抗CXCL13抗體和其使用方法用本申請?zhí)峤坏碾娮犹峤籄SCII文本文件序列表(名稱:"sequencelisting_ascii.txt";大小:16,923字節(jié);和創(chuàng)建日期:2011年4月28日)的內(nèi)容通過引用全文納入本文。技術(shù)背景內(nèi)穩(wěn)態(tài)B細(xì)胞虜獲（cell-attracting）趨化因子1(BCA-1)也稱為CXCL13(或ANGIE、BLC、BLR1L、ANGIE2或Scyb13)，在次級淋巴器官(如脾、淋巴結(jié)和派爾斑)中由濾泡型樹突細(xì)胞(FDC)和巨噬細(xì)胞組成型表達(dá)。參見Gunn等，Nature391:799-803(1998)和Carlsen等，Blood104(10):3021-3027(2004)。CXCL13主要通過G蛋白偶聯(lián)CXCR5受體(伯基特淋巴瘤受體1)作用。例如在成熟的B淋巴細(xì)胞、CD4+濾泡型輔助T細(xì)胞(Thf細(xì)胞)、小部分CD8+T細(xì)胞和活化的扁桃體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)上表達(dá)CXCR5。參見Legler等，J.Exp.Med.187:655-660(1998);等,Blood84:830-840(1994);Fazilleau等,Immunity30:324-335(2009);Ansel等,J.Exp.Med.190:1123-1134(1999);Lim等,J.Clin.Invest.114(11):1640-1649(2004);和R.ChapterinAcademicPressCytokineReference,2000年8月。產(chǎn)生有自身抗體(針對自身抗原的抗體)生成潛能的B細(xì)胞在正常生理情況下是常見的。然而，這種天然自身抗體是低親和性IgM抗體，其顯示了廣譜反應(yīng)性并且對可溶性自身抗原相比細(xì)胞表面抗原有更強(qiáng)優(yōu)先性(參見例如Dichiero等,J.Immunol.134(2):765-771(1985);Cote等,Proc.Natl.Acad.Sci83:2959-2963(1986))。自身反應(yīng)的低親和性B細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，并且因此不太可能危及健康生物。沒有傳染和在正常免疫反應(yīng)中，CXCL13和其受體CXCR5參與B細(xì)胞和濾泡型B輔助T細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)和脾中的初級濾泡；生發(fā)中心形成；和淋巴器官發(fā)生。參見，例如等，Cell87:1037-1047(1996)。CXCL13和CXCR5缺陷小鼠顯示了由于缺乏有序?yàn)V泡引起的派爾斑和淋巴結(jié)的發(fā)育損害。參見Ansel等,Nature406:309-314(2000)。另外，在CXCL13敲除表型背景中用T細(xì)胞依賴性抗原的免疫引起淋巴結(jié)和脾中形成錯位和異常小生發(fā)中心(Ansel等)。在慢性炎癥環(huán)境中，在受影響(經(jīng)常是非淋巴)組織內(nèi)形成異位生發(fā)中心。在這些生發(fā)中心中濾泡型樹突細(xì)胞(FDC)的CXCL13過量表達(dá)伴有FDC、B細(xì)胞和濾泡型Th細(xì)胞之間相互作用失調(diào)，降低了自身反應(yīng)B細(xì)胞的消除和隨后抗原驅(qū)動的親和性成熟長期漿細(xì)胞生成以及生成高親和性IgG自身抗體的記憶B細(xì)胞，能造成自身免疫和炎癥疾病發(fā)展。參見，例如Vinuesa等，Immunology9:845-857(2009)。再者，報(bào)道了某些癌癥中CXCR5受體的過度表達(dá)提高CXCL13依賴性細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。在幽門螺旋桿菌（H.pylori）誘導(dǎo)的胃淋巴濾泡和粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤上觀察到CXCL13(BCA-1)和其受體CXCR5的高水平表達(dá)。參見例如Mazzucchelli等,JClinInvest104:R49-R54(1999)。另外，在幽門螺旋桿菌（H.pylori）誘導(dǎo)胃炎的所有樣品中發(fā)現(xiàn)了CXCL13(BCA-1)表達(dá)。同上（Id.）。海爾曼螺桿菌（H.heilmannii）感染的野生型小鼠的胃粘膜中，已知參與淋巴組織(包含MALT)器官發(fā)生的CXCL13的mRNA表達(dá)水平顯著高于未感染的小鼠。參見Nobutani等,FEMSImmunolMedMicrobiol60:156-164(2010)。靶向CXCL13所介導(dǎo)信號通路的治療需求在近些年中明顯增加。這種治療的作用機(jī)制包含例如阻斷CXCL13與其受體的相互作用，造成干擾B細(xì)胞和濾泡型B輔助T細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織和生發(fā)中心形成(如在自動免疫疾病情況中)和抑制癌細(xì)胞增殖和在腫瘤疾病中擴(kuò)散的能力。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及CXCL13中和結(jié)合分子如抗體和其抗原結(jié)合片段例如人源化單克隆抗體，所述結(jié)合分子的使用方法，和治療CXCL13表達(dá)細(xì)胞相關(guān)病癥和疾病的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合與參照單克隆抗體相同CXCL13表位的經(jīng)分離抗原結(jié)合分子，所述參照單克隆抗體選自MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2和3C9。在某些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合分子特異性結(jié)合與MAb5261和MAb5378相同的CXCL13表位。另一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合CXCL13的經(jīng)分離抗原結(jié)合分子，所述結(jié)合分子競爭性抑制參照單克隆抗體特異性結(jié)合CXCL13，所述參照單克隆抗體選自MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2和3C9。在某些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合分子競爭性抑制MAb5261和MAb5378。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原或其片段選自MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2和3C9。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的重鏈可變區(qū)(VH)包含與選自SEQIDNO:13和SEQIDNO:3的序列至少90％相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)(VL)包含與選自SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8的序列至少90％相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的VH包含除了20個(gè)或更少保守性氨基酸取代外，與選自SEQIDNO：13和SEQIDNO：3的序列相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體或其片段的VL包含除了20個(gè)或更少保守性氨基酸取代外，與選自SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8的序列相同的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述分離抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的VH和VL包含與選自下組的VH和VL序列至少90%相同的氨基酸序列：(a)分別是SEQIDNO:13和SEQIDNO:15;(b)分別是SEQIDNO:13和SEQIDNO:17;和(c)分別是SEQIDNO:3和SEQIDNO:8。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，其中所述抗體或其片段的VH和VL包含除了20個(gè)或更少保守性氨基酸取代外，與選自下組的VH和VL序列相同的氨基酸序列：(a)分別是SEQIDNO:13和SEQIDNO:15;(b)分別是SEQIDNO:13和SEQIDNO:17;和(c)分別是SEQIDNO:3和SEQIDNO:8。