抗GD2抗體介紹單克隆抗體(MoAb)療法是一種公認的癌癥治療模態(tài)，有5種MoAb已經(jīng)被FDA批準用于成人實體瘤，包括結腸直腸癌和乳腺癌，非小細胞肺癌，鱗狀細胞癌和黑素瘤(Boyiadzisetal.,2008,ExpertOpinBiolTher8,1151-8;Yanetal.,2008,CancerJ14,178-83)。然而這種模態(tài)在兒科癌癥方面的應用尚且不足。與化療或放射不同，MoAb治療不具有骨髓抑制性和遺傳毒性，一般很少有長期毒性。這些對于幼兒來說是關鍵性的考慮因素。更重要的是，MoAb對在高風險神經(jīng)母細胞瘤(NB)中通常出現(xiàn)的血液、骨髓和骨中的轉(zhuǎn)移癌癥有效。作為一類藥物，人源或人源化IgG1抗體已經(jīng)得到了廣泛的研究。此外，抗體可攜帶細胞毒性負荷物(基于免疫、放射性同位素、毒素或酶的)，從而增加靶向性治療的選項。神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)是最常見的兒童顱外實體腫瘤。在大約50%的病例中，根治性策略必須解決軟組織團塊和骨髓(BM)中轉(zhuǎn)移的問題。劑量密集的化療提高腫瘤的可切除性，且手術后放射可降低原發(fā)部位的復發(fā)風險至<10%(Kushneretal.,2001,JClinOncol19,2821-8)。然而，骨髓疾病，如組織學和間碘苯甲胍(MIBG)掃描所證實的，往往持續(xù)存在并預示致命的結局(Matthayetal.,2003,JClinOncol21,2486-91;Schmidtetal.,2008,EurJCancer44,1552-8)。此外，骨髓復發(fā)是常見的，盡管在誘導治療后可達到幾乎完全的緩解。強化治療的嘗試遭遇了急性和長期的副作用，這二者對于年輕患者都是嚴重的擔憂。有前景的新藥稀缺，而且迄今為止，極少有(如果有的話)靶/途徑特異性小分子已經(jīng)對NB患者顯示了重大臨床效應，盡管有希望的前導藥物不斷累積。對于>18個月齡時確診的4期患者，在毒性極限下的治愈率<30%，因此還有很大的改善空間(Pearsonetal.,2008,LancetOncol9,247-56)。數(shù)種因素使得NB非常適合免疫療法。首先，在人白細胞存在下MoAb可介導高效率的NB的抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。其次，MoAb誘導NB細胞的補體介導細胞毒性(CMC)，NB細胞缺少衰變加速因子CD55(Cheungetal.,1988,JClinInvest81,1122-8)和同源的限制因子CD59(Chenetal.,2000,CancerRes60,3013-8)。NB細胞上的補體沉積通過活化中性粒細胞上的iC3b受體而增強ADCC(KushnerandCheung,1992,Blood79,1484-90,Metelitsaetal.,2002,Blood99,4166-73)，如果給予集落刺激因子，則即使在劑量密集的或者骨髓消減性的化療加上干細胞移植之后其仍然可用(Mackall,CL,2000,StemCells18,10-8)。第三，為達到臨床緩解而施用的高強度化療(NB的護理標準)可導致長期淋巴細胞減少和免疫抑制(Mackalletal.,2000,Blood96,754-762)，使得患者排斥鼠源、嵌合或人源化MoAb的可能性降低(Kushneretal.,2007,PediatrBloodCancer48,430-4)。GD2是一種二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside)，其在神經(jīng)外胚層起源的腫瘤(包括神經(jīng)母細胞瘤和黑素瘤)中豐富存在的，而在正常組織中的表達高度受限。至少有兩個抗體家族已經(jīng)得到了臨床測試，即3F8(Cheungetal.,1985,CancerRes45,2642-9)和14.18(Mujooetal.,1989,CancerRes49,2857-61)。嵌合ch14.18由鼠MoAb14.18的可變區(qū)和人IgG1-K的恒定區(qū)組成(Gilliesetal.,1989,JImmunolMethods125,191-202)。它在體內(nèi)展現(xiàn)NB及黑素瘤細胞的ADCC和CMC(Barkeretal.,1991,CancerRes51,144-9;BarkerandReisfeld,1993,CancerRes.52,362-7;Muelleretal.,1990,PNASUSA87,5702-050)?；谠贗期研究中令人鼓舞的臨床應答，在大規(guī)模II期研究中將ch14.18作為4期NB的鞏固治療進行了測試(德國NB90和NB97研究)。對于確診時>12個月的166名患者，雖然接受ch14.18的患者的無事件生存(event-freesurvival,EFS)與接受維持化療的患者相似，但總體生存(overallsurvival,OS)改善，且在用ch14.18治療的患者中BM復發(fā)率降低(Simonetal.,2004,JClinOncol22,3549-57)。在2001年，兒童腫瘤學集團(Children’sOncologyGroup(COG))啟動了一項隨機化III期實驗來研究ch14.18與GMCSF和IL-2的組合在自體干細胞移植(ASCT)后處于完全緩解(CR)中的患者中防止NB復發(fā)的效力(ClinicalTrials.govNCT00026312)(Gilmanetal.,JClinOncol27:85-91,2009)，發(fā)現(xiàn)無進展生存(PFS)和OS顯著提高2年(Yuetal.,NEnglJMed363:1324-1334,2010)。3F8，一種對GD2特異性的鼠IgG3MoAb，誘導細胞死亡，并且在體外介導針對NB的高效的ADCC和CMC(Cheungetal.,2007,同上)。在雖然接受了劑量密集的誘導加上積極的補救療法仍具有化療抗性骨髓疾病的患者中，80%的患者通常在1到2個周期的5日抗體加GM-CSF治療后實現(xiàn)了骨髓緩解(Kushneretal.,2007,ProcAmerSocClinOncol25,526s)。鑒于m3F8對化療抗性骨髓疾病的活性，m3F8用藥被擴展到處于第一次緩解期(firstremission)中的患者，并取得了令人鼓舞的結果。如果在復發(fā)風險最高的最先3-5年內(nèi)給予m3F8作為維持治療，這些兒童中的有利的臨床結果可以改善。然而，當化療結束，免疫系統(tǒng)恢復時，人抗小鼠抗體應答(HAMA)是一個限制因素。減少HAMA的策略之一是嵌合化或人源化3F8。因此對于這樣的嵌合和/或人源化抗體存在需求：其能夠以高親和力結合GD2、優(yōu)于m3F8、并且能夠介導抗體依賴性細胞細胞毒性，從而容許長程抗體療法以減少疾病復發(fā)。本文描述的是嵌合3F8(ch3F8-IgG1)和人源化3F8(hu3F8-IgG1和hu3F8-IgG4)的工程構建和分離。使用標準重組方法制備了這些抗體，并以CHO-DG44細胞系在無血清培養(yǎng)基中的高表達為標準加以選擇。使用CHO-Mage1.5細胞系產(chǎn)生了hu3F8-IgG1n的一種特殊糖形(又稱hu3F8-IgG1-MAGE1.5)。這種特殊糖形不具有巖藻糖，且只有末端甘露糖和N-乙酰葡萄糖或葡萄糖。使用Biacore系統(tǒng)所使用的表面等離子體共振測量，嵌合3F8和人源化3F8保持與m3F8相似的KD。與其他抗GD2抗體相對照的是，m3F8,ch3F8-IgG1,ch3F8-IgG4,hu3F8-IgG1,hu3F8-IgG4和hu3F8-IgG1n具有明顯更慢的koff，這在體外導致更慢的洗去(washoff)。與m3F8相似，嵌合和人源化3F8都在體外抑制細胞生長，這對其他抗GD2抗體而言不是典型的。類似的測量提示嵌合和人源化IgG1抗體與14.G2a相比具有更有利的KD。ch3F8-IgG1、hu3F8-IgG1、和hu3F8-IgG1n的血液單個核細胞(PBMC)-ADCC和中性粒細胞(PMN)-ADCC均優(yōu)于(10至>1000倍)m3F8，而CMC遜于m3F8。這種優(yōu)越性在ADCC測定中一貫地被觀察到，與供體無關，與NK92是用人CD16或CD32轉(zhuǎn)染也無關。對于CD16介導的ADCC，hu3F8-IgG1n相比于hu3F8-IgG1好10-40倍。與m3F8相比，使用hu3F8-IgG4的PBMC-ADCC和CMC活性大大下降。與其他神經(jīng)節(jié)苷脂的交叉反應性與m3F8相似。在生物分布中使用131I標記的抗體，hu3F8形式的腫瘤對正常組織比(tumortonormaltissueratio)與m3F8近似。Hu3F8-IgG1與m3F8相比時顯示更優(yōu)越的抗腫瘤效果。還描述了新hu3F8抗體hu3F8H3L3，使用實驗獲得的m3F8晶體結構結合使用力場方法的計算分析設計了這些抗體以使其具有更好的安全性概貌。

技術實現(xiàn)要素：
人源化策略共有的前提是，將鼠源序列特征性的氨基酸殘基替換為人抗體中相應位置處出現(xiàn)的殘基將會降低所得到的抗體在人體中的免疫原性。然而，在物種之間替換序列通常會導致抗體對其抗原的結合降低，并且喪失親和力。因此，人源化的技巧在于在替換原始的鼠源序列以降低免疫原性和人源化分子保留治療上有用的足夠抗原結合性之間取得平衡。本發(fā)明提供工程化的以及嵌合和人源化的3F8抗體，其具有至少一個源自m3F8的CDR序列，還有抗體組合物、抗體的糖形(glycoform)、穩(wěn)定性提高的抗體、對Fc受體的結合提高的抗體、對GD2的親和力提高的抗體、經(jīng)過工程改造而表達第二種不同的結合位點的雙特異性抗體或雙特異性T細胞接合物，或者任何本發(fā)明的抗體的Fv片段用于模塊化IgG構建用于雙特異性、雙特異性T細胞接合性(BiTE)抗體、三特異性或多特異性抗體的用途。這些抗體以及與之相關的編碼或互補核酸、載體、宿主細胞、組合物、配制劑、裝置、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物，以及制造和使用它們的方法，如本申請描述的以及結合本領域的知識使之能夠?qū)崿F(xiàn)的，屬于本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的hu3F8-IgG1抗體比m3F8或任何其他已知的抗GD2抗體(包括14G.2a,ch14.18或ME361)具有顯著更多的PMN-ADCC和PBMC-ADCC活性，并具有完整補體介導的細胞毒性(CMC)，盡管較m3F8為少。在ADCC測定中無論供體如何，也無論是用轉(zhuǎn)染了人CD16或CD32的NK92作為殺傷細胞，都一貫地觀察到這種優(yōu)越性。這一點是重要的，因為ADCC已被證明是MoAb在患者體內(nèi)的抗腫瘤作用的普遍機制。hu3F8-IgG1和hu3F8-IgG1n(hu3F8-IgG1的一種糖形)與m3F8相比針對神經(jīng)母細胞瘤(NB)異種移植物都顯示出更優(yōu)越的抗腫瘤作用。該抗體的IgG4形式顯示降低的效應物功能，并可有效地阻斷抗CD2抗體療法的疼痛副作用。在重鏈中具有三突變的Hu3F8-IgG1-DEL(或S239D/I332E/A330L)顯示對Fc受體(FcR)的親和力增加。作為對3F8:GD2相互作用的分析的結果，設計出了一種在重鏈中具有突變的3F8抗體，其在重鏈中具有突變，產(chǎn)生通過熱力學計算可賦予對GD2的增加的親和力的huH1I-gamma-1與huH3I-gamma-1重鏈。本發(fā)明提供至少一種分離的工程化的嵌合抗體ch3F8，或人源化的抗體hu3F8，如本文所述的。根據(jù)本發(fā)明的抗體包括任何這樣的蛋白質(zhì)或肽分子：其包含源自m3F8的重鏈或輕鏈或其配體結合部分的至少一個互補決定區(qū)(CDR)，與能夠組入本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)或其任何部分組合。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種hu3F8抗體，其包含如本文所述的輕鏈和重鏈，所述每條鏈包含人恒定區(qū)的至少一部分以及對GD2有特異性的源自m3F8的可變區(qū)的至少一部分，所述抗體以高親和力結合GD2，并且介導期望的效應，僅舉數(shù)例：抑制體外細胞生長、阻斷由于抗GD2抗體治療導致的疼痛副作用。本發(fā)明還包括此類抗體的片段或衍生物，例如抗體鏈的一個或多個部分，諸如重鏈恒定區(qū)、連接(joining)區(qū)、多樣性(diversity)或可變(variable)區(qū)?？贵w可以屬于任何類別諸如IgG、IgM、或IgA，或任何亞類諸如IgG1、IgG2a、IgG4，以及本領域已知的其他亞類。本發(fā)明中有用的抗體還包括本發(fā)明的抗體的抗原結合性抗體片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的或二硫化物穩(wěn)定化的Fv(sdFv或dsFv)。本發(fā)明還包括包含VL域或VH域的單域抗體。此外，所述抗體可以通過任何方法來產(chǎn)生，諸如噬菌體展示、或者在任何生物體、卵、或細胞系中產(chǎn)生，包括細菌、昆蟲、酵母(真菌)、哺乳動物或其他類型的產(chǎn)生具有期望特征的抗體(如人源化抗體)的細胞或細胞系。還可以通過組合來自不同物種的Fab部分與Fc區(qū)，或者通過保留抗原決定區(qū)而將框架區(qū)修飾為其他物種的框架區(qū)來形成抗體。所述抗體可以包含源自m3F8或hu3F8的至少一個互補決定區(qū)(CDR)(例如重鏈或輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3)的至少一個特定的部分，和/或至少一個恒定區(qū)或可變框架區(qū)或其任意部分(如這些術語在本文中所定義的)。所述抗體氨基酸序列可以任選進一步包含至少一種特定的取代、插入或缺失，如本文所述的或如本領域已知的。本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-IgG4、hu3F8IgG1n、Hu3F8-IgG1-DEL、hu3F8H1L1S(hu3F8-IgG1輕鏈界面增強的)、hu3F8H3L3(hu3F8-IgG1重鏈和輕鏈穩(wěn)定性增強的)、hu3F8H3L3S(界面和穩(wěn)定性增強的)、hu3F8H1-I-gamma-1(hu3F8-IgG1親和力增強的)、hu3F8H3-I-gamma-1(hu3F8-IgG1穩(wěn)定性和親和力增強的)，及其片段和區(qū)域。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有對GD2的結合特異性的嵌合單克隆抗體，其中所述抗體ch3F8-IgG1包含重鏈域SEQIDNO:1，以及輕鏈可變域SEQIDNO:2。在另一個實施方案中，所述抗體ch3F8-IgG4包含SEQIDNO:3的重鏈可變域以及SEQIDNO:2的輕鏈可變域。這樣的嵌合抗體源自鼠3F8抗體，在特定的實施方案中，所述嵌合抗體包含這樣的重鏈，其互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別由SEQIDNO:1的氨基酸殘基31-35、50-64和98-108所定義。在特定的實施方案中，所述嵌合抗體包含這樣的輕鏈，其CDR1、2和3分別由SEQIDNO:2的氨基酸殘基24-34、50-56和89-95所定義。在特定的實施方案中，所述嵌合抗體包含這樣的重鏈，其框架區(qū)(FR)1、2、3和4分別由SEQIDNO:1的氨基酸殘基1-30、36-49、65-97和109-120所定義。在特定的實施方案中，所述嵌合抗體包含這樣的輕鏈，其框架區(qū)(FR)1、2、3和4分別由SEQIDNO:2的氨基酸殘基1-23、35-49、57-88和96-108所定義。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有對GD2的結合特異性的人源化單克隆抗體，其中抗體hu3F8-H1L1-IgG1包含SEQIDNO:4的重鏈可變域可SEQIDNO:5的輕鏈可變域，其中hu3F8H2L2-IgG1包含SEQIDNO:6的重鏈可變域和SEQIDNO:7的輕鏈可變域，其中hu3F8-H1L1-IgG4包含SEQIDNO:8的重鏈可變域和SEQIDNO:5或7的輕鏈可變域。這樣的人源化抗體源自鼠3F8抗體的人源化。在特定的實施方案中，人源化抗體包含這樣的重鏈，其互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別由SEQIDNO:4、6或8的氨基酸殘基31-35、50-64和98-108所定義。在特定的實施方案中，人源化抗體包含這樣的輕鏈，其互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別由SEQIDNO:5或7的氨基酸殘基24-34、50-56和89-95所定義。本發(fā)明還涉及經(jīng)過工程化而具有修飾的碳水化合物構成的抗GD2人源化抗體，hu3F8-IgG1n，其具有增加的效應物功能。本發(fā)明還涉及Hu3F8-IgG1-DEL抗體，其在hu3F8-IgG1或hu3F8-IgG1n的重鏈中具有三突變DEL(S239D/A330L/I332E)。Hu3F8-IgG1-DEL在重鏈中包含由SEQIDNO:4、6或8的S239D、A330L和I332E組成的取代。本發(fā)明還涉及hu3F8H3L3，其是通過晶體結構的計算分析以及通過回復突變和正向突變調(diào)整氨基酸序列以提高抗體的穩(wěn)定性而獲得的。穩(wěn)定性提高的huH3重鏈的序列公開于SEQIDNO:9，而huL3輕鏈公開于SEQIDNO:10。這些突變也可以單獨地或者與本文所述的其他重鏈突變組合導入重鏈序列中。在輕鏈的第43位添加了一個額外的突變以提高VH-VL界面處的穩(wěn)定性，得到了huL3S。因此，huL3S包含由SEQIDNO:10的Ala43Ser組成的取代。當hu3F8-IgG1的輕鏈中組入了這種對43位的絲氨酸的改變時，該輕鏈被稱為huL1S。類似地，huL1S包含由SEQIDNO:5或7的Ala43Ser組成的取代。計算機建模進一步顯示，重鏈CDR3中第54位的Gly取代為Ile會改變結合口袋的形狀，并增加與GD2配體的接觸。將該突變Gly54Ile添加到huH1-IgG1和huH3-IgG1的序列的CDR區(qū)域中，分別得到了huH1I-gamma1和huH3I-γ。因此，huHI-gamma1包含SEQIDNO:4、6或8中的Gly54Ile取代。huH3I-gamma1包含SEQIDNO:9中的Gly54Ile取代。本發(fā)明的優(yōu)選抗體是那些結合人GD2并發(fā)揮期望的功能(即效應物功能，阻斷疼痛或抑制細胞生長)的抗體。優(yōu)選的用于通過競爭性抑制確定單克隆抗體特異性和親和力的方法可見于Harlow,etal,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1988)，在此通過引用將其并入本文。至少一種本發(fā)明的抗體結合至少一個特定的人GD2特異性表位，亞單位、片段、部分，或其任意組合。所述表位可包含至少一個抗原結合區(qū)，所述表位優(yōu)選由GD2的至少一個部分的至少1-5個糖殘基或神經(jīng)酰胺組成。在一個方面，本發(fā)明提供至少一種分離的人源化抗GD-2抗體，其包含至少一個來自m3F8的可變區(qū)，以及編碼所述抗體的核酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供至少一種分離的哺乳動物抗GD2抗體，其包含(i)源自m3F8的所有重鏈可變區(qū)(CDR)氨基酸序列，以及編碼它們的核酸序列；或(ii)來自m3F8的所有輕鏈CDR氨基酸序列，以及編碼它們的核酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供至少一種分離的哺乳動物抗GD2抗體，其包含至少一個具有源自m3F8的氨基酸序列的重鏈或輕鏈CDR，以及編碼它們的核酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供至少一種分離的嵌合的、人源化的、或CDR嫁接的抗GD2抗體，其包含至少一個m3F8CDR，其中該抗體特異性地結合至少一個這樣的表位，該表位包含人GD2的表位的至少1-5個糖殘基或神經(jīng)酰胺。在另一個方面，本發(fā)明提供一種診斷/檢測或治療免疫綴合物，其包含抗體組分，所述抗體組分包含任何本發(fā)明的3F8MoAb或其片段或包含任何本發(fā)明的3F8抗體或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中所述抗體組分結合于至少一種診斷/檢測劑或至少一種治療劑。在另一個方面，本發(fā)明提供一種治療免疫綴合物，其包含選自下組的治療劑：放射性核素，硼，釓或鐳原子，免疫調(diào)節(jié)物，如細胞因子，干細胞生長因子，淋巴毒素，腫瘤壞死因子(TNF)，造血因子如白介素(IL)，集落刺激因子(CSF)如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))，干擾素(IFN)如干擾素-α、-β或γ，以及干細胞生長因子，造血因子，紅細胞生成素，血小板生成素、抗體、激素、激素拮抗劑、酶、酶抑制劑、光敏治療劑、細胞毒藥物、如抗有絲分裂劑、烷化劑、抗代謝劑、血管新生抑制劑、凋亡劑、生物堿、COX-2抑制劑及抗生素劑，細胞毒性毒素，如植物、微生物和動物毒素，及其合成性變體，血管新生抑制劑，不同的抗體，以及上述的組合。在另一個方面，本發(fā)明還提供一種多價、多特異性抗體或其片段，其包含一個或多個對由3F8抗體所識別的抗原具有親和力的抗原結合位點，以及一個或多個對GD2之外的表位或半抗原具有親和力的半抗原結合位點。優(yōu)選地，所述3F8抗體或其片段是嵌合化的或人源化的。還優(yōu)選的是，所述抗原或其片段是完全人的或嵌合化的。在一個實施方案中，所述多價、多特異性抗體或其片段包含診斷/檢測或治療劑。在又一個方面，本發(fā)明提供一種向目標投遞診斷劑/檢測劑或其組合的方法，包括：(i)對受試者施用本發(fā)明的多價、多特異性抗體或其片段；(ii)等待足夠量的時間以使得一定量的非結合蛋白從受試者的血流清除；和(iii)對所述受試者施用包含診斷/檢測劑、治療劑、或其組合的擔載體分子，所述擔載體分子結合所述抗體的結合位點。所述診斷/檢測劑或治療劑選自包含下列的組：同位素、染料、色原、造影劑、藥物、毒素、細胞因子、酶、酶抑制劑、激素、激素拮抗劑、生長因子、放射性核素、金屬、脂質(zhì)體、納米顆粒、RNA或DNA。第二特異性還包括與上述作用劑群組中任意者綴合的半抗原。這些半抗原包括但不限于生物素及其衍生物、DOTA及其衍生物、DTPA及其衍生物、熒光素及其衍生物、組胺及其衍生物、去鐵胺(Deferoxamine)及其衍生物。在本發(fā)明的任何方法中，受試者優(yōu)選是哺乳動物，如人或家養(yǎng)伴侶動物。本發(fā)明的另一個實施方案是一種治療或鑒定受試者中的患病組織的方法，包括：(A)對所述受試者施用如下所述的雙特異性抗體或抗體片段，所述抗體或片段具有至少一個特異性結合患病組織相關標志物的臂，以及至少另一個特異性結合可尋靶的綴合物的臂，其中所述患病組織相關標志物是由3F8MoAb識別的抗原；(B)任選地，對所述受試者施用清除組合物，并讓所述組合物從循環(huán)中清除未定位的抗體或抗體片段；和(C)對所述受試者施用第一可尋靶綴合物，其包含擔載體部分，該擔載體部分包含或負載至少一個這樣的表位，該表位可以被所述雙特異性抗體或抗體片段的所述至少另一個臂所識別；以及一種多多種綴合的治療劑或診斷劑。優(yōu)選地，特異性結合靶組織的至少一個臂是人、嵌合、或人源化抗GD2抗體或人、嵌合、或人源化抗GD2抗體的片段。一個優(yōu)選的實施方案是在此類應用中使用3F8MoAb作為如這里所述的嵌合、人源化或人抗體。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供一種檢測或治療哺乳動物中表達被3F8MoAb識別的抗原的腫瘤的方法，包括：(A)施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含至少一個特異性結合靶組織的臂，以及至少另一個特異性結合可尋靶綴合物的臂，其中所述特異性結合靶組織的一個臂是3F8抗體或其片段；和(B)施用可尋靶的綴合物。所述可尋靶的綴合物可以選自下組：(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2;(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2;(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2;(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2;(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2;(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2;(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2;(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2;(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2;(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2;熒光素及其衍生物、去鐵敏(desferrioxamine)及其衍生物。在另一個方面，本發(fā)明提供一種尋靶方法，其中所述方法包括：(A)給要接受此類程序的受試者注射雙特異性抗體F(ab)2或F(ab')2片段，或單鏈Fv片段，其中所述雙特異性抗體或片段具有特異性結合3F8MoAb所識別的抗原的第一抗體結合位點，且具有特異性結合半抗原的第二抗體位點，并容許所述抗體片段在靶位點累積(accrete)；(B)任選地如果所述雙特異性片段沒有在注射后大約24小時內(nèi)從循環(huán)大部分清除，則使用清除劑清除未靶定的(non-targeted)抗體片段，并注射半抗原修飾的右旋糖酐、或樹枝狀化合物、或聚合物，這些物質(zhì)快速地將未靶定的抗體或片段移入肝臟以便降解，(C)在第一次注射數(shù)小時內(nèi)，通過核成像或通過利用掃描儀或探針近距檢測靶位點處累積的標記物的提高的水平，來檢測半抗原的存在，并實施所述程序，其中所述檢測在不使用造影劑或減影劑(subtractionagent)的條件下進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述半抗原標記有診斷/檢測放射性同位素，MRI圖像增強劑，熒光標記物或化學發(fā)光標記物。熒光標記可包括羅丹明、熒光素、腎造影劑(renographin)、異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白(phycoerytherin)、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)和熒光胺?；ㄐ醢l(fā)光標記物可包括魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、芳香吖啶酯(aromaticacridiniumester)、吲哚、吖啶鹽(acridiniumsalt)、和草酸酯。MRI圖像增強劑包括釓和鐵磁性物質(zhì)。對抗體-半抗原定位的成像檢測攜帶GD2的完整腫瘤細胞，這對腫瘤分期、測量腫瘤對治療的應答、檢測早期復發(fā)和腫瘤監(jiān)控而言是關鍵的。在外科手術進行中檢測抗體-半抗原定位可給出腫瘤的精確位置，并可發(fā)現(xiàn)隱藏的病變部位，從而使作為癌癥治愈性治療的完全手術切除成為可能。本發(fā)明還考慮一種多價、多特異性抗體或其片段，其包含：一個或多個對由3F8抗體所識別的抗原具有親和力的抗原結合位點，以及一個或多個對細胞(淋巴細胞、天然殺傷細胞、中性粒細胞、髓樣細胞、干細胞、神經(jīng)干細胞、間充質(zhì)干細胞、白血病細胞、細胞毒性淋巴細胞和B淋巴細胞)上的表位或半抗原具有親和力的半抗原結合位點。這些雙特異性抗體或片段可以通過各種途徑(包括靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、或腫瘤內(nèi))施用到哺乳動物(包括人)體內(nèi)，以使得內(nèi)源細胞或外源輸注的細胞靶向攜帶抗原GD2的位點或組織或細胞?；蛘撸梢酝ㄟ^離體方式用這些雙特異性抗體或片段武裝細胞，然后施用到哺乳動物(包括人)體內(nèi)。本發(fā)明還考慮3F8序列或其片段的如下用途：使用所述3F8序列或其片段通過遺傳方法創(chuàng)建對GD2特異性的嵌合表面受體，以將細胞(淋巴細胞、天然殺傷細胞、中性粒細胞、髓樣細胞、干細胞、神經(jīng)干細胞、間充質(zhì)干細胞、白血病細胞、細胞毒性淋巴細胞和B淋巴細胞)重定向至攜帶GD2的組織、器官或腫瘤，用于診斷和治療應用二者。在一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含、或互補于、或雜交到編碼前述特異性抗GD2抗體的多核苷酸，包含其至少一個特定的序列、域、部分或變體。在一個更具體的方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列，其中Hu3F8-H1L1-IgG1(也縮寫為hu3F8-IgG1)輕鏈由SEQIDNO:11編碼，而Hu3F8-H1L1-IgG1重鏈由SEQIDNO:12編碼，其中Hu3F8-H1L1-IgG4輕鏈由SEQIDNO:13編碼且Hu3F8-H1L1-IgG4重鏈由SEQIDNO:14編碼，其中Hu3F8-H1L2-IgG1輕鏈L2由SEQIDNO:15編碼且Hu3F8-H2L2-IgG1重鏈H2由SEQIDNO:16編碼。hu3F8-H1L1-IgG1的輕鏈和重鏈可以與hu3F8-H2L2-IgG1的輕鏈和重鏈互換，形成抗GD2抗體hu3F8-H1L2-IgG1和hu3F8-H2L1-IgG1。本文提供了其他核苷酸序列，其中ch3F8-IgG1輕鏈由SEQIDNO:17編碼且ch3F8-IgG1重鏈由SEQIDNO:1編碼8，其中ch3F8-IgG4輕鏈由SEQIDNO:19編碼且ch3F8-IgG4重鏈由SEQIDNO:20編碼，且其中hu3F8H3L3-IgG1輕鏈L3由SEQIDNO:21編碼且重鏈H3由SEQIDNO:22編碼。本發(fā)明進一步提供包含所述抗GD2抗體核酸分子的重組載體，含有此類核酸和/或重組載體的宿主細胞，以及制造和/或使用此類抗體核酸分子、載體和/或宿主細胞的方法。因此，本發(fā)明包括編碼至少一種分離的哺乳動物抗GD2抗體或其片段的分離的核酸，包含所述分離的核酸的分離的核酸載體，和/或包含所述分離的核酸的原核或真核宿主細胞。所述宿主細胞可任選地為選自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、CHO-S、DG44、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、或淋巴瘤細胞中的任一種，或其任何衍生細胞、永生化細胞或轉(zhuǎn)化細胞。還提供了一種用于產(chǎn)生至少一種抗GD2抗體的方法，包括在體外、體外或原位的條件下翻譯編碼抗體的核酸，使得抗體以可檢測或可回收的量表達；所述方法包括利用這樣的載體的方法：所述載體可容許利用在代謝途徑或者酶(包括但不限于dhfr(二氫葉酸還原酶)或GS(谷氨酰胺合酶)的控制下的生長和存活選擇來擴大蛋白質(zhì)表達。本發(fā)明還提供至少一種用于在宿主細胞中表達至少一種前述的抗GD2抗體的方法，包括在至少一種抗GD2細胞以可檢測和/或可回收的量表達的條件下培養(yǎng)如本文所述的宿主細胞。本發(fā)明還提供至少一種組合物，其包含(a)分離的如本文所述的抗GD2抗體編碼核酸和/或抗體；和(b)合適的擔載體或稀釋劑。所述擔載體或稀釋劑可任選為可藥用的，根據(jù)已知的擔載體或稀釋劑。所述組合物可任選地進一步包含至少一種其他化合物、蛋白質(zhì)或組合物。在這些組合物中的一些中，嵌合或人源化抗體綴合于細胞毒劑(即損害細胞的存活力和/或功能的作用劑)，諸如細胞毒藥物、毒素或放射性核素。本發(fā)明進一步提供至少一種抗GD2抗體方法或組合物，用于在相關的狀況之前、之后、或之中，如本領域已知的和/或如本文所述的，施用治療有效量來調(diào)節(jié)或治療細胞、組織、器官、動物或患者和/或中的至少一種GD2相關狀況。因此，本發(fā)明提供一種診斷或治療細胞、組織、器官或動物中的GD2相關狀況的方法，包括將包含有效量的至少一種本發(fā)明的分離的抗GD2抗體或其片段接觸或施用給細胞、組織、器官或動物。所述方法任選地可進一步包括對細胞、組織、器官或動物施用0.001-50mg/千克的本發(fā)明的抗GD2抗體。所述方法可任選地進一步包括通過選自下組的至少一種模式來進行所述接觸或施用：胃腸外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、椎管內(nèi)、鞘內(nèi)、奧馬耶貯器內(nèi)(intra-Ommaya)、玻璃體內(nèi)、眼內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、推注、陰道、直腸、含服、舌下、鼻內(nèi)、或經(jīng)皮。所述方法可任選地進一步包括在抗體接觸或施用之前、同時或之后施用至少一種組合物，所述組合物包含有效量的至少一種化合物或蛋白質(zhì)或細胞，所述化合物、蛋白質(zhì)或細胞選自下述中的至少一種：可檢測的標記物或報道分子、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉馳緩劑、麻醉藥、非甾體類抗炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻滯劑、抗微生物劑、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、紅細胞生成素、免疫、免疫球蛋白、抗體或抗體衍生綴合物、免疫抑制劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥劑、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或其類似物、細胞毒劑或其他抗癌劑、抗代謝藥如甲氨蝶呤、抗增殖劑、細胞因子、白介素、生長因子、細胞因子拮抗劑、以及抗TNF-α、白細胞、T細胞、LAK細胞、TIL細胞、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、NKT細胞、工程化T細胞或NK細胞或單核細胞或粒細胞。