專(zhuān)利名稱(chēng)：一種組織工程凝膠支架材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，尤其涉及一種組織工程凝膠支架材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物材料和種子細(xì)胞是組織工程技術(shù)中的兩大關(guān)鍵因素。作為種子細(xì)胞支架的生物可降解材料，是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的仿生，是保證組織工程化組織形成的前提。細(xì)胞與生物材料直接接觸后，產(chǎn)生一系列在細(xì)胞和分子水平上的反應(yīng)，因此支架材料的物化性質(zhì)直接影響著細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而影響體內(nèi)和體外組織構(gòu)建效果，最終影響組織工程化組織的形成。由于生物材料在組織工程中是起到負(fù)載細(xì)胞的支架的作用，一般需要具有相應(yīng)組織、器官的復(fù)雜外形，高空隙率，合適的降解速率，良好的生物相容性，等等。相對(duì)于其他類(lèi)型的支架材料，如通常用于軟組織構(gòu)建的纖維狀或膜片式聚a-羥基酸(包括聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及它們的共聚物PLGA)，或是用于硬組織構(gòu)建的磷酸三鈣、羥基磷灰石、珊瑚、脫鈣骨等，可注射的凝膠支架材料具有易塑形，且回植體內(nèi)時(shí)無(wú)創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)而深受科研人 員的青睞。透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,簡(jiǎn)稱(chēng)HA)是由N-乙酰氨基葡糖_D_葡萄糖醛酸為雙糖單位組成的天然直鏈高分子多糖(glycosaminoglycan ;GAG),商品形式的HA主要以透明質(zhì)酸鈉的形式出售，本文中的HA如不特意指出即指透明質(zhì)酸鈉。HA的分子量可以高達(dá)
1-2000，OOODa,具有較好的粘彈性，廣泛分布于哺乳動(dòng)物結(jié)締組織的胞外基質(zhì)、雞冠和鏈球菌的夾膜等地方。HA是黏多糖的一種，和細(xì)胞表面有密切的相互作用，由于參與了關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑和膠狀結(jié)締組織的連接而被認(rèn)為是生物“膠”。HA在骨骼演變的生長(zhǎng)，發(fā)育和重建過(guò)程中發(fā)揮著多種功能，并且在很多重大的生物學(xué)過(guò)程中也有舉足輕重的作用，如細(xì)胞遷移，增殖，組織形成，傷口愈合，血管化和器官形成等。最近的報(bào)道認(rèn)為HA能作為配體被干細(xì)胞表面的受體CD44所識(shí)別，并通過(guò)與CD44的作用參與到細(xì)胞的黏附，增殖和分化以及受體介導(dǎo)的基因表達(dá)。綜上所述，由于HA無(wú)種屬及臟器特異性，在植入體內(nèi)時(shí)顯示出優(yōu)良的機(jī)體生物相容性，是一種理想的制備組織工程注射型凝膠支架的天然生物材料。但是天然的HA容易被肌體組織中的酶降解，良好的水溶性使其在組織中容易被擴(kuò)散，所以它在體內(nèi)存留時(shí)間很短。根據(jù)文獻(xiàn)HA在皮膚中的半衰期為I天，在眼睛中為1-1. 5小時(shí)，在軟骨中為1-3周，在玻璃液中的半衰期為70天。那么天然HA很難用作組織工程支架材料，因?yàn)槠鋵?duì)細(xì)胞所起的支撐作用時(shí)間太短，來(lái)不及匹配組織的形成。通常需要對(duì)HA進(jìn)行修飾和交聯(lián)以得到凝膠狀HA支架材料。單純HA凝膠的制備以及生產(chǎn)工藝已有較多報(bào)道，最為典型的是用于注射的美容除皺產(chǎn)品瑞藍(lán)(Restylane)。根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利(US Patent, 5827937), HA凝膠的制備采用1，4-丁二醇二縮水甘油醚(I,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)為交聯(lián)劑,分為兩步法，第一步通過(guò)濃度來(lái)控制交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行程度使得到活化的HA多糖溶液；第二步增加反應(yīng)物濃度使交聯(lián)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行以得到黏性膠狀物質(zhì)。根據(jù)這樣的兩步法制備的HA凝膠，對(duì)生產(chǎn)工藝和過(guò)程很難精確控制，從而容易導(dǎo)致交聯(lián)度和凝膠性能的不穩(wěn)定，而用于組織構(gòu)建時(shí)，支架材料性能的微小改變就會(huì)增加后續(xù)細(xì)胞行為的不可控性，影響組織形成，因此這樣的方法不適合用作組織工程支架材料的制備。因此本領(lǐng)域迫切需要提供一種簡(jiǎn)單易行、能夠精確控制透明質(zhì)酸交聯(lián)度和凝膠性能的組織工程凝膠支架材料的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種簡(jiǎn)單易行、能夠精確控制透明質(zhì)酸交聯(lián)度和凝膠性能的組織工程凝膠支架材料的制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種組織工程凝膠支架材料的制備方法，所述的方法包括步驟(I)將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4_ 丁二酸縮水甘油醚混合，得到混合溶液