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的VH包含除了兩個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO：4相同的Chothia-Kabat重鏈互補(bǔ)決定區(qū)-1(VH-CDR1)氨基酸序列；除了四個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO:5相同的Kabat重鏈互補(bǔ)決定區(qū)-2(VH-CDR2)氨基酸序列；除了兩個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO:6相同的Kabat重鏈互補(bǔ)決定區(qū)-3(VH-CDR3)氨基酸序列；除了四個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO:16或9相同的Kabat輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)-1(VL-CDR1)氨基酸序列；除了兩個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO:10相同的Kabat輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)-2(VL-CDR2)氨基酸序列；或者除了兩個(gè)或更少的氨基酸取代外，與SEQIDNO:11相同的Kabat輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)-3(VL-CDR3)氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的VH包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，除了一個(gè)或多個(gè)所述VH-CDR中的4個(gè)或更少氨基酸取代以外，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分別包含SEQIDNO：4、5和6。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13，并且所述抗體或其片段的VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，除了一個(gè)或多個(gè)VL-CDR中的4個(gè)或更少氨基酸取代以外，所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分別包含SEQIDNO：16或9、10和11。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其片段抑制CXCL13與CXCL13受體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述CXCL13受體是CXCR5。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或其片段是人源化的、靈長類化的或嵌合的。本發(fā)明的另一方面針對包含本發(fā)明抗體或其片段、和運(yùn)載體（carrier）的組合物。本發(fā)明的其他方面針對包含抗體VH多肽編碼核酸的經(jīng)分離多核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列與選自SEQIDNO:12和SEQIDNO:2的序列至少90%相同。另一個(gè)方面，本發(fā)明針對包含抗體VL多肽編碼核酸的經(jīng)分離多核苷酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列與選自SEQIDNO:7和SEQIDNO14的序列至少90%相同；并且，包含所述VL多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離多核苷酸包含抗體VH多肽的編碼核酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列除了20個(gè)或更少保守性氨基酸取代外，與選自SEQIDNO:2和SEQIDNO:12的序列相同。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離多核苷酸包含抗體VL多肽的編碼核酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列除了20個(gè)或更少保守性氨基酸取代外，與選自SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:18的序列相同，并且，包含所述VL多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CXCL13。本發(fā)明的其他方面針對包含本發(fā)明多核苷酸的載體。另一方面針對包含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還針對生成特異性結(jié)合CXCL13的抗體或其片段的方法，所述方法包含培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和回收所述抗體或其片段。本發(fā)明另一方面針對中和動物中CXCL13的方法，所述方法包含給予所述動物含有以下的組合物：本發(fā)明的分離抗體或其片段；和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。本發(fā)明的其他實(shí)施方式針對在需要治療的動物中治療自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包含給予所述動物含有以下的組合物：本發(fā)明的分離抗體或其片段或組合物；和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。在一些實(shí)施方式中，所述自身免疫疾病或所述炎性疾病是多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或關(guān)節(jié)炎，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明其他方面針對降低或抑制動物中胃淋巴濾泡的方法，所述方法包含給予所述動物含以下的組合物：本發(fā)明的分離抗體或其片段和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。本發(fā)明的其他實(shí)施方式針對在需要防止或治療的動物中防止或治療粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤或者胃或十二指腸潰瘍的方法，所述方法包含給予所述動物含以下的組合物：本發(fā)明的分離抗體或其片段和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，用螺桿菌（Heliobacter）感染所述動物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述螺桿菌是幽門螺旋桿菌（H.pylori）或海爾曼螺桿菌（H.heilmannii）。附圖簡要說明圖1。特異性ELISA結(jié)果顯示了與抗體對照(小鼠MAb801和/或大鼠MAb470)相比，小鼠抗人CXCL13抗體(3D2和3C9)與重組人CXCL13(1A)、重組小鼠CXCL13(1B)、和重組短尾猴CXCL13(1C)的結(jié)合。顯示的EC50值從四參數(shù)S形曲線擬合中獲得(曲線顯示在圖中；生成EC50值的所述曲線的R2是0.99)。圖2。表位競爭ELISA結(jié)果顯示了與沒有競爭物或MAb801的結(jié)果相比，對小鼠抗人CXCL13抗體(3C9和3D2)而言，生物素化3D2與人CXCL13結(jié)合的抑制百分比。圖3。捕獲表位競爭性ELISA結(jié)果顯示了3D2抑制生物素-3C9與天然或重組人CXCL13的結(jié)合(3A)和生物素-3D2與天然或重組小鼠CXCL13的結(jié)合(3B)。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;所述R2=0.99)。使用非配對t檢驗(yàn)分析EC50值的差異，并且發(fā)現(xiàn)P>0.05。圖4。B細(xì)胞遷移結(jié)果顯示了3D2和3C9對人CXCL13誘導(dǎo)的人前-B-697-hCXCR5細(xì)胞遷移(4A)和人SDF-1α誘導(dǎo)的前-B-697-hCXCR4細(xì)胞遷移(4B)的影響。小鼠IgG用作陰性對照。MAb801用作抑制人CXCL13遷移的陽性對照，并且MAb87A用作抑制人SDF-1α誘導(dǎo)遷移的陽性對照。圖5。在C57Black/6中通過3D2、MAb470、小鼠IgG(對照)或大鼠IgG(對照)(5A)和在SJL/J中通過3D2、3C9、MAb470或小鼠IgG(對照)(5B)的脾細(xì)胞遷移的抑制百分比。所述結(jié)果表示為兩個(gè)(C57Black/6遷移)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD和三個(gè)(SJL/J遷移)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。通過生成P值>0.05的非配對t檢驗(yàn)分析3D2對C57Black/6和SJL/J遷移(5C)影響的比較。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.99)。圖6。通過3D2或?qū)φ?MAb470和/或小鼠IgG)，對人和小鼠CXCR5受體的人CXCL13所介導(dǎo)胞吞作用(6A)和小鼠CXCL13所介導(dǎo)胞吞作用(6B)而言CXCL13介導(dǎo)的胞吞作用結(jié)果。(6C)顯示了人和小鼠CXCL13所介導(dǎo)胞吞作用EC50值的比較，所述EC50值從R2值等于1(小鼠胞吞作用)和0.994(人胞吞作用)的S形劑量反應(yīng)曲線中得出。用生成P值>0.05的非配對t檢驗(yàn)分析比較3D2對人和小鼠受體胞吞作用影響的數(shù)據(jù)。圖7。用3D2(第0天開始)、3D2(評分>1開始)、或小鼠IgG對照(RR-EAE-1研究)治療的小鼠中EAE疾病的進(jìn)展。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自9只小鼠的平均值。使用單向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值(GMS)。圖8。用3D2(第0天開始)、3D2(第6天開始)、3D2(>第2天開始)或小鼠IgG對照(RR-EAE-2研究)治療的小鼠中EAE疾病的進(jìn)展。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自9只小鼠的平均值。使用單向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值(GMS)。圖9。3D2或小鼠IgG(對照)治療(SLE-1研究)后，有晚期狼瘡腎炎的小鼠中的腎病理學(xué)。