本發(fā)明進一步提供至少一種抗GD2抗體方法，用于在相關的狀況之前、之后或之中診斷細胞、組織、器官、動物或患者和/或中的至少一種GD2相關狀況，如本領域已知的和/或如本文中所描述的。本發(fā)明還提供至少一種投遞組合物、裝置和/或方法，用于根據(jù)本發(fā)明診斷至少一種抗GD2抗體狀況。還提供一種組合物，其包含至少一種分離的人源化抗GD2抗體和至少一種可藥用的擔載體或稀釋劑。所述組合物可任選地進一步包含有效量的至少一種選自下述的至少一種的化合物或蛋白質(zhì)：可檢測的標記物或報道分子、細胞毒劑或其他抗癌劑、抗代謝藥如甲氨蝶呤、抗增殖劑、細胞因子、或細胞因子拮抗劑、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉馳緩劑、麻醉藥、非甾體類抗炎藥(NTHE)、止痛劑、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻滯劑、抗微生物劑、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、紅細胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥劑、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物。還提供一種醫(yī)學裝置，包含至少一種本發(fā)明的分離的哺乳動物抗GD2抗體，其中所述裝置適合于通過選自下述的至少一種模式接觸或施用至少一種抗GD2抗體：胃腸外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、奧馬耶貯器內(nèi)、玻璃體內(nèi)、眼內(nèi)、結腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、椎管內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、推注、陰道、直腸、含服、舌下、鼻內(nèi)、或經(jīng)皮。在一個進一步的方面，本公開提供一種試劑盒，其包含處于第一容器中的至少一種呈凍干形式的本公開的嵌合或人源化抗GD2抗體或片段，和任選的第二容器，所述第二容器包含無菌水，無菌緩沖水，或處于水性稀釋劑中的選自苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、三氯叔丁醇、氯化鎂、對羥基苯甲酸烷基酯、苯扎氯銨、芐索氯銨、甲醋吡喃酮鈉和硫柳汞的至少一種的防腐劑，甘露醇，蔗糖，甘露糖，其他糖，吐溫80或其混合物。在一個方面，在所述試劑盒中，用所述第二容器中的內(nèi)容物將所述第一容器中的抗GD2抗體或特定的部分或變體的濃度復原到大約0.1mg/ml到大約500mg/ml的濃度。在另一個方面，所述第二容器進一步包含等張劑。在另一個方面，所述第二容器進一步包含生理學上可接受的緩沖劑。在一個方面，本公開提供一種治療至少一種GD2特征性狀況的方法，包括對有需要的患者施用試劑盒中提供的、并在施用之前經(jīng)復原的配制劑。還提供一種供人體藥用或診斷用的制品，其包括：包含溶液或凍干形式的至少一種本發(fā)明的分離的嵌合或人源化抗GD2抗體的容器和包裝材料。所述制品可任選地包含具有所述容器作為胃腸外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、奧馬耶貯器內(nèi)、玻璃體內(nèi)、眼內(nèi)、結腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、椎管內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、推注、陰道、直腸、含服、舌下、鼻內(nèi)、或經(jīng)皮遞送裝置或系統(tǒng)的組件。發(fā)明詳述在下面的說明中多處使用了若干重組DNA和免疫學中使用的術語。為了提供對說明書的權利要求書，包括賦予這些術語的范圍的更清楚、一致的理解，提供下面的定義。術語“抗體”是本領域公認的一個術語，意在包括結合已知抗原的分子或分子的活性片段。結合已知抗原的分子的活性片段的例子包括Fab和F(ab’)2片段。這些活性片段可通過多種技術從本發(fā)明的抗體獲得。例如，可以用酶，如胃蛋白酶切割經(jīng)純化的單克隆抗體，并進行HPLC凝膠過濾。然后可收集含有Fab片段的合適的級分并通過膜過濾等加以濃縮。關于分離抗體的活性片段的一般技術的進一步說明可見例如Khaw,B.A.etal.J.Nucl.Med.23:1011-1019(1982)。術語“抗體”還包括雙特異性和嵌合抗體。如本文所述的抗體指全長(即天然存在的或通過通常的免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫學活性的(即特異結合性的)片段，如抗體片段一樣?？贵w片段是抗體的部分，如F(ab').sub.2,F(ab).sub.2,Fab',Fab,Fv,sFv等。不考慮結構，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。例如，3F8單克隆抗體片段與3F8所識別的表位結合。術語“抗體片段”還包括任何通過結合特異性抗原形成復合物而像抗體一樣作用的任何合成或基因工程的蛋白質(zhì)。例如，抗體片段包括由下述組成的分離片段：可變區(qū)，例如由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的“Fv”片段；其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)；以及由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單位。用語“單克隆抗體”是本領域公知的術語。單克隆抗體是相同的單特異性抗體，因為它們是一種免疫細胞生成的，這些免疫細胞都是單一親本細胞的克隆。本領域存在多種用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法。例如，可以通過重組DNA方法，如美國專利第4,816,567號中描述的那些方法來制作單克隆抗體。在此語境中，術語“單克隆抗體”涉及從單一真核、噬菌體、或原核克隆獲得的抗體。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA可以利用常規(guī)程序(例如通過使用能夠特異性結合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈、或來自人、人源化或其他來源的此類鏈的基因的寡核苷酸探針)分離和測序。一旦被分離，可以將DNA置入表達載體，然后將該載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞如NS0細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、酵母細胞、藻類細胞、卵、或原本不產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細胞，以獲得重組宿主細胞中單克隆細胞的合成。DNA還可以通過用期望的物種的人重鏈和輕鏈恒定域編碼序列替換同源人序列(美國專利4,816,567，Morrison等人，同上)，或通過將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或一部分共價連接于免疫球蛋白編碼序列來加以修飾。可以用此類非免疫球蛋白多肽替換本發(fā)明的抗體的恒定域，或者可用其替換本發(fā)明的抗體的一個抗原結合位點的可變域，來形成嵌合二價抗體。術語“表位”是本領域公知的。按照通常本領域技術人員的理解其涉及抗原的與抗體相互作用的區(qū)域。肽或蛋白質(zhì)或糖抗原的表位可以是線性的或者是構象性的，或者可以由抗原的鄰接或非鄰接的氨基酸和/或糖序列形成。GD2分子，像許多碳水化合物一樣，含有許多表位。由本發(fā)明的抗體所識別的表位或糖，以及這些糖的仍然被該抗體識別的保守取代，GD2抗原的化學模擬物的肽，以及抗獨特型抗體，都是本發(fā)明的實施方案。這些糖，或模擬肽/化學品，或抗獨特型抗體，提供了在免疫親和柱上洗脫GD2到MoAb或從GD2洗脫MoAb的方便方法。對這些表位的進一步截短是可能的。裸抗體通常是未與治療劑綴合的完整抗體。這樣是因為抗體分子的Fc部分提供效應物功能，諸如補體固定和ADCC(抗體依賴性細胞細胞毒性)，效應物功能啟動某些機制的作用，有可能導致細胞裂解。裸抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體二者，以及某些重組抗體，諸如嵌合、人源化或人抗體。然而，有可能的是Fc部分并非為治療功能所必需，而是抗體通過其他機制，諸如誘導細胞周期靜息和凋亡來發(fā)揮治療效應。在此情況下，裸抗體也包括上文定義的未綴合的抗體片段。嵌合抗體是一種重組蛋白質(zhì)，其含有包括源自一個物種的抗體(優(yōu)選嚙齒動物抗體)的互補決定區(qū)(CDR)的可變域，而該抗體分子的恒定域則源自人抗體的那些。對于獸醫(yī)應用，嵌合抗體的恒定域可源自其他物種(如貓或犬)的。人源化抗體是一種重組蛋白質(zhì)，其中來源于來自一個物種的抗體(例如嚙齒動物抗體)的CDR從該嚙齒動物抗體的重鏈和輕鏈可變域被轉(zhuǎn)移到人重鏈和輕鏈可變域中。所述抗體分子的恒定域源自人抗體的那些。人抗體是這樣的抗體，其獲自這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)被“工程化”從而響應于抗原攻擊而產(chǎn)生特異性的(specific)人抗體。在這種技術中，抗體重鏈和輕鏈基因座的元件被導入源自含有內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座位的靶向破壞的胚胎干細胞系的小鼠品系。該轉(zhuǎn)基因小鼠能夠合成對人抗原特異性的人抗體，且該小鼠可用來產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。用于從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法在Greenetal.,NatureGenet.7:13(1994),Lonbergetal.,Nature368:856(1994),andTayloretal.,Int.Immun.6:579(1994)中有說明。完全人的抗體還可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染方法、以及噬菌體展示技術來構建，這些都是本領域已知的。例如參見McCaffertyetal.,Nature348:552-553(1990)，其從來自未經(jīng)免疫的供體的免疫球蛋白可變域基因庫體外產(chǎn)生人抗體及其片段。在這種技術中，將抗體可變域基因合框地克隆到絲狀細菌噬菌體的主要或次要包殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示到噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇亦導致編碼展示這些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。通過這種方式，噬菌體模擬B細胞的某些性質(zhì)。噬菌體展示可以按照多種模式進行，這些模式的綜述參見例如JohnsonandChiswell,CurrentOpinioninStructuralBiology3:5564-571(1993)。還可以通過體外活化的B細胞來生成人抗體。參見例如美國專利第5,567,610號和第5,229,275號，茲通過提述并入其全部內(nèi)容。治療劑是與抗體部分(即抗體或抗體片段，或子片段)分別、同時或順序施用，或者綴合于抗體部分，并有用于治療疾病的分子或原子。治療劑的粒子包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)物、螯合劑、硼化合物、光敏劑或染料以及放射性同位素。診斷劑是施用綴合于抗體部分(即抗體或抗體片段或子片段)，并通過確定含有抗體的細胞的位置而有用于診斷或檢測疾病的分子或原子。有用的診斷劑包括但不限于放射性同位素、染料(如具有生物素-鏈親和素復合物)、造影劑、熒光化合物或分子以及用于核磁共振成像(MRI)的增強劑(例如順磁離子)。美國專利第6,331,175號描述了MRI技術以及綴合于MRI增強劑的抗體的制備，茲通過提述并入其全部內(nèi)容。優(yōu)選地，診斷劑選自下組：放射性同位素、用于核磁共振成像的增強劑、以及熒光化合物。為了讓抗體組分負載放射性活性金屬或順磁離子，有可能需要使其與具有長尾部的化合物反應，其中該化合物附接有多個螯合基團用于結合所述離子。這樣的尾部可以是聚合物，諸如聚賴氨酸、多糖、或其他具有可結合螯合基團(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙-氨硫脲，聚肟、以及已知可用于此目的的類似基團)的側(cè)基的衍生化鏈或可衍生化鏈。使用標準化學將螯合物偶連到抗體。通常通過這樣的基團將螯合物連接于抗體，使得能夠在最小的免疫反應性損失、最小的聚集和/或內(nèi)部交聯(lián)的條件下與分子形成鍵。其他更通常的綴合螯合物到抗體的方法和試劑公開于授予Hawthorne的美國專利第4,824,659，名稱為“AntibodyConjugates”(抗體綴合物)，授權公告日為1989年4月25日，茲通過提述并入其全部內(nèi)容。特別有用的金屬-綴合物組合包括2-芐基-DTPA及其單甲基和環(huán)己基類似物，與診斷用同位素一起用于放射性成像。相同的螯合物當與非放射性金屬如錳、鐵和釓復合時，當與本發(fā)明的抗體一起使用時，可用于MRI。大環(huán)螯合物如NOTA、DOTA和TETA可以與多種金屬和放射性金屬(radiometal)一起使用，最具體地是分別與鎵、釔和銅的放射性核素一起使用。通過調(diào)整環(huán)大小以適應感興趣的金屬，可以使這些金屬-螯合物復合物變得非常穩(wěn)定。其他環(huán)型螯合物諸如大環(huán)聚醚，其因可穩(wěn)定地結合核素如223Ra以供用于RAIT而受到關注，被本發(fā)明所涵蓋。免疫綴合物是抗體組分與治療或診斷劑的綴合物。診斷劑可包括放射性或非放射性標記物、造影劑(諸如用于磁共振成像、計算機斷層照相或超聲)，且放射性標記物可以是發(fā)射γ、β、α、俄歇電子、或正電子的同位素。免疫調(diào)節(jié)物是如本發(fā)明定義的治療劑，當存在時，典型地刺激免疫細胞在免疫應答級聯(lián)中增殖或活化，諸如巨噬細胞、B細胞和/或T細胞。如本文中描述的免疫調(diào)節(jié)物的一個例子是細胞因子。如本領域技術人員將會領會的，特定的白介素和干擾素是刺激T細胞或其他免疫細胞增殖的細胞因子的實例。表達載體是包含在宿主細胞中表達的基因的DNA分子。典型地，基因表達被置于特定的調(diào)節(jié)元件(包括組成型和誘導型啟動子、組織特異性調(diào)節(jié)元件，和增強子)的控制之下。這樣的基因被稱為“可操作地連接于”所述調(diào)節(jié)元件。重組宿主細胞可以是任何含有克隆載體或者表達載體的原核或真核細胞。該術語還包含已經(jīng)過基因工程改造，從而在宿主細胞的染色體或基因組中，或者宿主細胞的細胞中含有經(jīng)克隆的基因的那些原核或真核細胞，以及轉(zhuǎn)基因動物。多特異性抗體是這樣的抗體，其能夠同時結合至少兩個不同結構的靶，例如兩種不同的抗原，同一抗原上的兩種不同表位，或一種半抗原與一種抗原或表位。例如，一種特異性可以是針對例如B細胞、T細胞、髓樣細胞、漿細胞、或肥大細胞抗原或表位的。另一種特異性可以是針對相同細胞類型上的不同抗原，如B細胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、或CD22。多特異性、多價抗體是具有多于一個結合位點的構建物，且所述各結合位點具有不同特異性。例如，一種雙特異性雙抗體，其中一個結合位點與一種抗原反應，另一個結合位點與另一種抗原反應。雙特異性抗體是這樣的抗體，其能夠同時結合具有不同結構的兩個靶。雙特異性抗體(bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)具有特異性結合例如GD2的至少一條臂，以及至少另一條特異性結合攜帶治療或診斷劑的可尋靶綴合物的臂。可以利用分子工程產(chǎn)生多種雙特異性融合蛋白。在一個形式中，雙特異性融合蛋白是二價的，由例如一個具有針對一種抗原的單一結合位點的scFv，以及一個具有針對第二種抗原的結合位點的Fab片段所組成。在另一個方面，雙特異性融合蛋白是四價的，由例如一個具有針對一種抗原的兩個結合位點的IgG，以及兩個針對第二種抗原的相同的scFv所組成。新近的產(chǎn)生雙特異性MoAb的方法包括這樣的工程化重組MoAb，它們具有額外的半胱氨酸殘基，使得它們比更常見的免疫球蛋白同種型更強地交聯(lián)。參見例如FitzGeraldetal.,ProteinEng.10(10):1221-1225,1997。另一種途徑是工程改造出這樣的重組融合蛋白：其連接兩個或更多個具有需要的雙重特異性的不同單鏈抗體或抗體片段區(qū)段。參見例如Colomaetal.,NatureBiotech.15:159-163,1997。利用分子工程可以產(chǎn)生多種雙特異性融合蛋白。連接兩個或更多個不同的單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白是以類似的方式產(chǎn)生的。重組方法可以用來產(chǎn)生多種融合蛋白。柔性的接頭將scFv連接到3F8抗體的重鏈的恒定區(qū)?；蛘撸梢詫cFv連接于另一人源化抗體的輕鏈的恒定區(qū)。通過PCR反應，將合框連接重鏈Fd與scFv所需的合適接頭序列導入VL和Vκ域。然后將編碼scFv的DNA片段連接到含有編碼CH1域的DNA序列的中間載體(stagingvector)中。將所得的scFv-CH1構建體切離并連接到含有編碼3F8抗體的VH區(qū)的DNA序列的載體中。所得的載體可以用來轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，如哺乳動物細胞，用于表達所述雙特異性融合蛋白。本發(fā)明的3F8抗體及其片段還可以用來制備功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，又稱雙抗體(diabodies)，并且可以使用重組方法在哺乳動物細胞中生成。參見例如Macketal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:7021-7025,1995,茲通過提述并入本文。例如，利用重組方法，藉由谷氨酸-絲氨酸接頭連接兩個單鏈Fv片段來產(chǎn)生bscAb。利用本領域已知的標準PCR方法分離兩種感興趣的抗體的V輕鏈和V重鏈域。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合蛋白包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文描述的雙特異性雙抗體的最終用途是用于預靶定(pre-targeting)GD2陽性細胞以便后續(xù)特異性投遞診斷/檢測劑或治療劑。這些雙抗體選擇性地結合被靶定的抗原，使得親和力增加以及在期望位置處的駐留時間更長成為可能。此外，非抗原結合的雙抗體被快速地從身體清除，且正常組織的暴露被最小化。所述診斷/檢測劑及治療劑可以包括同位素、藥物、毒素、細胞因子、激素、生長因子、綴合物、放射性核素、以及金屬。例如釓金屬用于磁共振成像(MRI)。放射性核素，尤其是在60-4000keV的能量范圍中的那些，也可以用作診斷劑和治療劑。所述可尋靶的構建物可以有多種多樣的結構，但對其加以選擇，以便在bsAb尋靶方法中使用時不僅避免引發(fā)免疫應答，還可快速地在體內(nèi)清除。疏水性作用劑在引發(fā)強免疫應答方面是最好的，而親水性作用劑對于快速體內(nèi)清除而言是優(yōu)選的；因此，需要在疏水性和親水性之間建立平衡。這部分地通過依賴使用親水性螯合劑抵消多種有機部分的固有疏水性來實現(xiàn)。另外，可以選擇具有相反的溶液性質(zhì)的可尋靶構建體亞單位，例如肽，其含有氨基酸，其中某些氨基酸是疏水性的，某些氨基酸是親水性的。除了肽之外，可以使用碳水化合物。可以使用少達兩個氨基酸殘基的肽，優(yōu)選2-10個殘基，如果還偶連于其他部分如螯合劑的話。接頭應當為低分子量綴合物，優(yōu)選具有小于50000道爾頓的分子量，最好小于大約20000道爾頓，10000道爾頓或5000道爾頓，其中包括所述螯合物中的金屬離子。所述接頭部分上親水性螯合物部分的存在有助于確?？焖俚捏w內(nèi)清除。除了親水性之外，還針對它們的金屬結合性質(zhì)遴選螯合劑，并隨意加以改變，因為至少對于那些其bsAb表位是肽的一部分或者是非螯合物化學半抗原的接頭而言，金屬-螯合物螯合物的識別不再是問題。螯合劑如DTPA、DOTA、TETA、或NOTA或合適的肽，可綴合可檢測的標記物(如熒光分子)或細胞毒劑(如重金屬或放射性核素)。例如，將光敏劑或染料與抗體融合蛋白綴合，可以獲得在治療上有用的免疫綴合物。已經(jīng)使用熒光組合物，如熒光色素，以及其他色原，或染料，如對可見光敏感的卟啉，來通過將合適的光導向病變來檢測和治療病變。在治療中，這被稱為光輻射(photoradiation),光療(phototherapy),或光動力學療法(photodynamictherapy)(Jorietal.(eds.),PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985);vandenBergh,Chem.Britain22:430(1986))。此外，還已將單克隆抗體偶連于光活化的染料來實現(xiàn)光療。Mewetal.,J.Immunol.130:1473(1983);同上,CancerRes.45:4380(1985);Oseroffetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8744(1986);同上,Photochem.Photobiol.46:83(1987);Hasanetal.,Prog.Clin.Biol.Res.288:471(1989);Tatsutaetal.,LasersSurg.Med.9:422(1989);Pelegrinetal.,Cancer67:2529(1991)。但是，這些較早的研究沒有包含內(nèi)窺鏡療法應用，尤其是同時使用抗體片段或子片段。因此，本發(fā)明考慮包含光敏劑或染料的免疫綴合物的治療用途。相同的螯合劑當與非放射性金屬如Mn、Fn和Gd螯合時，當與本發(fā)明的bsAbs一起使用時，可以用于MRI。大環(huán)螯合劑如NOTA(1,4,7-三氮雜-環(huán)壬烷-N,N',N''-三乙酸)、DOTA、和TETA(對-溴乙酰胺-芐基-四甲基胺四乙酸)可以與多種金屬和放射性金屬一起使用，尤其是分別與Ga、Y和Cu的放射性核素一起使用。如本文中使用的，術語“預防”涉及作為預防劑或治療劑施用的結果，受試者中某種病癥的一種或多種癥狀的復發(fā)或發(fā)病的防止。如本文中使用與，術語“組合”涉及使用多于一種預防和/或治療劑。術語“組合”并不限制對具有病癥的受試者施用各預防劑和/或治療劑的順序。對具有病癥的受試者施用第一預防或治療劑可以在施用第二預防或治療劑之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、25分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同時、或之后(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)。如本文中所述的“效應物功能”意思是抗體Fc區(qū)域與Fc受體或配體相互作用而導致的生物化學事件。效應物功能包括但不限于抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)、以及補體介導的細胞毒性(CMC)。效應物功能包括在抗原結合之后運作的那些，以及不依賴于抗原結合而運作的那些。如本文中所述的“效應(物)細胞”意思是免疫系統(tǒng)的表達一種或多種Fc受體并介導一種或多種效應物功能的細胞。效應物細胞包括但不限于單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴細胞、郎格漢斯細胞、天然殺傷(NK)細胞、T-淋巴細胞、B-淋巴細胞，并且可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。如本文中使用的“Fc配體”意思是來自任何生物的這樣的分子，優(yōu)選多肽，其結合抗體的Fc區(qū)而形成Fc-配體復合物。Fc配體包括但不限于Fc-γ-RIIA(CD32A)、Fc-γ-RIIB(CD32B)、Fc-γ-RIIIA(CD16A)、Fc-γ-RIIIB(CD16B)、Fc-γ-RI(CD64)、Fc-ε-RII(CD23)、FcRn、C1q、C3、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G、以及病毒Fc.γ.R。Fc片段可包括結合Fc的尚未發(fā)現(xiàn)的分子。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)域的分子，其中所述Fc區(qū)域相對于野生型Fc區(qū)域包含至少一個氨基酸修飾，使得所述分子具有對FcγR的改變的親和力，只要所述變體Fc區(qū)域在根據(jù)對Fc-FcγR相互作用的晶體學和結構分析與Fc-FcγR直接接觸的位置(如Sondermannetal.、2000(Nature、406:267-273，本文通過提述并入其全部內(nèi)容)中公開的那些)不具有取代即可。Fc區(qū)域內(nèi)與FcγR直接接觸的位置的例子為氨基酸234-239(鉸鏈區(qū))、氨基酸265-269(B/C環(huán))、氨基酸297-299(C'/E環(huán))、和氨基酸327-332(F/G)環(huán)。在某些實施方案中，本發(fā)明的包含變體Fc區(qū)域的分子包含對至少一個根據(jù)結構和晶體學分析與Fc-FcγR直接接觸的殘基的修飾。本發(fā)明的一個方面包括具有對活化性和/或抑制性受體的改變的親和力的3F8抗體，其具有包含一個或多個氨基酸修飾的變體Fc區(qū)域，其中所述一個或多個氨基酸修飾是在第239位用天冬氨酸的取代，在第330位用亮氨酸的取代，以及在第332位用谷氨酸的取代(見實施例13)。本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)域的分子，所述變體Fc區(qū)域在本發(fā)明的抗體的Fc區(qū)域中具有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代，以改變效應物功能，或增強或降低抗體對FcR的親和力。這些突變是本領域技術人員能力之內(nèi)的。因此，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)域的分子，所述變體Fc區(qū)域以更大的親和力結合一種或多種FcγR。這樣的分子優(yōu)選更有效地介導效應物功能，如上文討論的。在其他實施方案中，本發(fā)明涵蓋包含變體Fc區(qū)域的分子，所述變體Fc區(qū)域以更弱的親和力結合一種或多種FcγR。降低或消除效應物功能在某些情況下是理想的，例如在抗體的作用機理涉及阻斷或拮抗，而不是殺死攜帶靶抗原的細胞的情況下。降低或消除效應物功能在要阻斷效應物細胞中的FcγR活化受體的自身免疫病的情況下(這種類型的功能會存在于宿主細胞中)可能是理想的。一般而言，增加的效應物功能會指向腫瘤和外來細胞。本發(fā)明的Fc變體可與其他Fc修飾組合，包括但不限于改變效應物功能的修飾。本發(fā)明涵蓋將本發(fā)明的Fc變體與其他Fc修飾組合來提供抗體或Fc融合物中的疊加、協(xié)同或新的性質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的Fc變體增強它們與之組合的修飾的表型。例如，如果本發(fā)明的Fc變體與已知以高于相當?shù)陌吧虵c區(qū)域的分子的親和力結合FcγRIIIA的突變體組合，這種與本發(fā)明的突變體的組合導致FcγRIIIA親和力的更大倍數(shù)的提高。在一些實施方案中，本發(fā)明的Fc變體被組入這樣的抗體或Fc融合物中，所述抗體或Fc融合物包含一個或多個工程化的糖形(glycoforms)，即與包含F(xiàn)c區(qū)域的分子共價連接的碳水化合物組合物(carbohydratecomposition)，其中所述碳水化合物組合物在化學上不同于與包含F(xiàn)c區(qū)域的親本分子的碳水化合物組合物。本發(fā)明涵蓋具有修飾的糖基化位點的抗體，優(yōu)選不改變抗體的功能性，例如結合活性GD2。如本文中使用的，“糖基化位點”包括抗體中任何如下所述的特定的氨基酸序列：寡糖(即含有兩個或更多個連接到一起的簡單糖的碳水化合物+)會特異性并共價地附接到該氨基酸序列。寡糖側(cè)鏈典型地通過N-或O-連接與抗體的骨架連接。N連接的糖基化指寡糖部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的附接。O-連接的糖基化指寡糖部分與羥基氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸的附接。在特殊的CHO細胞中產(chǎn)生了一種Fc-糖形hu3F8-H1L1-IgG1n，其缺少某些寡糖，包括巖藻糖和末端N-乙酰葡糖胺，并展現(xiàn)增強的ADCC效應物功能。在某些實施方案中，本發(fā)明涵蓋通過增加或缺失糖基化位點來調(diào)節(jié)本發(fā)明抗體的碳水化合物含量的方法。調(diào)節(jié)抗體的碳水化合物含量的方法是本領域公知的，并涵蓋在本發(fā)明中，參見例如美國專利第6,218,149號；EP0359096B1;美國專利申請公開US2002/0028486；WO03/035835;美國專利申請公開2003/0115614;美國專利第6,218,149號；美國專利第6,472,511號，本文通過提述并入所有這些文獻的全部內(nèi)容。在其他實施方案中，本發(fā)明涵蓋通過缺失抗體的一個或多個內(nèi)源碳水化合物部分來調(diào)節(jié)本發(fā)明的抗體的碳水化合物含量的方法。在特定的實施方案中，本發(fā)明涵蓋通過將第297位從天冬酰胺修飾為丙氨酸來缺失抗體的Fc區(qū)域的糖基化位點。工程化的糖形可用于多種目的，包括但不限于提高或降低效應物功能。工程化的糖形可以通過本領域技術人員所知的任何方法來生成，例如通過使用工程化的或變體表達株，通過與一種或多種酶(例如DIN-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(GnTI11)共表達，通過在多種生物體或來自多種生物體的細胞系中表達包含F(xiàn)c區(qū)域的分子，或者通過在已經(jīng)表達了包含F(xiàn)c區(qū)域的分子之后修飾碳水化合物。用于生成工程化的糖形的方法是本領域已知的，包括但不限于下列文獻中描述的那些：Umanaetal,1999,Nat.Biotechnol17:176-180;Daviesetal.,20017BiotechnolBioeng74:288-294;Shieldsetal,2002,JBiolChem277:26733-26740;Shinkawaetal.,2003,JBiolChem278:3466-3473)美國專利第6,602,684號;美國申請流水號10/277,370；美國申請流水號10/113,929;PCTWO00/61739A1;PCTWO01/292246A1;PCTWO02/311140A1;PCTWO02/30954A1;PotillegentTM技術(Biowa,Inc.Princeton,N.J.);GlycoMAbTM糖基化工程化技術(GLYCARTbiotechnologyAG,Zurich,Switzerland);本文通過提述并入每一篇的全部內(nèi)容。參見例如WO00061739;EA01229125;US20030115614;Okazakietal.,2004,JMB,336:1239-49本文通過提述并入每一篇的全部內(nèi)容。如本文使用的，術語“衍生物”在多肽或蛋白質(zhì)的語境中指這樣的多肽或蛋白質(zhì)，其包含已經(jīng)通過導入氨基酸殘基取代、缺失或添加而改變了的氨基酸序列。如本文所用的，術語“衍生物”還指已經(jīng)經(jīng)過修飾的多肽或蛋白質(zhì)，例如通過將任何類型的分子共價連接到多肽和蛋白質(zhì)而修飾的多肽或蛋白質(zhì)。例如，但不限于，抗體可以通過例如糖基化、乙?；?、PEG化、磷酸化、酰胺化、用已知的保護基/封閉基衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體或其他蛋白質(zhì)結合等方式來修飾。衍生的多肽或蛋白質(zhì)可以通過使用本領域技術人員已知的技術進行化學修飾來產(chǎn)生，包括但不限于特異性化學切割、乙?；?、甲?；⒁旅顾氐拇x合成，等等。此外，衍生化多肽或蛋白質(zhì)衍生物與衍生它們的多肽或蛋白質(zhì)具有類似或相同的功能。如本文中使用的，術語“片段”指這樣的肽或多肽，其包含另一多肽的氨基酸序列的至少5個連續(xù)氨基酸殘基，至少10個連續(xù)氨基酸殘基，至少15個連續(xù)氨基酸殘基，至少20個連續(xù)氨基酸殘基，至少25個連續(xù)氨基酸殘基，至少40個連續(xù)氨基酸殘基，至少50個連續(xù)氨基酸殘基，至少60個連續(xù)氨基酸殘基，至少70個連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)80個氨基酸殘基，至少連續(xù)90個氨基酸殘基，至少連續(xù)100個氨基酸殘基，至少連續(xù)125個氨基酸殘基，至少150個連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)175個氨基酸殘基，至少連續(xù)200個氨基酸殘基，或至少連續(xù)250個氨基酸殘基的氨基酸序列。