專利名稱：糖鏈衍生物的制造方法、結(jié)構(gòu)解析方法、以及糖鏈衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自糖鏈的混合物的糖鏈衍生物的制造方法、以及糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法。進(jìn)一步，涉及根據(jù)本發(fā)明的糖鏈衍生物的制造方法制造的新的糖鏈衍生物。
背景技術(shù)：
糖蛋白質(zhì)中的糖鏈認(rèn)為具有保持蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)、獲得防止被蛋白酶的分解的抵抗性等作用。最近，逐漸地闡明了糖蛋白質(zhì)中的糖鏈參與受精和分化、信號(hào)傳導(dǎo)、癌化、蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)輸送和生理活性的調(diào)節(jié)等的生命現(xiàn)象。另外，還闡明了細(xì)胞表面的粘接分子和糖蛋白質(zhì)性激素等的糖鏈與其功能的關(guān)系，總結(jié)了糖質(zhì)科學(xué)公會(huì)(consortium)構(gòu)想?，F(xiàn)在，糖鏈功能研究的中心研究以影響其的生合成糖轉(zhuǎn)移酶(糖鏈基因)為中心，如果考慮糖轉(zhuǎn)移酶還根據(jù)基因組情報(bào)被保存，利用與其他蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)作業(yè)，參與生命功能，還需要利用捕捉細(xì)胞、組織中表達(dá)的糖鏈的整體圖像進(jìn)行解析的結(jié)構(gòu)糖組學(xué)(glyconomics)手法， 進(jìn)行糖鏈的功能解析。糖鏈科學(xué)中的結(jié)構(gòu)糖組學(xué)的作用是綜合地解析在多數(shù)生命現(xiàn)象中擔(dān)負(fù)重要作用的糖鏈識(shí)別機(jī)理，對(duì)功能糖組學(xué)是不可缺少的要素。作為結(jié)構(gòu)糖組學(xué)所要求的技術(shù)的要素， 有高綜合性、高生產(chǎn)量、高感度以及高精度。現(xiàn)在，作為糖蛋白質(zhì)糖鏈的結(jié)構(gòu)解析法，對(duì)從蛋白質(zhì)切出的糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記后， 利用高效液相色譜(HPLC)或者質(zhì)譜分析法(MQ的解析的方法成為利用質(zhì)譜分析的快速技術(shù)進(jìn)步的有力的手段(非專利文獻(xiàn)1 4)，唾液酸糖鏈的分離中，逐漸地專門地利用陰離子交換色譜色譜(非專利文獻(xiàn)5)。非專利文獻(xiàn)1Biomed Chromatogr. 16 :103-115(2002)非專利文獻(xiàn)2Anal Biochem. 206 :278-287 (1992)非專利文獻(xiàn)3Biochem Soc Trans. 21 :121-125(1993)非專利文獻(xiàn)4Chem Rev. 102 :321-369 (2002)非專利文獻(xiàn)5]Biochim Biophys Acta. 705 :167-173(1982)但是，對(duì)細(xì)胞或組織中的糖鏈綜合解析的場合，由于存在唾液酸和巖藻糖等的非還原末端修飾的多樣性和糖鏈的分枝這樣的問題，不能充分地分離混合存在的糖鏈，不能得到滿意的結(jié)果。特別地，如果使用離子交換色譜等，由于沒有特異的分離能力，不僅不能獲得充分的分離，而且分離操作后必須要進(jìn)行脫鹽處理，可以說并不是實(shí)用的方法。因此，對(duì)這些的糖鏈不均一性情報(bào)有擔(dān)心，同時(shí)迫切希望對(duì)細(xì)胞、組織可以詳細(xì)進(jìn)行特征糖鏈結(jié)構(gòu)解析的實(shí)用的手法。本發(fā)明的課題在于，提供從像細(xì)胞或者組織中的糖鏈那樣混合存在的各種的糖鏈的狀態(tài)分離、獲取各糖鏈的手段。]另外，本發(fā)明課題在于，提供對(duì)于分離的各糖鏈化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的手段。進(jìn)一步，本發(fā)明的課題在于提供新的糖鏈衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下的發(fā)明。1.糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于， 包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺(serotonin)親合柱色譜法進(jìn)行處理的工序。2.上述1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具備(C)采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。3.上述記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，在(C)工序之前，具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。4.糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于， 具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進(jìn)行處理的工序、以及(e)用質(zhì)譜分析法進(jìn)行處理的工序。5.上述記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其特征在于，在(b)工序之后，具備(C)通過采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進(jìn)行處理的工序。6.上述記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，在(C)工序之前具備(d)用糖水解酶進(jìn)行處理的工序。7.上述4記載的糖鏈的結(jié)構(gòu)解析方法，其中，質(zhì)譜分析法是利用MALDI-TOF MS的質(zhì)譜分析法。8.后述的式⑴ (6)表示的糖鏈衍生物[式中R1表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、ρ-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3。 在此，Asn表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保護(hù)基。Ac表示乙酰基。]。9.由式(1) (6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標(biāo)記物。本發(fā)明人等經(jīng)過深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基成為糖鏈衍生物后， 采用把對(duì)唾液酸有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱色譜法進(jìn)行處理，由此可以進(jìn)行無唾液酸糖鏈和唾液酸糖鏈的分離，還可以利用唾液酸殘基的數(shù)目對(duì)唾液酸糖鏈中的單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖鏈等進(jìn)行分離。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，把利用該親合柱色譜法分離的級(jí)分，分別供給使用氨基柱或者酰氨基柱的色譜，將分枝結(jié)構(gòu)不同的糖鏈衍生物可以進(jìn)行詳細(xì)分離，可以大量地制造單一結(jié)構(gòu)的糖鏈。另外還發(fā)現(xiàn)，使分離的各糖鏈衍生物與適當(dāng)?shù)奶撬饷缸饔茫┙o采用氨基柱或者酰氨基柱的色譜進(jìn)行分離，對(duì)得到的糖鏈衍生物用質(zhì)譜分析法進(jìn)行處理，由此可以高精度且綜合地解析糖鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的制造方法中使用的糖鏈混合物的糖鏈沒有特別的限制，包括天冬酰胺鍵合型糖鏈(N-葡糖甙鍵合型糖鏈),mucin型糖鏈(0-葡糖甙鍵合型糖鏈)、游離型糖鏈、進(jìn)一步還包括像糖鏈鍵合天冬酰胺那樣的結(jié)合了氨基酸的糖鏈。這些糖鏈也可以是利用化學(xué)的手法調(diào)制的糖鏈，例如，從天然的糖蛋白質(zhì)由來的糖鏈在其非還原末端的糖殘基隨機(jī)欠失的糖鏈的混合物，優(yōu)選使用這些糖鏈的混合物。此夕卜，優(yōu)選使用含有在糖鏈殘基上具有唾液酸殘基的糖鏈的糖鏈混合物。作為天然糖鏈的混合物，可舉出天然原料、例如乳汁、牛由來胎球蛋白、卵或者生體的組織或細(xì)胞由來的糖鏈混合物。特別地，使用癌組織或者癌細(xì)胞由來的糖鏈混合物可以期待特別濃厚興趣的結(jié)果。