對于蛋白尿癥評分(9A)和腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎和血管炎的腎病理學(xué)評分(9B)，各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示10次測量的平均值。圖10。3D2和小鼠IgG(對照)治療(SLE-2研究)后，有早期狼瘡疾病小鼠中的腎病理學(xué)。對于蛋白尿癥評分(10A)和腎小球腎炎及間質(zhì)性腎炎的腎病理學(xué)評分(10B)，各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自3D2治療組的7只小鼠和來自小鼠IgG治療組的9只小鼠。圖11：組織學(xué)切片顯示了3D2對狼瘡小鼠脾上生發(fā)中心(GC)和初級濾泡的影響。脾切片用GL-7(GC染色)、B220抗體(B細(xì)胞標(biāo)記)、或針對來自3D2治療(11A)和小鼠IgG治療(11B)NZB/NZWF1小鼠的濾泡型樹突細(xì)胞(FDC)的抗體來染色。圖12。用3D2治療的狼瘡小鼠脾中的初級濾泡和GC大小。每組5只小鼠，值顯示為平均值+/-SEM。當(dāng)表示為初級:次級(GC)濾泡比率(p=0.19)時(shí)，用3D2(“tx”)治療的小鼠顯示了GC數(shù)目降低的趨勢(12A)，以及GC大小顯著降低的趨勢(p=0.03)(12B)。圖13。3D2可變重鏈(H1609)和可變輕鏈(L0293)的多核苷酸和氨基酸序列?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)用下劃線顯示。圖14。人源化嵌合3D2的氨基酸序列顯示了可變重鏈H1609到H2177的修飾(14A)和可變輕鏈L0293到L5055到L5140的修飾(14B)。推定的糖基化位點(diǎn)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)加框表示。圖15。MAb5261可變重鏈和輕鏈(H2177/L5140)以及MAb5080可變重鏈和輕鏈(H2177/L5055)的多核苷酸和氨基酸序列?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)用下劃線顯示。圖16。MAb5261、MAb5080、MAb1476和人同種型對照與重組人(16A)、短尾猴(16B)和小鼠(16C)CXCL13結(jié)合的特異性ELISA結(jié)果。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次重復(fù)測量的平均值。從四參數(shù)S形曲線擬合中計(jì)算出EC50值(曲線顯示在圖中；生成EC50值的所述曲線的R2是0.99)。NB=沒有結(jié)合。圖17。MAb5261、MAb5080和3D2與天然人(17A)和天然小鼠(17B)CXCL13結(jié)合的捕獲表位競爭ELISA結(jié)果。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的雙重測量的平均值。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.99)。圖18。MAb5261對人前-B-697-hCXCR5(18A)和人扁桃體細(xì)胞(18B)遷移的抑制百分比。數(shù)據(jù)顯示來自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值+/-SEM。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.98-0.99)。圖19。MAb5261對SJL/J(19A)和C57Black/6(19B)脾細(xì)胞遷移的抑制百分比。代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示為雙重測量的平均值+/-SD。圖20。MAb5261和同種型對照對人CXCR5受體的人CXCL13介導(dǎo)內(nèi)化的抑制百分比。數(shù)據(jù)是來自至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.99)。圖21。MAb5378可變重鏈(H5188)和可變輕鏈(L5153)的多核苷酸和氨基酸序列?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)用下劃線顯示。圖22。MAb5378、MAb5261和MAb470的表位競爭ELISA結(jié)果。圖23。對MAb5378、3D2和小鼠同種型對照與重組人(23A)、短尾猴(23B)和小鼠(23C)CXCL13結(jié)合的特異性ELISA結(jié)果。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三重測量的平均值。從四參數(shù)S形曲線擬合中計(jì)算出EC50值(曲線顯示在圖中；生成EC50值的所述曲線的R2是0.99)。圖24。MAb5261或MAb5378(24A-B)和MAb5378或3D2(24C)對人前-B-697-hCXCR5(24A)、人扁桃體細(xì)胞(24B)和C57Black6小鼠脾細(xì)胞(24C)遷移的抑制百分比。數(shù)據(jù)顯示來自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值+/-SEM。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.99)。圖25。MAb5378、MAb5261、3D2、小鼠同種型對照、或人同種型對照對人CXCR5受體的人CXCL13介導(dǎo)內(nèi)化的抑制百分比。5261和5378的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均測量。3D2和同種型對照的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自單個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值。使用四參數(shù)S形曲線擬合來擬合曲線(曲線在圖中顯示;R2=0.99)。NE=沒有影響。圖26。用MAb5376、依那西普或小鼠IgG(對照)(CIA-1研究)治療的小鼠中膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)疾病的進(jìn)展。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自10只小鼠的平均評分。使用單向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值。圖27。用MAb5378、依那西普、MAb470或小鼠IgG(對照)(CIA-2研究)治療的小鼠中膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)疾病的進(jìn)展。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自10只小鼠的平均評分。使用單向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值。圖28。用MAb5378、小鼠同種型對照治療或沒有治療(GC-1研究)的NP-CGG免疫小鼠中的生發(fā)中心形成。各脾數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自三只小鼠的平均值。各淋巴結(jié)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示獲自從三只小鼠收集的匯集細(xì)胞的單個(gè)值。圖29。海爾曼螺桿菌（H.heilmannii）感染小鼠和給予抗體的治療方案。圖30。在獲自包含同種型對照抗體治療和抗CXCL13抗體治療的海爾曼螺桿菌感染小鼠的所有胃樣品中擴(kuò)增海爾曼螺桿菌特異性16srRNA基因。也顯示了陽性對照(P)和陰性對照(N)。圖31。如實(shí)時(shí)定量PCR所測定，海爾曼螺桿菌（HH）感染野生型（WT）小鼠在感染后1個(gè)月(31A)和3個(gè)月(31B)的胃粘膜中CXCL13的mRNA表達(dá)水平(值根據(jù)各樣品中小鼠β肌動蛋白表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化)。圖32。同種型對照抗體或抗CXCL13抗體治療后，海爾曼螺桿菌感染小鼠胃中CXCL13mRNA和β肌動蛋白的表達(dá)(上圖)。未感染小鼠的胃中CXCL13mRNA和β肌動蛋白的表達(dá)(下圖)。也顯示了陽性對照(P)和陰性對照(N)。圖33。海爾曼螺桿菌感染后三個(gè)月，來自同種型對照抗體治療小鼠（上面左圖）和抗CXCL13抗體治療小鼠（上面右圖）的經(jīng)蘇木精和伊紅(H&E)染色胃樣品。所述下圖顯示了在來自同種型對照抗體和抗CXCL13抗體治療小鼠的胃樣品中鑒定的胃淋巴濾泡數(shù)目。發(fā)明詳述I．定義需要注意，術(shù)語“一個(gè)”或“一種”實(shí)體指一種或多種該實(shí)體；例如，“一種抗-CXCL13抗體”應(yīng)理解為代表一種或多種抗-CXCL13抗體。如此，術(shù)語“一個(gè)”(或“一種”)、“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一個(gè)”在本文中可互換使用。本文所用的術(shù)語“腫瘤”是指無論惡性或良性的所有贅生性細(xì)胞生長和增殖，以及所有的癌和癌前期細(xì)胞和組織。術(shù)語“癌癥”和“癌”指或描述哺乳動物的生理病癥，其典型特征是細(xì)胞生長失控。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤和白血病。本文所用的術(shù)語“多肽”意在包括單數(shù)形式“多肽”和復(fù)數(shù)形式“多肽”，指酰胺鍵(也稱肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)所組成的分子。