在特定的實施方案中，多肽的片段保留多肽的至少一種功能。有效量：如本文中使用的，術語“有效量”涉及對于實現(xiàn)期望的生物學效應為必要或充分的給定化合物、綴合物或組合物的量。給定化合物、綴合物或組合物的依照本發(fā)明的方法的量會是達到此選定結果的量，而且本領域技術人員使用本領域已知的和/或本文中描述的測定法可以常規(guī)地確定這樣的量，而不需付出過度的實驗。例如，用于治療或預防癌癥轉(zhuǎn)移的有效量可以是為了防止腫瘤細胞體內(nèi)遷移和侵襲穿過基底膜或穿過內(nèi)皮細胞層所必要的量。該術語也與“充分量”同義。對于任何具體應用而言的有效量可以依賴于所治療的疾病、病癥或狀況、所施用的特定組合物、施用的路徑，受試者的身體大小，和/或疾病的嚴重程度等因素而變化。本領域普通技術人員能夠遵照本文中提供的指導根據(jù)經(jīng)驗確定本發(fā)明的具體化合物、綴合物或組合物的有效量而不需要過度的實驗。如本文中與測得的量聯(lián)用的術語“約”是指技術人員在給予與測量的目的以及所用的測量設備相當?shù)淖⒁馑降臈l件下，可預期的測得的量的正常變化。除非另有說明，“約”指所給出的數(shù)值的+/-10%的變化?！胺蛛x的”多肽或其片段、變體或衍生物意指不處于其天然環(huán)境中的多肽。不要求具體水平的純化。例如，分離的多肽可以是從其天然或自然環(huán)境中移出的。就本發(fā)明的目的而言，在宿主細胞中表達的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認為是分離的，而已經(jīng)通過任何合適的技術分開、分級、或部分地或?qū)嵸|(zhì)上地純化的天然或重組多肽也認為是分離的。作為本發(fā)明的多肽，還包括前述肽的片段、衍生物、類似物或變體，及其任何組合。術語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”當指抗GD2抗體或抗體多肽時包括任何保留相應的天然抗體或多肽的至少一些抗原結合性質(zhì)的多肽，即那些保留結合GD2上的一個或多個表位的能力的多肽。本發(fā)明的多肽的片段還包括蛋白水解片段、以及缺失片段，除了本文中他處討論的具體抗體片段之外。可依照本發(fā)明使用的抗GD2抗體和抗體多肽的變體包括如上文描述的片段，以及具有由于氨基酸取代、缺失或插入而改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的變體可以使用本領域已知的誘變技術或非天然氨基酸產(chǎn)生。變體多肽可包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加?？梢砸勒毡景l(fā)明使用的抗GD2抗體和抗體多肽的衍生物是已經(jīng)經(jīng)過改變而展現(xiàn)天然多肽中不出現(xiàn)的其他特征的多肽。例子包括融合多肽。變體多肽在本文中可以稱為“多肽類似物”。如本文中使用的，抗GD2抗體或抗體多肽的“衍生物”涉及具有一個或多個通過功能性側(cè)基的反應而化學衍生化的殘基的主題多肽?！把苌铩边€包括含有一個或多個20種標準氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可以替換脯氨酸；5-羥賴氨酸可以替換賴氨酸；3-甲基組氨酸可以替換組氨酸；高絲氨酸可以替換絲氨酸；且鳥氨酸可以替換賴氨酸。治療：如本文使用的，術語“治療”涉及預防(prophylaxis)和/或療法(therapy)，尤其是其中目標是防止或減慢(減少)不期望的生理學變化或病癥，例如多發(fā)性硬化的進展。有益的或期望的臨床結果包括但不限于癥狀的減輕，疾病程度的減小，疾病狀態(tài)的穩(wěn)定化(即不惡化)，疾病進展的延遲或減慢，疾病狀態(tài)的改善或緩和，以及緩解(部分或全部)，不管是可檢測的或是不可檢測的?！爸委煛边€可以意指與預期如果不接受治療的情況相比延長生存。需要治療者包括已經(jīng)具有狀況或病癥者，或者傾向于具有狀況或病癥者，或要預防狀況或病癥者?！笆茉囌摺被颉皞€體”或“動物”或“哺乳動物”意指期望進行診斷、預后或治療的任何受試者，尤其是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括人和其他靈長類動物、家養(yǎng)動物、農(nóng)場動物，以及動物園、運動或?qū)櫸飫游锶缛?、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、母牛等。人源化抗體在一個實施方案中，本發(fā)明提供的抗體是單克隆抗體，所述單克隆抗體在一個優(yōu)選的實施方案中是源自其他物種的相關抗GD2抗體的人源化形式。人源化抗體是通過重組DNA技術產(chǎn)生的抗體，其中用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈中對于抗原結合而言不需要的某些或全部氨基酸(例如恒定區(qū)以及可變域的框架區(qū))替換來自相關的非人抗體的輕鏈或重鏈的相應氨基酸例如，針對給定抗原的鼠抗體的人源化形式在其重鏈和輕鏈上具有(1)人抗體的恒定區(qū)；(2)來自人抗體的可變域的框架區(qū)；以及(3)來自鼠抗體的CDR。當必要時，人框架區(qū)中的一個或多個殘基可以改變?yōu)槭罂贵w中的相應位置處的殘基，以保留人源化抗體對抗原的結合親和力。這種改變有時稱為“回復突變”。類似地，為了期望的理由，例如穩(wěn)定性或?qū)乖挠H和力，可進行正向突變(forwardmutation)來恢復到鼠序列。例如，對于hu3F8-H1L1-IgG1，必須在重鏈序列中的19個位置上和輕鏈中的17個位置上進行回復突變，以保持體外結合親和力。人源化抗體通常與嵌合抗體相比在人體中引發(fā)免疫應答的可能性較小，因為前者所含的非人組分低得多。在例如下列文獻中記載了制造本發(fā)明的人源化抗體的合適方法：WinterEP0239400;Jonesetal.,Nature321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988);Queenetal.,Proc.Nat.Acad.ScLUSA86:10029(1989);美國專利6,180,370;和Orlandietal.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:3833(1989)；本文通過提述并入所有這些文獻的全部公開內(nèi)容。一般地，將鼠(或其他非人)CDR移植到人抗體上是這樣實現(xiàn)的。從雜交瘤分離編碼重鏈和輕鏈可變域的cDNA。通過測序確定可變域(包括CDR)的DNA序列。將編碼CDR的DNA插入人抗體重鏈或輕鏈可變域編碼序列的相應區(qū)域中，與期望同種型(例如對CH而言的γ1和對CL而言的K)的人恒定區(qū)基因區(qū)段連接，進行基因合成。將人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物宿主細胞(例如CHO或NSO細胞)中共表達以產(chǎn)生可溶性人源化抗體。為便于大規(guī)模產(chǎn)生抗體，在產(chǎn)生系中利用DHFR基因或GS基因選擇高表達者常常是理想的。將這些產(chǎn)生細胞系在生物反應器中或空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)中，或者使用WAVE技術進行培養(yǎng)，以產(chǎn)生可溶性抗體的大批培養(yǎng)物，或產(chǎn)生在乳汁中表達抗體的轉(zhuǎn)基因哺乳動物(例如山羊、?；蚓d羊)(參見美國專利5,827,690)。使用上述的方法，生成了3F8抗體的人源化和嵌合形式。用編碼輕鏈和重鏈的鼠3F8可變區(qū)的cDNA構建用于表達鼠-人嵌合物的載體，所述嵌合物中鼠3F8可變區(qū)連接于人IgG1(對于重鏈)和人κ(對于輕鏈)恒定區(qū)，如本文實施例中所述的。此外，為了提高對Fc受體的結合以及提高抗原親和力，創(chuàng)建了具有變體糖基化的hu3F8新形式。為了產(chǎn)生人源化3F8抗體，通過對人種系序列的同源性匹配選擇了人接受體框架域。使用這些選出的人接受體框架，設計了輕鏈和重鏈可變域，并生成和表達了每一種所述可變域的多種變體/形式，如下文實施例中所述。本申請中描述了本發(fā)明的MoAb的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明抗體及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋在嚴格或較低嚴格雜交條件下與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。所述多核苷酸現(xiàn)在可以通過本領域中已知的任何方法獲得。例如，由于抗體的核苷酸序列是已知的，可以用化學合成的寡核苷酸組裝編碼抗體的多核苷酸(例如如Kutmeieretal.,BioTechniques17:242(1994)中所述)，簡單地說，這包括合成含有編碼抗體的序列的部分的重疊的寡核苷酸，退火并連接這些寡核苷酸，然后通過PCR擴增連接的寡核苷酸。或者，可以從來自合適來源的核酸生成編碼抗體的多核苷酸。如果含有編碼具體抗體的核酸的克隆不可用，但抗體分子的序列已知，則可以化學合成或者從合適的來源(例如抗體cDNA文庫，或從任何表達所述抗體的組織或細胞，如選出的編碼本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞生成的cDNA文庫或分離的核酸，優(yōu)選多聚A+RNA)通過下述方式獲得編碼免疫球蛋白的核酸：使用可與所述序列的3’和5’端雜交的合成引物進行PCR擴增，或者通過使用對特定基因序列特異性的寡核苷酸探針進行克隆，以鑒定例如來自編碼所述抗體的cDNA文庫的cDNA克隆。隨后可使用本領域公知的任何方法將PCR產(chǎn)生的經(jīng)擴增的核酸克隆到可復制的克隆載體中。由于抗體的核苷酸序列和相應的氨基酸序列是確定的，可以使用本領域公知的核苷酸序列操作方法，例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等(參見例如下列文獻中記載的技術：Sambrooketal.,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，和Ausubeletal.,eds.,1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.，二者都通過提述全部并入本文)來操作該核苷酸序列，來生成具有不同氨基酸序列的抗體，例如生成氨基酸取代、缺失和/或插入。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者是DNA的形式，包括但不限于通過克隆獲得或化學合成的cDNA和基因組DNA，或其任何組合。DNA可以是三鏈的、雙鏈的、或單鏈的，或其任何組合。DNA或RNA的至少一條鏈上的任何部分可以是編碼鏈，又稱有義鏈，或其可為非編碼鏈，又稱反義鏈。本發(fā)明的分離的核酸分子可包括這樣的核酸分子，其包含可讀框(ORF)，任選地具有一個或多個內(nèi)含子，例如但不限于至少一條重鏈或輕鏈的至少一個CDR(如CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一個特定的部分；包含抗GD2抗體或可變區(qū)的編碼序列的核酸分子；以及包含這樣的核苷酸序列的核酸分子：該核苷酸序列與上述的那些實質(zhì)不同，但由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼如本文所述和/或本領域已知的抗GD2抗體。本發(fā)明提供在選擇性的雜交條件下與本文中公開的多核苷酸雜交的分離的核酸。因此，該實施方案的多核苷酸可以用來分離、檢測和/或定量編碼此類多核苷酸的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以用來鑒定、分離或擴增經(jīng)保藏的文庫中的部分或全長克隆。在某些實施方案中，所述多核苷酸是從來自人或哺乳動物核酸文庫分離的或以其他方式與之互補的基因組或cDNA序列。所述核酸可方便地包含除了本發(fā)明的多核苷酸之外的序列。例如，可以將包含一個或多個內(nèi)切核酸酶限制位點的多克隆序列插入核酸中以幫助該多核苷酸的分離。此外，可以插入可翻譯的序列以幫助經(jīng)翻譯的本發(fā)明多核苷酸的分離。例如，六組氨酸標記序列提供了一種純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的便利手段。本發(fā)明的核酸——不包括編碼序列——任選地為用于克隆和/或表達本發(fā)明的多核苷酸的載體、適體、或接頭?？梢詫Υ祟惪寺『?或表達序列添加額外的序列以優(yōu)化它們在克隆和/或表達中的功能，幫助多核苷酸的分離，或改善多核苷酸對細胞的導入?？寺≥d體、表達載體、適體、以及接頭的使用是本領域公知的(參見例如Ausubel，同上；或Sambrook同上)。本發(fā)明還提供包含任何上文所述的分離或純化的核酸分子或其片段的載體。任何上述的核酸分子或其片段可以克隆到任何合適的載體中，并用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何合適的宿主。載體的選擇和使用它們的方法是本領域普通技術人員公知的并在普通的技術參考文獻中有說明(一般地，可參見"RecombinantDNAPartD,"MethodsinEnzymology,Vol.153,WuandGrossman,eds.,AcademicPress(1987))。理想的是，視情況適宜，并考慮載體是DNA或RNA，載體包含調(diào)控序列，諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止密碼子，其對載體要導入的宿主(例如細菌、真菌、植物或動物)的類型是特異性的。優(yōu)選地，載體包含對宿主的屬(genus)而言特異性的調(diào)節(jié)序列。最優(yōu)選地，載體包含對宿主的種(species)而言特異性的調(diào)控序列。除了復制系統(tǒng)和插入的核酸序列，構建體可包含一個或多個標志物基因，所述標志物基因使得選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主成為可能。標志物基因包括殺生物劑抗性，例如對抗生素、重金屬等的抗性，補全營養(yǎng)缺陷型宿主以提供原養(yǎng)性，等等。合適的載體包括設計用來增殖和擴增，或用來表達，或二者的那些。例如，克隆載體選自pUC系列、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)，及pEX系列(Clontech,PaloAlto,Calif.)。也可以使用細菌噬菌體載體，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4,和λNM1149。植物表達載體的例子包括pBI110,pBI101.2,pBI101.3,pBI121和pBIN19(Clontech)。動物表達載體的例子包括pEUK-C1,pMAM和pMAMneo(Clontech)。TOPO克隆系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)也可以遵照制造商的推薦使用。表達載體可包含與如上所述的分離或純化的核酸分子可操作連接的天然或非天然啟動子。啟動子的選擇，例如強、弱、誘導型、組織特異性和發(fā)育特異性，是本領域技術之內(nèi)的。類似的，將如上所述的核酸分子或其片段與啟動子組合也是本領域技術之內(nèi)的。合適的病毒載體包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、基于細小病毒的載體、例如基于腺伴隨病毒(AAV)的載體、AAV-腺病毒嵌合載體，以及基于腺病毒的載體，以及慢病毒載體，如基于單純皰疹(HSV)的載體。這些病毒載體可以使用例如下列文獻中描述的標準重組DNA技術來制備：Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);以及Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.(1994)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種能夠感染極多種宿主細胞的RNA病毒。在感染時，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到它的宿主細胞的基因組中，并隨宿主細胞DNA一起被復制，從而持續(xù)地產(chǎn)生病毒RNA和任何組入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的核酸序列。這樣，當使用逆轉(zhuǎn)錄病毒時可實現(xiàn)治療因子的長期表達?？紤]用于基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒是相對地非致病性的，雖然存在致病性的逆轉(zhuǎn)錄病毒。當使用致病性逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人T細胞嗜淋巴細胞病毒(HTLV)時，需要注意改變病毒基因組以消除對宿主的毒性。可以進一步操作逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來使得該病毒復制缺陷。這樣，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被認為對體內(nèi)穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移而言特別有用。慢病毒載體，諸如基于HIV的載體，是用于基因投遞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子。不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，基于HIV的載體已知可將它們的搭乘基因(passengergenes)組入非分裂細胞，因此可用于治療頑固形式的疾病。任選地，所述分離或純化的核酸分子，或其片段，當與另一核酸分子連接時，可編碼融合蛋白。融合蛋白的生成是本領域常規(guī)技術之內(nèi)的，并可涉及限制酶或重組克隆技術的使用(參見例如Gateway.TM.(Invitrogen)).另見美國專利5,314,995。鑒于前述，本發(fā)明還提供一種組合物，其包含上文所述的分離或純化的核酸分子，任選以載體的形式。所述組合物可包含如本文進一步描述的其他組分。此外鑒于上述，本發(fā)明提供一種宿主細胞，其包含如上文描述的分離或純化的核酸分子，任選地以載體的形式。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的細胞表達所述載體，使得所述寡核苷酸或其片段被該細胞高效率地轉(zhuǎn)錄和翻譯。細胞的例子包括但不限于人細胞、人細胞系、大腸桿菌(例如大腸桿菌TB-1、TG-2、DH5α、XL-BlueMRF'(Stratagene)、SA2821和Y1090)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、銅綠假單胞菌(P.aerugenosa)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粗糙脈孢菌(N.crassa)、昆蟲細胞(例如Sf9、Ea4)，以及其他下文所述者。宿主細胞可以存在于宿主中，宿主可為動物，如哺乳動物，尤其是人。術語“多肽”在本文中用作屬類術語，指天然的蛋白質(zhì)，片段，或多肽序列的類似物。因此，天然蛋白片段和類似物是多肽屬類的種。依照本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:1,2,4,7,8中顯示的重鏈免疫球蛋白分子以及SEQIDNO:2,5,6中顯示的輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包含所述重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(如κ輕鏈免疫球蛋白分子)的組合所形成的抗體分子，反之亦然；及其片段和類似物。在一個特定的實施方案中，使用常規(guī)的重組DNA技術，可以將一個或多個本文中鑒定的CDR插入框架區(qū)?？蚣軈^(qū)可以是天然存在的或者是共有框架區(qū)，優(yōu)選是人框架區(qū)(參見例如Chothiaetal.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)中人框架區(qū)的列表)。優(yōu)選地，由框架區(qū)和CDR的組合生成的多核苷酸編碼特異性結合GD2的抗體?？梢栽诳蚣軈^(qū)中進行一個或多個氨基酸取代，并且優(yōu)選地，所述氨基酸取代改善抗體對其抗原的結合。此外，此類方法可用來取代或缺失一個或多個參與鏈間二硫鍵的可變區(qū)半胱氨酸殘基，以生成缺少一個或多個鏈間二硫鍵的抗體分子。所述多核苷酸的其他改變?yōu)楸景l(fā)明所涵蓋并在本領域技術之內(nèi)。完全人抗體對于人患者的治療性處理而言是特別理想的。人抗體可以用多種本領域已知的技術來制備，包括如上所述的噬菌體展示方法，使用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫。另參見美國專利第4,444,887和4,716,111號，以及PCT公開WO98/46645,WO98/60433,WO98/24893,WO98/16664,WO96/34096,WO96/33735,和WO91/10741；將上述每一文獻全文通過引用并入本文。Cole等人和Boerder等人的技術也可以用于制備人單克隆抗體(Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Riss,(1985);和Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86-95,(1991))。使用其他技術產(chǎn)生但保留本發(fā)明的抗GD2抗體的可變區(qū)的人抗體是本發(fā)明的一部分。人抗體還可以使用這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生，其不能表達功能性的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白，但能夠表達人免疫球蛋白基因。例如，可將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復合物隨機導入或通過同源重組導入小鼠胚胎干細胞?；蛘?，除了人重鏈和輕鏈基因之外，可以將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣性區(qū)導入小鼠胚胎干細胞。在通過同源重組導入人免疫球蛋白基因座的同時或者分別地，可以使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因變得無功能。尤其是，JH區(qū)域的純合缺失可阻止內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將經(jīng)過修飾的胚胎干細胞擴增后顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠來產(chǎn)生表達人抗體的純合后代。用選定的抗原，例如本發(fā)明多肽的全部或一部分，按照正常方式免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠?？梢詮慕?jīng)過免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠使用常規(guī)的雜交瘤技術獲得針對所述抗原的單克隆抗體。該轉(zhuǎn)基因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細胞分化過程中重排，然后經(jīng)過類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變。由此，使用這樣的技術，能夠產(chǎn)生治療上有用的IgG,IgA,IgM和IgE抗體。關于這種產(chǎn)生人抗體的技術的概述可見LonbergandHuszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。關于該項技術用于產(chǎn)生人抗體及人單克隆抗體的詳細討論以及產(chǎn)生此類抗體的規(guī)程，可見例如PCT公開WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;歐洲專利第0598877號;美國專利第5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,886,793;5,916,771;和5,939,598號,本文通過提述并入其全部內(nèi)容。此外，可接洽Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.),Genpharm(SanJose,Calif.),和Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)等公司以使用與上文所述的相似方法提供針對選定抗原的人抗體。對移植有人外周血白細胞、脾細胞或骨髓的小鼠(例如XTL的三體瘤(Trioma)技術)進行免疫也可以制造人MoAb?？梢允褂靡环N稱為“引導選擇”(guidedselection)的技術產(chǎn)生識別選定的表位的完全人抗體。在這種辦法中，使用選定的非人單克隆抗體，例如小鼠抗體，來引導選擇識別相同表位的完全人抗體(Jespersetal.,Bio/technology12:899-903(1988))。如本文使用的，“抗GD2抗體”、“抗GD2抗體部分”或“抗GD2抗體片段”和/或“抗GD2抗體變體”等等包括任何含有蛋白質(zhì)或肽的分子，其包含免疫球蛋白的至少一部分，所述至少一部分含有源自任何本文中所述的嵌合或人源化單克隆抗體的重鏈或輕鏈或其配體結合部分的至少一個互補決定區(qū)(CDR)，以及與之組合的非鼠來源，優(yōu)選人來源的、能夠組入本發(fā)明的抗體中的重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)或其任何部分?；蛘?，術語“抗GD2抗體”應合指或單獨地指嵌合抗體ch3F8-IgG1,ch3F8-IgG4,人源化單克隆抗體hu3F8-H1L1-IgG1,hu3F8H1L2-IgG1,hu3F8H2L1-IgG1hu3F8-H2L2-IgG1,hu3F8-H1L1-IgG1n,hu3F8-H1L1-IgG4,hu3F8-H3L3,hu3F8-H1L1S,hu3F8-H3L3S,huH1-I-γ-1,huH3-I-γ-1,hu3F8-IgG1-DEL抗體，以及它們的片段和區(qū)域。此類抗體能夠在體外、原位和/或在體內(nèi)調(diào)節(jié)、減少、拮抗、輕減、緩解、阻斷、抑制、消除、和/或干擾至少一種細胞功能，其中所述細胞表達GD2。作為非限制性實例，本發(fā)明的合適的抗GD2抗體、特定部分或片段可以高親和力結合人GD2表位。術語“抗體”進一步意在涵蓋抗體、消化片段、其特定部分和變體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體的結構和/或功能的抗體部分或其特定的片段或部分，它們各自含有至少一個源自抗GD2抗體的CDR。功能性片段包括結合哺乳動物GD2的抗原結合片段。例如，能夠結合GD2或其部分的抗體片段，包括但不限于Fab(例如通過木瓜蛋白酶消化),Fab'(例如通過胃蛋白酶消化和部分還原)以及F(ab')2(例如通過胃蛋白酶消化),facb(例如通過纖溶酶消化),pFc'(例如通過胃蛋白酶或纖溶酶消化),Fd(例如通過胃蛋白酶消化、部分還原和再聚集),Fv或scFv(例如通過分子生物學技術)片段，為本發(fā)明所涵蓋(見例如Colligan,Immunology,同上)?？梢云慰梢酝ㄟ^本領域已知和/或如本文所述的酶切割、合成或重組技術制備。還可以使用其中已經(jīng)在天然終止位點的上游導入了一個或多個終止密碼子的抗體基因來產(chǎn)生多種截短形式的抗體。例如，可以設計編碼F(ab')2重鏈部分的組合基因以包含編碼重鏈的CH1域和/或鉸鏈區(qū)的DNA序列?？贵w的不同部分可以通過常規(guī)技術化學連接在一起，或者可以使用基因工程技術制備為連續(xù)的蛋白質(zhì)。如本文中使用的，“嵌合”抗體或“人源化”抗體或“CDR嫁接的”包括本文中描述的抗GD2Ab，或源自其的任何CDR，與源自非鼠抗體，優(yōu)選人抗體的一種或多種蛋白質(zhì)或肽組合而成的任何組合。依照本發(fā)明，嵌合或人源化抗體包括這樣的抗體，其中諸CDR源自一種或多種本文所述的抗GD2Ab，而該抗體的至少一部分，或剩余部分源自一種或多種人抗體。因此，該抗體的人部分可包括在人體中基本上無免疫原性的框架、CL、CH域(例如CH1、CH2、CH3)、鉸鏈、(VL、VH))區(qū)域。所述抗體的源自人抗體的部分不需要與人抗體具有100%的同一性。在一個優(yōu)選的實施方案中，保留盡可能多的人氨基酸殘基以使得免疫原性可忽略，但對人殘基可以視需要加以修飾，以支持由CDR形成的抗原結合位點，同時使抗體的人源化最大化。相對于非修飾的抗體，這樣的變化或改變?nèi)芜x地并且優(yōu)選地保留或減少在人體或其他物種中的免疫原性。需要指出的是，人源化抗體可以由能夠表達功能性重排的人免疫球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因的非人動物或原核或真核細胞生成。此外，當抗體是單鏈抗體時，其可包含在天然人抗體中不出現(xiàn)的接頭肽。例如，F(xiàn)v可包含這樣的接頭肽，諸如2個至大約20個甘氨酸或其他氨基酸殘基，優(yōu)選8-15個甘氨酸或其他氨基酸殘基：其連接重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)。這樣的接頭肽被認為是來源于人的?？贵w人源化可以例如通過如下進行：合成組合文庫，所述組合文庫包含非人目標單克隆抗體的6個CDR與各別的人框架池合框融合而得到的融合物。可以利用含有代表所有已知的重鏈和輕鏈人種系基因的人框架。然后可以從所得的組合文庫篩選對感興趣抗原的結合。這種途徑可容許選擇就維持對親本抗體的結合活性而言最有利的完全人框架。然后可以使用多種技術進一步優(yōu)化人源化抗體?？贵w人源化可以用來將小鼠或其他非人抗體進化為“完全人”抗體。所得的抗體僅含有人序列而沒有小鼠或非人抗體序列，同時維持與起始抗體相似的結合親和力和特異性。對于全長抗體分子，免疫球蛋白基因可以從雜交瘤細胞系的基因組DNA或mRNA獲得。將抗體重鏈和輕鏈序列克隆到哺乳動物載體系統(tǒng)中。通過雙鏈序列分析來證實組裝?？贵w構建體可以在其他人或哺乳動物宿主細胞系中表達。然后可以通過瞬時轉(zhuǎn)染測定以及對表達的感興趣的載體的Western印跡分析來證明構建體的正確性。使用快速測定方法可以分離和篩選具有最高生產(chǎn)性的穩(wěn)定細胞系。至少一種本發(fā)明的抗GD2抗體可任選地由細胞系、混合細胞系、永生化細胞或永生化細胞的克隆群體來產(chǎn)生，如本領域公知的。參見例如Ausubel,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001);Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2.sup.ndEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989).Colligan,etal.,eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001);Colliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),本文通過提述并入上述每一文獻的全部內(nèi)容。根據(jù)一種途徑，通過下述方式產(chǎn)生雜交瘤：將合適的永生細胞系與抗體產(chǎn)生細胞融合，所述永生細胞系例如骨髓瘤細胞系，諸如但不限于Sp2/0,Sp2/0-AG14,NSO,NS1,NS2,AE-1,L.5,>243,P3X63Ag8.653,Sp2SA3,Sp2MAI,Sp2SS1,Sp2SA5,U937,MLA144,ACTIV,MOLT4,DA-1,JURKAT,WEHI,K-562,COS,RAJI,NIH3T3,HL-60,MLA144,NAMAIWA,NEURO2A)等等，或異源骨髓瘤(heteromylomas)，其融合產(chǎn)物，或源自其的任何細胞或融合細胞，或本領域已知的任何其他合適的細胞系，參見例如www.atcc.org,www.lifetech.com等等；所述抗體產(chǎn)生細胞諸如但不限于分離或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃體、或其他免疫或含B細胞的細胞，或任何其他表達重鏈或輕鏈恒定或可變或框架或CDR序列的細胞，作為內(nèi)源或異源核酸，作為重組或內(nèi)源、病毒、細菌、藻類、原核、兩棲動物、昆蟲、爬行動物、魚類、哺乳動物、嚙齒動物、馬、羊、山羊、綿羊、靈長類、真核、基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單鏈、雙鏈或三鏈的、雜交的等等，或其任何組合。參見例如Ausubel同上和Colligan,Immunology,同上，第2章，本文通過提述并入其全部內(nèi)容。任何其他合適的宿主細胞也可以用來表達編碼本發(fā)明的抗體、其特定片段或變體的異源或內(nèi)源核酸。融合的細胞(雜交瘤)或重組可以細胞使用選擇性培養(yǎng)條件或其他合適的已知方法加以分離，并通過有限稀釋或細胞分選或其他已知方法進行克隆。