I;和(2)將混合溶液I平鋪使厚度為2-10mm(較優(yōu)為2_8mm，最優(yōu)為3_7mm)、干燥，得到組織工程凝膠支架材料。上述制備方法中，以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4- 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度為2-10%。上述制備方法中，所述混合的時(shí)間為1-9小時(shí)。上述制備方法中，所述干燥時(shí)間1-6天。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供的一種組織工程凝膠支架材料的制備方法包括步驟(I)將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4_ 丁二酸縮水甘油醚混合1-9小時(shí)，得到混合溶液I ;以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4_ 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度為
2-10% ;和(2)將混合溶液I平鋪于培養(yǎng)皿、干燥1-6天，得到組織工程凝膠支架材料；其中混合時(shí)間優(yōu)選2-8小時(shí)，更優(yōu)選4-8小時(shí)；以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4- 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度優(yōu)選3-8% ;更優(yōu)選4-8%。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(3)將得到的組織工程凝膠支架材料和磷酸鹽緩沖液混合，溶脹后分別經(jīng)水和PBS溶液透析；所述的透析為至少I(mǎi)天。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種組織工程凝膠支架材料，它是使用如上所述的本發(fā)明提供的制備方法制備所得；所述的支架材料為片狀或顆粒狀；并且以所述支架材料的總重量計(jì)，其中游離的透明質(zhì)酸或其鹽的重量百分含量為1_25%，交聯(lián)的透明質(zhì)酸或其鹽的重量百分含量為75_99*%。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料的用途，用于制備組織工程移植物；較佳地所述的組織工程移植物包括軟骨移植物和結(jié)締組織移植物。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料的使用方法，所述的方法包括步驟(a)使如上所述的本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料成為粒徑為能濾過(guò)35目篩網(wǎng)(粒徑約為500 y m以下)的凝膠顆粒；(b)將步驟(a)得到的凝膠顆粒和含有游離透明質(zhì)酸的溶液混合，所述含有游離透明質(zhì)酸的溶液和步驟(a)得到的凝膠顆粒的體積比為I : 3至I : I;和(C)將含有種子細(xì)胞的細(xì)胞懸液和步驟(b)得到的混合物混合，得到細(xì)胞-支架復(fù)合物。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單易行、能夠精確控制透明質(zhì)酸交聯(lián)度和凝膠性能的組織工程凝膠支架材料的制備方法。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例2提供的組織工程凝膠支架材料的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2是本發(fā)明試驗(yàn)例中的第4. I部分提供的組織工程凝膠支架材料復(fù)合軟骨細(xì)胞 后豬皮下成軟骨大體照(A)和組織學(xué)切片圖(BX 10倍；CX20倍)。圖3顯示了游離HA和實(shí)施例2得到的HA凝膠支架以一定比例混合后和細(xì)胞混合形成的軟骨組織塊濕重情況。圖4顯示了游離HA和實(shí)施例2得到的HA凝膠支架以不同比例混合并結(jié)合細(xì)胞組所獲得的組織學(xué)切片圖；其中A為游離HA和凝膠HA以I : 2混合，Al (X 40倍)和A2 (X 100倍); B為游離HA和凝膠HA以2 : I混合，BI (X 40倍)和B2 (X 100倍);C為游離HA和凝膠HA以0 : 3混合，Cl (X 40倍)和C2 (X 100倍)。圖5顯示了本發(fā)明試驗(yàn)例中的第5部分提供的組織工程凝膠支架材料復(fù)合脂肪干細(xì)胞后形成的組織塊濕重情況。圖6顯示了本發(fā)明試驗(yàn)例中的第5部分提供的組織工程凝膠支架材料復(fù)合不同數(shù)量脂肪干細(xì)胞后形成的組織學(xué)顯微拼圖(X40倍)；其中A表示lX107cellS/ml ;B表示2X 107cells/ml ;C 表不 4X 107cells/ml。圖7A和圖7B分別顯示了實(shí)施例I所制備得到的凝膠顆粒的大體圖和光鏡下的顯微圖。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)在將透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和交聯(lián)劑混合時(shí)，如果控制好交聯(lián)劑的使用量以及混合時(shí)間，并且能夠?qū)⒒旌虾蟮娜芤哼M(jìn)行平鋪干燥形成膜狀物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)溶脹、透析和粉碎，便能簡(jiǎn)便地得到一種凝膠透明質(zhì)酸支架材料。