得到所述半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠。上述的制備方法中，還將制備的所述復(fù)合水凝膠從模具中取出，放入到大量滅菌水中分別反復(fù)溶脹和去溶脹以除去未反應(yīng)物質(zhì)及其他雜質(zhì)。上述的制備方法中，所述異丙基丙烯酰胺單體相對于整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量百分比濃度為5% 15%。上述的制備方法中，在加入海藻酸或海藻酸鹽水溶液和OTPAm單體后分別攪使體系充分混合均勻。上述的制備方法中，制備過程均在無菌環(huán)境中完成，用水均為滅菌水。上述的制備方法中，所述鋰藻土包括天然及人工合成鋰藻土。所述鋰藻土優(yōu)選 Rockwood公司生產(chǎn)的Laponite系列兩種溶膠型產(chǎn)品，其分子式分別為
XLS 型[Mfe 34Li0. B6Si8O20 (OH)4] Na0. 66，Na4P2O7 改性；
RDS型:Na+0.7[ (Si8Mfe5Li0.3) O20(OH)4]_0.7，Na4P2O7改性。所述引發(fā)劑為氧化還原引發(fā)體系，包括但不限于過硫酸鉀和四甲基乙二胺。本發(fā)明還提供上述半互穿納米復(fù)合水凝膠的應(yīng)用，即純化后的所述復(fù)合水凝膠用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞片的快速脫附，包括如下步驟
將純化好的所述復(fù)合水凝膠切成小片，先放入細(xì)胞培養(yǎng)液中在37 ！的二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)；在預(yù)培養(yǎng)好的水凝膠表面種植細(xì)胞并在37 °C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 待細(xì)胞鋪滿凝膠表面形成細(xì)胞片后，降低環(huán)境溫度，即可使細(xì)胞片從水凝膠表面快速脫附。上述的應(yīng)用中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液包括但不限于DMEM培養(yǎng)基；用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞包括但不限于人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人肺癌細(xì)胞(AM9)或人成纖維細(xì)胞(L929)。本發(fā)明的溫敏性半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠的制備方法包括以下步驟 本發(fā)明與現(xiàn)有材料和技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明制備方法簡單，不需要特殊設(shè)備，常溫常壓下操作，反應(yīng)簡單可控，成本低，適于推廣應(yīng)用；
2、本發(fā)明通過引入線性生物相容性高聚物制備半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠，線性高聚物提高了該水凝膠的生物相容性，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)則提供了溫度敏感性和高強(qiáng)高韌性，因此，該水凝膠即具有納米復(fù)合水凝膠的溫度敏感性和高強(qiáng)高韌性，又在較寬的鋰藻土含量范圍內(nèi)具有良好生物相容性；
3、本發(fā)明通過引入生物相容性線性高聚物，提高了納米復(fù)合水凝膠的生物相容性，更利于細(xì)胞在水凝膠表面的粘附和增殖為細(xì)胞片；通過降低培養(yǎng)液的溫度又能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞片的快速自動(dòng)脫附，避免了胰酶消化對細(xì)胞片造成的損害，更加拓寬了其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用；
4、本發(fā)明所制備的半互穿納米復(fù)合水凝膠的生物相容性和力學(xué)性能均可以通過改變聚合反應(yīng)體系各組分和鋰藻土的用量來進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化，以滿足不同使用情況下的需求。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。對實(shí)施例中得到的半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠，采用Xiong等Macromolecules，2009, 42: 3811-3817文獻(xiàn)公開方法測定凝膠機(jī)械性能，采用Hou等Biomaterials，2008, 29: 3175-3184文獻(xiàn)公開方法進(jìn)行溫敏性檢測，采用Haraguchi等Biomacromocules，2006, 7 3267-3275文獻(xiàn)公開方法進(jìn)行生物相容性檢測。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
首先，在無菌實(shí)驗(yàn)室中將1.8 g鋰藻土Laponte XLS分散于27 g滅菌水中，攪拌3 h得到均勻透明的分散液；然后加入1.5 mL預(yù)先制備好的濃度為20 mg/mL的海藻酸水溶液并繼續(xù)攪拌2 h ；再加入3 g單體NIPAm并繼續(xù)攪拌2 h ；最后往反應(yīng)液中通入氬氣10 min, 加入引發(fā)劑過硫酸鉀(KPS，20 mg/mL) 1.5 mL和四甲基乙二胺(TEMED) 60 "L，攪拌均勻后分別注入到玻璃試管和(或)厚度為2 mm的反應(yīng)模具中，密封并置于20 °C培養(yǎng)箱中反應(yīng) 24 h即可得到半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠。玻璃試管制備所得的水凝膠用于測定力學(xué)性能和溫敏性，該水凝膠的斷裂伸長率為1030 %，斷裂強(qiáng)度190 kPa，相轉(zhuǎn)變溫度為33. 2 °C。 片狀玻璃模具內(nèi)水凝膠被置于大量滅菌水中在20 1和40 °C環(huán)境中反復(fù)溶脹和去溶脹純化10 d以去除未反應(yīng)物質(zhì)及其他雜質(zhì)，每天更換一次水。將純化好的水凝膠用模具切成圓片，放入細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中在37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2天，中間更換一次培養(yǎng)液。 在預(yù)培養(yǎng)好的水凝膠表面種植密度為3 X IO4個(gè)/ cm2的人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，并在37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，二氧化碳濃度控制在5 %。培養(yǎng)過程中每兩天對凝膠表面的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并更換培養(yǎng)液。6天后，細(xì)胞密度為80 X IO4個(gè)/cm2;更換培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例2
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1 在無菌實(shí)驗(yàn)室中將2. 4 g鋰藻土 Laponte XLS分散于M g滅菌水中；然后加入4. 5 mL濃度為20 mg/mL的海藻酸鈉水溶液；該水凝膠的斷裂伸長率為1000 %，斷裂強(qiáng)度300kPa，相轉(zhuǎn)變溫度為34. 5 °C ；6天后，HeLa細(xì)胞密度為95 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。 實(shí)施例3
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1 在無菌實(shí)驗(yàn)室中將1.8 g鋰藻土Laponte RDS分散于22. 5 g滅菌水中；然后加入6 mL濃度為20 mg/mL的海藻酸水溶液；該水凝膠的斷裂伸長率為1060 %，斷裂強(qiáng)度沈0沙￡1，相轉(zhuǎn)變溫度為34 °C;6天后，HeLa細(xì)胞密度為98 X IO4 個(gè)/cm2 ；將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。 實(shí)施例4