產(chǎn)生具有期望的特異性的細胞可以通過合適的測定法(例如ELISA)來選擇。本發(fā)明的抗體還可以這樣制備：使用至少一種編碼抗GD2抗體的核酸來提供在它們的乳汁中產(chǎn)生此類抗體的轉(zhuǎn)基因動物或哺乳動物，諸如山羊、牛、綿羊等。此類動物可以利用已知方法來提供。參見例如，但不限于美國專利第5,827,690;5,849,992;4,873,316;5,849,992;5,994,616,5,565,362;5,304,489號等，本文通過提述并入每一篇的全部內(nèi)容。本發(fā)明的抗體還可以這樣制備：使用至少一種編碼抗GD2抗體的核酸來提供在植物部分或從其培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生此類抗體、特定部分或變體的轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細胞(例如但不限于煙草和玉米)。作為非限制性的實例，表達重組蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草葉已經(jīng)被成功地用于提供大量的重組蛋白，例如通過使用誘導型啟動子。參見例如Crameretal.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)及其中引用的文獻。此外，還已經(jīng)使用轉(zhuǎn)基因玉米來以產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)水平表達哺乳動物蛋白質(zhì)，其生物學活性與在其他重組系統(tǒng)中產(chǎn)生者或從天然來源純化者等同。參見例如Hoodetal.,Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)及其中引用的參考文獻。還已經(jīng)從包含抗體片段(如單鏈抗體(scFv))的轉(zhuǎn)基因植物種子(包括西紅柿種子和馬鈴薯塊莖)大量地生產(chǎn)了抗體。參見例如Conradetal.,PlantMol.Biol.38:101-109(1998)及其中引用的參考文獻。因此，本發(fā)明的抗體也可以根據(jù)已知方法施用轉(zhuǎn)基因植物來產(chǎn)生。還參見例如Fischeretal.,Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(October,1999),Maetal.,TrendsBiotechnol.13:522-7(1995);Maetal.,PlantPhysiol.109:341-6(1995);Whitelametal.,BiochemSoc.Trans.22:940-944(1994)及其中引用的參考文獻。將上述每一篇文獻通過提述完全并入本文?？笹D2抗體可以使用公知方法從重組細胞培養(yǎng)物回收和純化，所述公知方法包括但不限于蛋白A純化、蛋白G純化、硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和卵磷脂色譜。高效液相色譜("HPLC")也可用于純化。參見例如Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,orCurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1,4,6,8,9,和第10章，本文通過提述并入每一篇的全部內(nèi)容。本發(fā)明的抗體包括天然純化產(chǎn)物、化學合成程序產(chǎn)物、以及從真核宿主通過重組技術產(chǎn)生的產(chǎn)物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。取決于重組產(chǎn)生程序中使用的宿主，本發(fā)明的抗體可以是糖基化的或者非糖基化的，糖基化的是優(yōu)選的。此類方法在多個標準實驗室手冊中有說明，例如Sambrook(同上)第17.37-17.42節(jié)；Ausubel(同上)，第10,12,13,16,18和20章，Colligan,ProteinScience(同上)，第12-14章，本文通過提述并入所有上述文獻的全部內(nèi)容。純化的抗體可以通過例如ELISA、ELISPOT、流式細胞術、immunocytology、BiacoreTM分析、SapidyneKinExATM動力學排除測定、SDS-PAGE和Western印跡，或者通過HPLC分析以及多種本文公開的其他功能測定法來加以表征。典型的哺乳動物表達載體包含：至少一個啟動子元件，其介導mRNA轉(zhuǎn)錄的起始；抗體編碼序列；以及終止轉(zhuǎn)錄及對轉(zhuǎn)錄物進行聚腺苷酸化所要求的信號。其他的元件包括增強子、Kozak序列、以及被RNA剪接的供者和受者序列所包夾的居間序列。用來自SV40的晚期和早期啟動子、來自逆轉(zhuǎn)錄病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重復(LTR)、以及巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子，可以實現(xiàn)高效率的轉(zhuǎn)錄。但是，也可以使用細胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)。用于實施本發(fā)明的合適表達載體包括例如：載體如pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(ClonetechLabs、PaloAlto、Calif.)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)?？梢允褂玫牟溉閯游锼拗骷毎ㄈ薍ela293、H9和Jurkat細胞，小鼠NIH3T3和C127細胞，Cos1、Cos7和CV1、鵪鶉QC1-3細胞，小鼠L細胞和中華倉鼠卵巢(CHO)細胞?；蛘撸蚩梢栽诤姓系饺旧w的該基因的穩(wěn)定細胞系中表達。用選擇標志物如DHFR、GPT、新霉素或潮霉素共轉(zhuǎn)染容許鑒定和分離經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞。轉(zhuǎn)染的基因也可以加以擴增以表達大量的被編碼的抗體。DHFR(四氫葉酸還原酶)標志物可用于開發(fā)攜帶數(shù)以百計甚至數(shù)以千計的感興趣基因拷貝的細胞系。另一種有用的選擇標志物是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy、etal.，Biochem.J.227:277-279(1991);Bebbington、etal.、Bio/Technology10:169-175(1992))。使用這些標記物，使哺乳動物細胞在選擇培養(yǎng)基中生長，并選擇具有最高抗性的細胞。這些細胞系含有整合到染色體中的經(jīng)擴增的基因。中華倉鼠卵巢(CHO)及NSO細胞經(jīng)常用于抗體的產(chǎn)生。依照本發(fā)明，抗GD2抗體包括ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1L1-IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、hu3F8-H1L1-IgG1n、hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、hu3F8-H3L3S、huH1I-γ-1、huH3I-γ-1、hu3F8-IgG1-DEL抗體中的任一者，或這樣的抗體：其中可變區(qū)或CDR源自ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1L1-IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、hu3F8-H1L1-IgG1n、hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、hu3F8-H3L3S、huH1I-gamma1、huH3I-gamma1、hu3F8-IgG1-DEL抗體中的任一者，且該抗體的框架區(qū)和恒定區(qū)源自一種或多種人抗體。源自所述抗體的可變區(qū)或CDR優(yōu)選與ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1L1-IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、hu3F8-H1L1-IgG1n、hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、hu3F8-H3L3S、huH1I-gamma1、huH3I-gamma1、hu3F8-IgG1-DE中的任一者的可變區(qū)或CDR具有大約90%至大約100%的同一性，盡管來源于自然突變或來自人為操作的任何及所有修飾，包括取代、插入和缺失均在考慮之內(nèi)，只要該抗體保留結合GD2的能力。源自人抗體的嵌合、人源化或CDR嫁接抗體的區(qū)域并不需要與人抗體具有100%同一性。在優(yōu)選的實施方案中，盡可能多地保持人氨基酸殘基以使得免疫原性可忽略，但對于所述人殘基，尤其是框架區(qū)的殘基，根據(jù)需要并且如本文后面教導的那樣依照本發(fā)明進行取代。本文中公開的此類修飾對于支持由CDR形成的抗原結合位點，同時使抗體的人源化最大化是必須的。與本文中描述的序列基本上相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代、以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸取代指將第一個氨基酸替換成具有與該第一個氨基酸相似的化學和/或物理性質(zhì)(例如電荷、結構、極性、疏水性/親水性)的第二個氨基酸。保守取代包括用下列各組之內(nèi)的一個氨基酸替換其他氨基酸：賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。當然，技術人員要實施的氨基酸取代的數(shù)目取決于多種因素，包括上述的那些。一般而言，對于任何給定的抗GD2抗體、片段或變體，氨基酸取代、插入或缺失的數(shù)目不會多于40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個，例如1-30個或者其中的任何范圍或數(shù)值，如本文中具體規(guī)定的。本發(fā)明的抗GD2抗體中對功能而言必不可少的氨基酸可以通過本領域已知的方法來鑒定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如Ausubel，同上、Chapters8、15;CunninghamandWells、Science244:1081-1085(1989))。后一種程序在分子中的每一個殘基處導入單個丙氨酸突變。然后對所得的突變分子測試生物學活性，包括但不限于至少對GD2的結合。對抗體結合而言的關鍵位點也可以通過結構分析諸如結晶、核磁共振或光親和標記來鑒定(Smith、etal.、J.Mol.Biol.224:899-904(1992)anddeVos、etal.、Science255:306-312(1992))?？笹D2抗體可進一步任選地包含源自本文所述的至少一個序列的CDR的70-100%的連續(xù)氨基酸的至少一個的多肽。在一個實施方案中，免疫球蛋白鏈或其部分(例如可變區(qū)，CDR)的氨基酸序列與表1-4中的至少一個序列的氨基酸序列具有大約70-100%同一性(例如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范圍或數(shù)值)。本文中提供了示例性的重鏈和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體或其特定的變體可包含來自本發(fā)明的抗體的任意數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基，其中所述數(shù)目選自由抗GD2抗體的連續(xù)殘基數(shù)目的10-100%的整數(shù)。任選地，該連續(xù)氨基酸的子序列的長度為大約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多個氨基酸，或其中的任何范圍或數(shù)值。此外，此類子序列的數(shù)目可以是選自1-20的任何整數(shù)，例如至少2、3、4或5。依照本發(fā)明，SEQIDNO:11-22所示的核酸序列以及抗GD2抗體的可變區(qū)(輕鏈和重鏈)的推定的氨基酸序列示于SEQIDNO:1-10。這些重鏈和輕鏈可變區(qū)中的每一個均含有3個CDR，它們聯(lián)合形成抗原結合位點。這3個CDR被四個框架區(qū)包圍，所述框架區(qū)主要發(fā)揮支持這些CDR的功能。重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列中的CDR序列可以依照SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、4thed.、UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices、U.S.GovernmentPrintingOffice、Washington、D.C中Kabat等人(1987)一文通過計算機輔助比對來鑒別，或者通過對可變區(qū)的分子建模，例如利用Levitt(1983)J.Mol.Biol.168:595所述的ENCAD程序來加以鑒別編碼本發(fā)明的人源化抗體、片段和區(qū)域的恒定(C)區(qū)的人類基因可以通過已知方法從人胎肝文庫獲得。人C區(qū)基因可以從任何人細胞，包括那些表達并產(chǎn)生免疫球蛋白的細胞獲得。人CH區(qū)可以從人H鏈的任何已知的類別或者同種型獲得，包括γ、μ、α、δ、ε、及其亞型，諸如G1、G2、G3和G4。由于H鏈同種型負責抗體的各種效應物功能，因此CH區(qū)的選擇將由期望的效應物功能(諸如補體固定，或者抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC))中的活性來引導。優(yōu)選地，CH區(qū)源自γ1(IgG1)或γ4(IgG4)。人CL區(qū)可以從兩種人L鏈同種型：κ或λ中任意一種獲得，優(yōu)選從κ獲得。通過標準克隆技術(Sambrook、etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual、2.sup.ndEdition、ColdSpringHarborPress、ColdSpringHarbor、N.Y.(1989)和Ausubeletal.、eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology(1987-1993))從人細胞獲得編碼人免疫球蛋白C區(qū)的基因。人C區(qū)基因可以從已知的含有呈現(xiàn)兩類L鏈、五類H鏈、以及亞類的基因的克隆容易地獲得?？贵w的可變區(qū)的序列可以通過插入、取代和缺失來修飾，以嵌合抗體維持結合人GD2的能力為限。本領域普通技術人員可以通過實施如下所述的功能測定來確定該活性的維持?？勺儏^(qū)例如針對下文指明的可變區(qū)可具有大約50%至大約100%同源性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體的可變區(qū)對下文指明的可變區(qū)具有大約80%至大約100%的同源性。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述可變區(qū)針對下文指明的可變區(qū)可具有大約90%至大約100%的同源性。在一個特定的實施方案中，本公開的優(yōu)選的抗GD2Mab包含與本文中指明的序列具有95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同源性的可變輕鏈區(qū)，并進一步包含與本文指明的序列具有95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同源性的可變重鏈區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或其特定部分的抗體或抗原結合部分結合人GD2，因此部分地或基本上中和一種GD2蛋白或片段，從而抑制通過GD2介導的活性。如本文所用的，術語“中和性抗體“指這樣的抗體，其能夠抑制GD2依賴性活性達約20-120%，優(yōu)選至少約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或更多，依賴于測定法?？笹D2抗體抑制GD2依賴性活性的能力優(yōu)選通過至少一種如本文所述的或本領域已知的合適的測定法來評估。如所述的，本發(fā)明還涉及這樣的抗體、抗原結合片段、免疫球蛋白鏈和CDR，其包含與本文中描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列中的氨基酸。這樣的抗GD2抗體可包括一個或多個來自自然突變或人工操作(如本文具體說明的)氨基酸取代、缺失或添加。優(yōu)選地，這樣的抗體或抗原結合片段以及包含此類鏈或CDR的抗體可以高親和力結合人GD2。如本領域技術人員將會領會的，本發(fā)明包括本發(fā)明的至少一種生物學活性抗體。生物學活性抗體具有天然(非合成)、內(nèi)源或相關的和已知的抗體的至少20%、30%、或40%，優(yōu)選至少50%、60%、或70%，最優(yōu)選至少80%、90%、或95%-100%的特異性活性。測定和定量酶活性和底物特異性的度量的方法是本領域技術人員公知的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的人抗體和抗原結合片段，其通過共價附接有機部分而被修飾。這樣的修飾可以產(chǎn)生具有改善的藥動學性質(zhì)(例如增加的體內(nèi)血清半衰期)的抗體或抗原結合片段。有機部分可以是線性或分枝的親水性聚合物基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。在具體的實施方案中，親水性聚合物基團可以具有大約800至大約120,000道爾頓的分子量，并且可以是聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且所述脂肪酸或者脂肪酸酯基團可包含約8至約40個碳原子。本發(fā)明的修飾抗體及抗原結合部分可包含一個或多個直接或間接地共價結合于該抗體的有機部分。每個與本發(fā)明的抗體或抗原結合片段鍵合的有機部分可獨立地為親水性聚合物基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。如本文所用的，術語“脂肪酸”涵蓋單羧基酸和雙羧基酸。如本文中使用的，術語“親水性聚合物基團”指在水中比在辛烷中更可溶的有機聚合物，例如聚賴氨酸。因此，通過共價附接聚賴氨酸而修飾的抗體為本發(fā)明所涵蓋。適用于修飾本發(fā)明的抗體的親水性聚合物可以是直鏈的或者分枝的，并且包括例如聚烷二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如右旋糖酐、纖維素、寡糖、多糖等)、親水氨基酸的聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷氧化物(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)及聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選地，修飾本發(fā)明抗體的親水性聚合物作為單獨的分子實體具有約800至約150,000道爾頓的分子量。例如可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下標為聚合物的平均分子量的道爾頓數(shù)。親水性聚合物基團可以被一個至約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團所取代。被脂肪酸或脂肪酸酯基團取代的親水性聚合物可以利用合適的方法來制備。例如，可將包含胺基的聚合物偶連于脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸，且可將脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸(例如用N,N-羰基二咪唑活化的)偶連于聚合物上的羥基。適于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的，或者可以含有一個或多個不飽和單位。適于修飾本發(fā)明抗體的脂肪酸包括例如正十二烷酸鹽或酯、正十四烷酸鹽或酯、正十八烷酸鹽或酯、正二十烷酸鹽或酯、正二十二烷酸鹽或酯、正三十烷酸鹽或酯、正四十烷酸鹽或酯、順-δ.9-十八烷酸鹽或酯、所有順-δ.5,8,11,14-二十碳四烯酸鹽或酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷酸、等等。合適的脂肪酸酯包括含有直鏈或分枝的低級烷基的二羧酸的單酯。所述低級烷基可包含1個至約12個，優(yōu)選1個至約6個碳原子。修飾的人抗體及抗原結合片段可以使用合適的方法來制備，諸如通過與一種或多種修飾劑反應。術語“修飾劑”如本文所用的，是指包含活化基團的合適的有機基團(例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)?！盎罨鶊F”是這樣的化學部分或功能基團，其在合適的條件下可以與第二化學基團反應從而在該修飾劑與該第二化學基團之間形成的共價鍵。例如，胺反應性活化基團包括親電性基團諸如甲苯磺酸鹽或酯、甲磺酸(mesylate)、鹵素(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀酸亞胺酯(NHS)等等。能夠與硫醇反應的活化基團包括，例如，馬來酰亞胺、碘乙?；⒈；?、吡啶基二硫化物(pyridyldisulfides)、5-巰基-2-硝基苯甲酸巰基(TNB-thiol)，等等。醛功能基團可以偶連于含胺或酰肼的分子，且疊氮基團可與三價磷基團反應而形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺(phosphorimide)連接。用于將活化基團導入分子的合適方法是本領域已知的(參見例如Hernanson、G.T.、BioconjugateTechniques、AcademicPress:SanDiego、Calif.(1996))?；罨鶊F可以直接鍵連于所述有機基團(例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或者通過接頭部分，例如二價C1-C12基團，其中一個或多個碳原子可以被雜原子如氧、氮或硫替換。合適的接頭部分包括例如四乙二醇、--(CH2)3--、--NH--，僅舉數(shù)例。包含接頭部分的修飾劑可以例如通過使單-Boc-烷基二胺(例如單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞酰胺(EDC)的存在下反應而在游離胺與脂肪酸羧酸之間形成酰胺鍵來產(chǎn)生?？梢杂萌宜?TFA)處理從產(chǎn)物去除Boc保護基以暴露伯胺，后者可以偶連于如所述的另一羧酸；或者可以與馬來酸酐反應，使所得產(chǎn)物環(huán)化而產(chǎn)生所述脂肪酸的經(jīng)活化的馬來酰亞胺衍生物(參見例如Thompson、etal.、WO92/16221，茲通過提述并入其全部教導)。本發(fā)明的修飾抗體可以通過使人抗體或抗原結合片段與修飾劑反應來產(chǎn)生。例如，可以利用胺反應性修飾劑，例如PEG的NHS酯，將有機部分以非位點特異性的方式與抗體鍵合。還可以通過還原抗體或抗原結合片段的二硫鍵(例如鏈內(nèi)二硫鍵)來制備修飾的人抗體或抗原結合片段。然后可以將該還原的抗體或抗原結合片段與巰基反應性修飾劑反應來產(chǎn)生本發(fā)明的修飾抗體。包含與本發(fā)明的抗體的特定位點鍵合的有機部分的修飾人抗體和抗原結合部分可以使用合適的方法來加以制備，所述方法例如逆蛋白水解(reverseproteolysis)(Fischetal.、BioconjugateChem.、3:147-153(1992);Werlenetal.、BioconjugateChem.、5:411-417(1994);Kumaranetal.、ProteinSci.6(10):2233-2241(1997);Itohetal.、Bioorg.Chem.、24(1):59-68(1996);Capellasetal.、Biotechnol.Bioeng.、56(4):456-463(1997))、以及Hermanson、G.T.、BioconjugateTechniques、AcademicPress:SanDiego、Calif.(1996)中描述的方法。本發(fā)明的抗體能夠以如下所示的寬范圍的親和力(KD)結合人GD2?？贵w對抗原的親和力或親合力可以使用任何合適的方法通過實驗確定(參見例如Berzofsky、etal.、"Antibody-AntigenInteractions,"收錄于FundamentalImmunology、Paul、W.E.、Ed.、RavenPress:NewYork、N.Y.(1984);Kuby、JanisImmunology、W.H.FreemanandCompany:NewYork、N.Y.(1992);及本文中描述的方法)。具體的抗體-抗原相互作用的測得的親和力如果在不同的條件下(例如，鹽濃度、pH)測量可能變化。因此親和力以及其他抗原結合參數(shù)的測量優(yōu)選使用標準化的抗體及抗原溶液、以及標準化的緩沖液(如本文中所述的緩沖液)來進行。在本發(fā)明的方法和組合物中有用的抗GD2抗體以結合GD2為特征，并且優(yōu)選以具有低毒性為特征。具體地，本發(fā)明的抗體、特定片段或變體，其中各別組分，諸如可變區(qū)、恒定區(qū)和框架，單獨地和/或集合地，任選地和優(yōu)選地具有低免疫原性，在本發(fā)明中是有用的。能夠用于本發(fā)明的抗體任選地以它們能夠長期治療患者并產(chǎn)生可測量的癥狀緩解且毒性低和/或可接受為特征。低或可接受的免疫原性和/或高親和力，以及其他適合的性質(zhì)，可以對達到的治療結果起貢獻?！暗兔庖咴浴痹诒疚闹卸x為在少于約75%、或優(yōu)選少于約50%的受治療的患者中產(chǎn)生顯著的HAMA、HACA或HAMA應答，和/或在受治療的患者中產(chǎn)生低效價(Elliottetal.、Lancet344:1125-1127(1994)、茲通過提述并入其全部內(nèi)容)。也可以使用雙特異性、異特異性(heterospecific)、異源綴合(heteroconjugate)、或類似的抗體，所述抗體是具有對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆、人源化抗體。在本案中，所述結合特異性之一針對的是至少一種GD2蛋白質(zhì)，另一種則是針對任何其他抗原。制造雙特異性抗體的方法是本領域中已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性(MilsteinandCuello、Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機搭配，這些四體雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生潛在的10種不同抗體分子的化合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。正確分子的純化通常通過親和純化步驟來實現(xiàn)，這是相當繁重的，且產(chǎn)物產(chǎn)率較低。類似的程序在例如WO93/08829、美國專利第6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、6,060,285、6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、5,932,448、5,833,985、5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、5,582,996、5,496,549、4,676,980、WO91/00360、WO92/00373、EP03089號、Trauneckeretal.、EMBOJ.10:3655(1991)、Sureshetal.、MethodsinEnzymology121:210(1986);ChanandCarter、2010、NatureRev.10、301-316;Weineretal.、2010、NatureRev.10、317-327中有公開;本文通過提述并入每一篇的全部內(nèi)容。在某些實施方案中，結合GD2的抗體可以以未綴合的形式使用。在其他實施方案中，結合GD2的抗體可以綴合，例如綴合于可檢測的標記物、藥物、前藥或同位素。在下文進一步描述的本發(fā)明的某些方法，例如檢測細胞或組織中的GD2表達作為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛力的量度，或者作為鑒定組織中的原位癌(例如DCIS或LCIS)的方法中，將抗GD2抗體綴合于一種或多種可檢測標記物。對于此類應用，抗體可以通過共價或非共價附接生色性、酶、放射性同位素、同位素、熒光性、毒性、化學發(fā)光性、核磁共振造影劑或其他標記物。合適的生色性標記物的例子包括二氨基聯(lián)苯胺和4-羥基偶氮-苯-2-羧酸。合適的酶標記物的例子包括脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-類固醇異構酶、酵母-醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶、以及乙酰膽堿酯酶。合適的放射性同位素標記物的例子包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、等等。111In在使用體內(nèi)成像的場合是優(yōu)選的同位素，因為其避免了125I或131I標記的GD2結合抗體被肝臟脫鹵素化的問題。此外，這種放射性核苷酸具有對于成像而言更有利的γ發(fā)射能(Perkinsetal、Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985);Carasquilloetah、J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，與帶有1-(P-異硫氰基芐基)-DPTA的單克隆抗體偶連的111In已經(jīng)在非腫瘤組織，尤其是肝臟中顯示幾乎無攝取，由此提高腫瘤定位的特異性(Estebanetal.、J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。合適的非放射性同位素標記物的例子包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、和56Fe。合適的熒光標記物的例子包括152Eu標記物、熒光素標記物、異硫氰酸鹽或酯標記物、羅丹明標記物、藻紅蛋白標記物、藻藍蛋白標記物、別藻藍蛋白標記物、綠色熒光蛋白(GFP)標記物、鄰苯二醛標記物、和熒光胺標記物。合適的毒素標記物的例子包括白喉毒素、蓖麻毒蛋白、以及霍亂毒素?；瘜W發(fā)光標記物的例子包括魯米諾標記物、芳香吖啶酯標記物、吲哚標記物、吖啶鹽標記物、草酸酯標記物、熒光素標記物、熒光素酶標記物、以及水母光蛋白(aequorin)標記物。核磁共振造影劑的例子包括重金屬核如Gd、Mn、和鐵。用于將上述標記物結合于抗GD2抗體的典型技術在下述文獻中提供：Kennedy等人，Clin.CMm.Acta70:1-31(1976)，和Schurs等人，Clin.CMm.Acta81:1-40(1977)。后者中提到的偶聯(lián)技術是戊二醛法，高碘酸鹽法，二馬來酰亞胺法，m-馬來酰亞胺芐基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯法，通過提述并入其所有這些方法。為了用于本發(fā)明的某些治療手段，諸如手術后殘余腫瘤細胞的消融或者轉(zhuǎn)移的預防，可以將抗GD2抗體偶聯(lián)于一種或多種藥物、前藥或同位素。優(yōu)選的此類綴合物包含一種或多種結合GD2的配體，例如一種或多種抗體或片段、其衍生物或變體，所述配體綴合于一種或多種細胞毒劑；這樣的綴合物可用于本發(fā)明提供的治療和預防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。根據(jù)本發(fā)明的某些此類實施方案，抗GD2抗體與細胞毒劑綴合?？捎糜谏煽笹D2抗體-細胞毒劑綴合物的細胞毒劑，例如化療劑是本領域公知的，包括但不限于順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、多柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、微管毒物、以及番荔枝己酸配質(zhì)(annonaceousacetogenins)。其他適于依照本發(fā)明的該方面使用的化療劑是公知的，普通技術人員將熟悉之。本文還想到了一種或多種抗GD2抗體與一種或多種小分子毒素的綴合物的用途，所述小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美登木素(maytansine)(美國專利5,208,020)、trichothene、以及CC1065。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗GD2抗體綴合于一種或多種美登木素分子(例如每個抗GD2抗體約1個至約10個美登木素分子)。美登木素可以例如轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，May-SS-Me可以還原為May-SH3并與經(jīng)修飾的抗GD2抗體反應來產(chǎn)生美登木素生物堿-抗GD2抗體綴合物(Charietal.CancerResearch52:127-131(1992))?