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供了一種組織工程凝膠支架材料的制備方法，包括步驟第一步，將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4_ 丁二酸縮水甘油醚攪拌混合1-9小時(shí)，得到混合溶液I ;第二步，將混合溶液I平鋪于器皿，干燥1-6天，得到干燥的膜片；第三步，將膜片用磷酸鹽緩沖液溶脹后先后用水和PBS溶液分別透析至少I(mǎi)天，以除去未參加反應(yīng)的交聯(lián)劑1，4_ 丁二酸縮水甘油醚，得到組織工程凝膠支架材料。在上述第一步中，所述含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液是氫氧化物溶液，所述氫氧化物中的金屬離子同透明質(zhì)酸鹽的金屬離子是同一種金屬離子。上述第一步中含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4_ 丁二酸縮水甘油醚的混合時(shí)間較佳地為2-8小時(shí)，更佳地為4-8小時(shí)或5-8小時(shí)，最佳地為5-6小時(shí)。所述的混合在40°C進(jìn)行。上述第一步所得到的混合溶液1，以其總體積計(jì)，其中1，4_ 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度為2-10 %，較佳地為3-8 %，更佳地為4-8 %，最佳地是4-6 %。上述第二步中用于平鋪混合溶液I的器皿可以是本領(lǐng)域常規(guī)使用的器皿，只要其與混合溶液I的接觸面是平整、光滑的，且該接觸面的面積與混合溶液I的體積比是合適的，即可使混合溶液I鋪于該接觸面從而形成一厚度約為2-10mm (較佳地,厚度約為2-8_ ；更佳地，厚度約為3-7mm)的液膜，所述接觸面的材質(zhì)可以是玻璃、塑料、陶瓷、不銹鋼等。所述的器皿例如但不限于培養(yǎng)皿、燒杯等。
上述第二步中的干燥時(shí)間較佳地為2-5天，更佳地至少3天，最佳地為3-4天。上述第二步中得到的干燥的膜片是透明的，膜片的厚度約為2_10mm(較佳地，厚度約為2-8mm ;更佳地，厚度約為3_7mm)。上述第三步中的磷酸鹽緩沖液是pH為中性的PBS溶液，其中含有氯化鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉。上述第三步中用于透析的水選自純凈水、蒸餾水、或去離子水；用于透析的PBS溶液可以是用于溶脹膜片的PBS溶液；透析在室溫下進(jìn)行。本發(fā)明中提及的透明質(zhì)酸的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、和鈣鹽。如本文所用，“組織工程”和“組織工程學(xué)”可以互換使用，都是指在體外構(gòu)建一個(gè)有生物活性的種植體，植入體內(nèi)修復(fù)組織缺損，替代器官功能；或作為一種體外裝置，暫時(shí)替代器官功能，達(dá)到提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生命活動(dòng)的目的的上世紀(jì)80年代提出的一種新興科學(xué)。 如本文所用，“支架材料”和“組織工程學(xué)支架材料”或“組織工程支架材料”是同一概念，都是指用于支撐細(xì)胞成長(zhǎng)為一個(gè)完整的組織的框架材料。如本文所用，“凝膠”是指溶膠或溶液中的透明質(zhì)酸或其鹽的膠體粒子在一定條件下互相連接，形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體。如本文所用，“室溫”是指10_35°C，較佳地是15_30°C，更佳地是20_25°C。通過(guò)本發(fā)明提供的制備方法，可以獲得一種組織工程凝膠支架材料，本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料是可注射凝膠支架材料，在室溫下是細(xì)小的凝膠顆粒，可通過(guò)混合來(lái)負(fù)載活性細(xì)胞和治療藥物，通過(guò)注射可攜帶細(xì)胞到指定位置。本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料幾乎不殘留交聯(lián)劑1，4_ 丁二酸縮水甘油醚，其中交聯(lián)劑的殘余量小于原交聯(lián)劑總量的0.6%。本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料中游離透明質(zhì)酸或其鹽的含量為1-25%(以組織工程凝膠支架材料的總重量計(jì))，也就是說(shuō)，以本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料的總重量計(jì)，含有約75-99wt%的交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽和約l_25wt%的未交聯(lián)的透明質(zhì)酸或其鹽。本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料可以用于制備組織工程移植物，例如但不限于，組織工程化軟骨、脂肪或結(jié)締組織移植物。本發(fā)明提供的凝膠也可以作為基礎(chǔ)原料，進(jìn)一步制備膜片、纖維、膏狀、塊狀或粉末狀物質(zhì)等等。應(yīng)用領(lǐng)域包括可皮下或真皮內(nèi)注射的美容、除皺和保濕材料，日化原料或輔料，組織填充材料，藥物載體或藥物配料，皮膚膜輔料，組織工程用支架材料，關(guān)節(jié)癥治療用注射劑，防粘連和栓塞形成材料，或是代用玻璃體及眼科植入凝膠等?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法制備移植物，例如但不限于將種子細(xì)胞接種于本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料上，在適宜條件下回植體內(nèi)。細(xì)胞在本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料上的細(xì)胞濃度為IX 107-9X 107cells/ml ;優(yōu)選