作為本發(fā)明中可以使用的天然糖鏈的混合物，可優(yōu)選以下所示的糖鏈混合物，特別優(yōu)選含有唾液酸糖鏈的糖鏈混合物?？梢允褂孟率霁@得的混合物，S卩，從該天然原料中利用公知的方法獲得糖蛋白質(zhì)以及/或者糖肽的混合物，使當(dāng)該混合物與蛋白質(zhì)分解酶等作用，切斷肽部分，利用采用凝膠過濾柱或者離子交換柱等的色譜法進(jìn)行精制獲得的糖鏈鍵合天冬酰胺的混合物。另外，可以使用下述獲得的混合物，S卩，采用例如生體的組織或者細(xì)胞、特別是培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)液中的組織或者細(xì)胞勻化，然后將離心分離獲得的細(xì)胞膜級(jí)分， 用2-巰基乙醇處理后，使作用于N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖鏈的混合物。另外，可以使用將培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞勻化，采集離心分離的上清液獲得的游離糖鏈的混合物。在這些的糖鏈之中由于含有作為中性糖鏈的高甘露糖型糖鏈和多種唾液酸糖鏈，所以適用于各種糖鏈的制造。在獲得的糖鏈的混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基使其成為糖鏈衍生物的混合物。脂溶性基是與糖鏈的還原末端的開環(huán)醛、糖鏈鍵合天冬酰胺的天冬酰胺氨基或者羧基反應(yīng)形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3_或者4-羧基苯基氨基、ρ-乙氧基羰基苯基氨基、2-吡啶基氨基等作為通常熒光標(biāo)記使用的取代基、或者9-芴基甲氧基羰基(Fmoc) 基、叔-丁氧基羰基(BOC)基、芐基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙?；鹊淖鳛榘被姿狨ハ祷蛘啧０废当Ｗo(hù)基使用的取代基。這些脂溶性基的導(dǎo)入可以利用公知的方法進(jìn)行導(dǎo)入，從操作的簡便、得到的糖鏈衍生物的穩(wěn)定性、激發(fā)光與水銀光源或者激光光源對(duì)應(yīng)等方面出發(fā)，可以優(yōu)選使用2-羧基苯基氨基、Fmoc基或者BOC基。例如，采用2-氨基苯甲酸，在氰基硼氫化鈉或者二甲基氨基化硼等的還原劑的存在下，使其與糖鏈反應(yīng)，由此可以成為氨基醛糖醇衍生物。另外，例如采用9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，在碳酸氫鈉存在下，使與糖鏈鍵合天冬酰胺反應(yīng)，可以在天冬酰胺的氨基導(dǎo)入氨基甲酸酯樣上鍵合的Fmoc基。根據(jù)以上的操作，可以得到導(dǎo)入了脂溶性基的糖鏈衍生物的混合物。把獲得的糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進(jìn)行分離。本發(fā)明中的5-羥色胺親合柱色譜法可以采用把與唾液酸具有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱。作為5-羥色胺親合柱，可以將5-羥色胺固定在填充劑上制成，也可以采用市售的柱。作為市售的柱，可舉出LA-5-羥色胺柱(株式會(huì)社J-才O S ^ *制)等。色譜的分離條件可以適當(dāng)設(shè)定，如果舉出其一例，采用熒光檢測器，設(shè)定激發(fā)波長 350nm、熒光波長425nm，流速0. 5ml/min、流動(dòng)相使用超純水和醋酸銨水溶液，進(jìn)行直線梯度洗脫，可以達(dá)到分離。通過5-羥色胺親合柱色譜法，將糖鏈衍生物的混合物，根據(jù)糖鏈衍生物的唾液酸殘基的數(shù)目可以進(jìn)行分離，沒有唾液酸殘基的無唾液酸糖鏈衍生物最早洗脫，接著按單唾液酸糖鏈衍生物、二唾液酸糖鏈衍生物這樣地與唾液酸殘基的數(shù)目增加成比例地進(jìn)行分離洗脫。把利用以上的5-羥色胺親合柱分離的糖鏈衍生物，用采用聚合物基質(zhì)的氨基柱或者二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱的正相HPLC進(jìn)行處理，由此可以很好地進(jìn)行糖鏈衍生物間的分離。所謂正相色譜法，是將氨基、氨基丙基、丙烯酰胺基等極性固定相作為填充劑使用的色譜法，其特征在于，根據(jù)相對(duì)于試料成分的固定相-流動(dòng)相的試料成分的分配度的差別達(dá)到分離?；旧鲜腔谔擎湹挠H水性而分離的模式，還可以優(yōu)選用在結(jié)合了唾液酸的糖鏈的異構(gòu)體的分離中。另外，還可以利用在采用稀酸或者唾液酸苷酶處理的無唾液酸型的糖鏈的分離中。