；蛘?，可以將抗GD2抗體與一個或多個加利車霉素分子綴合。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y構類似物(Hinmanetal.CancerResearch53:3336-3342(1993)andLodeetal.CancerResearch58:2925-2928(1998))?？捎脕砼c一個或多個抗GD2抗體生成綴合物的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(PhytolacaAmericana)蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日以英文公布的WO93/21232，茲通過提述并入其全部公開內(nèi)容。也可以將美登木素生物堿綴合于一個或多個抗GD2抗體。本發(fā)明還設想了與具有核酸水解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶）綴合的抗GD2抗體。有多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)HER2抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗GD2抗體和細胞毒劑的綴合物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯（諸如鹽酸己二酰亞胺二甲酯）、活性酯類（諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯）、醛類（諸如戊二醛）、雙疊氮化合物（諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙(對重氮苯甲酰基)己二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）、和雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.、Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗GD2抗體綴合的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭（Charietal.、CancerResearch52:127-131(1992)）?；蛘?，可例如通過重組技術或肽合成來制備包含抗GD2抗體配體和細胞毒劑的融合蛋白。本發(fā)明還提供至少一種抗GD2抗體組合物，其包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多種如本文中所描述的和/或如現(xiàn)有技術已知的抗GD2抗體，以非天然存在的組合物、混合物或形式提供。這樣的組合物包括：非天然存在的組合物，其包含選自下組的抗GD2抗體氨基酸序列的至少一種或兩種全長、C-和/或N-段缺失的變體、域、片段或特定的變體：如本文所述的抗體的CDR區(qū)的70-100%的連續(xù)氨基酸，或其特定的片段、域或變體。優(yōu)選的抗GD2抗體組合物包括如本文所述的抗GD2抗體氨基酸序列的至少一種含CDR或LBR的部分的至少一種或兩種全長的序列、片段、域或變體。進一步優(yōu)選的組合物包含如本文所述的抗GD2抗體的CDR區(qū)域的70-100%的至少一種的40-99%。這樣的組分百分比是液體或干溶液、混合物、懸浮液、乳液或膠體的重量、體積、濃度、體積克分子濃度(molarity)或重量克分子濃度(molality)百分比，如本領域公知或如本文中所述的。本發(fā)明的抗GD2抗體組合物可以進一步包含任意適當?shù)挠行Я康慕M合物或藥物組合物中的至少一種，所述組合物包含需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者的至少一種抗GD2抗體，該組合物任選進一步包含選自下列的至少一種：至少一種TNF拮抗劑(例如但不限于TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或其片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥物(如氨甲喋呤、金諾芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥基氯喹、來氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉馳緩劑、麻醉藥(narcotic)、非甾體類抗炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻滯劑、抗微生物劑(例如氨基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑、碳青霉素烯(carbapenem)、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其他抗微生物劑)、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關藥劑、礦物質(zhì)、營養(yǎng)劑、甲狀腺劑、維生素、鈣相關激素、抗腹瀉藥、止咳藥、抗嘔吐藥、抗?jié)兯?、通便藥、抗凝劑、促紅細胞生成素(例如紅細胞生成素(Epoetin)α)、菲格司亭(filgrastim)(如G-CSF、優(yōu)保津)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫法、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達克珠單抗)、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、散瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥劑、抗抑郁藥、抗躁狂劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經(jīng)藥、興奮劑、多奈哌齊、他克林、哮喘藥物、β激動劑、吸入類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸鈉、腎上腺素或類似物、α鏈道酶(Pulmozyme)、細胞因子或細胞因子拮抗劑、以及細胞療法(celltherapies)。此類細胞因子的非限制性實例包括但不限于IL-1至IL-34中的任何一種。合適的劑量是本領域公知的，參見例如Wells等人編，PharmacotherapyHandbook、2ndEdition、AppletonandLange、Stamford、Conn.(2000)；PDRPharmacopoeia、TarasconPocketPharmacopoeia2000、DeluxeEdition、TarasconPublishing、LomaLinda、Calif.(2000)，茲通過提述并入這些參考文獻每一篇的全部內(nèi)容。這些抗癌癥或抗感染劑也可以包括與本發(fā)明的至少一種抗體締合、結合、共同配制或共同施用的毒素分子。毒素可以任選選擇性地殺滅病變細胞或組織。病變細胞可以是癌癥或其他細胞。此類毒素可以是，但不限于，純化的或重組的毒素或毒素片段，它包含如選自蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或細菌毒素中的至少一種的毒素的至少一種功能性細胞毒性域。術語毒素也包括由任意天然存在的、突變或重組細菌或病毒的內(nèi)毒素和外毒素，它們可以導致人類或其他哺乳動物中的任意病理學狀況，包括致死的毒素休克。此類毒素可以包括，但不限于，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)、志賀氏菌細胞毒素、氣單胞菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌腸毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、鏈球菌腸毒素等。所述細菌包括，但不限于，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌(ETEC)、腸出血性大腸桿菌(如血清型0157:H7的菌株)、葡萄球菌屬物種(如金黃色葡萄球菌、化膿性葡萄球菌)、志賀氏菌屬菌種(如痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、鮑氏志賀氏菌(Shigellaboydii)和索氏志賀氏菌(Shigellasonnei))、沙門氏菌屬菌種(如傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌)、梭菌屬菌種(如產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌)、彎曲桿菌屬菌種(如空腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌)、螺桿菌屬菌種(例如幽門螺桿菌)、氣單胞菌屬菌種(例如溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌)、類志賀鄰單胞菌(Pleisomonasshigelloides)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinaenterocolitica)、弧菌屬菌種(例如霍亂弧菌、副溶血弧菌)、克雷伯氏菌屬菌種、銅綠假單胞菌和鏈球菌。參見例如Stein編，INTERNALMEDICINE，3rded.，pp1-13，Little，BrownandCo.，Boston,(1990);Evans等人編，BacterialInfectionsofHumans:EpidemiologyandControl，2d.Ed.，pp239-254，PlenumMedicalBookCo,NewYork(1991);Mandell等人，PrinciplesandPracticeofInfectiousDiseases，3d.Ed.,ChurchillLivingstone，N.Y.(1990);Berkow等人編，TheMerckManual，16thedition，MerckandCo.，Rahway，N.J.，1992;Wood等人，F(xiàn)EMSMicrobiologyImmunology，76:121-134(1991);Marrack等人，Science，248:705-711(1990)，茲通過提述并入這些參考文獻的全部內(nèi)容。本發(fā)明的抗GD2抗體化合物，組合物或其組合可以進一步包含任意適當輔助物質(zhì)，例如但不限于稀釋劑，粘合劑，穩(wěn)定劑，緩沖劑，鹽，親脂溶劑，防腐劑，佐劑等中的至少一種。優(yōu)選可藥用的輔助物質(zhì)。此類無菌溶液的非限制性的例子和制備方法是本領域公知的，例如，但不限于Gennaro，Ed.，Remington'sPharmaceuticalSciences，18.sup.thEdition，MackPublishingCo.(Easton，Pa.)1990?？伤幱玫膿d體可以常規(guī)選擇，此類擔載體適于抗GD2抗體，片段或變體組合物的施用方式，溶解度和/或穩(wěn)定性，如本領域公知或如本文所描述的?？捎糜诒景l(fā)明組合物的藥物賦形劑和添加劑包括，但不限于蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物(如糖，包括單糖、雙糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，如醛醇、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它們可以單個或組合存在，單獨地或組合地占重量或體積的1-99.99%。示例性的蛋白賦形劑包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。可以起緩沖作用的代表性氨基酸/抗體成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺等。一種優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。適合用于本發(fā)明的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；雙糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉籽糖、松三糖、麥芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；以及醛醇，如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的碳水化合物賦形劑是甘露醇、海藻糖和棉籽糖?？笹D2抗體組合物也可以包含緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑；一般地，緩沖劑是由有機酸或堿制備的鹽。代表性的緩沖劑包括有機酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二甲酸的鹽；Tris，鹽酸三羥甲基氨基甲烷(tromethamine)、或磷酸緩沖液。用于本發(fā)明的組合物中的優(yōu)選緩沖劑是有機酸鹽如檸檬酸鹽。此外，本發(fā)明的抗GD2抗體組合物可包括聚合物賦形劑/添加劑，如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯爾(ficolls)(一種聚合的糖)、葡聚糖結合劑(dextrates)(例如環(huán)糊精、諸如2-羥基丙基-β-環(huán)糊精)、聚乙二醇、矯味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(如聚山梨醇酯、例如"吐溫20"和"吐溫80")、脂質(zhì)(如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)，和螯合劑(例如EDTA)。適用于抗GD2抗體、部分或變體組合物的這些和其他賦形劑和/或添加劑是本領域公知的，例如，列于"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy"、19.sup.thed.、Williams&Williams、(1995)、andinthe"Physician'sDeskReference"、52.sup.nded.、MedicalEconomics、Montvale、N.J.(1998)，在此通過述及引入其完整公開內(nèi)容。優(yōu)選的載體或賦形劑物質(zhì)是碳水化合物(如糖和醛醇)和緩沖劑(如檸檬酸鹽)或聚合劑。如前文指出的，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的制劑，優(yōu)選為含有鹽水或選定的鹽的磷酸鹽緩沖液，以及含有防腐劑的儲存溶液和制劑，適于藥用或獸醫(yī)用途的多用途貯存制劑，包含置于可藥用制劑中的至少一種抗GD2抗體。儲存制劑包含在水性稀釋劑中的至少一種已知的防腐劑或任選選自至少一種苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、三氯叔丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、對羥基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯銨、芐索氯銨、甲醋吡喃酮鈉和硫柳汞、或其混合物?？梢允褂帽绢I域公知的任何適當濃度或混合物，例如0.001-5%，或其中的任意范圍或任意值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或其中的任意范圍或任意值。非限制性實例包括，無防腐劑，0.1-2%間甲酚(例如0.2、0.3.0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.1-3%苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001-0.5%硫柳汞(例如0.005、0.01)、0.001-2.0%苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005-1.0%對羥基苯甲酸烷基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)，等等。如前文指出的，本發(fā)明提供一種制品，其包括包裝材料和至少一個管形瓶，其中包含至少一種抗GD2抗體的溶液和規(guī)定的緩沖劑和/或防腐劑，任選溶于水性稀釋劑中，其中所述包裝材料包含標簽，該標簽標明所述溶劑可以保留1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72個小時或更長的時間。本發(fā)明進一步包括一種制品，其包括包裝材料和含有至少一種凍干的抗GD2抗體的第一管形瓶，和含有規(guī)定的緩沖劑或防腐劑的水性稀釋劑的第二管形瓶，其中所述包裝材料包含標簽，該標簽指導患者在水性稀釋劑中復原所述至少一種抗GD2抗體，以便形成可以保留24小時或更長時間的溶液。根據(jù)本發(fā)明使用的至少一種抗GD2抗體可以通過重組方法產(chǎn)生，包括從哺乳動物細胞或轉(zhuǎn)基因制備物產(chǎn)生，或者從其他生物來源純化，如本文中所述或本領域公知的。本發(fā)明的產(chǎn)品中的至少一種抗GD2抗體的范圍包括在濕/干體系中重構時產(chǎn)生約1.0μg/ml至約1000mg/ml的量，但更低和更高的濃度也是可行的，并且依賴于準備使用的遞送載體，例如溶液制劑將不同于經(jīng)皮貼劑、肺、經(jīng)粘膜或滲透或微泵方法。優(yōu)選地，所述水性稀釋劑任選進一步包含可藥用的防腐劑，優(yōu)選的防腐劑包括選自苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯銨、芐索氯銨、甲醋吡喃酮鈉和硫柳汞、或其混合物的那些。用于制劑中的防腐劑的濃度為足以產(chǎn)生抗微生物作用的濃度。這些濃度取決于選擇的防腐劑，并且本領域技術人員很容易確定。任選地和優(yōu)選地，可以將其他賦形劑，如等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐增強劑加入稀釋劑中。等滲劑如甘油等通常以公知的濃度使用。優(yōu)選加入生理耐受的緩沖劑以改進pH控制。制劑可以有寬范圍的pH值，例如約pH4-約pH10，優(yōu)選約pH5-約pH9，最優(yōu)選約pH6.0-約pH8.0。本發(fā)明的制劑的pH優(yōu)選為約6.8-約7.8。優(yōu)選的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選為磷酸鹽，特別是磷酸緩沖鹽水(PBS)。也可以任選向制劑或組合物中加入其他添加劑，如可藥用的增溶劑，如吐溫20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯)、吐溫40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯)、吐溫80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯)、PluronicF68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、和PEG(聚乙二醇)或非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆84或88、多元醇，其他嵌段共聚物，以及螯合劑如EDTA和EGTA，以減少聚集。如果用泵或塑料容器來施用制劑，這些添加劑是特別有用的?？伤幱玫谋砻婊钚詣┑拇嬖诳蓽p少蛋白質(zhì)聚集的傾向。本發(fā)明的制劑可以通過以下方法制備：包括將至少一種抗GD2抗體與選自苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯銨、芐索氯銨、甲醋吡喃酮鈉和硫柳汞或其混合物在水性稀釋劑中混合。采用常規(guī)的溶解和混合物種在水性稀釋劑中混合所述至少一種抗GD2抗體和防腐劑。為了制備適當?shù)闹苿?，例如，可以將測得量的溶于緩沖液中的至少一種抗GD2抗體在其量足以提供需要濃度的蛋白質(zhì)和防腐劑的緩沖液中混合。本領域技術人員可以了解該方法的變化，例如，加入各成分的順序、是否使用其他添加劑、制備該制劑的溫度和pH都是可以對使用的濃度和施用方式進行優(yōu)化的因素?？梢詫⒁蟊Ｗo的制劑以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗GD2抗體的管形瓶，所述抗體用含有水、防腐劑和/或賦形劑、優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑和/或鹽水和溶于水性稀釋劑中的選定的鹽的第二個管形瓶復原。單一溶液的管形瓶或要求復原的雙管形瓶可以重復使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此比現(xiàn)有的方法提供更方便的治療方案。本發(fā)明的制品可用于立即至24小時或更長的時間內(nèi)施用。因此，本申請要求保護的制品為患者提供了顯著的好處。本發(fā)明的制劑任選可以安全地儲存在約2℃至約40℃的溫度下，并且長時間保持蛋白的生物活性，因此容許包裝標簽指明該溶液可以在超過6、12、18、24、36、48、72、或96小時的時間內(nèi)保存和/或使用。如果使用了儲存稀釋劑，該標簽可包括長達1-12個月、半年、一年半和/或兩年的使用。本發(fā)明中的至少一種抗GD2抗體溶液可以通過包括在水性稀釋劑中混合至少一種抗體的方法來制備。采用常規(guī)的溶解和混合步驟進行混合。為了制備適當?shù)南♂寗?，例如，可以將測得的量的溶于水或緩沖液中的至少一種抗體以足以提供所需濃度的蛋白的量與任選的防腐劑或緩沖液混合。本領域技術人員可以了解該方法的變化。例如，加入各成分的順序、是否使用其他添加劑、制備該制劑的溫度和pH都是可以對使用的濃度和施用方式進行優(yōu)化的因素。要求保護的產(chǎn)品可以以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗GD2抗體的管形瓶，所述抗體用含有水性稀釋劑的第二個管形瓶復原。單一溶液的管形瓶或要求復原的管形瓶可以重復使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此比現(xiàn)有的方法提供更方便的治療方案。要求保護的產(chǎn)品可以以澄清的溶液或作為雙管形瓶的形式提供給藥店、診所或其他機構和設施，從而間接提供給患者，其中雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗GD2抗體的管形瓶，所述抗體用含有水性稀釋劑的第二個管形瓶復原。此情況下的澄清溶液最多達1升或甚至更多，提供于大的儲存容器，其中可以一次或多次取出至少一種抗體溶液的更小部分，將其轉(zhuǎn)移至更小的管形瓶中，由藥店或診所提供給用戶和/或患者。公認的包括這些管形瓶體系的設備包括用于遞送溶液的筆式注射器，例如BD筆，例如由BectonDickensen(FranklinLakes，N.J.,)，Disetronic(Burgdorf，Switzerland,;Bioject，Portland，Oreg.;NationalMedicalProducts，WestonMedical(Peterborough，UK)，Medi-JectCorp(Minneapolis、Minn.)等生產(chǎn)和開發(fā)的。公認的包括雙管形瓶的設備包括用于在藥筒中遞送復原的凍干藥物的筆式注射器系統(tǒng)，當前要求保護的產(chǎn)品包括包裝材料。除了管理部門要求的信息，包括材料還提供可以使用該產(chǎn)品的條件。本發(fā)明的包裝材料為患者提供以下說明：用雙管形瓶的濕/干產(chǎn)品在水性稀釋劑中復原至少一種抗GD2抗體，以形成溶液，并且在2-24小時或更長的時間內(nèi)使用該溶液。對于單管形瓶的溶液產(chǎn)品，標簽說明該溶液可以在2-24小時或更長的時間內(nèi)使用。當前要求保護的產(chǎn)品可以用于人類藥用產(chǎn)品用途。本發(fā)明的制劑可以通過以下方法制備，所述方法包括混合至少一種抗GD2抗體和選定的緩沖劑，優(yōu)選含有鹽水或選定的鹽的磷酸鹽緩沖劑。用常規(guī)溶解和混合步驟在水性緩沖液中緩和至少一種抗體和緩沖劑。為了制備適當?shù)闹苿?，可以將測得量的溶于水或緩沖液中的至少一種抗體以足以提供所需濃度的蛋白和緩沖劑的量與所需緩沖劑在水中混合。本領域技術人員可以了解該方法的變化。例如，對于所使用的濃度和施用方式加入各成分的順序、是否使用其他添加劑、制備該制劑的溫度和pH都是可以加以優(yōu)化的因素。要求保護的穩(wěn)定或儲存的試劑可以以澄清的溶液或者作為雙管形瓶的形式提供給患者，雙管形瓶包含一個裝有至少一種凍干的抗GD2抗體的管形瓶，所述抗體用含有水性稀釋液的第二個管形瓶復原。單一溶液的管形瓶或要求復原的雙管形瓶可以重復使用多次，并且可以滿足患者治療的單個或多個周期，因此比現(xiàn)有的方法提供更方便的治療方案?？梢愿颖景l(fā)明通過各種遞送方法給予患者此處描述的至少一種抗GD2抗體的穩(wěn)定或儲存制劑或溶液；所述方法包括皮下或肌肉內(nèi)注射；經(jīng)皮、肺部、經(jīng)粘膜、植入、滲透泵、藥筒、微泵，或其他本領域技術人員了解的手段，如本領域公知的。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含本公開的抗GD2抗體的藥物組合物使人源化抗體對生物體，優(yōu)選動物，優(yōu)選哺乳動物的施用變得容易。具體的哺乳動物包括牛、犬、馬、貓、綿羊和豬類動物，非人靈長類，以及人。人是特別優(yōu)選的。針對GD2的高親和力、中和性嵌合或人抗體在表達GD2的疾病中的使用可能是理想的，例如，GD2在>50%的黑素瘤(Zhangetal.，1997，Int.J.Cancer.73，42-49)、88%的骨肉瘤(Heineretal.，1987，CancerRes.47，5377-5388)、以及93%的軟組織肉瘤包括脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤、以及梭形細胞肉瘤(Changetal.、1992、Cancer70、633-638)，還有腦腫瘤(Longeeetal.，1991，ActaNeuropathol.82，45-54)中表達。抗GD2抗體已經(jīng)通過靜脈內(nèi)注射以及使用奧馬耶貯器的隔室療法(compartmentaltherapy)在具有下述疾病的患者中進行了測試：黑素瘤(Salehetal，1992，Hum.AntibodiesHybridomas3，19-24;Cheungetal.，1987，J.Clin.Oncol.5，1430-1440;Choietal.，2006，CancerImmunol.Immunother.55，761-774)、肉瘤(Choietal.，2006，同上;Yehetal.，1992，ThefifthAsiaandOceaniaCongressofNuclearMedicineandBiologyProceedings，p.104)、小細胞肺癌(Grantetal.、1996、Eur.J.Nucl.Med.23、145-149)、腦腫瘤(Arbitetal.，1995，Eur.J.Nucl.Med.22，419-426)、通過靜脈注射以及通過使用Ommaya儲庫(Krameretal.，2007，J.Clin.Oncol.25，5465-5470)。GD2也是視網(wǎng)膜母細胞瘤(Chantadaetal.，2006，J.Pediatr.Hematol.Oncol.28，369-373)以及HTLV-1感染的T細胞白血病細胞(Furukawaetal.，1993，PNASUSA90，1972-1976)的腫瘤靶。在一個優(yōu)選的方面，本公開的抗GD2抗體可以用來治療神經(jīng)母細胞瘤。抗GD2抗體或其衍生物可以用作單一藥劑或與其他治療劑組合。此外，這些單抗可以用作化學敏化劑(chemosensitizer)，它們的使用可以改善放射的效力。它們還可以與其他腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑諸如IL-2、IL-12和/或IFNα組合使用。此外，抗GD2抗體可以與其他單克隆抗體諸如抗TNF-α、IL-12/IL-23、IL-2、GpIIb/IIIa受體、CD52、CD20、RSV蛋白、HER2/neu受體等組合使用，以及與經(jīng)批準上市的抗體包括Rituxan、Herceptin、Mylotarg、Campath、Zevalin、Bexxar、Erbitux、Avastin和Vectibix組合使用。因此，本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明的抗GD-2抗體調(diào)節(jié)或治療如本領域已知或本文中記載的、細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種GD2相關疾病的方法。本發(fā)明包括一種用于調(diào)節(jié)或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種惡性疾病的方法，所述疾病包括但不限于下列中的至少一種：多發(fā)性骨髓瘤、白血病、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、B細胞、T細胞或FABALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病、骨髓增生異常綜合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、惡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡波西肉瘤、結腸直腸癌、腎細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、惡性組織細胞病、副腫瘤綜合征/惡性高鈣血癥、實體瘤、腺癌、肉瘤、惡性黑素瘤、血管瘤、轉(zhuǎn)移性疾病、癌癥相關的骨重吸收、癌癥相關的骨疼痛；癌癥轉(zhuǎn)移的阻遏；癌癥惡病質(zhì)的改善；以及炎癥性疾病如系膜增生性腎小球腎炎等的治療。這樣的方法可任選地與GD2抗體、放射治療、抗血管新生劑、化療劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等聯(lián)用，通過在該GD2抗體、放射治療、抗血管新生劑、化療劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑施用之前、同時或之后施用。本發(fā)明還提供一種調(diào)節(jié)或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種GD2介導的免疫相關疾病的方法，所述疾病包括但不限于下列中的至少一種：類風濕性關節(jié)炎，青少年類風濕性關節(jié)炎，全身發(fā)病的幼年類風濕性關節(jié)炎、銀屑病關節(jié)炎、強制性脊柱炎、胃潰瘍、血清陰性關節(jié)病、骨關節(jié)炎、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、特發(fā)性肺纖維化、系統(tǒng)性血管炎/韋格納肉芽腫、肉樣瘤病、睪丸炎/輸精管切除逆轉(zhuǎn)程序、過敏性/特應性疾病、哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、變應性接觸性皮炎、變應性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎癥反應綜合征、膿毒癥綜合征、革蘭氏陽性菌膿毒癥、革蘭氏陰性菌膿毒癥、培養(yǎng)陰性菌膿毒癥、真菌膿毒癥、中性粒細胞減少性發(fā)熱、尿膿毒癥、腦膜炎球菌血癥、創(chuàng)傷/出血、燒傷、離子輻射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫綜合征、類風濕性關節(jié)炎、酒精誘導的肝炎、慢性炎癥病變、肉樣瘤病、克羅恩氏病(Crohn'spathology)、鐮刀狀細胞貧血、糖尿病、腎病、特應性疾病、過敏反應、變應性鼻炎、枯草熱、終年性肺炎、結膜炎、子宮內(nèi)膜異位、哮喘、風疹、全身過敏、皮炎、惡性貧血、血小板減少癥、溶血性疾病、任何器官或組織的移植排斥、腎移植排斥、心臟移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮膚同種異體移植排斥、軟骨移植排斥、骨移植排斥、小腸移植排斥、胎兒胸腺移植排斥、甲狀旁腺移植排斥、任何器官或組織的異種移植排斥、同種異體移植排斥、抗受體過敏反應、格雷夫斯病、雷諾氏病(Raynaud’sdisease)、B型胰島素抵抗糖尿病、哮喘、重癥肌無力、抗體介導的細胞毒性、III型過敏反應、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、POEMS綜合征(多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大、內(nèi)分泌病、單克隆γ球蛋白病和皮膚改變綜合征)、多發(fā)性神經(jīng)病、器官巨大、內(nèi)分泌病、單克隆γ球蛋白病、皮膚改變綜合征、抗磷脂綜合征、天皰瘡、硬皮病、混合性結締組織病、特發(fā)性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、白癜風、血管炎、MI心臟切開后綜合征、IV型過敏、接觸性皮炎、過敏性肺炎、同種異體排斥、細胞內(nèi)生物引起的肉芽腫、藥物過敏、代謝性/特發(fā)性威爾遜氏病、血色素沉著病、α-1-抗胰島素缺陷、糖尿病腎病、橋本氏甲狀腺炎、骨質(zhì)疏松癥、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、原發(fā)性膽汁性肝硬化、甲狀腺炎、腦脊髓炎、惡液質(zhì)、囊性纖維化、新生兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、家族性血巨噬細胞淋巴細胞組織細胞增多癥、皮膚病學狀況、銀屑病、斑禿、腎病綜合征、腎炎、腎小球腎炎、急性腎衰竭、血液透析、尿毒癥、中毒、驚厥前狀態(tài)、okt3治療、抗cd3治療、細胞因子治療、化療、放療(如包括，但不限于虛弱、貧血、惡液質(zhì)等)、慢性水楊酸鹽中毒、睡眠性呼吸暫停、肥胖、心臟衰竭、竇炎、炎性腸病等。