術(shù)語“多肽”指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何一條鏈或多條鏈，而非具體長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或其它任何用于指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的術(shù)語均包含于“多肽”的定義內(nèi)，術(shù)語“多肽”可與任意這些術(shù)語替代或互換使用。術(shù)語“多肽”還指多肽表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，所述修飾包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化、蛋白酶切割或非天然產(chǎn)生氨基酸修飾。多肽可能由天然生物來源衍生或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必定由指定核酸序列翻譯而來?？梢匀魏畏绞疆a(chǎn)生多肽，包括化學(xué)合成。本發(fā)明多肽的大小可以是約3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、75個(gè)或更多個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)、200個(gè)或更多個(gè)、500個(gè)或更多個(gè)、1,000個(gè)或更多個(gè)或者2,000個(gè)或更多個(gè)氨基酸。多肽可具有確定的三維結(jié)構(gòu)，但它們不必定具有這種結(jié)構(gòu)。具有確定三維結(jié)構(gòu)的多肽稱為折疊多肽，不具有確定三維結(jié)構(gòu)、但可采用大量不同構(gòu)象的多肽稱為非折疊多肽。本文所用的術(shù)語糖蛋白指偶聯(lián)于至少一個(gè)糖部分的蛋白質(zhì)，所述糖部分通過某一氨基酸殘基如絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基的含氧或含氮側(cè)鏈連接于蛋白質(zhì)?！胺蛛x的”多肽或其片段、變體或衍生物指不在其天然環(huán)境中的多肽。不要求特定的純化水平。例如，可從其自然或天然環(huán)境中移出分離多肽。就本發(fā)明目的而言，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，通過任何合適技術(shù)分離、分級、部分或基本上純化的天然或重組多肽也如此。本發(fā)明多肽也包括上述多肽的片段、衍生物、類似物或變體，及其任何組合。提到本發(fā)明抗-CXCL13抗體或抗體多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”包括保持相應(yīng)的本發(fā)明抗體或本發(fā)明抗體多肽的至少一部分抗原結(jié)合特性的任何多肽。除本文他處討論的具體抗體片段外，本發(fā)明多肽的片段還包括蛋白酶水解片段以及缺失片段。本發(fā)明抗CXCL13抗體和抗體多肽的變體包括上述片段，以及具有因氨基酸取代、缺失或插入而改變氨基酸序列的多肽。變體可以是天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生的。可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)生成非天然產(chǎn)生變體。變體多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。多肽變體在本文中也稱作“多肽類似物”。本文所用抗CXCL13抗體或抗體多肽的“衍生物”指具有官能性側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)化學(xué)所衍生的一個(gè)或多個(gè)殘基的對象多肽?！把苌铩边€包括那些含有一個(gè)或多個(gè)20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然產(chǎn)生氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；鳥氨酸可取代賴氨酸。本發(fā)明抗CXCL13抗體和抗體多肽的衍生物可包括經(jīng)改變以具有本發(fā)明參照抗體或抗體多肽上不存在的額外特征的多肽。術(shù)語“多核苷酸”意在包括單個(gè)核酸和多個(gè)核酸，指分離的核酸分子或構(gòu)建物，例如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(如酰胺鍵，如肽核酸(PNA)中發(fā)現(xiàn)的酰胺鍵)。術(shù)語“核酸”指多核苷酸中存在的任何一種或多種核酸區(qū)段，如DNA或RNA片段?！胺蛛x的”核酸或多核苷酸指從其天然環(huán)境中移出的核酸分子，DNA或RNA。例如，就本發(fā)明目的而言，包含在載體中的編碼抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段的重組多核苷酸被認(rèn)為是分離的。經(jīng)分離多核苷酸的其它例子包括保持于異源宿主細(xì)胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或基本上純化)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離多核苷酸或核酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括調(diào)控元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子。本文所用的術(shù)語“編碼區(qū)”是由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸部分。雖然“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，但它可被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，而任何側(cè)接序列如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等均不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)可存在在單一多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單一載體上，或者在分開的多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單獨(dú)(不同)載體上。而且，任何載體可包含單個(gè)編碼區(qū)，或者可包含兩個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，例如，單一載體可單獨(dú)編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明的載體、多核苷酸或核酸可編碼與抗CXCL13抗體或其片段、變體或衍生物的編碼核酸融合或不融合的異源編碼區(qū)。異源編碼區(qū)包括但不限于專用的元件或基序，如分泌信號肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況中，包含多肽編碼核酸的多核苷酸通常包含啟動子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，這些元件與一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)可操作連接?？刹僮鬟B接指當(dāng)基因產(chǎn)物如多肽的編碼區(qū)與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列以此方式連接時(shí)，將該基因產(chǎn)物的表達(dá)置于該調(diào)控序列的影響或控制下。如果啟動子功能的誘導(dǎo)使編碼所需基因產(chǎn)物的mRNA轉(zhuǎn)錄，且如果兩個(gè)DNA片段間連接的屬性不干擾表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)或不干擾轉(zhuǎn)錄DNA模板的能力，則兩個(gè)DNA片段(如多肽編碼區(qū)及其相連的啟動子)“可操作連接”。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉(zhuǎn)錄，則啟動子區(qū)域與多肽編碼核酸可操作連接。啟動子可以是僅在預(yù)定細(xì)胞中指導(dǎo)DNA實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動子。啟動子以外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏物和轉(zhuǎn)錄終止信號，能與多核苷酸可操作連接以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。本文公開了合適的啟動子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。許多轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。它們包括但不限于在脊椎動物細(xì)胞中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如但不限于，來自巨細(xì)胞病毒(立即早期啟動子，與內(nèi)含子-A聯(lián)用)、猿病毒40(早期啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(如勞氏肉瘤病毒)的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)段。