專利名稱：一種手性天冬氨酸拆分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子表面印跡技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種手性拆分氨基酸對(duì)映體的印跡材料制備技術(shù)及其用于天冬氨酸外消旋體的分離工藝。
背景技術(shù)：
構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶、抗體、激素、核苷酸、多糖等，幾乎都毫無例外地具有手性，手性識(shí)別是生命過程的基本屬性之一。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單元，且存在于生命體內(nèi)的游離態(tài)氨基酸，在有機(jī)體的代謝與機(jī)能調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著很重要的作用。 在生命體內(nèi)高度不對(duì)稱的環(huán)境中，氨基酸兩種對(duì)映體的生理作用是迥然不同的。具有生物活性的天然氨基酸均為L(zhǎng)-型，而化學(xué)合成制備的氨基酸則一般為DL-型的外消旋體。顯然， 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，氨基酸對(duì)映體的拆分具有十分重要的科學(xué)意義；另一方面，氨基酸在藥物合成(手性藥物前驅(qū)體的合成)、食品與飼料工業(yè)、日用化工品等領(lǐng)域中應(yīng)用正在快速發(fā)展，對(duì)化學(xué)合成的氨基酸進(jìn)行手性拆分，制備光學(xué)純的氨基酸又具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，氨基酸對(duì)映體分離雖然已有一些方法，比如結(jié)晶法(經(jīng)典法)、酶法、化學(xué)拆分法、膜分離法以及色譜法(包括氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE) 法及手性配基交換色譜(CLCE))等法。但前面幾種非色譜方法，有的適用范圍窄；有的步驟繁多、處理效率低；有的則成本高，放大過程成本昂貴；而各種色譜法，雖然分離效率高及選擇性好(尤其是CLCE法)，但都局限于分析化學(xué)領(lǐng)域(以分離分析為目標(biāo))，難以達(dá)到工業(yè)化規(guī)模的拆分過程。因此，在氨基酸對(duì)映體的拆分方面，盡管人們做了大量的努力，但是在實(shí)現(xiàn)低成本、高效的規(guī)模化分離等方面依然存在著很大困難。因此，設(shè)計(jì)與發(fā)展識(shí)別選擇性高、效率高、成本低的新型拆分方法，是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的科技難題。如果能制備選擇性地結(jié)合氨基酸的某一對(duì)映體的固體吸附劑，即可通過固相萃取，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；陌被釋?duì)映體的高效拆分，但迄今為止，具有此性能的固體吸附劑是難以尋找的。分子印跡聚合物(MIPs)是被精心裁制的一類功能聚合物材料，其內(nèi)部分布有大量模板分子的印跡空穴，這些空穴與模板分子在尺寸大小、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點(diǎn)等方面高度地相匹配，使得分子印跡聚合物對(duì)模板分子具有特異的識(shí)別選擇性與優(yōu)良的結(jié)合親和性， 被人們稱為人工抗體或人工接受器。目前，分子印跡聚合物已被廣泛地用于各種高科技領(lǐng)域，尤其在物質(zhì)的分離、純化與富集濃縮領(lǐng)域，以分子印跡聚合物為固體吸附劑的分子印跡固相萃取法(MISPE)應(yīng)運(yùn)而生，得到了廣泛的應(yīng)用。在手性氨基酸的拆分領(lǐng)域，雖然分子印跡聚合物也受到了很大關(guān)注，已有較多研究，但在這方面存在兩個(gè)明顯的局限制備印跡聚合物的方法大多為傳統(tǒng)方法(包埋法)，該方法具有若干明顯的缺點(diǎn)，所制得的印跡聚合物的性能較差；目前印跡聚合物大多只用作為色譜固定相，用來研究氨基酸對(duì)映體的(分離) 分析，其性能還遠(yuǎn)達(dá)不到固相萃取劑的水平，無法用于氨基酸對(duì)映體的規(guī)?；滔噍腿?。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有天冬氨酸手性拆分技術(shù)的不足，本發(fā)明擬解決的技術(shù)問題是提供一一種手性天冬氨酸拆分方法；本發(fā)明方法如下1.制備接枝微粒P4VP/Si& ；2.對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&的制備稱取0. Ig的接枝微粒P4VP/Si02，置于濃度為0. lOg/L^-O. 2(^/171的L-Asp水溶液中，P4VP/Si02*所接枝的單體4-乙烯基吡啶GVP)與L-Asp的摩爾比為1 0.8-2 ；用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值為3. 5-6 ；混合液置于恒溫振蕩器中，28-33°C恒溫振蕩2_4h， 濾出微粒，真空干燥；將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. IOgAZ1-O. 20g/ L^L-Asp的水和乙醇混合溶劑，水和乙醇的體積比為1 0. 5-2，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為 3. 5-6，加入交聯(lián)劑1，6_ 二溴己烷，1,6- 二溴己烷與P4VP/Si&中所接枝的單體4-乙烯基吡啶的摩爾比為1 2-4 ；30-45°C下攪拌反應(yīng)6h ；NaOH溶液洗滌1次以上，除去L_Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。所述1，6_ 二溴己烷與P4VP/Si&中4VP的摩爾比為1 3-4本發(fā)明方法2中pH值優(yōu)選3. 5-5 ；pH值優(yōu)選4。水和乙醇的體積比為1:1;本發(fā)明中方法2中所述氫氧化鈉溶液濃度為0. 1-lmol/L ；3. L-Asp 分子表面印跡材料 MIP-P4VP/Si02 分離 L-Asp L-Asp印跡材料MIP_P4VP/Si&填充裝柱后，用D和L型天冬氨酸混合溶液流經(jīng)柱子，并使L-Asp吸附在柱子上，待檢測(cè)L-Asp印跡材料MIP-P4VP/Si&飽和吸附L-Asp后， 用濃度為0. 