專利名稱：一種透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺共聚物、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚合載體材料，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺的共聚物、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究，為基因治療帶來(lái)新的契機(jī)，它正以飛快地速度發(fā)展成為基因治療主要手段。由21-23個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的雙鏈小干擾核糖核酸(small interference RNA, siRNA) [1’2]，可在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中特異性降解與其堿基對(duì)互補(bǔ)的信使RNA(mRNA)，從而阻斷mRNA編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因沉默[3’4]，即RNA干擾。但是，siRNA在機(jī)體內(nèi)會(huì)被快速酶解，而且細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取量很少，所以體內(nèi)siRNA 的基因沉默效率很低[5_7]。為了解決這些問(wèn)題，人們探究了許多種能以靜電形式與siRNA結(jié)合形成縮聚毫微粒的陽(yáng)離子高分子材料，在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)傳遞的同時(shí)也增加了酶攻擊的穩(wěn)定性[8’弋陽(yáng)離子高分子材料中的聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)被廣泛用于凝聚 DNA質(zhì)粒、siRNA和反義鏈脫氧核苷酸(ODN) [1°_12]。帶有正電荷PEI與siRNA形成了帶有正電荷的復(fù)合物體，經(jīng)內(nèi)吞等方式進(jìn)入細(xì)胞后先形成內(nèi)涵體，通過(guò)PEI質(zhì)子海綿吸附作用 (proton sponge effect)，導(dǎo)致復(fù)合物從內(nèi)涵體逃逸后直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向基因沉默。但是該過(guò)程中，由于正電荷表面特征siRNA/PEI復(fù)合物能引起補(bǔ)體活化[13]、血細(xì)胞凝固[14]以及血清蛋白的自我聚集[15]。此外，PEI固有的細(xì)胞毒性限制了它在活體基因治療中的應(yīng)用[16]。為了緩解這些問(wèn)題，常采用各種多聚陰離子在不破裂siRNA/PEI復(fù)合物結(jié)構(gòu)的同時(shí)將其外包[15’16]，增加siRNA/PEI復(fù)合物轉(zhuǎn)移率。我們選擇了具有無(wú)毒無(wú)免疫原性、靶向細(xì)胞表面 CD44 (Cluster determinant 44) [10]> LYVE-I (lymphatic vessel endothelial hyaluronan rec印tor_l)[17]受體的透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA)作為 PEI 聚合物的軛合物能夠減少PEI對(duì)細(xì)胞毒性、增加血清穩(wěn)定性以及通過(guò)HA受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用維持內(nèi)涵體脫離的能力，促進(jìn)siRNA/PEI-HA復(fù)合物被細(xì)胞攝取，進(jìn)而提高對(duì)靶向基因沉默效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA)鍵合聚乙烯亞胺 (Polyethyleneimine, PEI)的聚合載體材料、制備方法及其應(yīng)用，該聚合載體材料以HA作為骨架，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-(3-dimethylamin0pr0pyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC 'HCl]作為交聯(lián)劑，嫁接到 PEI 上，形成HA-PEI
聚合載體材料，所述HA-PEI化合物的制備過(guò)程用結(jié)構(gòu)式表示如下
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺的聚合載體材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.將濃度為0.5 ％ig/mL的透明質(zhì)酸溶液溶解于同體積的聚乙烯亞胺溶液中，用HCl 調(diào)PH值到6. 5，其中，所述聚乙烯亞胺溶液濃度是透明質(zhì)酸溶液濃度的20倍；b.向體積百分比為50%的二甲基亞砜溶液中按Iml 68. 9mg的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-苯并-三氮唑的混合物，所述混合物中1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與1-羥基-苯并-三氮唑的質(zhì)量比為 40. 4 28. 5 ；c.將步驟b所得溶液按1 20的體積比加入到步驟a所得溶液中，在常溫下攪拌混合 24小時(shí)之后，用NaOH調(diào)pH到7. 0 ；d.將步驟c所得溶液經(jīng)過(guò)分離純化和濃縮后制得聚合載體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的透明質(zhì)酸的平均分子量為200 道爾頓 300萬(wàn)道爾頓，所述的聚乙烯亞胺的平均分子量為200道爾頓 25，000道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述的透明質(zhì)酸的平均分子量為132，300道爾頓，所述的聚乙烯亞胺的平均分子量為25，000道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟d所述的分離純化方法為在 IOOmmol/L NaCl溶液中透析2天，在25wt%的乙醇中透析1天，純化水中透析1天；步驟d 所述的濃縮方法為冷凍干燥法。
5.如權(quán)利要求1或4所述的制備方法制備的透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺的共聚物載體材料。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺的共聚物載體材料作為基因載體、制備生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的共聚物載體材料作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于共聚物載體材料與能在真核細(xì)胞內(nèi)沉默血管生成因子的基因、癌基因和報(bào)告基因的siRNA形成復(fù)合物，并轉(zhuǎn)染動(dòng)物來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及癌細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的共聚物載體材料作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于共聚物載體材料與siRNA形成的復(fù)合物的平均粒徑小于lOOnm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的共聚物載體材料作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于共聚物載體材料與siRNA形成的復(fù)合物的平均粒徑為20nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的共聚物載體材料在制備醫(yī)藥中的應(yīng)用，其特征在于共聚物載體材料與siRNA形成復(fù)合物，通過(guò)局部給藥、口腔吸附給藥的途徑，應(yīng)用于腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸鍵合聚乙烯亞胺的聚合載體材料、制備方法及其應(yīng)用，該聚合載體材料以透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)作為骨架，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)作為交聯(lián)劑，嫁接到聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)上，形成的HA-PEI聚合載體材料，本聚合載體材料能夠提高基因/陰離子蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的靶向性，降低對(duì)細(xì)胞的毒性、以及提高靶向基因的轉(zhuǎn)化效率，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/08GK102408498SQ201110276350
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者馮曉娜, 王慧國(guó), 董爽, 蔣革 申請(qǐng)人:大連大學(xué)