I.5X 107-8X 107cells/ml ;更優(yōu)選 2X 107_7X 107cells/ml。本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料的方法，包括步驟(a)使本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料成為粒徑為能濾過(guò)35目篩網(wǎng)的，粒徑約為500 以下的凝膠顆粒； (b)將步驟(a)得到的凝膠顆粒和含有游離透明質(zhì)酸的溶液混合，所述含有游離透明質(zhì)酸的溶液和步驟(a)得到的凝膠顆粒的體積比為0 : 3至I : I;(c)將含有種子細(xì)胞的細(xì)胞懸液和步驟(b)得到的混合物混合，得到細(xì)胞-支架復(fù)合物。步驟(a)中使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法使本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料成為顆粒，例如但不限于，均質(zhì)機(jī)粉碎，擠壓等。步驟(b)中所述步驟(a)得到的凝膠顆粒的體積是指各個(gè)單個(gè)的顆粒形成的顆粒集合的體積。步驟(b)中含有游離透明質(zhì)酸的溶液中所述游離透明質(zhì)酸的濃度應(yīng)當(dāng)同步驟(a)中本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料復(fù)原為游離透明質(zhì)酸時(shí)，其中的透明質(zhì)酸的濃度一致。步驟(C)得到的復(fù)合物在適宜條件下回植體內(nèi)以得到組織工程化移植物。步驟(c)得到的復(fù)合物以其總體積計(jì)，其中的細(xì)胞有1-9X IO7細(xì)胞數(shù)/ml ;較佳地為 I. 5-8X IO7 細(xì)胞數(shù) /ml。本發(fā)明涉及的種子細(xì)胞包括成體細(xì)胞和干細(xì)胞，干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，例如但不限于，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于I、本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料制備方法簡(jiǎn)單易行，并且能精確控制HA交聯(lián)度和凝膠性能。2、本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料具有較長(zhǎng)的功效。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按
重量計(jì)。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。下述實(shí)施例中使用的原料有透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronic acid, HA,山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)；1，4_ 丁二醇縮水甘油醚(I, 4-butanediol diglycidyl ether,BDDE,美國(guó) sigma 公司)；氫氧化鈉，氯化鈉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制藥有限公司)。實(shí)施例I制備HA凝膠支架I
精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的1%氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20 ill BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為4 % )，將溶液置于40 °C使其攪拌均勻混合4小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。膜片用磷酸鹽緩沖液(PBS :氯化鈉(NaCl) 9mg/ml，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 03mg/ml，磷酸氫二鈉(Na2HPO4X2H20)0. 14mg/ml, pH = 7)溶脹后置于透析袋中先后在去離子水和PBS溶液中室溫下分別透析一天，以除去未參加反應(yīng)的交聯(lián)劑。得到的凝膠狀HA膜片再用PBS調(diào)成含20mg HA/ml溶液,最后用均質(zhì)機(jī)(T10 basic, IKA, Germany)打碎成凝膠顆粒,過(guò)35目篩網(wǎng)，得到粒徑約為500 pm以下凝膠顆粒(大體圖和光鏡下的顯微圖見(jiàn)A和圖7B)。透析完成后的材料置于4°C冰箱密封保存?zhèn)溆茫缬糜诩?xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)置于高壓蒸汽滅菌(120°C,20min)后使用。實(shí)施例2制備HA凝膠支架II精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20 u I BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為4% )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合5小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。后續(xù)處理和實(shí)施例I類(lèi)似，即用PBS溶脹后透析，均質(zhì)機(jī)粉碎，密封保存或滅菌后密封保存。