08mol/L-0. 2mol/L的氫氧化鈉解吸。本發(fā)明方法1中所述制備接枝微粒P4VP/Si&是在硅膠微粒表面接枝聚合功能單體4-乙烯基吡啶，過程如下采用5 %的鹽酸溶液對(duì)硅膠進(jìn)行活化處理；以乙醇與水的混合液為溶劑，使活化硅膠與偶聯(lián)基甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)于50°C下反應(yīng)Mh，制得表面改性的硅膠微粒(MPS-SiO2)；在裝有電動(dòng)攪拌器、回流冷凝管及溫度計(jì)的四口燒瓶中加入160ml的無水乙醇、MPS-SiO2 (8g)和40ml的4-乙烯基吡啶，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將混合物升溫至70°C，加入引發(fā)劑AIBN(AIBN是4-乙烯基吡啶質(zhì)量的1. 2% )，恒溫?cái)嚢柘逻M(jìn)行接枝聚合反應(yīng)，7小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物微粒在索氏抽提器中用無水乙醇抽提Mh，以除去物理吸附的聚合物，真空干燥后即得接枝微粒P4VP/Si02。本發(fā)明中采用熱失重法測(cè)定P4VP/Si&中4-乙烯基吡啶的含量。有益效果本發(fā)明中采用水和乙醇的合適比例，使交聯(lián)劑1，6_ 二溴己烷良好地和混合溶劑相溶，便于其與接枝微粒P4VP/SiA上的吡啶氮發(fā)生季氨化反應(yīng)；控制1，6_ 二溴己烷與 P4VP/Si02中4VP的摩爾比為1 2-4可以改變所制備的分子印跡材料MIP-P4VP/Si&中特征空穴的數(shù)量及其空間結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)L-Asp的良好吸附和識(shí)別能力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，分子印跡材料MIP_P4VP/Si&對(duì)模板分子L-Asp具有良好的識(shí)別選擇性與結(jié)合親和性，相對(duì)于D-Asp，識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 31-3. 85，(識(shí)別選擇性系數(shù)為分子印跡材料所吸附的L-Asp與D-Asp的比值)；對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。對(duì)所制備的分子印跡材料進(jìn)行重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明該分離載體具有良好的重復(fù)使用能力，經(jīng)15次重復(fù)使用其吸附能力及選擇性改變不到10%。本發(fā)明天冬氨酸手性拆分方法具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、不需要特殊設(shè)備、工業(yè)化實(shí)施容易、對(duì)環(huán)境影響較小等特
點(diǎn)ο


圖1為接枝微粒P4VP/Si&結(jié)構(gòu)示意圖；圖 2MIP_P4VP/Si& 結(jié)構(gòu)示意具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1 結(jié)合圖1和圖2說明；(1)制備接枝微粒P4VP/Si& 采用5%的鹽酸溶液對(duì)硅膠進(jìn)行活化處理；以乙醇與水的混合液為溶劑，使活化硅膠與偶聯(lián)基甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷 (MPS)于30°C下反應(yīng)20h，將可聚合雙鍵引入到硅膠微粒表面，制得表面改性的硅膠微粒 (MPS-SiO2)；在裝有電動(dòng)攪拌器、回流冷凝管及溫度計(jì)的四口燒瓶中加入120ml的無水乙醇、MPS-SiO2(6g)和20ml的4-乙烯基吡啶，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將混合物升溫至70°C，加入引發(fā)劑AIBN (AIBN是4-乙烯基吡啶質(zhì)量的0. 8% )，恒溫并在攪拌下進(jìn)行接枝聚合反應(yīng)，5小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物微粒在索氏抽提器中用無水乙醇抽提Mh，以除去物理吸附的聚合物，真空干燥后即得接枝微粒P4VP/Si02。(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&的制備稱取0. 06g的接枝微粒P4VP/Si02，置于濃度為0. lOg/L—1的L-Asp水溶液中，用0. 10mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值，使pH = 3. 5 ；，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)與L-Asp的摩爾比為 1:1;將混合液置于恒溫振蕩器中，恒溫30°C振蕩2h，使接枝的P4VP充分溶脹，且使接枝微粒對(duì)L-Asp的吸附達(dá)到飽和，濾出微粒，真空干燥.將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. lOg/L^L-Asp的水和乙醇混合溶劑(V V = 1 2)中，用0. 10mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 3. 5，加入交聯(lián)劑1，6- 二溴己烷，1,6- 二溴己烷與 P4VP/Si02中4VP的摩爾比為1 3 ；在30°C下攪拌反應(yīng)Mi.反應(yīng)結(jié)束后，用0. 10mol/L的氫氧化鈉溶液反復(fù)洗滌，除去模板分子L-Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脫方法如下將已飽和吸附L-Asp的印跡材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充裝柱，在室溫條件下，用濃度為0. 