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括衍生自脊椎動物基因例如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔β-珠蛋白的那些，以及能夠在真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的其它序列。其它合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子，以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動子(如干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。類似地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解各種翻譯控制元件。它們包括但不限于：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或IRES，也稱為CITE序列)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸是RNA，例如，采用信使RNA(mRNA)形式。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼分泌或信號肽的其它編碼區(qū)聯(lián)合，所述分泌或信號肽指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽分泌。根據(jù)信號假說，哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦生長的蛋白質(zhì)鏈向粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外的輸出過程啟動，所述序列從成熟蛋白質(zhì)上切除。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，脊椎動物細(xì)胞分泌的多肽通常具有融合于所述多肽N末端的信號肽，它們從完整或“全長”多肽上切割產(chǎn)生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些實(shí)施方式中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或者使用仍然能夠指導(dǎo)與其操作性相連多肽分泌的該序列的功能衍生物?；蛘撸刹捎卯愒床溉閯游镄盘栯幕蚱涔δ苎苌?。例如，野生型前導(dǎo)序列可以用人組織纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前導(dǎo)序列取代。廣義來說，本發(fā)明的"結(jié)合分子"或"抗原結(jié)合分子"指特異性結(jié)合抗原決定簇的分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子特異性結(jié)合CXCL13(也稱為BCA-1)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子是抗體或其抗原結(jié)合片段，如抗CXCL13抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括抗體分子的至少一個(gè)重鏈或輕鏈CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括來自一種或多種抗體分子的至少兩個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括來自一種或多種抗體分子的至少三個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括來自一種或多種抗體分子的至少四個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括來自一種或多種抗體分子的至少五個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子包括來自一種或多種抗體分子的至少六個(gè)CDR。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)CDR來自MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9。本發(fā)明針對某些抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。除非特別提到完整大小的抗體如天然產(chǎn)生的抗體，術(shù)語“抗CXCL13抗體”包括完整大小的抗體以及這種抗體的抗原結(jié)合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然產(chǎn)生的抗體或免疫球蛋白分子，或以類似于抗體分子的方式結(jié)合抗原的經(jīng)工程改造抗體分子或片段。本文所用的“人”或“完全人”抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，包括分離自人免疫球蛋白文庫的抗體或不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因動物，如下文所述，例如，Kucherlapati等的美國專利號5,939,598?！叭恕被颉巴耆恕笨贵w也包括至少含重鏈可變區(qū)或至少重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體，其中所述可變區(qū)具有人免疫球蛋白可變區(qū)的氨基酸序列?！叭恕被颉巴耆恕笨贵w還包括如上所述包含本文所述抗體分子(如VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括衍生物)或基本由其組成或由其組成的“人”或“完全人”抗體，所述抗體或其片段免疫學(xué)特異性結(jié)合于CXCL13多肽或其片段或變體?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在編碼人抗CXCL13抗體的核苷酸序列中引入突變，包括但不限于，引起氨基酸取代的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，相對于參照VH區(qū)、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL區(qū)、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，該變體(包括衍生物)編碼少于50個(gè)氨基酸取代、少于40個(gè)氨基酸取代、少于30個(gè)氨基酸取代、少于25個(gè)氨基酸取代、少于20個(gè)氨基酸取代、少于15個(gè)氨基酸取代、少于10個(gè)氨基酸取代、少于5個(gè)氨基酸取代、少于4個(gè)氨基酸取代、少于3個(gè)氨基酸取代或少于2個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所詳述?；蛘撸部裳厮谢蛞徊糠志幋a序列隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變引入，可篩選所得突變體的生物學(xué)活性以鑒定保持活性(例如，結(jié)合CXCL13多肽，如結(jié)合人CXCL13、鼠CXCL13或同時(shí)結(jié)合人和鼠CXCL13的能力)的突變體。“人”或“完全人”抗體的這類變體(或其衍生物)也可稱為“優(yōu)化”或“就抗原結(jié)合優(yōu)化”的人或完全人抗體，包括對抗原親和性提高的抗體。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用?？贵w或免疫球蛋白至少包括重鏈可變區(qū)，通常至少包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)。脊椎動物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相對較好理解。參見例如，Harlow等(1988)Antibodies:ALaboratoryManual(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(第2版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))。正如下文中更詳細(xì)討論，術(shù)語“免疫球蛋白”包括可通過生化性質(zhì)區(qū)分的各種類型多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，重鏈分為gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中還有一些亞類(如γ1-γ4)。該鏈的特性決定抗體“類別”分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被良好表征，且已知賦予功能特化。根據(jù)本文公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難區(qū)分這些類別和同種型的修飾形式，因此，它們涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。所有免疫球蛋白類別明顯屬于本發(fā)明范圍，以下討論通常針對免疫球蛋白分子的IgG類。在IgG中，標(biāo)準(zhǔn)的免疫球蛋白分子包括分子量約為23,000道爾頓的兩個(gè)相同輕鏈多肽和分子量為53,000-70,000的兩個(gè)相同重鏈多肽。這四條鏈通常在“Y”構(gòu)型中由二硫鍵連接起來，其中輕鏈從Y的口部開始托起重鏈，并延續(xù)通過可變區(qū)。輕鏈分類為卡帕(kappa)或拉姆達(dá)(lambda)(κ、λ)。各重鏈類可與κ或λ輕鏈結(jié)合。通常，通過雜交瘤、B細(xì)胞或遺傳工程改造的宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白時(shí)，輕鏈和重鏈互相共價(jià)結(jié)合，兩條重鏈的“尾部”通過共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)連接互相結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型的分叉末端的N末端走向每條鏈底部的C末端。