實(shí)施例3制備HA凝膠支架III精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20 u I BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為4% )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合8小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。后續(xù)處理和實(shí)施例I類(lèi)似，即用PBS溶脹后透析，均質(zhì)機(jī)粉碎，密封保存或滅菌后密封保存。實(shí)施例4制備HA凝膠支架IV精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入30 u I BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為6 % )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合6小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。后續(xù)處理和實(shí)施例I類(lèi)似，即用PBS溶脹后透析，均質(zhì)機(jī)粉碎，密封保存或滅菌后密封保存。實(shí)施例5
制備HA凝膠支架V精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入40iU BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為8% )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合2小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。后續(xù)處理和實(shí)施例I類(lèi)似，即用PBS溶脹后透析，均質(zhì)機(jī)粉碎，密封保存或滅菌后密封保存。對(duì)比例I精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的1%氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入IOiU BDDE(交聯(lián)劑最終濃度為2% )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合6小時(shí)，然后把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。膜片用磷酸鹽緩沖液(PBS :氯化鈉(NaCl) 9mg/ml，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 03mg/ml，磷酸氫二鈉(Na2HPO4X 2H20)0. 14mg/ml, pH = 7)溶脹后置于透析袋中先后在去離子水和PBS溶液中室溫下分別透析一天，以除去未參加反應(yīng)的交聯(lián)劑。 結(jié)果只形成微量可忽略的凝膠。對(duì)比例2精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20 u I BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為4% )，將溶液置于40°C使其攪拌均勻混合5小時(shí)。加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS :氯化鈉(NaCl) 9mg/ml，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 03mg/ml，磷酸氫二鈉(Na2HPO4 X 2H20)0. 14mg/ml, pH = 7)溶脹后置于透析袋中先后在去離子水和PBS溶液中室溫下分別透析一天，以除去未參加反應(yīng)的交聯(lián)劑。結(jié)果沒(méi)有觀察到凝膠的形成。對(duì)比例3精確稱(chēng)取0. 5g HA，將其置于5ml的I %氫氧化鈉溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20 u I BDDE (交聯(lián)劑最終濃度為4% )，攪拌幾分鐘后，把溶液平鋪于培養(yǎng)皿，干燥3天，得到干燥的HA透明膜片。加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS :氯化鈉(NaCl)9mg/ml，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 03mg/ml，磷酸氫二鈉(Na2HPO4X2H20)0. 14mg/ml,pH = 7)溶脹后置于透析袋中先后在去離子水和PBS溶液中室溫下分別透析一天，以除去未參加反應(yīng)的交聯(lián)劑。對(duì)比例4瑞藍(lán)(Restylane),制法根據(jù)United States Patent (Patent Number5, 827, 937)試驗(yàn)例I. HA凝膠支架交聯(lián)度的測(cè)定將實(shí)施例1-5和對(duì)比例1-4得到的HA干燥膜片，分別置于燒杯，加入50ml去離子水，室溫浸泡12小時(shí)后，提取15ml浸提液并過(guò)濾得到(A)，再補(bǔ)充15ml新鮮去離子水加入上述混合物中；過(guò)12小時(shí)后再取浸提液15ml并過(guò)濾得到(B)，重復(fù)上述過(guò)程，得到(C)、