作為使用的聚合物基質(zhì)的氨基柱，是將把氨基結(jié)合在聚乙烯醇系基材凝膠等的聚合物上的固定相作為填充劑使用的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的氨基柱，可舉出Asahi Shodex NH2P-50 4E(昭和電工株式會(huì)社制)。作為二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱，是將把丙烯酰胺等的酰胺基與把二氧化硅作為固定相的填充劑進(jìn)行化學(xué)鍵合而導(dǎo)入的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的酰氨基柱，可舉出TSK-GEL Amide-80 (T0S0H Corp制)。色譜的分離條件進(jìn)行適宜地設(shè)定，如果舉出其一例，通過采用熒光檢測器，激發(fā)波長350nm、熒光波長425nm，流速lml/min，流動(dòng)相采用含有醋酸的乙腈和醋酸以及含有三乙胺的水溶液，進(jìn)行線性梯度洗脫可以進(jìn)行分離。以上那樣分離獲得的糖鏈衍生物通過采用糖水解酶、利用質(zhì)譜分析法進(jìn)行分析， 可以將其糖鏈結(jié)構(gòu)解析。作為糖水解酶，可以采用公知的酶，例如可舉出唾液酸酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶(acetylglucosamidase)、巖藻糖苷酶等。作為質(zhì)譜分析方法，利用采用現(xiàn)有公知的質(zhì)譜分析法的質(zhì)譜分析裝置進(jìn)行，近年特別優(yōu)選采用用于糖鏈分析的MALDI-TOF MS進(jìn)行測定。為了解析糖鏈結(jié)構(gòu)，與特定的糖水解酶作用后，通過采用聚合物基質(zhì)的氨基柱或者二氧化硅基質(zhì)的酰氨基柱的正相HPLC處理，將得到的級(jí)分質(zhì)譜分析，考慮到消失的質(zhì)量分和水解酶的特性，可以通過進(jìn)一步反復(fù)該操作進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)解析。獲得的糖鏈衍生物通過將其脂溶性基除去，可以人工容易地且大量地獲得各種的糖鏈。脂溶性基的除去可以使用現(xiàn)有公知的方法。例如，2-羧基苯基氨基的除去通過在醋酸中與過氧化氫在室溫進(jìn)行反應(yīng)而達(dá)到， 可以容易地作為游離型糖鏈回收。另外，F(xiàn)moc基的除去通過在N，N- 二甲基甲酰胺中、糖鏈衍生物中加入嗎啉進(jìn)行反應(yīng)來達(dá)到，為了除去BOC基，通過與弱酸反應(yīng)來達(dá)到。糖鏈?zhǔn)翘擎滄I合天冬酰胺的場合，通過與無水胼反應(yīng)后乙?；姆椒?，在堿性水溶液中加熱回流后乙?；姆椒ǖ?，可以除去天冬酰胺殘基。
該糖鏈類，在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中非常有用，可舉出例如癌的疫苗合成，將得到的糖鏈類組合利用化學(xué)反應(yīng)或糖轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)等鍵合新的糖殘基而衍生物化，可以開發(fā)新的疫苗。本發(fā)明人等通過本發(fā)明的結(jié)構(gòu)解析方法以及制造方法，成功地分離出在各種癌細(xì)胞中迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)的下述式(1) (6)表示的糖鏈。
權(quán)利要求
1.下表所示的糖鏈衍生物，
全文摘要
本發(fā)明涉及糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于，具備下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導(dǎo)入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序，以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法處理的工序。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102516402SQ20111032912
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日
發(fā)明者掛樋一晃, 木下充弘, 松野裕樹 申請(qǐng)人:大塚化學(xué)株式會(huì)社