輕鏈和重鏈都可以分成結(jié)構(gòu)和功能同源的區(qū)域。術(shù)語“恒定”和“可變”從功能角度使用。在這方面，應(yīng)理解輕鏈(VL或VK)和重鏈(VH)部分的可變區(qū)決定抗原識別和特異性。相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定區(qū)產(chǎn)生重要的生物學(xué)特性，例如分泌、跨胎盤移動、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等。通常，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號越大，離抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基末端越遠(yuǎn)。N-末端部分是可變區(qū)，C-末端部分是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包括重鏈和輕鏈的羧基末端。如本文所述，可變區(qū)允許抗體選擇性識別和特異性結(jié)合抗原上的表位。也就是說，抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域、或這些可變區(qū)內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)亞組組合形成確定三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)。這種四聯(lián)抗體結(jié)構(gòu)形成在Y的每條臂末端存在的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)由各VH和VL鏈上的三個(gè)CDR確定。在一些情況下，例如在衍生自羊駝種類或根據(jù)羊駝免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可僅由重鏈構(gòu)成而不含輕鏈。參見例如，Hamers-Casterman等，Nature363:446-448(1993)。在天然產(chǎn)生的抗體中，每個(gè)抗原結(jié)合域上出現(xiàn)的六個(gè)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”是短的非毗連氨基酸序列，隨著抗體在水性環(huán)境中確定其三維構(gòu)型時(shí)，它們特別定位以形成抗原結(jié)合域?？乖Y(jié)合域中的其余氨基酸稱為“框架”區(qū)，顯示較小的分子間變化。框架區(qū)主要采用β-片層構(gòu)象，CDR形成連接β-片層結(jié)構(gòu)和某些情況下形成部分β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。因此，框架區(qū)用于通過鏈間非共價(jià)相互作用形成為CDR提供正確方向位置的支架。通過定位CDR形成的抗原結(jié)合域能確定與免疫反應(yīng)性抗原上表位互補(bǔ)的表面。這種互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與其關(guān)聯(lián)表位的非共價(jià)結(jié)合。就任何給定的重鏈或輕鏈可變區(qū)而言包含CDR和框架區(qū)的氨基酸能由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易鑒定，因?yàn)樗鼈円驯痪_定義(見下)。除非明確陳述相反，在本領(lǐng)域內(nèi)所使用和/或接受的某一術(shù)語有兩種或多種定義的情況下，本文所用的該術(shù)語定義應(yīng)包括所有這些含義。具體例子是使用術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非毗連抗原結(jié)合位點(diǎn)。這一特定區(qū)域的描述可參見Kabat等(1983)美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices)，“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)上感興趣的蛋白質(zhì)序列)”以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其通過引用全文納入本文，其中所述定義在互相比較時(shí)包括重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基亞組。盡管如此，應(yīng)用任一定義指抗體或其變體的CDR均應(yīng)落入本文所定義和使用的術(shù)語范圍。合適氨基酸殘基包括上文引用的各參考文獻(xiàn)中定義的CDR，所述氨基酸殘基列于下表1以作比較。包括特定CDR的準(zhǔn)確殘基編號取決于CDR的序列和大小而變化?？紤]到抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)確定哪些殘基包含具體CDR。表1.CDR定義1KabatChothiaVHCDR131-3526-32VHCDR250-6552-58VHCDR395-10295-102VLCDR124-3426-32VLCDR250-5650-52VLCDR389-9791-961表1中所有CDR定義的編號均根據(jù)Kabat等所述的編號規(guī)則(見下)。Kabat等也定義了適用于任何抗體的可變區(qū)序列的編號系統(tǒng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能明確地將所述“Kabat編號”系統(tǒng)應(yīng)用于任何可變區(qū)序列，而不依賴序列本身外的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本文所用的“Kabat編號”指Kabat等(1983)美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部，“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)上感興趣的蛋白質(zhì)序列)”中所述的編號系統(tǒng)。除非另有說明，提到本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物中具體氨基酸殘基位置的編號時(shí)，均按照Kabat編號系統(tǒng)。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段、變體、或其衍生物包括但不限于：多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化、靈長類化或嵌合抗體，單鏈抗體，表位結(jié)合片段如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段、Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段和抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括例如，本文所述抗CXCL13抗體的抗-Id抗體)。ScFv分子為本領(lǐng)域已知，描述于例如美國專利號5,892,019。本發(fā)明的免疫球蛋白或抗體分子可以是任何類型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或亞類的免疫球蛋白分子。本文所用的術(shù)語“重鏈部分”包括衍生自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重鏈部分的多肽包括下組中的至少一個(gè)：CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(如上部、中部和/或下部絞鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段。例如，本發(fā)明所用的結(jié)合多肽可包括含有CH1結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；含有CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分絞鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；含有CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；含有CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分絞鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈，或者含有CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分絞鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明多肽包括含有CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。另外，本發(fā)明所用的結(jié)合多肽可能缺少CH2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(例如，所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域)。如上所述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可修飾這些結(jié)構(gòu)域(例如重鏈部分)，從而其氨基酸序列不同于天然產(chǎn)生的免疫球蛋白分子。在本文公開的某些抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物中，多聚體的一條多肽鏈的重鏈部分與該多聚體的第二條多肽鏈相同?