專利名稱：鴨疫里默氏菌脂質(zhì)a的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏菌病(TPiewereWa anatipestifer infection)是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。該病是目前危害世界各國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一， 已在所有的集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國(guó)家發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)已呈漫延之勢(shì)，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，主要由3部分組成，由外向內(nèi)依次為0-特異性多糖、核心多糖和脂質(zhì)A。0-特異性多糖又稱為0抗原，由低聚糖組成的重復(fù)單位，重復(fù)單位及鏈的長(zhǎng)度取決于細(xì)菌的種類， 不同細(xì)菌0抗原單糖種類、位置、排列順序和空間結(jié)構(gòu)各不相同，形成種的特異性抗原，是血清學(xué)分類的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。0-抗原的差異使之在免疫學(xué)和臨床診斷中具有重要意義。核心多糖與0抗原多糖側(cè)鏈相連接，由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸(KDO)等組成，所有革蘭氏陰性細(xì)菌都有相似結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)A是脂多糖的主要毒性組分，對(duì)脂多糖的生物學(xué)功能起到了至關(guān)重要的作用。但是，目前還沒有一種有效的方法，能提取高純度的脂質(zhì)A。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，該方法獲得率高，操作簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明的技術(shù)方案為
1、鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，具體包括以下步驟
A將鴨疫里默氏菌脂多糖溶解于Wi值為4. 2^4. 6的SDS的乙酸溶液中，并充分溶解，得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液；
B將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至默氏菌脂多糖的化學(xué)鍵斷裂， 得含有脂質(zhì)A的溶液，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌所述含有脂質(zhì)A的溶液以去除SDS， 得酸化乙醇的混合溶液；
C將步驟B所得酸化乙醇的混合溶液在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘取沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為909Γ95%的乙醇溶液洗滌樣品，在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘；
D將步驟C重復(fù)不少于2次后，進(jìn)行干燥，得白色絨毛狀物質(zhì)，所述白色絨毛狀物質(zhì)為鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A。2、根據(jù)1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為將鴨疫里默氏菌充分裂解菌體，用熱酚水提取法提取脂多糖，得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖粗品。3.根據(jù)2所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為將脂多糖粗品用DNA酶和RNA酶處理，再加入蛋白酶K處理，得脂多糖，所述脂多糖為酶處理脂多糖粗品。4.根據(jù)3所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，將所述酶處理脂多糖粗品溶解于蒸餾水中，在不低于8000g條件下離心不低于15min，取上層水相在0°C、°C且不低于 105000g速度下離心不少于4小時(shí)，得沉淀，用去離子水溶解沉淀并干燥，得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖純品。5.根據(jù)1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，步驟A中SDS的乙酸溶液中， 所述SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1(Γ14%，所述乙酸的濃度為l(Tl5mm0l/L，所述鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液中鴨疫里默氏菌脂多糖與SDS的乙酸溶液的用量配比為Img =100^150 μ L06、根據(jù)1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至100°C，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌去除SDS，得酸化乙醇的混合溶液。7.根據(jù)1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，步驟B中所述酸化的乙醇洗滌為4mol/L的HCl和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇以體積比為1:4的比例混合而得的混合液。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明建立的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A提取方法操作簡(jiǎn)單， 所得鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A經(jīng)鑒定純度高，為其結(jié)構(gòu)的解析及進(jìn)一步闡述其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為藥物及疫苗研發(fā)提供依據(jù)。更多有益效果，將在實(shí)施例中體現(xiàn)。


圖1為鴨疫里默氏菌脂多糖SDS-PAGE銀染圖；泳道1為大腸桿菌055:B5脂多糖， 泳道2為鴨疫里默氏菌ATCCl 1845脂多糖
圖2為鴨疫里默氏菌ATCCl 1845脂質(zhì)A紅外光譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鴨疫里默氏菌ATCC11845脂多糖的制備一材料
1菌株及標(biāo)準(zhǔn)品
鴨疫里默氏菌模式菌株ATCC11845，購自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。大腸桿菌055 :B5脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司 2儀器設(shè)備
超速離心機(jī)(Beckman公司，型號(hào)LE-80K)
傅立葉變換近紅外光譜儀(Perkin Elmer公司，型號(hào)Vector 22/N) 3 試劑
DNA酶、RNA酶，蛋白酶K購自購自寶生物工程有限公司，Tris堿、丙烯酰胺、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS、過硫酸銨、TEMED、2-巰基乙醇購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，苯酚、乙醇、乙酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。
4 主要溶液配制
權(quán)利要求
1.鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，具體包括以下步驟A將鴨疫里默氏菌脂多糖溶解于Wi值為4. 2^4. 6的SDS的乙酸溶液中，并充分溶解，得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液；B將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至默氏菌脂多糖的化學(xué)鍵斷裂， 得含有脂質(zhì)A的溶液，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌所述含有脂質(zhì)A的溶液以去除SDS， 得酸化乙醇的混合溶液；C將步驟B所得酸化乙醇的混合溶液在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘取沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為909Γ95%的乙醇溶液洗滌樣品，在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘；D將步驟C重復(fù)不少于2次后，進(jìn)行干燥，得白色絨毛狀物質(zhì)，所述白色絨毛狀物質(zhì)為鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為將鴨疫里默氏菌充分裂解菌體，用熱酚水提取法提取脂多糖，得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖粗品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為將脂多糖粗品用DNA酶和RNA酶處理，再加入蛋白酶 K處理，得脂多糖，所述脂多糖為酶處理脂多糖粗品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，將所述酶處理脂多糖粗品溶解于蒸餾水中，在不低于SOOOg條件下離心不低于15min，取上層水相在 O0C、°C且不低于105000g速度下離心不少于4小時(shí)，得沉淀，用去離子水溶解沉淀并干燥， 得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，步驟A中SDS 的乙酸溶液中，所述SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1(Γ14%，所述乙酸的濃度為l(Tl5mm0l/L，所述鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液中鴨疫里默氏菌脂多糖與SDS的乙酸溶液的用量配比為Img 100^150 μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至100°C，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌去除SDS， 得酸化乙醇的混合溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，其特征在于，步驟B中所述酸化的乙醇洗滌為4mol/L的HCl和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇以體積比為1:4的比例混合而得的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A的提取方法，具體為將鴨疫里默氏菌脂多糖溶解于pH值為4.2~4.6的SDS的乙酸溶液中，并充分溶解，得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液，將其加熱至100℃，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌去除SDS，在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘取沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為90~95%的乙醇溶液洗滌樣品，在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘；重復(fù)不少于2次后，進(jìn)行干燥，得鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A；本發(fā)明建立的鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A提取方法操作簡(jiǎn)單，所得鴨疫里默氏菌脂質(zhì)A經(jīng)鑒定純度高，為藥物及疫苗研發(fā)提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102276748SQ201110217849
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者何明洪, 朱德康, 汪銘書, 程安春, 賈仁勇, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)