專利名稱：海藻酸鹽水凝膠微載體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海藻酸鹽水凝膠微載體及其制備方法，屬于高分子生物醫(yī)用材料。
背景技術：
間充質(zhì)干細胞(MSCs)在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出多向分化潛能，同時具有體外易分離、培養(yǎng)，并且不表達共刺激抗原B7等特性[Brinchmann JE. Expanding autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells (自體多能骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增)Journal of the neurological sciences, 2008，265 :127-130]，因此是細胞治療理想的細胞來源，已經(jīng)廣泛應用于再生醫(yī)學和組織工程領域。但人體組織中MSCs數(shù)量極少，約占骨髓有核細胞的0.001% 0.01%，遠遠不能滿足臨床治療的需要[Croft A, Przyborski S. Mesenchymal stem cells from the bone marrow stroma :basic biology and potential for cell therapy (骨髓間充質(zhì)干細胞基本的生物學性狀和細胞治療的潛力)Current Anaesthesia & Critical Care，2004，15 :410-417]。因此，在保證其細胞功能的前提下，在體外大規(guī)模、規(guī)范化培養(yǎng)和擴增MSCs成為臨床應用的關鍵。近年來發(fā)展的微載體動態(tài)培養(yǎng)體系是規(guī)?；囵B(yǎng)貼壁細胞的新措施，早期微載體多采用人工合成聚合物如聚甲基丙烯酸-2羥乙酯(PHEMA)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等制備。近年來，越來越多的研究者嘗試用天然聚合物及其衍生物來制備微載體。天然聚合物來源豐富，在功能適應性、組織相容性、理化性能、 生物降解性、造價等方面優(yōu)于人工合成材料。制備微載體常用的的天然聚合物有明膠、膠原、海藻酸鹽、殼聚糖、纖維素、葡聚糖等[(a)過琴媛，王輝.微載體培養(yǎng)動物細胞技術的研究進展.微生物學免疫學進展，2007, 35 73-75]。目前常用的以海藻酸鹽制備的微載體大多為以二價陽離子如Ca2+、Ba2+、Sr2+等為交聯(lián)劑的離子交聯(lián)型水凝膠。但離子交聯(lián)水凝膠中的二價離子很容易與水凝膠周圍介質(zhì)中的離子(如Na+、K+等)發(fā)生交換，而且這一過程很難控制也無法避免，因而此類水凝膠在生理介質(zhì)環(huán)境中因離子交換易解體而失去水凝膠特性。為了克服因發(fā)生離子交換反應而引起的微載體的過度溶脹或變形，經(jīng)常以聚-L-賴氨酸、聚-L-鳥氨酸包覆海藻酸鹽微載體或通過自由基聚合和縮合反應在海藻酸鹽水凝膠載體表面引入化學交聯(lián)層對其進行表面修飾，海藻酸鹽微載體穩(wěn)定性顯著提高[(a)Darrabie MD，Kendall Jr WF，Opara EC. Characteristics of PoIy-L-Ornithine-coated alginate microcapsules (1 -L- - 氨酸涂層海藻酸鹽微膠囊的特征)Biomaterials，2005，26 :6846-6852 ； (b)Mazumder MAJ, Shen F, Burke NAD, Potter MA, Sto ver HDH. Self-cross-1inking polyelectrolyte complexes for therapeutic cell encapsulation (用于治療性細胞封裝的自交聯(lián)聚電解質(zhì)復合物)Biomacromolecules，2008，9 :2292-2300]。將離子交聯(lián)海藻酸鹽水凝膠微載體用于擴增MSCs，由于微載體材料不能降解，需用胰酶將細胞消化下來。但有研究表明，酶解過程容易對干細胞染色體組型的穩(wěn)定性造成不禾1J景i口向[(a)Mitalipova MM, Rao RR, Hoyer DM, Johnson JA, Meisner LF, Jones KL, et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells (保存人胚月臺干細胞的遺傳完整性)Nature Biotechnology, 2005, 23 :19-20]。同時，MSCs作為細胞治療或組織工程的種子細胞使用時，動物來源的消化酶成分的混入可能對其臨床使用造成潛在的危險性[Zhang J, Skardal A, Prestwich GD. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery(可用于細j^JH 殖和細胞恢復的工程化細胞外基質(zhì))Biomaterials，2008，29 :4521-4531]。