；蛘?，本發(fā)明含有重鏈部分的單體不同。例如，各單體可包含不同的靶結(jié)合位點(diǎn)，形成例如雙特異性抗體。本文公開的診斷和治療方法中所用結(jié)合分子的重鏈部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可包含衍生自IgG1分子的CH1結(jié)構(gòu)域和衍生自IgG3分子的絞鏈區(qū)。在另一個(gè)示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG3分子的絞鏈區(qū)。在另一個(gè)示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合鉸鏈。本文所用的術(shù)語“輕鏈部分”包括衍生自免疫球蛋白輕鏈，如κ或λ輕鏈的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述輕鏈部分包含VL或CL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)。本文所述的抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可根據(jù)它們識別或特異性結(jié)合的抗原如本文所述靶標(biāo)多肽(如CXCL13)的表位或部分進(jìn)行描述或說明。靶標(biāo)多肽與抗體的抗原結(jié)合域特異性相互作用的部分是“表位”或“抗原決定簇”。靶標(biāo)多肽可包含單個(gè)表位，但通常包含至少兩個(gè)表位，并可包括任意數(shù)量的表位，這取決于抗原的大小、構(gòu)象和類型。而且，應(yīng)該注意到，靶標(biāo)多肽上的“表位”可以是或可包括非多肽元件，例如表位可包括糖側(cè)鏈。認(rèn)為抗體的肽或多肽表位的最小尺寸是約4-5個(gè)氨基酸。肽或多肽表位優(yōu)選包含至少七個(gè)，更優(yōu)選至少九個(gè)，最優(yōu)選至少約15-約30個(gè)氨基酸。由于CDR能以三聯(lián)形式識別抗原性肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不必定是毗連的，在某些情況下甚至可不在同一肽鏈上。本發(fā)明抗CXCL13抗體識別的肽或多肽表位可包含CXCL13中至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、更優(yōu)選至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、或約15-約30個(gè)毗連或非毗連的氨基酸序列?！疤禺愋越Y(jié)合”通常指該抗體通過其抗原結(jié)合域結(jié)合于表位，并且該結(jié)合需要抗原結(jié)合域和表位之間某種程度的互補(bǔ)。按照這一定義，抗體通過其抗原結(jié)合域與表位結(jié)合比結(jié)合隨機(jī)無關(guān)表位更容易時(shí)，稱該抗體“特異性結(jié)合”該表位。本文中使用術(shù)語“特異性”定性分析某一抗體與某一表位結(jié)合的相對親和性。例如，可認(rèn)為抗體“A”對某給定表位的特異性高于抗體“B”，或者可以說抗體“A”結(jié)合表位“C”的特異性高于它對相關(guān)表位“D”的特異性?！皟?yōu)選結(jié)合”指與結(jié)合相關(guān)、相似、同源或類似的表位相比，該抗體更容易特異性結(jié)合某表位。因此，與相關(guān)表位相比，“優(yōu)選結(jié)合”給定表位的抗體更可能結(jié)合該表位，即便這種抗體可能與相關(guān)表位發(fā)生交叉反應(yīng)。作為非限制性示例，如果抗體與第一表位結(jié)合的解離常數(shù)(KD)低于抗體與第二表位的KD，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一表位。在另一個(gè)非限制性例子中，如果抗體與第一表位結(jié)合的KD比抗體與第二表位的KD低至少一個(gè)數(shù)量級，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一抗原。在另一個(gè)非限制性例子中，如果抗體與第一表位結(jié)合的KD比抗體與第二表位的KD低至少兩個(gè)數(shù)量級，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一表位。在另一個(gè)非限制性例子中，如果抗體與第一表位結(jié)合的解離速率(k(off))比抗體與第二表位的k(off)低，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一表位。在另一個(gè)非限制性例子中，如果抗體與第一表位結(jié)合的k(off)抗體與第二表位的k(off)低至少一個(gè)數(shù)量級，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一表位。在另一個(gè)非限制性例子中，如果抗體與第一表位結(jié)合的k(off)比抗體與第二表位的k(off)低至少兩個(gè)數(shù)量級，則可認(rèn)為抗體優(yōu)選結(jié)合第一表位。可以說，本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物結(jié)合本文公開的靶標(biāo)多肽(如CXCL13，如人、鼠或者人和鼠CXCL13)或其片段或變體，其解離速率(k(off))低于或等于5X10-2s-1、10-2s-1或5X10-3s-1。在某些實(shí)施方式中，所述k(off)小于或等于約3X10-2，如其中所述抗體是3D2和所述CXCL13是人或小鼠的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述k(off)小于或等于約3X10-3，如其中所述抗體是MAb5261和所述CXCL13是人或小鼠的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述k(off)小于或等于約4X10-3，如其中所述抗體是MAb5378和所述CXCL13是人或小鼠的。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以說，本發(fā)明抗體結(jié)合本文公開的靶標(biāo)多肽(如CXCL13，如人、鼠、或者人和鼠CXCL13)或其片段或變體，其解離速率(k(off))低于或等于5X10-4s-1、10-4s-1、5X10-5s-1、或10-5s-1、5X10-6s-1、10-6s-1、5X10-7s-1或10-7s-1。可以說，本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物結(jié)合本文公開的靶標(biāo)多肽(如CXCL13，如人、鼠或者人和鼠CXCL13)或其片段或變體，其結(jié)合速率(k(on))大于或等于103M-1s-1、5X103M-1s-1、104M-1s-1、5X104M-1s-1、105M-1sec-1、5X105M-1s-1、106M-1s-1或5X106M-1s-1。在某些實(shí)施方式中，所述k(on)大于或等于約5X105，如其中所述抗體是3D2和所述CXCL13是人的；或者所述k(on)大于或等于約1X105，如其中所述抗體是3D2和所述CXCL13是小鼠的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述k(on)大于或等于約1X106，如其中所述抗體是MAb5261和所述CXCL13是人或小鼠的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述k(on)大于或等于約1X106，如其中所述抗體是MAb5378和所述CXCL13是人或小鼠的。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以說本發(fā)明抗體結(jié)合本文公開的靶標(biāo)多肽(如CXCL13，如人、鼠或者人和鼠的CXCL13)或其片段或變體，其結(jié)合速率(k(on))大于或等于105M-1s-1、5X105M-1s-1、106M-1s-1或5X106M-1s-1或107M-1s-1。如果抗體優(yōu)選結(jié)合所述表位并以某種程度阻斷所述參照抗體與所述表位的結(jié)合，認(rèn)為抗體競爭性抑制參照抗體與給定表位的結(jié)合，所述參照抗體如本文公開的抗CXCL3抗體，如MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2、或3C9。競爭性抑制可通過本領(lǐng)域已知的任何方法確定，例如競爭ELISA實(shí)驗(yàn)?？梢哉f，抗體將參照抗體與給定表位的結(jié)合競爭性抑制至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。本文所用的術(shù)語“親和性”指單獨(dú)表位與免疫球蛋白分子的CDR結(jié)合的強(qiáng)度量度。參見例如，Harlow等(1988)Antibodies:ALaboratoryManual(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，第2版)，第27-28頁。本文所用的術(shù)語“親合力”指免疫球蛋白群體和抗原間復(fù)合物的總體穩(wěn)定性，即免疫球蛋白混合物與抗原的功能性結(jié)合強(qiáng)度。參見例如，Harlow，第29-34頁。親合力既與群體中單獨(dú)免疫球蛋白分子與特定表位的親和性相關(guān)，也與免疫球蛋白分子和抗原的價(jià)態(tài)相關(guān)。例如，二價(jià)單克隆抗體和具有高度重復(fù)表位結(jié)構(gòu)的抗原例如多聚體之間的相互作用是具有高親合力的一個(gè)例子。本發(fā)明的抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或其衍生物也可按照其交叉反應(yīng)性進(jìn)行描述或說明。