08mol/L的氫氧化鈉作為洗脫液，以4BV · 的流速逆流通過填充柱，進(jìn)行解吸，以2BV的間隔收集洗出液，測(cè)定洗出液中L-Asp的濃度，相對(duì)于D-Asp， L-Asp識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 31，對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。BV為有效柱體積。實(shí)施例2 (1)制備接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&的制備稱取接枝微粒P4VP/SiO2,置于濃度為0. Ug/L—1的L-Asp水溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 4,P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶GVP)與L-Asp的摩爾比為1 2 ；將混合液置于恒溫振蕩器中，31°C振蕩池，使接枝的P4VP充分溶脹，且使接枝微粒對(duì)L-Asp的吸附達(dá)到飽和，濾出微粒，真空干燥.將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. UgAZ1L-Asp的水和乙醇混合溶劑(V V = 1 1)中，NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 4，加入交聯(lián)劑1，6_ 二溴己烷，1，6_ 二溴己烷與P4VP/Si02*4VP的摩爾比為1 4 ；在下攪拌反應(yīng)7h.反應(yīng)結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液反復(fù)洗滌，除去模板分子L-Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得 L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脫方法如下將已飽和吸附L-Asp的印跡材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充裝柱，在室溫條件下，用濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉和作為洗脫液，以4BV 的流速逆流通過填充柱，進(jìn)行解吸，以2BV的間隔收集洗出液，測(cè)定洗出液中L-Asp的濃度，相對(duì)于D-Asp， 識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 85，對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。實(shí)施例3 (1)制備接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&的制備稱取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于濃度為0. Ug/L—1的L-Asp水溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 4. 5，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)與L-Asp的摩爾比為1 0. 8。將混合液置于恒溫振蕩器中，振蕩3. 5h，使接枝的P4VP充分溶脹，且使接枝微粒對(duì)L-Asp的吸附達(dá)到飽和，濾出微粒，真空干燥.將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. UgA^1L-Asp的水和乙醇混合溶劑(V V= 1 1)中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的PH值，使pH = 4. 5，加入交聯(lián)劑1，6- 二溴己烷，在40°C下攪拌反應(yīng)訃，1，6- 二溴己烷與P4VP/Si02*4VP的摩爾比為1 2;反應(yīng)結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液洗滌2次，除去模板分子L-Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脫方法如下將已飽和吸附L-Asp的印跡材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充裝柱，在室溫條件下，用濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉和作為洗脫液，以4BV 的流速逆流通過填充柱，進(jìn)行解吸，以2BV的間隔收集洗出液，測(cè)定洗出液中L-Asp的濃度，相對(duì)于D-Asp， 識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 51，對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。實(shí)施例4:(1)制備接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP_P4VP/Si&的制備稱取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于濃度為0. Hg/L—1的L-Asp水溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 5，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)與L-Asp的摩爾比為1 0. 8。將混合液置于恒溫振蕩器中，30°C振蕩3. 5h，使接枝的P4VP充分溶脹，且使接枝微粒對(duì)L-Asp的吸附達(dá)到飽和， 濾出微粒，真空干燥.將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. HgAZ1L-Asp的水和乙醇混合溶劑(V V = 1 1)中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH= 5，加入交聯(lián)劑1，6_ 二溴己烷，1，6-二溴己烷與P4VP/Si02中4VP的摩爾比為1 3. 3;在45°C下攪拌反應(yīng)7h.反應(yīng)結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液反復(fù)洗滌，除去模板分子L-Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脫方法如下將已飽和吸附L-Asp的印跡材料MIP-P4VP/Si&(1. 