見，例如theMerckManual，12th-17thEditions，Merck&Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，PharmacotherapyHandbook，Wellsetal.，eds.，SecondEdition，AppletonandLange，Stamford，Conn.(1998，2000)，每一篇通過在此引入作為參考。本發(fā)明也提供了一種調(diào)節(jié)或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種感染疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中的至少一種：急性和慢性細菌感染、急性和慢性寄生或感染過程，包括細菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神經(jīng)病、腦膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型等)、膿毒性關節(jié)炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎、大腸桿菌0157:h7、溶血性尿毒癥綜合征/血栓溶解性血小板減少性紫癜、瘧疾、登革熱、利什曼病、麻風病、中毒性休克綜合征、鏈球菌肌炎、氣性壞疽、分支桿菌結核、胞內(nèi)鳥型分枝桿菌分支桿菌(mycobacteriumaviumintracellulare)、間質(zhì)性漿細胞肺炎、盆腔炎性疾病、睪丸酮/附睪炎、軍團菌病、萊姆病、甲型流感、埃巴二氏病毒、生命體征相關的血巨噬細胞綜合征、致命性腦炎/無菌性腦膜炎等；上述任何方法可以任選包括給予需要所述調(diào)節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者有效量的至少一種含有至少一種抗GD2抗體的組合物或藥物組合物。本發(fā)明的任何方法可以包括，給予需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物、病人有效量的包含至少一種抗GD2抗體的組合物或藥物組合物。所述方法可以任選進一步包括用于治療這些免疫疾病或惡性疾病的共同施用或聯(lián)合治療，其中給予所述至少一種抗GD2抗體、其特定部分或變體，進一步包括在之前、同時和/或之后，給予至少一種選自下組至少一種的藥物：TNF拮抗劑(例如，但不限于TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或其片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗劑)、IL-18抗體或抗體片段、小分子IL-18拮抗劑或IL-18受體結合蛋白、IL-1抗體(包括IL-1α和IL-1β)或片段、可溶性IL-1受體拮抗劑、抗風濕藥物(如氨甲喋呤、金諾芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥基氯喹、來氟米特、柳氮磺胺吡啶)、放療、抗血管新生劑、化療劑、沙利度胺肌肉松弛劑、麻醉藥、非甾體類抗炎藥(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經(jīng)肌肉阻滯劑、抗微生物劑(如氨基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑、碳青霉素烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其它抗微生物劑)、抗銀屑病藥物、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關試劑、礦物質(zhì)、營養(yǎng)劑、甲狀腺制劑、維生素、鈣相關激素、促紅細胞生成素(如epoetinα)、菲格司亭(如G-CSF，優(yōu)保津)、沙格司亭(GM-CSF，Leukine(重組GM-CSF))、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑(如巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達克珠單抗)、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、散瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑郁劑、抗躁狂藥、抗精神病藥物、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經(jīng)藥物、刺激劑、多奈哌齊、他克林、抗哮喘藥、β激動劑、吸入性類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸鈉、腎上腺素或類似物、α鏈道酶(Pulmozyme)、細胞因子或細胞因子拮抗劑。適當?shù)膭┝渴潜绢I域公知的。見，例如，Wellsetal.，eds.，PharmacotherapyHandbook，2ndEdition，AppletonandLange，Stamford，CT(2000)；PDRPharmacopoeia，TarasconPocketPharmacopoeia2000，DeluxeEdition，TarasconPublishing，LomaLinda，CA(2000)，茲通過提述并入這些參考文獻每一篇的全部內(nèi)容。。適用于本發(fā)明的組合物、聯(lián)合治療、共同施用、設備和/或方法的TNF拮抗劑(進一步包括本發(fā)明的至少一種抗體、其特定片段和變體)包括，但不限于，抗TNF抗體、其抗原結合片段、以及與TNF特異性結合的受體分子；防止和/或抑制TNF合成、TNF釋放或TNF作用于靶細胞的化合物，如酞胺哌啶酮、替尼達普、磷酸二酯酶抑制劑(如己酮可可堿和環(huán)戊苯吡酮)、A2b腺苷受體激動劑和A2b腺苷受體增強劑；防止和/或抑制TNF受體信號傳遞的化合物，如有絲分裂原激活的蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻斷和/或抑制膜TNF裂解的化合物，如金屬蛋白酶抑制劑；阻斷和/或抑制TNF活性的化合物，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑(如卡托普利)；和阻斷和/或抑制TNF活性產(chǎn)生和/或合成的化合物，如MAP激酶抑制劑。本發(fā)明的任何方法可以包括治療GD2介導的病癥或以GD2表達為特征的病癥的方法，所述方法包括給予需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者有效量的包含至少一種GD2抗體的組合物或藥物組合物。所述方法可以任選進一步包括用于治療這些免疫疾病的共同施用或聯(lián)合治療，其中給予所述至少一種抗GD2抗體、其特定部分或變體，進一步包括在之前、同時和/或之后，給予至少一種上述試劑。一般地，病理學狀況的治療是通過給予有效量或劑量的至少一種抗GD2抗體組合物而實現(xiàn)的，該組合物中平均總共含有至少約0.01-500mg至少一種抗GD2抗體/千克患者體重/劑，優(yōu)選每單次或多次施用約0.1-100mg抗體/千克患者體重，這取決于組合物中含有的具體活性?；蛘?，有效血清濃度可以包括每單次或多次施用0.1-5000μg/ml的血清濃度。適當?shù)膭┝渴轻t(yī)學從業(yè)者已知的，當然，取決于特定的疾病狀態(tài)、給予的組合物的具體活性、以及患者正在進行的具體治療。在一些情況下，為獲得需要的治療量，有可能必須提供重復施用，即重復特定監(jiān)測或計量劑量的各次施用，其中重復各次施用，直到達到需要的每日劑量或效果。優(yōu)選的劑量可以任選包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其中的任意范圍、任意值或任意分數(shù)，或每單次或多次施用達到0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、和/或5000μg/ml血清濃度，或其中的任意范圍、任意值或任意分數(shù)。此外，施用劑量可以根據(jù)已知因素而改變，例如具體試劑的藥代動力學特征，以及其施用模式和途徑；接受者的年齡、健康和體重；癥狀的性質(zhì)和范圍；同時進行的治療的類型、頻率，以及需要的效果。通?；钚猿煞值膭┝繛榧s0.1-100mg/kg體重。通常為0.1-50，優(yōu)選0.1-10mg/kg/施用，或以有效獲得需要的結果的持續(xù)釋放形式。作為非限制性實例，人或動物的治療可以通過一次或周期劑量的至少一種本發(fā)明的抗體而提供，其劑量為0.1-100mg/kg，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/日，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40天中的至少一天施用，或作為選擇或額外地在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、或52周的至少一周施用，或作為選擇或額外地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20年中的至少一年中施用，或其任意組合，采用單次、輸注或重復給藥。適于內(nèi)部施用的劑型(組合物)一般包含約0.1mg-約500mg活性成分/單位或容器。在這些藥物組合物中，活性成分的量一般為基于組合物總重量的約0.5-99.999%(重量)。對于腸胃外施用，可以將抗體配制為與可藥用的腸胃外載體結合或分別提供的溶液、懸浮液、乳液或凍干的粉末。這些載體的例子為水、鹽水、林格氏液、右旋糖溶液、和1-10%的人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水性載體如固定的油。載體或冷凍干燥的粉末可以含有維持等滲性(如氯化鈉、甘露醇)和化學穩(wěn)定性(如緩沖劑和防腐劑)的添加劑。該制劑通過已知或適當技術滅菌。適當?shù)乃幬飺d體描述于本領域的標準參考文獻Remington’sPharmaceuticalSciences，A.Osol的最新版本。腸胃外施用的制劑可以包含作為常規(guī)賦形劑的無菌水或鹽水、聚鏈烷醇如聚乙二醇、植物油、氫化萘等?？梢酝ㄟ^適當?shù)娜榛瘎┗驖櫇駝┖蛻腋└鶕?jù)已知方法制備用于注射的水性或油性懸浮液。用于注射的試劑可以是無毒的、可非口服施用的稀釋劑，如水溶液或無菌可注射溶液或溶劑中的懸浮液。作為可使用的載體或溶劑，可以使用水、林格氏液、等滲鹽水等；作為普通溶劑或懸浮溶劑，可以使用無菌的不揮發(fā)油。對于這些目的，可以使用任意類型的不揮發(fā)油和脂肪酸，包括天然或合成的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成的或半合成的甘油單酯或二酯或三酯。腸胃外施用是本領域公知的，包括，但不限于，常規(guī)注射工具、描述于美國專利No.5,851,198的氣加壓的無針頭注射設備，和描述于美國專利No.5,839,446的激光穿孔器設備，在此全文引入上述專利作為參考。本發(fā)明進一步涉及通過胃腸外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、奧馬耶貯器內(nèi)、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、結腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、椎管內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、推注、陰道、直腸、頰部、舌下、鼻內(nèi)、或經(jīng)皮方式施用至少一種抗GD2抗體?？梢灾苽渲辽僖环N抗GD2抗體的組合物，用于腸胃外(皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))或任意其它施用，特別是以液體溶液或懸浮液施用；用于陰道或直腸施用，特別是以半固體形式施用，例如，但不限于以霜和栓劑形式施用；用于頰部或舌下施用，例如，但不限于以片劑或膠囊形式施用；或用于鼻內(nèi)施用，例如，但不限于以粉末、鼻滴液或氣溶膠或某些制劑形式施用；或用于經(jīng)皮施用，例如，但不限于以凝膠、油膏、洗液、懸浮液或貼劑遞送系統(tǒng)施用，同時用化學增強劑如二甲基亞砜修飾皮膚結構或增加經(jīng)皮貼劑的藥物濃度(Junginger，etal.收錄于“DrugPermeationEnhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp.59-90(MarcelDekker，Inc.NewYork1994，)在此全文引入作為參考)，或使用氧化劑以便將含有蛋白和肽的制劑應用于皮膚上(WO98/53847)，或施加電場以便產(chǎn)生電穿孔等瞬時轉(zhuǎn)運途徑，或增加帶電藥物通過皮膚的遷移率，如離子電滲療法，或應用超聲，如超聲電滲療法(美國專利Nos.4,309,989和4,767,402)(上述文獻和專利在此全文引入作為參考)。對于肺部施用，至少一種抗GD2抗體組合物優(yōu)選以到達肺的下氣道或鼻竇的顆粒大小進行遞送。根據(jù)本發(fā)明，至少一種抗GD2抗體可以通過本領域公知的各種吸入或鼻設備遞送，用于通過吸入進行治療劑的施用。這些設備可以將氣溶膠化的制劑沉積在患者的鼻竇腔或肺泡中，所述設備包括計量吸入器、噴灑器、干粉產(chǎn)生器、噴霧器等。其它適于指導抗體的肺或鼻施用的設備是本領域公知的。所有這些設備可以使用適于以氣溶膠形式給予分散抗體的制劑。這些氣溶膠可以由溶液(水性和非水性)或固體顆粒組成。等計量吸入器一般使用推進氣體并且在吸入時要求作動(見，例如WO94/16970，WO98/35888)。干粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、InhaleTherapeutics出售的裝置，僅舉數(shù)例，利用對混合粉末的呼吸作動(US4668218Astra，EP237507Astra，WO97/25086Glaxo，WO94/08552Dura，US5458135Inhale，WO94/06498Fisons，在此全文引入作為參考)。噴灑器如噴灑器(Mallinckrodt)和噴灑器(MarquestMedicalProducts)((US5404871Aradigm，WO97/22376)，上述參考文獻在此全文引入作為參考)從溶液產(chǎn)生氣溶膠，而計量吸入器、干粉吸入器等產(chǎn)生小顆粒氣溶膠。這些商購吸入設備的具體例子是用于代表適于本發(fā)明的實施的具體設備，不準備限制本發(fā)明的范圍。包含至少一種抗GD2抗體的組合物優(yōu)選通過干粉吸入器或噴霧器遞送。用于本發(fā)明的至少一種抗體的施用的吸入設備具有一些理想的特征。例如，通過吸入設備遞送是有利的，它可靠、可重復并且準確。吸入設備可以任選遞送小的干顆粒，例如小于約10μm，優(yōu)選約1-5μm，以便能夠較好地呼吸。可以迫使至少一種抗GD2抗體的懸浮液和溶液在壓力下通過噴嘴，從而產(chǎn)生包括GD2抗體組合物蛋白的噴霧?？梢赃x擇噴嘴大小和構型、施加的壓力和送入液體的速度而達到需要的輸出量和顆粒大小。可以通過例如連接于毛細管或噴嘴的電場產(chǎn)生電噴霧。有利的是，由噴霧遞送的至少一種抗GD2抗體組合物蛋白的顆粒大小小于約10μm，優(yōu)選約1-5μm，最優(yōu)選約2-3μm。適用于噴霧器的至少一種抗GD2抗體組合物蛋白的制劑一般包含溶于水溶液中的抗體組合物蛋白，其濃度為約每毫升溶液約0.1-100mg至少一種抗GD2抗體組合物蛋白或mg/gm，或其中的任意范圍或任意值，例如，但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/ml或mg/gm。該制劑可以包含賦形劑、緩沖劑、等滲試劑、防腐劑、表面活性劑和優(yōu)選鋅等試劑。該制劑也可以包含賦形劑或用于穩(wěn)定抗體組合物蛋白的試劑，例如緩沖劑、還原劑、填充蛋白(bulkprotein)或碳水化合物。用于配制抗體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等。用于配制抗體組合物蛋白的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等?？贵w組合物蛋白制劑也可以包含表面活性劑，它可以減少或防止由于溶液形成氣溶膠時的霧化導致的表面誘導的抗體組合物蛋白的聚集?？梢允褂酶鞣N常規(guī)的表面活性劑，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其含量一般為制劑重量的約0.001-14%。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。公知的用于GD2抗體或其特定部分或變體的蛋白制劑的其它試劑也可以包含在制劑中?？贵w組合物蛋白可以通過噴灑器施用，例如射流噴灑器或超聲噴灑器。一般地，在射流噴灑器中，用壓縮氣體源通過一個孔而產(chǎn)生高速氣體射流。當氣體膨脹超過噴嘴時，產(chǎn)生低壓區(qū)，該區(qū)將抗體組合物蛋白溶液拉拽通過與液體儲存器連接的毛細管。通過毛細管的液體流出管時被剪切成不穩(wěn)定的細絲和微滴，產(chǎn)生氣溶膠。可以使用各種構型、流速和擋板類型，以便用給定的射流噴灑器達到需要的性能特征。在超聲噴灑器中，采用高頻電能產(chǎn)生振動、機械能，一般采用壓電式換能器。該能量被直接或通過耦合流體轉(zhuǎn)移至抗體組合物蛋白，產(chǎn)生包含抗體組合物蛋白的氣溶膠。有利地，由噴灑器遞送的抗體組合物蛋白的顆粒大小小于約10μm，優(yōu)選約1-5μm，最優(yōu)選約2-3μm。適用于噴灑器，包括射流噴灑器或超聲噴灑器，的至少一種抗GD2抗體制劑的濃度一般為每毫升溶液約0.1-100mg至少一種抗GD2抗體蛋白。該制劑可以包含賦形劑、緩沖劑、等滲試劑、防腐劑、表面活性劑和優(yōu)選鋅等試劑。該制劑也可以包含賦形劑或用于穩(wěn)定至少一種抗GD2抗體組合物蛋白的試劑，例如緩沖劑、還原劑、填充蛋白或碳水化合物。用于配制至少一種抗GD2抗體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等。用于配制至少一種抗GD2抗體的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一種抗GD2抗體制劑也可以包含表面活性劑，它可以減少或防止由于溶液形成氣溶膠時的霧化導致的表面誘導的至少一種抗GD2抗體的聚集?？梢允褂酶鞣N常規(guī)的表面活性劑，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其含量一般為制劑重量的約0.001-4%。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制蛋白如抗體蛋白等的其它試劑是本領域公知的，也可以包含在制劑中。在計量吸入器(MDI)中，推進劑、至少一種抗GD2抗體和任意賦形劑或其它添加劑作為包含液化壓縮氣體的混合物被裝在一個小罐中。計量閥的作動釋放作為氣溶膠的混合物，優(yōu)選含有大小小于約10μm，優(yōu)選約1-5μm，最優(yōu)選約2-3μm的顆粒。需要的氣溶膠顆粒大小可以通過使用由本領域技術人員公知的各種方法，包括射流研磨、噴霧干燥、臨界點濃縮等方法產(chǎn)生的抗體組合物蛋白制劑而獲得。優(yōu)選的計量吸入器包括由3M或Glaxo制造并且使用氫氟碳推進劑的那些。計量吸入器裝置中使用的至少一種抗GD2抗體制劑一般包含精細分割的粉末，其中含有作為非水介質(zhì)中的懸浮物的至少一種抗IL-6抗體，例如，在表面活性劑的幫助下懸浮于一種推進劑中。用于此目的的推進劑可以是任何常規(guī)材料，如氯氟碳、氫氯氟碳、氫氟碳或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氫氟鏈烷-134a)、HFA-227(氫氟鏈烷-227)等。推進劑優(yōu)選是氫氟碳?？梢赃x擇表面活性劑以使至少一種抗GD2抗體作為懸浮物穩(wěn)定在推進劑中，從而保護活性試劑免受化學降解等。適當?shù)谋砻婊钚詣┌ㄉ嚼嫣谴既退狨ァ⒋蠖孤蚜字?、油酸等。在一些情況下，使用乙醇等溶劑的溶液氣溶膠是優(yōu)選的。本領域已知的用于蛋白制劑的其它試劑也可以包含在制劑中。本領域的普通技術人員將認識到，本發(fā)明的方法可以通過本文中沒有描述的裝置對至少一種抗GD2抗體組合物進行肺部施用而達到。用于口服施用的制劑依賴于佐劑(如間苯二酚和非離子型表面活性劑如聚氧乙烯油酯和正十六烷基聚乙烯酯)的共同施用而人工增加腸壁的通透性，并且依賴于酶抑制劑(如胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟代硫酸酯(DFF)和抑肽酶)的共同施用而抑制酶促降解。用于口服施用的固態(tài)劑型的活性組成化合物可以與至少一種添加劑混合，所述添加劑包括蔗糖、乳糖、纖維素、甘露醇、海藻糖、棉籽糖、麥芽糖醇、右旋糖苷、淀粉、瓊脂、藻酸鹽(arginates)、幾丁質(zhì)、脫乙酰殼聚糖、果膠、黃芪樹膠、阿拉伯樹膠、明膠、膠原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。這些劑型也可以包含其它類型的添加劑，如非活性稀釋劑、潤滑劑如硬脂酸鎂、對羥基苯甲酸酯、防腐劑如山梨酸、抗壞血酸、α生育酚、抗氧化劑如半胱氨酸、崩解劑、粘合劑、增稠劑、緩沖劑、增甜劑、矯味劑、芳香劑等。片劑和丸劑可以進一步加工成腸衣制劑。用于口服施用的液體制劑包括允許醫(yī)學應用的乳液、糖漿、酏劑、懸浮液和溶液制備物。這些制備物可以含有所述領域常用的非活性稀釋劑，如水。也已經(jīng)描述將脂質(zhì)體用作胰島素和肝素的藥物遞送系統(tǒng)(美國專利No.4,239,754)。最近，已經(jīng)使用混合氨基酸(類蛋白)的人工聚合物微球體來遞送藥物(美國專利No.4,925,673)。此外，本領域已知美國專利No.5,879,681和美國專利No.5,5,871,753中描述的但載體化合物也已經(jīng)用于口服遞送生物活性試劑。對于通過粘膜的表面吸收，給予至少一種抗GD2抗體的組合物和方法包括含有多種亞微米顆粒、粘膜吸附性大分子、生物活性肽和水性連續(xù)相的乳液，它通過達到乳液顆粒的粘膜吸附而促進通過粘膜表面的吸收(美國專利Nos.5,514,670)。適于施加本發(fā)明的乳液的粘膜表面可以包括角膜、結膜、頰、舌下、鼻、陰道、肺、胃、腸和直腸施用途徑。用于陰道或直腸施用的制劑，如栓劑，可以包含賦形劑，例如聚鏈烷醇、凡士林、可可油等。用于鼻內(nèi)施用的制劑可以是固體，并包含例如乳糖作為賦形劑；或可以是水性或油性的鼻滴液。對于頰部施用，賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預膠化淀粉等(美國專利Nos.5,849,695)。對于經(jīng)皮施用，將至少一種抗IL-6抗體包被于遞送裝置，如脂質(zhì)體或聚合納米顆粒、微顆粒、微膠囊或微球體中(除非特別指出，統(tǒng)一稱作微顆粒)。適合的裝置已知有許多，包括由以下成分組成的微顆粒：合成聚合物如多羥基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，以及天然聚合物如膠原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白、藻酸鹽和其它多糖、及其組合(美國專利Nos.5,814,599)。有時可能需要在長時間內(nèi)向受試者遞送本發(fā)明的化合物，例如，自單次施用起一周至一年的周期?？梢允褂酶鞣N緩釋、儲存或植入劑型。例如，劑型可以包含化合物的可藥用的無毒鹽，該化合物在體液中具有低溶解度，例如，(a)多價酸的酸加成鹽，所述酸例如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、鞣酸、拍酸、藻酸、聚谷氨酸、萘單或二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)多價金屬陽離子的鹽，所述陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等，或與有機陽離子如N,N’-二芐基-乙二胺或乙二胺形成的鹽；或(c)，(a)和(b)的組合物，如鞣酸鋅鹽。此外，本發(fā)明的化合物或優(yōu)選相對不溶的鹽，如前面描述的化合物和鹽，可以與例如芝麻油等適于注射的物質(zhì)一起配制于例如單硬脂酸鋁凝膠等凝膠中。特別優(yōu)選的鹽是鋅鹽、鞣酸鋅鹽、雙羥萘酸鹽等。用于注射的緩釋儲存制劑的另一種類型包含用于包被于膠囊中的分散的化合物或鹽，所述化合物或鹽位于緩慢降解、無毒、非抗原性的聚合物中，如描述于美國專利No.3,773,919的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。該化合物或優(yōu)選相對不溶的鹽，如前面描述的化合物和鹽，也可以配制于膽固醇基質(zhì)硅橡膠丸中，特別是用于動物。其它緩釋、儲存或植入制劑，如氣體或液體脂質(zhì)體是文獻中公知的(美國專利Nos.5,770,222和“SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems”，J.R.Robinsoned.，MarcelDekker，Inc.，N.Y.，1978)。在此明確地通過提述并入本申請引用的所有參考文件(包括文獻參考文件、授權的專利、公布的專利申請、以及共同待審的專利申請)的內(nèi)容。在下文對示例性的實施方案的描述過程中本發(fā)明的其他特征可變得自明，這些描述只是為了示例說明本發(fā)明而不意在限制本發(fā)明。下面的“材料和方法”在下文中的實施例中使用。材料和方法細胞培養(yǎng)物和人組織人神經(jīng)母細胞瘤細胞系LAN-1由RobertSeeger博士(Children’sHospitalofLosAngeles，LosAngeles，CA)提供，NB1691由PeterHoughton博士(St.JudeChildren'sResearchHospital，Memphis，TN)提供。NK-92MI獲自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，Manassas，VA。使所有細胞系在5%CO2培養(yǎng)箱中在F10[補充有10%胎牛血清(Hyclone，SouthLogan，UT)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、和100ug/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基]中37°C下生長。將在MemorialSloan-KetteringCancerCenter(MSKCC)獲得的不同組織學類型的正常組織和實體瘤樣品在液氮中速凍。遵照MSKCC機構審查委員會的指南從患者和/或他們的監(jiān)護人獲得了書面知情同意。單克隆抗體鼠3F8是一種具有κ輕鏈的小鼠IgG3抗體(Cheungetal.，1985，CancerRes45，2642-9)。與神經(jīng)母細胞瘤具有反應性的單克隆抗體3F8(小鼠IgG3，κ)、5F11(小鼠IgM，κ)和8H9(小鼠，κ)先前已經(jīng)有描述(Cheungetal，1985，同上;Cheungetal.，2004，JNuclMed45，867-77;Modaketal.，2001，CancerRes61，4048-54)。它們作為腹水產(chǎn)生并通過親和色譜純化：對于3F8為蛋白A(GEHealthcare，Piscataway，NJ)，對于8H9為蛋白G，而對于5F11為C1q-sepharose(Pierce，Rockford，IL)。這些抗體根據(jù)SDS-PAGE為>90%純。如先前所述通過胃蛋白酶消化制備了F(ab')2片段(Cheungetal.，1988，JClinInvest81，1122-28)?？笹D2雜交瘤ME361及TIB114(N.S.7)，一種分泌IgG3對照抗體的雜交瘤，獲自ATCC。14.G2a購自BDBiosciences，SanJose，CA。嵌合14.18由LexigenPharmaceuticals，Lexington，MA的StephenGillies博士惠贈。MAB1027(anti-B7-H3MoAb)購自R&DSystem，Minneapolis，MN。針對GD2特異性的小鼠IgG3抗體S220-51購自NorthstarBioproducts，CapeCod，MA。hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG4、ch3F8-IgG1、和ch3F8-IgG4抗體產(chǎn)生系的構建。基于m3F8的人同源物，將m3F8的重鏈和輕鏈二者的CDR序列嫁接到人IgG1框架中并加以優(yōu)化。從兩個重鏈基因和兩個輕鏈基因設計了4個版本的hu3F8。合成這些hu3F8基因并針對CHO細胞優(yōu)化(BlueHeronBiotechnology，Bothhell，WA或Genscript，Piscataway，NY)。使用bluescript載體(Eureka，CA)將這些hu3F8的重鏈和輕鏈基因轉(zhuǎn)染到DG44細胞中并用G418(InVitrogen，CA)選擇。當轉(zhuǎn)染到Mage1.5CHO細胞(Eureka，CA)中時，產(chǎn)生了特殊的IgG糖形(glycoform)。類似地將小鼠VH和VL序列嫁接到人IgG1和IgG4框架上以制作ch3F8-IgG1和ch3F8-IgG4重組抗體。hu3F8與ch3F8的純化將Hu3F8與ch3F8產(chǎn)生系在Opticho無血清培養(yǎng)基(InVitrogen，CA)中培養(yǎng)并收集成熟的上清液。蛋白A親和柱用含0.15NaCl，pH8.2的25mM檸檬酸鈉緩沖液預平衡。將結合的hu3F8用0.1M檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液，pH3.9洗脫并在25mM檸檬酸鈉，pH8.2中堿性化(1:10v/v比)。使其通過Sartobind-Q膜并濃縮到25mM檸檬酸鈉、0.15MNaCl、pH8.2中的5-10mg/ml。對hu3F8-IgG1分別在25mM檸檬酸鈉、0.15MNaCl，pH8.2中及PBSpH7.4中在有或無0.7mg/ml吐溫80(Sigma)的條件下進行穩(wěn)定性研究。SDS-PAGE將每種蛋白質(zhì)2ug在非還原性或還原性條件下進行SDS-PAGE分析，使用4-15%Tris-甘氨酸速成凝膠系統(tǒng)(ReadyGelSystem)(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用InvitrogenSeeBluePlus2預染色標準品作為蛋白質(zhì)分子量標記物。電泳后，使用PIERCE的GelCode藍色染色試劑對凝膠染色。使用Bio-RadFluor-SMultiImager(Bio-Rad)掃描凝膠，并用QuantityOne軟件(Bio-Rad)對條帶強度定量。通過ELISA定量hu3F8和ch3F8以20ng每孔用GD2包被微量滴定板。對每個板加入150μl每孔的溶于PBS(稀釋劑)的0.5%BSA，在環(huán)境溫度下經(jīng)過至少30分鐘以封閉過量的結合位點，然后用PBS洗滌至少3次。用一批次的純化hu3F8-IgG1(儲存濃度1mg/ml)來構建標準曲線，以0.5ug/ml起始，后隨多個2倍稀釋。將100ul的標準品和樣品(也2倍稀釋)添加到每個孔中并在37℃溫育2.5小時。用PBS洗滌平板5次后，向每個孔中加入100ul在稀釋劑中1:3500稀釋后的山羊抗人IgG(H+L)(JacksonResearchLaboratory)并在4℃溫育1小時。ELISA顏色反應用色原OPD(Sigma)，過氧化氫為底物，室溫黑暗中顯色30min。用5NH2SO4終止反應，用ELISA讀板器MRX(Dynex)讀取490的OD?；谠摌藴是€，以ug/ml或ug/mg蛋白計來計算人3F8上清液的量。BiacoreT-100生物傳感器(BiacoreABofGEHealthcare，Uppsala，Sweden)上的體外結合動力學CM5傳感器芯片(研究級別)和相關的試劑購自BiacoreUSA(Piscataway，NJ)。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1來自ALEXISBiochemicals(AXXORALLC，SanDiego，CA)，GD2來自AdvancedImmunoChemical(LongBeach，CA)。GM1溶于(0.5mg/ml)90%乙醇、10%甲醇(v/v)，GD2溶于(0.5mg/ml)乙醇。通過疏水相互作用將神經(jīng)節(jié)苷脂直接固定化到CM5傳感器芯片上。參比表面固定GM1。GM1用100%乙醇1:1稀釋，然后在HBS-E緩沖液(10mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、及3mMEDTA)中1/5稀釋。將經(jīng)稀釋的GM1(50μg/ml)以15μl/min的流速歷時20分鐘注射(300μl)。然后用10mMNaOH充分洗滌(通常以5μl/min流速20μl洗滌5次)，直到獲得穩(wěn)定的基線?；钚员砻嬗肎D2和GM1以1:1比例固定化。