(D)、(E)和(F)。用咔唑顯色法測(cè)定溶液A、B、C、D、E和F中HA的含量，從而推算出HA干燥膜片中能游離出來(lái)的未交聯(lián)即游離HA量。如(F)中的HA含量還很高，再重復(fù)上述的浸泡過(guò)程，直至最后得到的過(guò)濾溶液(X)中未能用以下的咔唑法檢測(cè)出HA。咔唑顯色法測(cè)定HA含量的方法原理為透明質(zhì)酸鈉水解后，葡萄糖醛酸與咔唑試劑作用產(chǎn)生紅紫色，且顏色深淺與葡萄糖醛酸含量成正比。主要步驟如下1.取0. Ig咔唑，加無(wú)水乙醇IOOml溶解，移至深棕色瓶；2.稱(chēng)取IOmg葡萄糖醛酸(GA)于IOOml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得到GA標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)GA標(biāo)準(zhǔn)溶液配備GA系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；3.稱(chēng)取9. 54g的四硼酸鈉(Na2B4O7 IOH2O)，加入IL濃硫酸中，加蓋。不定時(shí)的振搖，直至四硼酸鈉完全溶解，得到0. 025mol/l的四硼酸鈉硫酸溶液；4.將HA樣品試管和步驟2中的各標(biāo)準(zhǔn)液試管一起置于冰水浴中，用酸式滴定管緩慢地向每管中加入0. 025mol/l的四硼酸鈉硫酸溶液5ml，邊加邊搖勻?；靹蚝笾糜诜兴≈兄蠓?0mi n取出，冷卻至室溫。向各試管內(nèi)加入咔唑乙醇溶液0. 2ml，充分搖勻，室溫放置2小時(shí)。用分光光度計(jì)測(cè)定550nm處各標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并查處樣品管內(nèi)的葡萄糖醛酸濃度，最后換算成HA的濃度。結(jié)果見(jiàn)表I。表I不同反應(yīng)條件對(duì)HA凝膠支架交聯(lián)度的影響
權(quán)利要求
1.一種組織工程凝膠支架材料的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟 (1)將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4_丁二酸縮水甘油醚混合，得到混合溶液I;和 (2)將混合溶液I平鋪使厚度為2-10_、干燥，得到組織工程凝膠支架材料。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4_丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度為2-10%。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述混合的時(shí)間為1-9小時(shí)。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述干燥時(shí)間1-6天。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟 (1)將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和I，4-丁二酸縮水甘油醚混合1-9小時(shí)，得到混合溶液I ;以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4_ 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度為2-10%;和 (2)將混合溶液I平鋪于培養(yǎng)皿、干燥1-6天，得到組織工程凝膠支架材料； 混合時(shí)間優(yōu)選2-8小時(shí)，更優(yōu)選4-8小時(shí)；以混合溶液I的總體積計(jì)，其中1，4_ 丁二酸縮水甘油醚的體積百分濃度優(yōu)選3-8% ;更優(yōu)選4-8%。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟 (3)將得到的組織工程凝膠支架材料和磷酸鹽緩沖液混合，溶脹后分別經(jīng)水和PBS溶液透析。
7.—種組織工程凝膠支架材料，其特征在于，使用如權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法制備得到。
8.如權(quán)利要求7所述的組織工程凝膠支架材料，其特征在于，所述的支架材料為片狀或顆粒狀；并且以所述支架材料的總重量計(jì)，其中游離的透明質(zhì)酸或其鹽的重量百分含量為1_25%，交聯(lián)的透明質(zhì)酸或其鹽的重量百分含量為75-99%。
9.一種如權(quán)利要求7或8任一所述的組織工程凝膠支架材料的用途，用于制備組織工程移植物。
10.一種如權(quán)利要求7或8任一所述的組織工程凝膠支架材料的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步驟 (a)使如權(quán)利要求7或8任一所述的組織工程凝膠支架材料成為粒徑為能濾過(guò)35目篩網(wǎng)的凝膠顆粒； (b)將步驟(a)得到的凝膠顆粒和含有游離透明質(zhì)酸的溶液混合，所述含有游離透明質(zhì)酸的溶液和步驟(a)得到的凝膠顆粒的體積比為I : 3至I : I;和 (C)將含有種子細(xì)胞的細(xì)胞懸液和步驟(b)得到的混合物混合，得到細(xì)胞-支架復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種組織工程凝膠支架材料及其制備方法和用途。本發(fā)明提供的組織工程凝膠支架材料是通過(guò)下述步驟制備得到(1)將含有透明質(zhì)酸或其鹽的溶液和1，4-丁二酸縮水甘油醚混合，得到混合溶液1；和(2)將混合溶液1平鋪、干燥，得到組織工程凝膠支架材料。本發(fā)明還公開(kāi)了制備得到的組織工程凝膠支架材料的用途。
文檔編號(hào)C08L5/08GK102805880SQ20111014401
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者岑蓮, 曹誼林, 尹爍, 劉廣鵬 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司