2g)填充裝柱，在室溫條件下，用濃度為0. 12mol/L的氫氧化鈉和作為洗脫液，以4BV · h—1的流速逆流通過填充柱，進(jìn)行解吸，以3BV的間隔收集洗出液，測(cè)定洗出液中L-Asp的濃度，相對(duì)于 D-Asp，識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 41，對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。實(shí)施例5 (1)制備接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP_P4VP/Si&的制備稱取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于濃度為0. leg/L—1的L-Asp水溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 6，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)與L-Asp的摩爾比為1 0. 8。將混合液置于恒溫振蕩器中，33°C振蕩4h，使接枝的P4VP充分溶脹，且使接枝微粒對(duì)L-Asp的吸附達(dá)到飽和，濾出微粒，真空干燥.將1. Og飽和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. lBg/L^L-Asp的水和乙醇混合溶劑(V V = 1 1)中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值，使pH = 6，加入交聯(lián)劑 1，6_ 二溴己烷，1，6-二溴己烷與P4VP/Si02中4VP的摩爾比為1 3. 2 ；在下攪拌反應(yīng)7h.反應(yīng)結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液反復(fù)洗滌，除去模板分子L-Asp，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脫方法如下將已飽和吸附L-Asp的印跡材料MIP-P4VP/Si&(1. 2g)填充裝柱，在室溫條件下，用濃度為0. 12mol/L的氫氧化鈉和作為洗脫液，以4BV · h—1的流速逆流通過填充柱，進(jìn)行解吸，以3BV的間隔收集洗出液，測(cè)定洗出液中L-Asp的濃度，相對(duì)于 D-Asp，識(shí)別選擇性系數(shù)為3. 35，對(duì)天冬氨酸的外消旋體具有良好的拆分性能。
權(quán)利要求
1.一種手性天冬氨酸拆分方法，包括如下步驟(1)制備接枝微粒P4VP/Si02；(2)對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&的制備稱取接枝微粒P4VP/Si02，置于濃度為0. lOg/L^-O.的L-Asp水溶液中，P4VP/SiO2中所接枝的單體4-乙烯基吡啶與L-Asp的摩爾比為1 0. 8-2 ；調(diào)節(jié)pH值為3. 5-6 ；混合液置于恒溫振蕩器中，28-33°C恒溫振蕩2-4h，濾出微粒，真空干燥；將飽和吸附了 L-Asp 的接枝微粒置于含有0. lOg/L^-O. 20g/L-1L-Asp的水和乙醇混合溶劑，水和乙醇的體積比為1 0. 5-2，調(diào)節(jié)pH值為3. 5-6，加入交聯(lián)劑1，6_ 二溴己烷，1，6_ 二溴己烷與P4VP/Si02 中所接枝的單體4-乙烯基吡啶的摩爾比為1 2-4;30-45°C下攪拌反應(yīng)Mi;NaOH溶液洗滌1次以上，再用蒸餾水洗滌，真空干燥，即得L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si& ；(3)L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/Si&分離L-Asp L-Asp印跡材料MIP-P4VP/Si&填充裝柱后，用D和L型天冬氨酸混合溶液流經(jīng)柱子， L-Asp印跡材料MIP-P4VP/Sih飽和吸附L-Asp后，用濃度為0. 08mol/L-0. 2mol/L的氫氧化鈉解吸。
2.如權(quán)利要求1所述的一種手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步驟O)中水和乙醇的體積比為1 1。
3.如權(quán)利要求1所述的一種手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步驟O)中1， 6- 二溴己烷與P4VP/Si&中4VP的摩爾比為1 3-4。
4.如權(quán)利要求1所述的一種手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步驟(2)中pH值為 3. 5-5。
5.如權(quán)利要求1所述的一種手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步驟(2)中pH值為4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種手性天冬氨酸拆分方法，本發(fā)明屬于分子表面印跡技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明方法如下1.制備接枝微粒P4VP/SiO2；2.對(duì)映體L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/SiO2的制備；3.L-Asp分子表面印跡材料MIP-P4VP/SiO2分離L-Asp使L-Asp吸附在柱子上，待檢測(cè)L-Asp印跡材料MIP-P4VP/SiO2飽和吸附L-Asp后，用濃度為0.08mol/L-0.2mol/L的氫氧化鈉解吸。MIP-P4VP/SiO2對(duì)模板分子L-Asp具有良好的拆分性能。本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、不需要特殊設(shè)備、工業(yè)化實(shí)施容易、對(duì)環(huán)境影響較小等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C08F292/00GK102358719SQ20111026099
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者胡志勇, 郭建峰, 高保嬌 申請(qǐng)人:中北大學(xué)