GD2和GM1用100%乙醇1:1稀釋并以1:1比例混合。將GD2與GM1的混合物在HBS-E緩沖液(10mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、及3mMEDTA)中1/5稀釋。將經(jīng)稀釋的GD2與GM1(50μg/ml)混合物(300μl)以15μl/min流速歷時20min注射。然后用10mMNaOH充分洗滌(通常以5μl/min流速20μl洗滌5次)，直到獲得穩(wěn)定的基線。在分析之前將純化的抗GD2MoAbs在含有250mMNaCl的HBS-E緩沖液中稀釋到不同濃度(50～1600nM)。2.將樣品(60μl)以30μl/min流速歷時2分鐘注射到傳感器表面上。締合階段完成后，在相同的流速下在含有250mMNaCl的HBS-E緩沖液中監(jiān)測解離300秒鐘。在每個循環(huán)結束時，將表面用50μl20mMNaOH以50μl/min流速再生1分鐘，以及用100μl4MMgCl2以50μl/min流速再生2分鐘。用注射樣品到固定化GD2之上后獲得的生物傳感器曲線減去在動力學分析之前注射樣品到固定化的GM1之上而獲得的對照曲線。利用BiacoreT-100評價軟件用二價分析物模型(bivalentanalytemodel)及速率常數(shù)的缺省參數(shù)設置分析數(shù)據(jù)，并計算表觀締合開(on)速率常數(shù)(kon，ka1)、解離關(off)常數(shù)(koff，kd1)，以及解離平衡常數(shù)(KD=kd1/ka1)。進一步使用大鼠抗3F8抗獨特型抗體(Cheungetal.、1993、IntJCan54、499-505)表征了Hu3F8和ch3F8。還將這些大鼠IgG1抗體消化成Fab片段，并使用Fab制備試劑盒(PierceProteinResearchProducts，ThermoFisherScientific)加以純化。用ELISA和BIACORE測定了它們對ch3F8和hu3F8的反應性。對與其他神經(jīng)節(jié)苷脂的交叉反應性的ELISAGD2、GM2、GD1a、GD1b、GT1b、以及GD3、GM3、GM1、GD1a在90%乙醇中以20ng/孔包被。空氣干燥后，用150ul/孔的含0.5%BSA的PBS室溫封閉孔1小時，然后用PBS洗滌3次。一式三份地加入0.5%BSA中的1ug/ml的抗體(每孔100ul)。為了扣減背景，使用了(1)無抗原的孔和(2)無樣品的孔。在37℃溫育2小時并用PBS洗滌5次后，使用HRP-山羊抗小鼠IgG(JacksonLaboratory，稀釋到1:1000)(用于小鼠抗體(例如3F8))或HRP-山羊抗人IgG(JacksonLaboratory，1:1000)(用于人源化抗體)。在4℃再溫育1小時并再洗滌后，使用ELISA讀板器MRX(Dynex)于490讀取OD，并以相對于對GD2的最大結合的%來表示交叉反應性?？贵w的生物素化將生物素(長臂(LongArm)-N-羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS，VectorLaboratories，Inc.，Burlingame，CA)以50mg/ml濃度溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。以試劑對抗體1/10的重量比加入生物素化試劑。在不時攪動下，室溫溫育反應混合物2小時。將生物素化的抗體在PBS中室溫透析4小時或4℃透析過夜。將生物素化抗體的免疫反應性與天然抗體比較，并確保二者的EC50相互在20%之內(nèi)。免疫染色確定的組織交叉反應性用冷凍切片機切出5-7微米厚的冷凍切片，用250ul丙酮在-20℃固定30分鐘。用PBS洗滌玻片之后，使玻片在室溫下暴露于新鮮配制的0.1%過氧化氫15分鐘。洗滌之后，加入封閉性親和素溶液(VECTOR親和素-生物素封閉試劑盒)并在室溫溫育20分鐘。洗滌之后，加入1滴封閉性生物素溶液(VECTOR親和素-生物素封閉試劑盒)并在室溫溫育20分鐘。在進一步洗滌之后，加入>100ul封閉血清(在PBS中新鮮稀釋的10%馬血清)并在室溫溫育1h。這一步可以更長。注意：不能重復使用血清。從每個玻片吸出封閉血清后，加入100ul在1%馬血清中稀釋的1ug/ml生物素化MOPC21(陰性對照)或生物素化抗體并在室溫溫育1小時。洗滌之后，加入100ul在PBS中1:100稀釋的親和素-生物素復合物[ABC](VectastainABC試劑盒，VECTOR)并在室溫溫育30分鐘。洗滌之后，向每個切片添加200ul染料(DAB過氧化氫酶底物試劑盒，VECTOR)并讓顏色發(fā)色2分鐘(直到根據(jù)標準品中的發(fā)色判定達到了期望的染色強度)。在流動的自來水中洗滌切片5分鐘并用儲存的Myer’s蘇木精復染，然后進一步在流動的自來水中洗滌5分鐘。將玻片順序地在75%、然后95%，再然后100%的乙醇中脫水。最后的脫水步驟在二甲苯或二甲苯替代劑中進行。加入1滴新鮮的Cytoseal，然后用蓋玻片密封切片。直接細胞毒性測試了抗體在沒有人血清或人效應細胞存在時對腫瘤細胞生長和生存的直接影響。將腫瘤靶物用2mMEDTA或胰蛋白酶-EDTA解離，洗滌，并以1.2x103至3.5x104/孔播種在96孔平底平板中的F10中。在CO2培養(yǎng)箱中5%CO2、37℃溫育24小時后，對各個孔中加入遞增濃度的溶于F10的抗體。對照孔僅接受F10。5%CO2中37℃溫育72小時后，對每個孔加入WST-8試劑并在CO2培養(yǎng)箱中37℃黑暗中溫育2-6小時。使用ELISA讀板器MRX(Dynex)在450nm和690nm讀取OD。通過使用臺盼藍(Sigma)或BeckmanCoulter計數(shù)儀(BeckmanCoulter，Brea，CA)直接細胞計數(shù)來驗證WST-8測定。借助51Cr釋放的抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)將靶細胞用2mMEDTA解脫到不含Ca2+和Mg2+的PBS中，并用含10%小牛血清(Gibco)的RPMI1640(F10)洗滌。將100μCi的51Cr與106個靶細胞在終體積250μl中37℃溫育1小時，其中每隔15分鐘輕柔地使沉淀重懸浮。然后洗滌細胞并在250ulF10中重懸浮并在37℃溫育30分鐘。洗滌后，計數(shù)細胞并使用臺盼藍(Sigma)測定存活力，并快速播種到96孔U底平板上。將來自正常志愿者的外周血收集到肝素化管中。將血液與3%右旋糖酐/PBS混合并保持于室溫20分鐘以使紅細胞沉降。然后用菲柯爾(ficoll)處理白細胞，并分離成外周血單個核細胞(PMBC)和粒細胞(PMN)，分別用于PBMC-ADCC和PMN-ADCC。用F10洗滌細胞，計數(shù)，并測定存活力。在10U/mlIL-2存在下進行PBMC-ADCC，在2ng/mlGMCSF存在下進行PMN-ADCC。ADCC的最終體積為250ul/孔。將抗體在F10中從1ug/ml起進行3倍或5倍稀釋。將平板在室溫500rpm短暫旋轉(zhuǎn)離心，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育4小時。收集ADCC上清液中釋放的51Cr用于γ計數(shù)。使用10%SDS測定總釋放，并使用沒有效應物的單獨F10測定背景自發(fā)釋放。一般使用50:1的E:T比。類似地，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CD16或人CD32Fc受體的NK92-MI細胞進行ADCC測定。與PBMC或PMN不同，該測定中不需要細胞因子。E:T比通常保持在20:1?？贵w的碘化利用iodogen法(Divgietal.，2007，LancetOncol.8，304-10)用124I和131I進行碘化。用50μgiodogen包被玻璃管形瓶，并將50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的100μgIgG與1mCi的124I(或131I)一起加入。碘124在MSKCC利用回旋加速器現(xiàn)場制作。在反應管形瓶中將0.05MNaOH中的10mCi的124I(0.02-0.05mL)與1mgMoAb(～0.5mL)、0.063mL1MTris堿和0.4mL0.2M磷酸鈉pH7.4混合。讓反應在冰上進行15分鐘，然后移出溶液，用P6大小排阻柱，含1%BSA的PBS作為洗脫液，通過大小排阻色譜進行純化。放射免疫測定(RIA)用Lindmo的方法來估計免疫反應性(Lindmoetal.，1984，JImmunolMethods72，77-89)。將放射標記的MoAb用1%BSA稀釋到50μl含有大約15,000-20,000cpm(約1-1.5uCi/3ml)。將50μl加入到含6.25、3.75、2.5、2.2、1.9百萬個腫瘤細胞的500μl0.5BSA中并在環(huán)境溫度下混合1小時。在1500rpm離心5分鐘后移出上清液并用1ml冰冷的0.5%BSA洗滌。再次在1500rpm離心5分鐘后，在γ計數(shù)器中計數(shù)細胞離心沉淀。減去在沒有細胞或碘化抗體的存在下的背景計數(shù)，并使用Lindmo法估計免疫反應性(Lindmoetal.，1984，同上)。MoAb在異種移植小鼠中的生物分布使用異種移植了皮下LAN1神經(jīng)母細胞瘤腫瘤的無胸腺裸小鼠來研究藥動學/生物分布和抗腫瘤性質(zhì)。用卡尺測量腫瘤。當皮下腫瘤達到～200mg時啟動實驗。每只小鼠靜脈內(nèi)注射～100uCi的放射性碘化抗體，且通常在48小時時處死動物，取出它們的器官并用γ計數(shù)器(PackardInstruments，PerkinElmer)計數(shù)。這些器官包括皮膚、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胃、小腸、大腸、膀胱、股骨、肌肉、腫瘤、心臟、肺、脊柱、以及腦?；谠谄鞴僦蟹e累的uCi以及器官重量，計算了%注射劑量(ID)/gm小鼠。還計算了%ID/gm的腫瘤對正常組織比。糖分析由ComplexCarbohydrateResearchCenter，Athens，GA進行了抗體的單糖和寡糖分析。單糖分析通過HPAEC測定。N-糖苷譜分析通過MALDI-MS進行。實施例1嵌合IgG1和四種人源化Igg1的氨基酸序列。將m3F8的重鏈和輕鏈的CDR嫁接到人IgG1框架上，基于它們各自對人框架IGGHV3-33和IGKV3-15的同源性。根據(jù)兩種重鏈和兩種輕鏈設計，基因合成了4個版本的hu3F8并在DG44細胞中表達。嵌合人重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，人源化重鏈序列huH1-gamma1示于SEQIDNO:4，huH2-gamma1示于SEQIDNO:6，人源化輕鏈序列huL1-kappa示于SEQIDNO:5，而huL2-kappa示于SEQIDNO:7。當表達為完整IgG時，四種hu3F8-IgG1命名為hu3F8-H1L1-IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1和hu3F8-H2L1-IgG1。制作了用人IgG4框架替代m3F8和hu3F8-H1L1-IgG1的重鏈序列(嵌合重鏈γ4、SEQIDNO:4和人源化3F8重鏈γ4、SEQIDNO:8)的其他構建物，用bluescript載體轉(zhuǎn)染到DG44細胞中。在另一組實驗中，將hu3F8-H1L1-IgG1序列轉(zhuǎn)染到一種特殊的經(jīng)過特殊的糖基化簽名選擇的MAGE1.5CHO細胞系(見“材料與方法”)中。嵌合和人源化3F8都是使用標準蛋白A親和色譜純化的。在SDS凝膠上，嵌合和人源化抗體作為具有合適大小的重鏈和輕鏈的IgG遷移；而且在HPLC上它們都作為完整的IgG洗脫，聚集物形成<10%(數(shù)據(jù)未顯示)。在ELISA中它們都以相似的親合力結合GD2。在FACS分析(LAN-1，數(shù)據(jù)未顯示)中抗體顯示最優(yōu)的抗體濃度(～0.1-1ug/百萬個細胞)，在此濃度之外由于較高抗體濃度下的細胞死亡而平均熒光強度(MFI)下降。對于M14黑素瘤，在超過1ug每百萬細胞的過量抗體條件下未發(fā)生細胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。IgG4傾向于具有較低的MFI，原因是熒光第二抗體與人IgG1的優(yōu)先反應性。與其他hu3F8構建體相比，hu3F8-H1L1-IgG1在凍融后最為穩(wěn)定，在FACS和ELISA中都保留其對腫瘤細胞的結合(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)糖分析，hu3F8-IgG1n主要具有甘露糖，以及一些N-乙酰-葡糖胺，與之相對的是，hu3F8-IgG1和hu3F8-IgG4含有幾乎等摩爾比的巖藻糖和N-乙酰-葡糖胺(表1)。實施例2基于SPR(BIACORE)的親合力測量將GD2包被到CM5芯片上，使用BIACORET-100通過表面等離子體共振在低GD2密度下比較了抗體結合的動力學(kon，koff和KD)(表2)。在高GD2密度下所有抗體的koff和KD均成比例地提高(數(shù)據(jù)未顯示)。對BIACORECM5芯片上在低GD2密度(數(shù)據(jù)未顯示)和高GD2密度(數(shù)據(jù)未顯示)下的不同抗體濃度的代表性抗體的傳感圖進行比較。表1：單糖組成抗體的緩慢的koff導致當抗體與GD-2陽性腫瘤細胞反應時的洗去(washoff)較慢。這里，將LAN-1細胞(數(shù)據(jù)未顯示)或M14細胞(數(shù)據(jù)未顯示)與單克隆抗體反應并用洗滌緩沖液洗滌多次。在每次洗滌時，使用第二種FITC標記的山羊抗小鼠抗體檢測細胞表面上殘余的抗體。MFI作為基線(即第一次洗滌之后)的百分比表示。在LAN-1細胞上，3F8和抗B7-H38H9抗體相比于14.G2a(～30%保留，數(shù)據(jù)未顯示)具有緩慢的洗去(10次洗滌后～80%保留)。類似地，對于M14腫瘤細胞，到第5次洗滌時，腫瘤細胞上的抗體的保留存在實質(zhì)性的差異。3F8、3F8-(Fab’)2和hu3F8-IgG1(它們都具有緩慢的koff)具有>80%的保留，而其他抗GD2抗體14.G2a(mIgG2a)、ME361(mIgG2a)、和S220-51(mIgG3)(它們都具有快速的koff，根據(jù)BIACORE)滲漏至<30%。Hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG4、ch3F8-IgG1和ch3F8-IgG4也在ELISA中及通過SPR(見“方法”)與大鼠抗3F8獨特型抗體(Cheungetal.，1993，InterJCancer54，499-505)以及它們的Fab以高親合力特異性反應。實施例3與其他抗原的交叉反應性在交叉反應性研究中，hu3F8-H1L1-IgG1具有與ch3F8-IgG1和m3F8相似的概貌(表3)。與GD1b存在低水平的交叉反應性，表達為ELISA中相對于固相GD2的OD的OD百分比。Western或SPR均顯示m3F8、hu3F8或14.G2a與人N-CAM無交叉反應性(Pateletal.，1989，Br.J.Cancer60，861-866)(數(shù)據(jù)未顯示)。表2:SPR(BIACORE-T100)測量的嵌合和人源化3F8的結合動力學抗體nkonkoffKD(nM)ch3F8-IgG121.15E+051.45E-0313±3hu3F8-H1L1-IgG1129.19E+041.03E-0311±1hu3F8-H1L2-IgG131.74E+051.07E-037±2hu3F8-H2L1-IgG131.92E+055.04E-0331±14hu3F8-H2L2-IgG131.52E+053.51E-0326±11hu3F8-H1L1-IgG1n39.76E+046.88E-0411±2ch3F8-IgG429.40E+041.28E-0314±2hu3F8-H1L1-IgG431.18E+051.76E-0315±1m3F8101.75E+051.04E-035±1m3F8(Fab')231.44E+051.23E-039±314.G2a61.30E+051.11E-02100±26實施例4直接細胞毒性當這些抗體體外添加到神經(jīng)母細胞瘤細胞時，它們誘導直接細胞死亡并減慢體外細胞生長。在3日培養(yǎng)系統(tǒng)中通過WST-8測定時，比較m3F8和hu3F8的EC50可見二者具有相似的效力(見表4)，與它們相對照的是，14.G2a大約弱10倍。表3:ELISA測定的與其他神經(jīng)節(jié)苷脂的交叉反應性實施例5抗體依賴性細胞介導的細胞毒性使用志愿者PMBC(數(shù)據(jù)未顯示)和志愿者PMN(數(shù)據(jù)未顯示)作為效應物，在ADCC測定中比較了四種hu3F8IgG1抗體(H1L1、H1L2、H2L1、H2L2)。除了H1L2之外的所有三種hu3F8具有可比較的PBMC-ADCC。但最重要的是，它們?nèi)?gt;10-100倍優(yōu)于m3F8。表4:抗體存在下的神經(jīng)母細胞瘤LAN-1的直接細胞毒性Hu3F8-H1L1-IgG1(縮寫為hu3F8-IgG1)在體外最為穩(wěn)定，選擇其用于進一步表征。使用PMBC(數(shù)據(jù)未顯示)或PMN(數(shù)據(jù)未顯示)作為效應物，在針對LAN-1的ADCC測定中比較了Ch3F8-IgG1、hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG1n、14.G2a、和m3F8。這些抗體的ADCC效力作為(3F8的EC50)/(MoAb的EC50)之比來計算(表5)。相對于m3F8，hu3F8-IgG1在PBMC-ADCC中強217倍，在PMN-ADCC中強19倍。hu3F8-IgG1n則分別強3901倍和5倍。此外，嵌合和人源化3F8達到的最大細胞毒性實質(zhì)性地且一致性高于m3F8或14.G2a，無論是PBMC-ADCC或是PMN-ADCC。為了考察MoAb在ADCC中對孤立的單獨FcR(在沒有抑制性FcR的存在下)的能力，我們使用了NK92細胞了測試ADCC。NK92細胞在其細胞表面上不攜帶人FcR。當用人CD16和CD32轉(zhuǎn)染時，它們能夠介導高效的ADCC。當用神經(jīng)母細胞瘤LAN-1靶物測試這些效應物細胞時，在CD16-ADCC中hu3F8-IgG1n的效率實質(zhì)性地(～10倍)高于hu3F8-IgG1，而hu3F8-IgG1的效率高于m3F8(12倍)(數(shù)據(jù)未顯示)。與之相對照的是，用CD32作為FcR時，hu3F8-IgG1的效力比hu3F8-IgG1n高將近10倍(數(shù)據(jù)未顯示)。當使用黑素瘤M14作為靶物時觀察到了類似的趨勢。在CD16-ADCC中，Hu3F8-IgG1n的效率比hu3F8-IgG1或ch3F8-IgG1高大約10倍，而hu3F8-IgG1或ch3F8-IgG1的效率比mu3F8或14G.2a高大約20倍(數(shù)據(jù)未顯示)。與之相對照的是，當FcR為CD32時，hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG1n和ch3F8-IgG1相似，在CD32-ADCC中都比m3F8效率高>10倍(表6)。IgG4亞類抗體具有<3%的CMC活性，最小的CD16-ADCC活性，但比m3F8更好的C32-ADCC。實施例6補體介導的細胞毒性在人補體介導的裂解(CMC)中，不同的hu3F8IgG1形式(H1L1、H1L2、H2L1、和H2L2)的效率相近(表6)。在CMC中Ch3F8與hu3F8為m3F8的40-60%，而14G.2a與ch14.18為4-12%(表6)。表5:在ADCC和CMC中針對神經(jīng)母細胞瘤LAN-1的相對抗體效力實施例7靶向人神經(jīng)母細胞瘤異種移植物用131I放射性標記的Hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG1n、和hu3F8-IgG4具有近似的免疫反應性，大約40-45%(表7)。將它們在攜帶皮下LAN-1神經(jīng)母細胞瘤異種移植物的小鼠中48小時時的生物分布與131I-m3F8進行了比較。當以%ID/gm量度時，腫瘤攝取在hu3F8-IgG1(29.6%)與m3F8(28.6%)之間是近似的，二者均大約二倍于hu3F8-IgG1n和hu3F8-IgG4(數(shù)據(jù)未顯示)。對于NBLAN-1異種移植物而言這四種抗體的腫瘤對正常組織比是近似的。相比之下，對于黑素瘤M14，所有三種hu3F8抗體的%ID/gm和腫瘤對正常組織比均與m3F8相似(數(shù)據(jù)未顯示)。表6:在ADCC和CMC中針對黑素瘤M14的相對抗體效力M14-CD16M14-CD32抗體效力效力14.G2a16ch14.18921ch3F8-IgG13917ch3F8-IgG400.5hu3F8-IgG12031hu3F8-IgG1n25210hu3F8-IgG40.14m3F811hu3F8-H1L2-IgG14044hu3F8-H2L1-IgG169hu3F8-H2L2-IgG11511實施例8對神經(jīng)母細胞瘤異種移植物的治療用m3F8或hu3F8-H1L1-IgG1靜脈內(nèi)處理異種移植了已建立的人神經(jīng)母細胞瘤LAN-1(0.5-1cm直徑)的小鼠，每周2次歷時4周。對腫瘤響應和小鼠生存進行監(jiān)控。腫瘤生長的延遲對hu3F8-H1L1-IgG1抗體劑量具有依賴性(200ug>100ug>20ug，數(shù)據(jù)未顯示)。接受100-200ug的小鼠的生存顯著地長于(p=0.003)接受PBS對照或m3F8的小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)。表7:生物分布研究中131I標記的抗體的RIALAN1m3F8hu3F8-IgG1hu3F8-IgG1nhu3F8-IgG4RIA45%45%42%40%TCA94%96%96%96%#小鼠18191719討論抗GD2抗體是一種已得到證實的GD2陽性神經(jīng)母細胞瘤的治療手段(Yuetal.，NEnglJMed363:1324-1334，2010)。鼠抗體14.18及其衍生物(14.G2a和ch14.18)已經(jīng)為將來抗GD2療法的改進提供了標尺。我們選擇了鼠IgG3抗體m3F8進行臨床開發(fā)的原因是其在GD2結合過程中的koff比14.G2a或ch14.18慢10倍。在具有骨髓中化療抵抗性的轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細胞瘤的患者中，m3F8加GMCSF誘導了80%完全的緩解(Kushneretal.，2001，JClinOncol19，4189-94)。然而，人抗小鼠抗體(HAMA)可以中和鼠抗體對其抗原的結合能力、阻斷該抗體的直接作用、并加速抗體從循環(huán)中的清除，從而減弱鼠抗體的作用。通過基因工程來將鼠IgG框架改變?yōu)槿薎gG框架可能減少HAMA應答。Ch14.18與hu14.18(二者均衍生自14.G2a的VH和VL)在患者中具有最小的免疫原性。因此我們將3F8的嵌合和人源化形式作為潛在的下一代抗GD2抗體進行了測試。嵌合化和人源化的成功標準之一是在基因工程過程中保持親和力。這對于人源化過程中的CDR移植是尤其不確定的。ch3F8和hu3F8保留緩慢的koff是令人放心的。但更重要的是，體外效應物功能，以及體內(nèi)腫瘤靶向以及體內(nèi)治療性能的保持和增強可能是關鍵的。ch3F8-IgG1和hu3F8-IgG1均顯示效率高于m3F8>200倍的PBMC-ADCC，而PMN-ADCC為>20倍。此外，特殊的糖形hu3F8-IgG1n的PBMC-ADCC效率比m3F8高>3500倍，PMN-ADCC效率比m3F8高5倍。與之形成鮮明對照的是，對于CMC，ch3F8和hu3F8的補體活化能力比m3F8低。鑒于近來關于ADCC在單克隆抗體在患者中的抗腫瘤效果中所起作用的證據(jù)，ADCC的這種大幅改善是最為理想的。在使用利妥昔單抗(rituximab)治療的淋巴瘤患者中，高親和力FcR2A和FcR3A均顯示具有更好的響應和生存優(yōu)勢(WengandLevy，2003，JClinOncol21，3940-7)。雖然高親和力受體FcR3A在體外ADCC中導致的改進<10(Niwaetal.，2004，ClinCancerRes10，6248-55)，但總體響應和進展前時間改善了200%(WengandLevy，2003，同上)。當用赫賽汀(Herceptin)治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌時，具有高親和力FcR3A的患者的總體響應更好(83%對35%，p=0.03)，且無進展生存更長(p=0.005)(Musolinoetal.，2008，JClinOncol26，1789-96)。對于用Cetuximab治療的轉(zhuǎn)移性結腸直腸癌，具有低親和力FcR2A和FcR3A的患者與具有突變的KRAS的患者具有近似的危險比例(Bibeauetal.，2009，JclinOncol27，1122-9)。對于鼠3F8，在髓樣細胞上具有對m3F8的高親和力FcR3A受體的患者顯示具有更好的存活(Cheungetal.，2006，JClinOncol24，2885-90)。雖然結合親和力和效應物功能對治療應用而言是關鍵的，但交叉反應性會造成預料之外的毒性問題。我們用純化的神經(jīng)節(jié)苷脂進行ELISA，以及對一組正常人組織進行免疫組織化學，顯示了這些嵌合和人源化3F8形式具有與鼠3F8近似的交叉反應模式(數(shù)據(jù)未顯示)。與m3F8相似，嵌合和人源化3F8形式與GD2相比顯示對GD1b的低水平反應性。已經(jīng)顯示GD1b是在神經(jīng)母細胞瘤腫瘤中高度普遍的神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是當其由視黃酸類(retinoids)分化而來時(Hettmeretal.，2004，BrJCancer91，389-97;Gongetal.，2002，Brain125，2491-506)。這可能是有意義的，因為對于接受針對高風險的神經(jīng)母細胞瘤的免疫療法的患者給予順式視黃酸是常規(guī)做法。但是，抗GD1b抗體也已與感覺性共濟失調(diào)神經(jīng)病變聯(lián)系起來(Gongetal.，2002，同上)。無論如何，在超過500名患者中m3F8的安全性概貌(與GD1b具有相似的交叉反應性)且沒有長期的或遲發(fā)的感覺神經(jīng)病變，這是令人放心的。補體介導的細胞毒性(CMC)對于人神經(jīng)母細胞瘤異乎尋常地有效(Saarinenetal.，1985，ProcAmerAssocCancerRes26，291)，因為人神經(jīng)母細胞瘤對CD55(Cheungetal.，1987，ProcNatlAmAssocCancerRes28，387)和CD59(Chenetal.，2000，同上)的表達低。所有抗GD2抗體均介導高效的補體介導細胞毒性，且m3F8似乎特別高效。然而，對于利妥昔單抗的研究提示補體活化在ADCC的下調(diào)中起負面作用(Wangetal.，2009，Blood114，5322-30)。在臨床研究中，補體組分C1qA的較高活性被與對利妥昔單抗療法的較差響應關聯(lián)起來(Racilaetal.，2008，ClinCancerRes14，6697-703)。對于抗GD2抗體，補體活化被認為是疼痛副作用的原因(Navidetal.,CurrCancerDrugTargets10:200-209，2010)，也促成了目前處于臨床試驗中的Fc-CH2域突變版本(hu14.18K322A)的問世?？紤]到這些因素，CMB的亢進可能不是理想的。ch3F8和hu3F8的CMC效率都稍有降低，這是令人安心的。實施例9利用抗體來阻斷急性疼痛副作用有假說稱具有緩慢的koff，但消除了ADCC或CMC活性的抗體可以用來阻斷包圍血管周空間的神經(jīng)纖維上的GD2。3F8的熱處理(HM3F8)消除其ADCC和CMC活性，而不影響其GD2結合(Kushneretal.2011，JClinOncol29，1168-1174)。當對大鼠預注射經(jīng)熱處理的3F8時，它們對后續(xù)的5-10倍摩爾過量的天然3F8的疼痛響應被實質(zhì)性降低。更重要的是，抗腫瘤效果未受折損。在一項I期臨床試驗中(IRB-05015，NCT00450307)，30名具有抵抗性神經(jīng)母細胞瘤(NB)的患者在門診環(huán)境下接受了一至二個周期的3F8加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。3F8施用開始時為20mg/m2/d，在沒有劑量限制性毒性(DLT)的條件下以20mg/m2/d遞增。在先施用包括鎮(zhèn)痛劑、抗組胺藥、以及2mg/m2HM3F8的5分鐘輸注。將阿片使用與用3F820mg/m2/d處理但無HM3F8的同時對照組比較。由于藥物供應限制劑量升高終止于160mg/m2/d；即使到這個劑量水平，鎮(zhèn)痛劑的需求仍然與歷史對照相似，而且沒有DTL。3F8劑量水平直到80mg/m2/d時的鎮(zhèn)痛劑需求仍顯著低于對照?？筃B活性在所有劑量下均發(fā)生。這種多重3F8劑量升高是可行的，并提示HM3F8可能可以調(diào)節(jié)毒性而不鈍化抗NB活性。hu3F8-IgG4的疼痛阻斷潛力基于HM3F8的臨床結果，我們提出這樣的假說，即小劑量的不具有CMC或ADCC功能的抗體可以優(yōu)先阻斷血管周圍的疼痛纖維。雖然加熱m3F8破壞其CMC和ADCC功能(而保留結合)，熱改性的hu3F8卻保留幾乎完整的CMC和ADCC功能。hu3F8-IgG4在不同的NB細胞系如Lan1、NMB7、SKNLP、BE(1)N和SHEP1中不能活化CMC和ADCC(表8，以及未顯示的數(shù)據(jù))，這使得這種抗體亞類成為HM3F8的有效替代者。與對抗體結構和免疫原性具有未知影響的加熱不同的是，hu3F8-IgG4是一種工程化蛋白。除了不存在CMC和ADCC功能之外，IgG4亞類具有獨特的生物化學性質(zhì)。它們通常是由慢性抗原刺激誘導的，已知它們可干擾其他抗體同種型的免疫復合物形成，從而抑制炎癥反應(Losenetal.，2008，AnnNYAcadSci1132，174-9)。最重要的是，它天然能夠?qū)⒆陨頊p少為單價，從而在血液中經(jīng)過數(shù)小時時間后失去其與hu3F8-IgG1競爭的能力(vanderNeutKolfschotenetal.，2007，Science317，1554-7)。這種單價性來源于其已知的交換Fab臂的性質(zhì)：通過與來自另一個IgG4分子的重鏈-輕鏈對互換一條重鏈及附接的輕鏈(半分子)，導致針對所討論的特定抗原(例如GD2)的單價性。大鼠異常性疼痛(allodynia)模型使用大鼠模型來測試hu3F8-IgG4阻斷疼痛副作用的能力(MSK規(guī)程#09-05-010)。使用了m3F8(大鼠補體的高效活化物，Bergmanetal.，2000，CancerImmunolImmunother49，259-66)和hu3F8二者來誘導異常性疼痛。在靜脈內(nèi)施用m3F8(5mg/kg)、或hu3F8-IgG1(5mg/kg)、或ch14.18(5mg/kg)之前30分鐘，將Hu3F8-IgG4(0.1、0.25或0.5mg/kg)作為靜脈內(nèi)推注(ivpush)施用。其他組接受了熱改性的m3F8(HM3F8)或?qū)φ湛贵w代替hu3F8-IgG4。在MoAb注射之前和之后利用VonFrey纖絲法評估基線疼痛(Chassaingetal.，2006，BrJClinPharmacol61，389-97;Benanietal.，2003，EurJNeurosci18，2904-14)。hu3F8-IgG4對131I-hu3F8-IgG1的生物分布和效力的作用將神經(jīng)母細胞瘤(LAN-1)腫瘤皮下植入多組具有低血清IgG的雌性NOD/SCID/IL2-gcnull免疫缺陷小鼠(n=10/組)中。在實驗前24小時以1gm/kg對小鼠注射人IgG。將Hu3F8-IgG4(0.1、0.25或0.5mg/kg)或?qū)φ説uIgG4(0.1、0.25或0.5mg/kg)、或HM3F8(0.5mg/kg)、或鹽水作為靜脈內(nèi)推注施用，30分鐘后用131I-標記的各MoAb(50uCi/小鼠)跟蹤標記的m3F8、或hu3F8-IgG1或ch14.18(5mg/kg)。在第1、3、6、12、24、36、48和96h從尾部收集血液。在生物分布研究中，在兩個時間點上(131I-MoAb注射之后24小時和48小時)處死小鼠以進行組織計數(shù)。移出主要器官并在具有已知體積的注射物的γ計數(shù)器中計數(shù)，數(shù)據(jù)以百分比Ig/gm組織表示。藥動學分析使用WinNonlin軟件程序(PharsightCorp.，MountainView，CA)對血清濃度-時間數(shù)據(jù)進行非隔室分析來進行。在另外的幾組實驗中，類似地處理異種移植小鼠但沒有131I跟蹤標記，并在2個月時間內(nèi)隨時間測量它們的皮下腫瘤響應。hu3F8-IgG4阻斷大鼠中的異常性疼痛的能力可以與熱處理的m3F8的能力比較?；谒褂玫淖钄嗫贵w的劑量響應曲線(同時保持天然m3F8、或hu3F8-IgG1或ch14.18的刺激，均使用5mg/kg)，可以求出在大鼠中阻斷異常性疼痛的相對效力。我們預期hu3F8-IgG4阻斷異常性疼痛的效率與熱處理的3F8等同或更高。這些研究將提供將hu3F8-IgG4轉(zhuǎn)化到臨床試驗的臨床前依據(jù)。實施例10優(yōu)化hu3F8框架序列以提高穩(wěn)定性在人源化鼠抗體的過程中，常常將結構上重要的位置上的框架殘基回復突變成鼠序列以便保持抗體穩(wěn)定性和抗體結合性(Honegger，A，2008，EngineeringAntibodiesforStabilityandEfficientFolding，In:TherapeuticAntibodies.HandbookofExperimentalPharmacology，181)。材料和方法m3F8可變域的結構模型利用DiscoveryStudio(Accerlys，SanDiego，CA)中的MODELER(Eswaretal.，2006，CurrProtBioinfor，Supplement15，5.6.1-5.6.30)創(chuàng)建了m3F8可變域的同源性模型。