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1 在無菌實(shí)驗(yàn)室中將1. 5 g鋰藻土 Laponte RDS分散于19. 5 g滅菌水中；然后加入9 mL濃度為20 mg/mL的海藻酸鈉水溶液；該水凝膠的斷裂伸長率為980 %，斷裂強(qiáng)度175 kPa，相轉(zhuǎn)變溫度為34. 5 °C ；6天后，HeLa細(xì)胞密度為95 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。 實(shí)施例5
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1 所用細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞(AM9)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為50 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例6
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例1 所用細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞(L929)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為30 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例7
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例2 所用細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞(AM9)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為50 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例8
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例2 所用細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞(L929)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為40 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例9
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例3 所用細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞(L929)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為50 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。
實(shí)施例10
本實(shí)施例除下述特征外同實(shí)施例3 所用細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞(AM9)。培養(yǎng)6天后細(xì)胞密度為45 X IO4個(gè)/cm2;將培養(yǎng)液溫度降低至室溫，觀察到細(xì)胞片30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)脫附。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.具有生物相容性和溫敏性的半互穿納米復(fù)合水凝膠的制備方法，其特征在于將鋰藻土分散于水中，攪拌得到均勻透明的分散液，加入海藻酸或海藻酸鹽水溶液，再加入異丙基丙烯酰胺單體，鋰藻土的添加量為Λ/-異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量的20% 95%，海藻酸或海藻酸鹽的用量為Λ/-異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量的1% 10%，攪拌均勻后除氧加入質(zhì)量為異丙基丙烯酰胺單體質(zhì)量0. 1% 4%的引發(fā)劑，將反應(yīng)液裝入模具中并密封；然后將反應(yīng)體系置于15 25 °C下反應(yīng)即得到所述半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于將制備的所述復(fù)合水凝膠從模具中取出，放入到大量滅菌水中分別反復(fù)溶脹和去溶脹以除去未反應(yīng)物質(zhì)及其他雜質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述異丙基丙烯酰胺單體相對于整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量百分比濃度為5% 15%，制備過程均在無菌環(huán)境中完成，用水均為滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是在加入海藻酸或海藻酸鹽水溶液和 NIPAm單體后分別攪使體系充分混合均勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述鋰藻土包括天然及人工合成鋰藻土。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述鋰藻土為Rockwood公司生產(chǎn)的 Laponite系列兩種溶膠型產(chǎn)品，其分子式分別為XLS 型[Mg5. 34Li0. B6Si8O20 (OH)4] Na0. 66，Na4P2O7 改性；RDS 型:Na+0.7 [ (Si8Mg5.5Li0.3) O20 (OH) J _0.7，Na4P2O7 改性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述引發(fā)劑為氧化還原引發(fā)體系，包括過硫酸鉀和四甲基乙二胺。
8.由權(quán)利要求廣7任一項(xiàng)所述制備方法制得的具有生物相容性和溫敏性的半互穿納米復(fù)合水凝膠。
9.權(quán)利要求2所述制備方法制得的復(fù)合水凝膠的應(yīng)用，其特征是純化后的所述復(fù)合水凝膠用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞片的快速脫附，包括如下步驟將純化好的所述復(fù)合水凝膠切成小片，先放入細(xì)胞培養(yǎng)液中在37 ！的二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)；在預(yù)培養(yǎng)好的水凝膠表面種植細(xì)胞并在37 °C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪滿凝膠表面形成細(xì)胞片后，降低環(huán)境溫度，即可使細(xì)胞片從水凝膠表面快速脫附。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)液包括DMEM培養(yǎng)基；用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞包括人宮頸癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞或人成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開具有生物相容性和溫敏性的半互穿網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。制備方法為將鋰藻土分散于水中，攪拌得到均勻透明的分散液，再依次加入生物相容性海藻酸或海藻酸鹽、N-異丙基丙烯酰胺單體，攪拌均勻后除氧加引發(fā)劑，將反應(yīng)液裝入反應(yīng)模具中并密封，在15~25℃下通過原位自由基聚合反應(yīng)得目標(biāo)產(chǎn)物。所制備的水凝膠中NC凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)提供了溫度敏感性及高強(qiáng)高韌性，而半互穿的海藻酸或海藻酸鹽提高了其生物相容性，因此，此類溫度敏感性半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠在具有納米復(fù)合水凝膠的高強(qiáng)高韌性的同時(shí)還具良好的有生物相容性。細(xì)胞可以在水凝膠表面粘附并增殖形成細(xì)胞片，降低凝膠所處環(huán)境溫度則可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞片的快速脫附。
文檔編號C08K3/34GK102161728SQ201110043519
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者劉丹, 劉新星, 王朝陽, 王濤, 童真 申請人:華南理工大學(xué)