而更重要的是， 由于微載體多是大孔結構，經(jīng)三維動態(tài)擴增后相當數(shù)量的細胞(有時甚至達到40%以上) 存在于載體的內(nèi)部孔隙中，因此很難通過常規(guī)的酶消化方式完全消化下來，從而使最終的細胞產(chǎn)量受到影口向[Bancel S，Hu WS. Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporous microcarriers (共聚焦激光掃描顯微鏡檢測多孑L 微載體細胞分布)Biotechnology Progress，1996，12 :398-402]。因此，有必要從模擬MSCs 在體內(nèi)生長的三維微環(huán)境角度出發(fā)，以分子水平設計和制備出細胞相容性良好的新型微載體材料，在溫和的生理條件下通過非酶解途徑降解載體材料，快速回收擴增后的MSCs。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海藻酸鹽水凝膠微載體及其制備方法。所述的海藻酸鹽水凝膠微載體具有優(yōu)良的生物相容性和體外降解性的特點；其原料來源豐富，制備方法簡單易行，成本較低。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，一種海藻酸鹽水凝膠微載體，其特征在于，該海藻酸鹽水凝膠的分子結構式如式1所示，其上附著了殼聚糖、肝素和堿性成纖維細胞生長因子或殼聚糖和纖連蛋白。它的性質(zhì)為粒徑為450 μ m 950 μ m，含水率高，柔軟而富有彈性，具有多孔結構，海藻酸鹽水凝膠1H-NMR譜圖中，在化學位移D = 3. 25和D = 2. 85 的兩個振動峰分別對應于胱胺交聯(lián)橋上-S-CH2-和-CH2-NH-中兩個亞甲基的質(zhì)子。
權利要求
1.本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，一種海藻酸鹽水凝膠微載體，其特征在于，該海藻酸鹽水凝膠的分子結構式如式1所示，其上附著了殼聚糖、肝素和堿性成纖維細胞生長因子或殼聚糖和纖連蛋白。它的性質(zhì)為粒徑為450 μ m 950 μ m,含水率高，柔軟而富有彈性，具有多孔結構，海藻酸鹽水凝膠1H-NMR譜圖中，在化學位移D = 3. 25和D = 2. 85的兩個振動峰分別對應于胱胺交聯(lián)橋上-S-CH2-和-CH2-NH-中兩個亞甲基的質(zhì)子，
2. 一種制備權利要求ι所述海藻酸鹽水凝膠微載體的方法，其特征在于包括以下步驟·1)將海藻酸鈉加入PH為5.O的磷酸鹽緩沖溶液中，配制質(zhì)量濃度為2. O 8. O %的海藻酸鈉溶液，并稱重，按水溶性碳二亞胺與海藻酸鈉質(zhì)量比為(0. 5 1. 0) (0. 2 0. 8) 向海藻酸鈉溶液中加入水溶性碳二亞胺，室溫攪拌，得到海藻酸鈉混合溶液，然后按花生油質(zhì)量、質(zhì)量濃度為25%的吐溫80水溶液質(zhì)量與海藻酸鈉溶液質(zhì)量比為(1 10) (0. 1 0.5) 2依次向海藻酸鈉混合溶液中加入花生油和吐溫80水溶液，在室溫下攪拌形成均勻的W/0型懸浮液，再按胱胺質(zhì)量與海藻酸鈉質(zhì)量比為(0.2 1.5) (0.2 0.8)向懸浮液中加入胱胺交聯(lián)劑，在40°C、500rpm的條件下恒溫磁力攪拌1 池，然后對產(chǎn)物進行抽濾和無水乙醇洗滌得到海藻酸鹽水凝膠微載體；2)將步驟1)得到的海藻酸鹽水凝膠微載體加入相對分子質(zhì)量為1 100k、質(zhì)量濃度為0. 1 1. 0%的殼聚糖溶液中浸泡1 10h，接著在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡 10 Mh，然后將海藻酸鹽水凝膠微載體在-20 -80°c條件下預凍10 20h，再移入凍干機中在0 20°C下冷凍干燥2d得到具有多孔結構的海藻酸鹽水凝膠微載體；·3)將步驟2、得到的海藻酸鹽水凝膠微載體在質(zhì)量濃度為0.1 0. 5%的肝素溶液中浸泡1 證，接著在pH為7. 4的磷酸鹽溶液中浸泡10 Mh，然后在質(zhì)量濃度為0. 0001 0. 001%的堿性成纖維細胞生長因子溶液中浸泡1 池，得到海藻酸鹽水凝膠微載體；或者將步驟2、得到的海藻酸鹽水凝膠微載體在質(zhì)量濃度為0. 0001 0. 001%的纖連蛋白溶液中浸泡1 池，得到海藻酸鹽水凝膠微載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海藻酸鹽水凝膠微載體及其制備方法。其分子結構式如下其制備過程用懸浮交聯(lián)法，在水溶性碳二亞胺的活化作用下海藻酸鈉中的羧基與胱胺中的氨基發(fā)生酰胺化反應，形成化學交聯(lián)海藻酸鹽水凝膠微載體，經(jīng)冷凍干燥后得到多孔結構微載體，其上附著殼聚糖、肝素、堿性成纖維細胞生長因子、纖連蛋白等組分。本發(fā)明的海藻酸鹽水凝膠微載體制備方法簡單、原料來源豐富，具有良好的體外降解性和細胞相容性；用于間充質(zhì)干細胞的體外擴增，可避免胰酶消化過程對細胞造成的傷害，同時提高細胞產(chǎn)量。
文檔編號C08J9/42GK102250390SQ20111013583
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2011年5月25日
發(fā)明者尹玉姬, 趙燕燕, 趙爽 申請人:天津大學