選用瘧疾抗原AMA1抗體Fab(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號2Q8A)的晶體結構作為可變輕鏈的模板(84%同一性)。選用抗體13G5Fab(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號2GJZ)的晶體結構作為可變重鏈的模板。m3F8Fab片段的晶體結構使用標準Fab制備試劑盒(PierceBiotechnology，Rockford，IL)通過木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生了m3F8的Fab片段。將經(jīng)純化的m3F8濃縮到20mMHEPESpH6.5中12mg/ml，然后在懸滴中16℃下通過對含有HamptonIndex試劑D9(含0.1MTrispH8.5、25%w/vPEG3350(HamptonResearch，AlisoViejo，CA))的儲庫進行蒸汽擴散來結晶。液滴是通過混合1μl蛋白溶液與1μl儲庫溶液而形成的。用含有25%甘油、0.1MTrispH8.5、25%w/vPEG3350的冷凍保護液保護晶體。在ArgonneAdvancedPhotonSourcebeamline24IDC收集數(shù)據(jù)。晶體屬于空間群C2，且衍射至1.7分辨率。使用Phaser(CCP4套件)(McCoyetal.，2007，JApplCrystallogr40，658-674)及PDB條目2AJU作為檢索模型(Qinetal.，2008，JBiolChem283，29473-84)通過分子置換來解析Fab結構。對最佳分子置換模型用Refmac5(Murshudovetal.，1997，ActaCrystallogr.D:Biol.Crystallogr53，240-255)進行細化，并使用O(TheCCP4suite:programsforproteincrystallography.ActaCrystallogr.，D:Biol.Crystaollogr.50(1994)760-763)進行手動搭模，用Arp–Warp(LamzinandWilson，1993，ActaCrystallogr，D:Biol.Crystallogr.49，129-147)加入溶劑。最終的模型含有兩個m3F8Fab多肽鏈和585個溶劑分子。m3F8晶體結構的計算分析基于人模板IgHV3-33-HC和IGKV3-15-LC，利用計算化學方法對每一個可能引入到m3F8上的框架中的人源化突變進行了分析。使用CHARMm(ChemistryatHarvardMolecularmechanics)力場(Brooksetal，2009，J.CompChem30，1545-1615)模擬m3F8的晶體結構，并根據(jù)突變后結構與野生型蛋白的折疊自由能的差異來計算每個點突變的影響。使用廣義玻恩近似來解釋溶劑的影響，且所有的靜電項均作為庫侖相互作用與對溶劑化能的極性貢獻的和來計算。對每個點突變計算范德華力、靜電、熵和非極性項的加權和。所有的計算均使用DiscoveryStudio3.0(Accelrys，SanDiego，CA)進行。結果對于hu3F8-H1L1重鏈序列，使用人IgG重鏈序列IgHV3-33-HC作為模板，并在第5、9、16、19、20、24、28、29、30、40、48、49、67、71、76、78、81、86和92位進行了回復突變。對于hu3F8-H1L1輕鏈，使用人IgG輕鏈序列IGKV3-15-LC作為模板，并在第1、7、9、15、19、21、22、43、45、58、60、67、70、73、78、80和87位進行了回復突變?；貜屯蛔兪腔趍3F8的同源性模型推斷的，包括確定這些突變是否會影響CDR環(huán)的折疊或者影響骨架穩(wěn)定性(牽涉Gly和Pro的突變)。為了驗證同源性模型的準確性并進一步改善人源化策略，以1.7解析了m3F8的晶體結構(數(shù)據(jù)未顯示)。將m3F8可變區(qū)的同源性模型與經(jīng)解析的晶體結構疊加(數(shù)據(jù)未顯示)。對于CDR之外的大部分框架區(qū)域的同源性模型與實驗獲得的晶體結構緊密吻合。然而，在CDR區(qū)中觀察到顯著的差異，尤其是在環(huán)H3、H2和L3中。同源性模型也未能準確地預測任何VH-VL界面處的對Fv結構的穩(wěn)定性關鍵的相互作用。有6對氨基酸在VH-VL形成氫鍵，兩對氨基酸參與pi相互作用(表10)。在解析了m3F8的晶體結構之后，基于IgHV3-33-HC與IGKV3-15-LC模板，應用計算分析來確定每個人源化突變的能量效應。計算了每個突變的折疊自由能差?；谠摲治?，發(fā)現(xiàn)這些人源化突變中有5個對m3F8的整體折疊而言是失穩(wěn)性的(見表9)。這些包括重鏈第11和21位，以及輕鏈第1、10、12、40、和97位。還確定了輕鏈中分別位于第40和97位的涉及Pro和Gly的人源化突變會顯著影響骨架柔性。這5個失穩(wěn)性突變，加上上述兩個Gly/Pro突變，被認為是回復突變的候選者，并包含在hu3F8-H3L3的序列中(SEQIDNO:9和10)。對m3F8晶體結構的計算分析還鑒定了5個對抗體穩(wěn)定性將具有中性影響的人源化突變(數(shù)據(jù)未顯示)。這些突變是輕鏈的第24和56位，以及重鏈的第20、58和92位。這些突變不包括在基于同源性模型的hu3F8-H1L1的序列中(SEQIDNO:4和5)，但包括在對hu3F8-H3L3的設計中。對m3F8的晶體結構的VH-VL界面進行了分析以在hu3F8中保留各個氫鍵和pi相互作用(表10)。在界面相互作用所牽涉的15個氨基酸中，14個被保留在hu3F8-H1L1和hu3F8-H3L3的設計中。不包括在內(nèi)的那個相互作用涉及輕鏈中的Ser43。將該突變加入到hu3F8-L1和hu3F8-L3的設計中以產(chǎn)生Hu3F8-L1S和Hu3F8-L3S。這些穩(wěn)定性增強的框架區(qū)是不可能通過涉及使用同源性建模來設計穩(wěn)定的人源化框架的現(xiàn)有技術實現(xiàn)的。具有提高的穩(wěn)定性概貌的新抗體的設計需要將實驗獲得的m3F8晶體結構與使用力場方法的計算分析結合起來使用。表9.對m3F8Fv晶體結構的人源化突變的計算分析會使小鼠結構失穩(wěn)或改變骨架柔性的突變.突變ΔG(kcal/mol)觀察結果輕鏈S1E0.82失穩(wěn)性輕鏈F10T1.36失穩(wěn)性輕鏈L12S1.98失穩(wěn)性重鏈L11V1.90失穩(wěn)性重鏈T21S1.71失穩(wěn)性輕鏈A40P-1.03改變骨架柔性輕鏈G97Q-1.42改變骨架柔性對穩(wěn)定性的影響將可忽略的突變突變ΔG(kcal/mol)觀察結果輕鏈K24R-0.30中性影響輕鏈S56T0.24中性影響輕鏈V58I-0.73中性影響重鏈I20L-0.44中性影響重鏈M92V-0.56中性影響表10.m3F8Fv晶體結構的VH-VL界面處的氨基酸之間的重要相互作用相互作用輕鏈殘基重鏈殘基氫鍵Gln38Gln39氫鍵Ser43Gly110氫鍵Tyr55Asp107氫鍵Gln89Tyr104氫鍵Tyr92Arg98氫鍵Tyr36Leu106Pi-PiTyr92Trp47Pi-sigmaTyr92Tyr104實施例11基于對3F8:GD2相互作用的計算分析的3F8抗體的更高親和力使用m3F8的晶體結構作為模板進行計算研究來確定抗原識別的分子細節(jié)。GD2抗原由一個五糖(penta-saccharide)頭部基團及與之相連的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)尾部組成。在沒有實驗獲得的3F8:GD2共復合物的條件下，嘗試僅與GD2五糖頭部基團進行計算對接，其中將神經(jīng)酰胺部分替換成甲基基團。鑒于計算對接領域的發(fā)展水平，GD2五糖分子對于對接研究是一個重大挑戰(zhàn)。首先，大型、柔性配體的對接是難于準確預測的。GD2頭部基團具有超過30個可旋轉(zhuǎn)的鍵。目前尚未報道有確立的對接規(guī)程可準確地用于具有如此高柔性的配體。其次，GD2頭部基團是碳水化合物分子，而關于當對碳水化合物分子應用力場法時對接研究的準確度的報道很少。第三，GD2頭部基團是一類特殊的碳水化合物，因為它具有兩個帶電的基團，存在于它的唾液酸部分中。尚未有確立的對接方法被顯示可準確地預測如此大型、柔性、并且?guī)щ姷奶妓衔锏慕Y合構象。一種據(jù)報道能夠可靠地預測寡糖(盡管不含帶電的唾液酸殘基)的結合構象的對接算法是GLIDE(Agostinoetal.，2009，JChemInfModel49，2749-60)。該報道顯示，當預測寡糖對抗體的結合構象并與實驗獲得的共晶體結構比較時，GLIDE的性能優(yōu)于AutoDock、GOLD和FlexX。應當注意的是，其測試的抗原均不大于四糖。文獻中另一種有前景的對接算法是CDOCKER(Wuetal.，2003，J.CompChem24，1549)，這是一種基于CHARMm的對接算法，已顯示其預測具有8個或更多可旋轉(zhuǎn)鍵的配體的對接構象的性能優(yōu)于DOCK、FlexX、和GOLD(Ericksonetal.，2004，JMedChem47，45-55)。應當注意，該研究中未分析寡糖，且其測試的配體的大小和柔性比GD2(>30個可旋轉(zhuǎn)鍵)小得多。利用可獲自蛋白數(shù)據(jù)庫的三個測試實例(PDB編號2HRL:Siglec-7與GT1b的復合物；PDB編號3BWR：猿病毒VP1與GM1的復合物；以及PDB編號3HMY：破傷風毒素HCR/T與GT2的復合物)對于GLIDE與CDOCKER對接與GD2相似的配體(含唾液酸的寡糖)進行了頭對頭(head-to-head)比較。在三個測試實例的所有2個中，CDOCKER能夠準確地預測各寡糖的正確結合模式(均方根偏差2之內(nèi))。GLIDE在3個測試實例的2個中對接不準確(均方根偏差>2)，而在第三個測試實例中未能找到對接姿態(tài)(見表11)。由該分析可見CDOCKER對接帶電荷寡糖的性能優(yōu)于GLIDE。GLIDE在每一個實例中均失敗(見表11)。然后使用CDOCKER來將GD2五糖頭部基團對接到m3F8晶體結構的抗原結合口袋。然后將最優(yōu)對接的結構(topdockedstructure)利用CHARMm力場進行能量最小化。該分析指明了與GD2頭部基團直接相互作用的14個氨基酸(表12)。然后在計算機上將這些位置分別突變成所有可能的氨基酸，并計算基于CHARMm的相互作用能。相互作用最高的突變體列于表13?；谶@種方法，預測一個突變(重鏈Gly54Ile)可顯著增加相互作用能。計算機建模顯示將重鏈CDR3第54位的Gly取代為Ile將改變結合口袋的形狀并增加與GD2配體的接觸。使用該分析來將重鏈突變Gly54Ile添加到huH1-gamma1和huH3-gamma1的序列的CDR區(qū)，分別形成huH1I-gamma1和huH3I-gamma。對接方法使用SchrodingerSuite2009(NewYork，NY)來進行GLIDE對接。使用OPLS力場來參數(shù)化蛋白質(zhì)和配體。將最優(yōu)配體姿勢集簇于均方根偏差2.0之內(nèi)并用GlideScore打分。使用DiscoveryStudio3.0(Accelrys，SanDiego，CA)進行CDOCKER對接和相互作用能測量。使用CHARMm力場來參數(shù)化蛋白質(zhì)和配體。將最優(yōu)配體姿勢集簇于均方根偏差2.0之內(nèi)并用CDOCKERInteractionEnergy打分。表11.對接算法GLIDE與CDOCKER預測已知蛋白:神經(jīng)節(jié)苷脂復合物的比較實施例12通過提高對抗原和Fc受體(FcR)的親和力改善效應物功能抗GD2MoAb是針對化療抗性的轉(zhuǎn)移神經(jīng)母細胞瘤(NB)的經(jīng)驗證的療法，ch14.18提供了下一代MoAb的標尺?？笹D2MoAb小鼠3F8(m3F8)與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的組合在80%的原發(fā)性頑固性NB患者中一貫地誘導了完全骨髓緩解。在受治療的處于最先完全緩解/非常好的部分緩解(CR/VGPR)中的患者中，該組合加上13-順-視黃酸改善了5年后PFS至51%±7%，以及OS至80%±5%。表12.基于CDOCKER與CHARMm能量最小化的與GD2直接相互作用的3F8氨基酸殘基。結果分析一再顯示基于基因多態(tài)性的FcR親和力在NB和其他實體瘤的MoAb療法中的重要性。在不犧牲特異性的同時改善對抗原和FcR的親和力可改善MoAb在體外和體內(nèi)的效力。表12.基于CDOCKER與CHARMm能量最小化的與GD2直接相互作用的3F8氨基酸殘基表13.3F8中與GD2頭部基團相互作用的殘基的計算機突變分析所得的最優(yōu)CDR突變體野生型突變相互作用能的變化(kcal/mol)HCGLY54ILE-8.23HCGLY103LEU-2.38HCGLY103TRP-1.9HCGLY55THR-1.38HCILE56ARG-0.93HCGLY54SER-0.86方法：通過基因工程構建huIgG1亞類的嵌合3F8(ch3F8)和人源化3F8(hu3F8)，在CHO細胞中表達，并通過蛋白A親和色譜純化。在特殊的MAGE1.5CHO細胞中產(chǎn)生了缺少巖藻糖和N-乙酰葡糖胺的的hu3F8Fc糖形(hu3F8n或hu3F8-MAGE1.5)。使用BIACORET-100比較了這些MoAb形式對GD2以及對FcR的親和力。利用抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CMC)測定法測試了效應物功能，并從MoAb的EC50得出了它們的效力。將這些策略應用于具有臨床潛力的針對其他腫瘤抗原系統(tǒng)(B7-H3、HER-2、CSPG4、LICAM)的MoAb。結果：Ch3F8和hu3F8維持了與m3F8相似的Kd，它們與14G.2a或chl4.18相比都具有慢10倍的koff，從而有更好的KD和更長的駐留時間。M3F8、ch3F8或hu3F8在體外抑制了NB細胞系的擴增，而其他抗GD2抗體沒有效果。在外周血單個核細胞(PBMC)-ADCC、粒細胞(PMN)-ADCC、或CMC中，ch3F8與hu3F8比chl4.18強超過10倍。hu3F8n的PBMC-ADCC比hu3F8效率高10倍，而比m3F8高>100倍。雖然在生物分布研究中131I-hu3F8顯示與131I-m3F8近似的腫瘤對正常組織比，但hu3F8針對NB異種移植物顯示了更優(yōu)越的抗腫瘤作用。盡管就針對其他腫瘤抗原系統(tǒng)的嵌合和人源化抗體可以得到類似的結論，但腫瘤表位/抗原的性質(zhì)對于確定腫瘤殺死的效率而言是關鍵的。結論：雖然對抗原或FcR的koff(或KD)單獨地改善了效應物功能，但對于抗GD2MoAb3F8而言它們的作用結合起來似乎是相乘性的(multiplicative)。將來旨在改善這兩種親和力的策略可能進一步增加迄今為止觀察到的MoAb的臨床效力。實施例13進一步Fc修飾以改善FcR結合：已經(jīng)制備了在重鏈中具有三突變DEL(S239D/A330L/I332E)的Hu3F8-IgG1-DEL(Lazaretal.，2006，PNASUSA103，4005-10)，其具有顯著增加的對FcR3A和FcR2A的親和力，以及對FcR2B的親和力(見表14中的BIACORE數(shù)據(jù))。然而，CD16-158V對hu3F8-IgGn的活化信號對抑制信號的A/I比為196，相比之下hu3F8-IgG1-DEL則為30，有人提出這具有臨床上的優(yōu)勢(NimmerjahnandRavetch，ImmunolRev，236:265-275，2010)。表14:相對親和力.通過使用BIACORET-100使抗體流過CM5芯片上的重組FcR來確定KD。所有值均對FcRIII-158F上的hu3F8-IgG1結合標準化。對神經(jīng)母細胞瘤LAN-1的CD16介導的ADCC在歷時4小時的51Cr釋放測定中，在不同抗體濃度下以效應物:靶物比5:1將NK92-CD16效應物細胞添加到LAN1神經(jīng)母細胞瘤腫瘤靶物中。對FcR的親和力的增加導致由CD16或CD32介導的ADCC效力增加。對于由CD16介導的ADCC(數(shù)據(jù)未顯示)，hu3F8-IgG1-DEL和hu3F8-IgG1n是等同的。補體介導的神經(jīng)母細胞瘤LAN-1裂解在歷時4小時的51Cr釋放測定中，在抗體的遞增濃度下以1:100的最終血清補體稀釋度將人補體加入神經(jīng)母細胞瘤LAN-1腫瘤靶物中。在補體介導的裂解中(CMC、數(shù)據(jù)未顯示)，hu3F8-IgG1-DEL并不比hu3F8-IgG1或hu3F8-IgG1n差。當IgG重鏈中的三突變與hu3F8-IGg1n組合時，對ADCC沒有進一步的改善。實施例15在體內(nèi)武裝T細胞和效應物T細胞或稱T淋巴細胞是參與細胞介導免疫的關鍵白細胞?？梢曰谒鼈兗毎砻嫔系姆Q為T細胞受體(TCR)的特殊受體的存在將它們與其他淋巴細胞類型，如B細胞和天然殺傷(NK)細胞區(qū)分開來。它們還攜帶一種獨特的表面標記物，稱為CD3。T代表胸腺，這是主要負責T細胞成熟的器官。T細胞存在數(shù)種亞群，分別具有不同的功能。T輔助細胞(TH細胞)在免疫過程(包括B細胞成熟以分泌抗體，以及細胞毒性T細胞和巨噬細胞的活化)中幫助其他白細胞。已經(jīng)將它們稱為CD4+T細胞，因為它們攜帶CD4蛋白。當被活化時，輔助T細胞快速分裂并分泌細胞因子以調(diào)節(jié)或幫助免疫應答。這些抗體能夠分化為分泌不同的細胞因子的數(shù)種亞型(例如TH1、TH2、TH3、TH17或TFH)以調(diào)節(jié)免疫應答。在某些腫瘤模型中，CD4+T細胞也足以阻遏癌癥生長。盡管常規(guī)的活化信號來自抗原呈遞細胞(APC)，CD4+T細胞當它們的表面CD3被抗體交聯(lián)時可以活化。細胞毒性T細胞(CTL)破壞被病毒感染的細胞和腫瘤細胞，并且還負責移植物或嫁接物排斥。它們被稱為CD8+T細胞，因為它們表達表面CD8糖蛋白。它們通過識別與I類主要組織相容性復合物(MHC)分子(這些分子在許多人類腫瘤上不存在或稀少)締合的抗原來接合靶物。記憶T細胞是在病毒或腫瘤細胞被殺死后長期持續(xù)存在的抗原特異性T細胞。當面對腫瘤抗原攻擊時它們能夠快速大量擴增，從而使免疫系統(tǒng)具有針對癌癥的“記憶”能力。天然殺傷T細胞(NKT細胞)是一種特殊的T細胞，它們構成獲得性免疫系統(tǒng)和天然免疫系統(tǒng)之間的橋梁。不同于識別MHC上的肽抗原的常規(guī)T細胞，NKT細胞識別被一種稱為CD1d的分子呈遞的糖脂抗原。一旦被活化，這些細胞可以行使與Th和Tc細胞二者相似的功能(即產(chǎn)生細胞因子以及釋放溶胞性/殺細胞性分子)。已知它們可識別并消滅腫瘤細胞。γδT細胞(gammadeltaT細胞)是T細胞的一個小亞群，它們在其表面上攜帶TCR。大多數(shù)T細胞具有由稱為α和βTCR鏈的兩條糖蛋白鏈組成的TCR。然而，在γδT細胞中，TCR由一條γ鏈和一條δ鏈組成。它們僅占總T細胞的5%，但在腸粘膜中最為豐富(并且被稱為表皮內(nèi)淋巴細胞，IEL)?；罨忙腡細胞的抗原未知；但γδT細胞不受限于MHC，可能識別完整的蛋白，而不是MHC上的肽。在1986年進行的使用淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的獲得性免疫治療試驗報道了患者中偶見的腫瘤響應。在同基因干細胞移植后的慢性髓性白血病患者，或者移植后EBV相關淋巴增殖性疾病(PTLD)的患者中，供體淋巴細胞輸注顯示了更多的成功。在實體瘤中，CTL在高劑量化療造成的淋巴細胞減少期中治療惡性黑素瘤獲得了成功。雙特異性抗體是通過將兩種雜交瘤融合產(chǎn)生具有兩種結合位點的雜合免疫球蛋白分子而制作的。該抗體不但將腫瘤扭送給T細胞，還交聯(lián)T細胞上的CD3并引發(fā)活化級聯(lián)。由此，將基于TCR的細胞毒性重定向到期望的腫瘤靶，而回避MHC限制。通過用抗CD3×抗TAA(BsAb或BiTE抗體)武裝多克隆活化T細胞(ATC)，將MoAb(例如hu3F8，當TAA為GD2時)的靶向特異性與T細胞的非MHC限制性的穿孔素/顆粒酶介導的細胞毒性結合起來。BsAb或BiTE可以在輸注到患者體內(nèi)之前武裝經(jīng)離體擴增的活化T細胞。這種策略將每種ATC轉(zhuǎn)化成特異性的CTL(ThakurandLum，2010，CurrOpinMolTher12，340-349;Grabertetal.，2006，ClinCancerRes12，569-576)。腫瘤通過多種機制逃避T細胞：低表達或不表達MHC(例如在NB中)，干擾T細胞信號傳導過程，MHC上腫瘤肽的呈遞減少，缺失共刺激分子，以及誘導抑制CTL和體液應答的調(diào)節(jié)性T細胞。由于經(jīng)BsAb或BiTE武裝的ATC所實施的殺傷是非MHC限制性的，這種策略應該能夠克服這些腫瘤逃避機制中的某一些。腫瘤分泌TGF-β，使T細胞免疫應答偏向Th2型，下調(diào)白介素2(IL-2)和IFN-γ分泌，同時上調(diào)IL-10和IL-6，這都導致免疫抑制。通過BsAb或BiTE重定向的T細胞可能回避這些調(diào)節(jié)性細胞因子的負面作用，因為經(jīng)武裝的ATC是以IL-2非依賴性的方式裂解腫瘤靶物的。用經(jīng)BsAb或BiTE武裝的針對其腫瘤的T細胞治療后的患者具有增加水平的TNF-α和IFN-γ，這應可使T細胞偏向Th1應答。此外，細胞毒性T細胞通過它們的Fas配體(FasL)實施殺傷，所述Fas配體結合腫瘤細胞上的Fas受體(CD95)。不幸的是，腫瘤細胞上的FasL也可誘導T細胞凋亡。通過CD3的TCR刺激可以保護CD8+細胞免于CD95介導的自殺。經(jīng)武裝的ATC通過交聯(lián)TCR與BsAb或BiTE來抵抗CD95誘導的細胞死亡。T細胞的系列殺傷(即一個T細胞接連殺死多個腫瘤靶物)、在該過程中擴增、以及移動到淋巴和軟組織中的能力增加了當NB細胞轉(zhuǎn)移出骨髓空間以形成腫瘤團塊時捕捉到它們的機會。近來使用靶向人癌癥的BsAb或BiTE的研究已經(jīng)顯示了前景。原來越多的證據(jù)，尤其是來自接受了同基因造血細胞移植的患者的分析的證據(jù)，支持T細胞阻遏或消滅淋巴瘤以及某些形式的白血病的潛力(O’reillyetal.，2010，SeminImmunol22，162-172)。然而，尚無有說服力的證據(jù)支持T細胞在控制兒童實體瘤中的作用。這一點與如下的事實一致，即這些腫瘤中的一些不表達遺傳的I類或II類HLA等位基因(例如神經(jīng)母細胞瘤)(Raffaghelloetal.，2005，Oncogene24，4634-4644;Wolfletal.，2005，CancerImmunolImmunother54，400-406)，或僅表達I類等位基因并且表達水平低(例如橫紋肌肉瘤)(Pradosetal.，2006，Neoplasma53，226-231)。此外，關鍵的共刺激分子如B7.1和ICAM-1的表達常常低或檢測不到。結果，這些腫瘤引發(fā)T細胞應答的能力低下，且效應物T細胞通過T細胞受體結合由HLA等位基因呈遞的腫瘤抗原而接合腫瘤的潛力受到限制。此外，目前可用的對神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、尤因氏肉瘤和促纖維增生性小圓細胞腫瘤最有效的療法使用免疫抑制性烷化劑，尤其是環(huán)磷酰胺，使用的劑量可誘導深度的T細胞減少。雙功能抗體允許T細胞的靶向性接合，并允許通過HLA非限制性CD3介導的活化而非它們的抗原特異性HLA限制性TCR來利用它們的效應物功能。對某些針對CD3以及一種腫瘤抗原(如CD-19、HER-2NEU、或CEA)特異性的雙功能單克隆抗體的研究已經(jīng)顯示這些抗體的將細胞毒性T細胞聯(lián)系到表達該另一種被靶向的抗原的腫瘤細胞的能力(Bargouetal.，2008，Science321，974-977;Toppetal.，2009，Blood(ASHAnnualMeetingAbstracts)114，840;Kieweetal.，2006，ClinCancerRes12，3085-3091;Lutterbueseetal.，2009，JImmnother32，341-352)。一旦兩種抗體受體均得到接合，則引發(fā)針對腫瘤細胞的T細胞應答。T細胞應答涉及T細胞受體與腫瘤細胞之間的細胞毒性突觸的形成，以及穿孔素和顆粒酶介導的腫瘤細胞凋亡誘導(Offneretal.，2006，MolImmunol43，763-771;Brischweinetal.，2006，MolImmunol43，1129-1143)。CD3的接合也活化T細胞，誘導擴增和可強化抗腫瘤作用的效應物細胞因子的產(chǎn)生(Brischweinetal.，2006，同上;Brischweinetal.，2007，JImmunother30，798-807)。令人注意的是，活化的T細胞上調(diào)一種抗凋亡蛋白c-FLIP，該蛋白保護它們免受在T細胞活化過程中產(chǎn)生的TNF和Fas配體的細胞毒作用(Dreiretal.，2002，IntJCancer100，690-697)。結果，T細胞應答被放大。結果，皮克水平的雙功能抗體可在體外(Lutterbueseetal.，2009，同上;Brandletal.，2007，CancerImmunolImmunother56，1551-1563)和體內(nèi)發(fā)揮顯著的抗腫瘤效果，如臨床前動物模型中，尤其是在CD3/CD19雙特異性抗體在治療B細胞淋巴瘤和ALL的初步臨床試驗結果(Toppetal.，2009，同上;Kieweetal.，2006，同上)中顯示的。已經(jīng)有假說稱所誘導的T細胞應答還可以募集幼稚T細胞并在腫瘤部位刺激腫瘤特異性T細胞的產(chǎn)生(Koehneetal.，2002，Blood99，1730-1740)。除T淋巴細胞之外，雙特異性抗體還可以用來重靶定其他效應物細胞。這些效應物細胞包括NK細胞、B-淋巴細胞、樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞和其他干細胞，到表達GD2的細胞、組織或器官。當所述組織是腫瘤時，可以利用這些效應物細胞來殺死或者沉積(deposit)用于診斷或用于治療的蛋白質(zhì)(例如細胞因子、抗體、酶或毒素)、放射性同位素。當所述組織是正常器官時，可以類似地使用所述效應物細胞來投遞用于診斷或用于治療的蛋白質(zhì)或同位素。雙特異性MoAb可以由兩個可變域組成，其中一個域具有具有抗3F8可變域，另一個域選自下組：用于重靶定T細胞以實現(xiàn)腫瘤細胞毒性的抗OKT3，或用于多步預靶定的DOTA-金屬、C8.2.5，或用于以抗41BB-scFv或CD137作為激動劑的ADCC的克隆35、CD137，用于以41BBL作為激動劑的ADC的41BBL。CH2域中的N297A突變導致無糖基化，結果是沒有FcR或C1q結合。(hu3F8-LC)-(huOKT3-scFv)的氨基酸序列，其中huOKT3-scFv被二硫化物穩(wěn)定化，示于SEQIDNO:23。(hu3F8-LC)-(C8.2.5-scFv)的氨基酸序列(基于Orcuttetal.，2010，ProteinEngDesignandSelection23，221)，其中C8.2.5-scFv被二硫化物穩(wěn)定化，示于SEQIDNO:24。雙特異性抗體(抗GD2和抗DOTA)可以用在多步預靶定中的第一步，然后使用DOTA(金屬)-右旋糖酐作為清除劑進行血液清除，第三步導入DOTA(金屬)-綴合的治療劑諸如DOTA(金屬)-放射性金屬、DOTA(金屬)-納米顆粒、DOTA(金屬-脂質(zhì)體、DOTA(金屬)-藥物、DOTA(金屬)-DNA、DOTA(金屬)-RNA、和DOTA(金屬)-毒素。由于C8.2.5對每種DOTA-金屬復合物(comples)具有不同的親和力，經(jīng)預靶定的C8.2.5對清除劑和DOTA-配體的親和力可以得到精確的控制。3F8、hu3F8及其變體的氨基酸序列可以用來構建嵌合抗原受體(CAR)，如先前對其他抗GD2抗體顯示的那樣(Krauseetal.，1998，JExpMed188，619-626)。重靶定免疫效應物細胞的CAR策略不依賴MHC-肽-TCR相互作用，并容許細胞與許多種細胞表面抗原反應(DaviesandMaher，2010，Achivumimmunologiaeettherapiaeexperimentalis58，165-178)。有數(shù)種方法已經(jīng)被用于CAR的設計中，它們大多采用呈單鏈可變片段(scFv)形式的單克隆抗體抗原結合域來進行抗原識別。最先的T細胞活化受體源于使得研究者探明CD3ζ鏈的作用的研究(IrvingandWeiss，1991，Cell64，891-901;Romeoetal.，1992，Cell68，889-897)。在后來的研究中，感興趣的scFv被融合于CD3ζ鏈(Eshharetal.，1993，PNASUSA90，720-724)或FcεRIγ鏈(Weijtensetal.，1996，JImmunol157，836-843)，發(fā)現(xiàn)二者均足以活化T細胞。雖然這制定了CAR構建的藍圖，但共刺激因子的組入是在人們發(fā)現(xiàn)第一代CAR僅能誘導不超過2-3次細胞分裂的T細胞擴增，然后很快發(fā)生細胞凋亡之后才出現(xiàn)的(Gongetal.，1999，Neoplasia1，123-127)。通過在靶腫瘤細胞上表達CD80，研究者們能夠顯示表達CAR的細胞可以被重新刺激，導致T細胞數(shù)目的進一步增加。最早的在CD3ζ鏈之外還組入了CD28共刺激分子的CAR與僅表達CD3ζ鏈者相比顯示了巨大的改善(Krauseetal.，1998，同上;Haynesetal.，2002，Blood100，3155-3163;Maheretal.，2002，NatureBiotech20，70-75)；這包括T細胞數(shù)目的絕對增加以及IL-2產(chǎn)生的增加。從那以后，若干其他研究組開始使用其他的共刺激分子，或是單獨與組合，或是與及CD28二者組合。這些其他的信號分子包括4-1BB(Wangetal.，2007，HumanGeneTher18，712-725;Brentjensetal.，2007，ClinCncerRes13，5426-5432;Imaietal.，2004，Leukemia18，676-684;Finneyetal.，2004，JImmunol172，104-113)，DAP10(Brentjensetal.，2007，同上)，OX40(Brentjensetal.，2007，同上;Finneyetal.，2004，同上;Wilkieetal.，2008，JImmunol180，4901-4909;NguyenandGeiger，2003，GeneTherapy10，594-604;Puleetal.，2005，MolTher12，933-941)和ICOS(Finneyetal.,2004，同上)，并且已經(jīng)應用于T細胞以及NK細胞的背景(Daldrup-Linketal.，2005，Eropeanradiology15，4-13;ImaiandCampana，2004，JBiolRegHomeostaticAg18，62-71;Robertsetal.，1998，JImmunol375-384;Kruschinskietal.，2008，PNASUSA105，17481-17486;Pegrametal.，2008，JImmunol181，3449-3455)。雖然第一代CAR是迄今為止僅有的得到臨床測試者，但體外和體內(nèi)比較均已顯示第二代和第三代CAR具有明顯的優(yōu)勢(Haynesetal.，2002，同上;Brentjensetal.，2007，同上;Tengetal.，2004，HumanGeneTher15，699-708;Haynesetal.，2002，JImmunol169，5780-5786;Kowoliketal.，2006，CancerRes66，10995-11004;Loskogetal.，2006，Leukemia20，1819-1928;Moelleretal.，2004，CancerGeneTherapy11，371-379;Veraetal.，2006，Blood108，3890-3897)。目前，大多數(shù)研究者使用總(bulk)人外周血T細胞，但其他人近來開始使用EBV-特異性T細胞(Rossigetal.，2002，Blood99，2009-2016)，淋巴樣祖細胞(Zakrzewskietal.，2006，NatureMed12，1039-1047;Zakrzewskietal.，2008，NatureBiotech26，453-461)，以及未分級的骨髓細胞(Papapetrouetal.，2009，JclinInvest119，157-168;Wangetal.，1998，NatureMed4，168-172)。具有溶胞性的，容易培養(yǎng)的殺傷性白血病細胞系(Killerleukemiacelllines)(例如NK92，NK92MI，KHYG-1)也可為臨床前和臨床測試提供持續(xù)的CAR表達性效應物細胞的供應源。NK92MI是一種衍生自何杰金氏淋巴瘤的，并經(jīng)人IL-2cDNA轉(zhuǎn)導的人NK細胞系；先前的研究已經(jīng)顯示其在小鼠模型中的強細胞毒能力(Tametal.，1999，JHematol8，281-290;KorbelikandSun，2001，InterJCancer93，269-274)。此外，NK92細胞也已用于臨床環(huán)境，并且經(jīng)過若干在腎細胞癌和黑素瘤患者中進行的I期研究后證明是安全的(Araietal.，2008，Cytotherapy10，625-632)。由于這些細胞易于體外維持且倍增時間相對較短，對于各種測試多種靶定途徑的細胞毒測定法而言它們是理想的效應物。使用原初的IL-2依賴性NK92細胞系進行的實驗在小鼠和人中顯示了最小的毒性，但IL-2轉(zhuǎn)導的NK92MI細胞可能具有更大的致白血病潛力。研究者中嘗試在使用NK92細胞的SCID小鼠中避免白血病產(chǎn)生的一種方法是在接種前使用3000cGy照射效應物。在I期臨床試驗中，這足以防止NK92MI細胞在免疫受損的患者體內(nèi)不受控地增殖。一種替代的安全機制涉及自殺基因的使用。一個常見的例子是使用皰疹病毒胸苷激酶基因，該基因是這樣工作的：通過施用阿昔洛韋或更昔洛韋，該基因殺死表達該基因的細胞(Heleneetal.，1997，JImmunol5079-5082)。