本文所用的術(shù)語“交叉反應(yīng)性”指抗體對某一種抗原具有特異性、與第二種抗原發(fā)生反應(yīng)的能力；它是兩種不同抗原性物質(zhì)之間相關(guān)性的量度。因此，如果抗體與誘導(dǎo)其形成的表位以外的其他表位結(jié)合，則具有交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性表位通常含有許多與誘導(dǎo)表位相同的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)特征，在某些情況下甚至比原始表位更適用。例如，某些抗體具有一定程度的交叉反應(yīng)性，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合相關(guān)但不相同的表位，例如，與參照表位至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%相同(按照本領(lǐng)域已知方法和本文所述方法計(jì)算)的表位。如果抗體不結(jié)合與參照表位少于95%、少于90%、少于85%、少于80%、少于75%、少于70%、少于65%、少于60%、少于55%和少于50%相同性(按照本領(lǐng)域已知方法和本文所述方法計(jì)算)的表位，則可以說該抗體具有很小或沒有交叉反應(yīng)性。如果某抗體不結(jié)合某表位的任何其它類似物、直向同源物或同源物，則可認(rèn)為該抗體對該表位“高度特異”。本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可根據(jù)與本發(fā)明多肽的結(jié)合親和性進(jìn)行描述或說明，所述多肽例如CXCL13，如人、鼠或者人和鼠的CXCL13。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合親和性包括解離常數(shù)或Kd低于或不高于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的那些。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人CXCL13的Kd小于約5x10-9M–約5x10-10M，如其中所述抗體是MAb5261和所述Kd小于或等于約5x10-9M。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合鼠CXCL13的Kd小于約5x10-7M–約9x10-9M，如其中所述抗體是MAb5261和所述Kd小于或等于約8x10-9M。本發(fā)明的抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可能是“多特異性”，例如是雙特異性、三特異性或更高特異性，這意味著它能同時(shí)識別和結(jié)合一種或多種不同抗原(如蛋白質(zhì))上出現(xiàn)的兩種或更多種不同表位。因此，抗CXCL13抗體是“單特異性”還是“多特異性”如“雙特異性”，指與結(jié)合多肽發(fā)生反應(yīng)的不同表位數(shù)量。多特異性抗體可以對本文所述靶標(biāo)多肽的不同表位有特異性，或?qū)Π袠?biāo)多肽以及異源表位例如異源多肽或固體支持材料有特異性。本文所用的術(shù)語“價(jià)態(tài)”指結(jié)合多肽或CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段中存在的潛在結(jié)合域如抗原結(jié)合域的數(shù)量。各結(jié)合域特異性結(jié)合一種表位。當(dāng)結(jié)合多肽或CXCL13結(jié)合分子包含一個(gè)以上結(jié)合域時(shí)，對具有兩個(gè)結(jié)合域的抗體來說各結(jié)合域可特異性結(jié)合同一表位時(shí)，稱為“二價(jià)單特異性”，或?qū)哂袃蓚€(gè)結(jié)合域的抗體來說特異性結(jié)合不同表位時(shí)，稱為“二價(jià)雙特異性”?？贵w或其抗原結(jié)合片段也可以是雙特異性，每種特異性為二價(jià)(稱為“雙特異性四價(jià)抗體”)。在另一實(shí)施方式中，可制備四價(jià)小抗體或結(jié)構(gòu)域缺失抗體。雙特異性二價(jià)抗體及其制備方法描述于例如美國專利號5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美國專利申請公開號2003/020734和2002/0155537，其所有公開內(nèi)容通過引用納入本文。雙特異性四價(jià)抗體及其制備方法描述于例如WO02/096948和WO00/44788，其公開內(nèi)容通過引用納入本文。一般參見，PCT公開WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793；Tutt等，J.Immunol.147:60-69(1991)；美國專利號4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；以及Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。如前所述，各種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。本文所用的術(shù)語“VH結(jié)構(gòu)域域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變區(qū)，術(shù)語“CH1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(最靠氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。CH1結(jié)構(gòu)域鄰近VH結(jié)構(gòu)域，并且位于免疫球蛋白重鏈分子絞鏈區(qū)的氨基末端。本文所用的術(shù)語“CH2結(jié)構(gòu)域”包括用常規(guī)編號方案例如從抗體的約殘基244延伸至殘基360的重鏈分子部分(殘基244-360，Kabat編號系統(tǒng)；和殘基231-340，EU編號系統(tǒng)；參見KabatEA等)。CH2結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的，因?yàn)樗c其它結(jié)構(gòu)域不是緊密配對的。相反，兩個(gè)N-連接的分支糖鏈間插在完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。已有充分記載顯示CH3結(jié)構(gòu)域從IgG分子的CH2結(jié)構(gòu)域延伸至C末端，并包含大約108個(gè)殘基。本文所用的術(shù)語“絞鏈區(qū)”包括連接CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈分子部分。該絞鏈區(qū)包括約25個(gè)殘基并具有撓性，因此使兩個(gè)N-末端抗原結(jié)合區(qū)能獨(dú)立移動。絞鏈區(qū)可細(xì)分成三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域：上部、中部和下部絞鏈區(qū)(Roux等，J.Immunol.161:4083(1998))。本文所用的術(shù)語“二硫鍵”包括兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包括可形成二硫鍵或與第二個(gè)巰基橋接的巰基。在大部分天然產(chǎn)生的IgG分子中，CH1和CL區(qū)域通過二硫鍵相連，兩條重鏈通過對應(yīng)于Kabat編號系統(tǒng)239和242位(EU編號系統(tǒng)是226或229位)的兩個(gè)二硫鍵相連。本文所用的術(shù)語“嵌合抗體”指任何抗體，其中免疫反應(yīng)性區(qū)域或位點(diǎn)獲自或衍生自第一物種，而恒定區(qū)(根據(jù)本發(fā)明，可能是完整、一部分或修飾的)獲自第二物種的任何抗體。在某些實(shí)施方式中，靶結(jié)合區(qū)域或位點(diǎn)來自非人來源(如小鼠或靈長動物)而恒定區(qū)是人的(例如，本文所述的單克隆抗體(MAb)1476)。本文所用的術(shù)語“工程抗體”指通過從具有已知特異性的抗體至少部分置換一個(gè)或多個(gè)CDR和必要時(shí)通過部分框架區(qū)置換和序列變化，來改變重鏈或輕鏈或二者中可變區(qū)的抗體。雖然CDR可衍生自與產(chǎn)生框架區(qū)的抗體屬于同一類或甚至亞類的抗體，但設(shè)想CDR衍生自不同類別的抗體，優(yōu)選衍生自不同物種的抗體。將具有已知特異性的非人抗體的一個(gè)或多個(gè)“供體”CDR移植到人重鏈或輕鏈框架區(qū)內(nèi)形成的工程抗體在本文中稱為“人源化抗體”?？赡懿槐囟ㄓ脕碜怨w可變區(qū)的完整CDR代替所有CDR以將一種可變區(qū)的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移至另一可變區(qū)。相反，可能只需要轉(zhuǎn)移維持靶結(jié)合位點(diǎn)活性所必需的那些殘基。在某些實(shí)施方式中，所述人源化抗體包含來自供體可變重結(jié)構(gòu)域的1、2或3個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化抗體包含來自供體可變輕結(jié)構(gòu)域的1、2或3個(gè)CDR。進(jìn)一步認(rèn)識到，人源化抗體的重鏈或輕鏈或二者中可變區(qū)內(nèi)的框架區(qū)可僅包含人來源的殘基，在這種情況下人源化抗體的這些框架區(qū)(例如，MAb5080或5261)稱為“完全人構(gòu)架區(qū)”?；蛘?，如果需要維持與CXCL13抗原的適當(dāng)結(jié)合或提高結(jié)合，可以在人源化抗體的重鏈或輕鏈或二者可變區(qū)中人框架區(qū)的相應(yīng)位置內(nèi)工程改造供體可變區(qū)中框架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)殘基。因此，以此方式工程改造的人框架區(qū)包含人和供體框架區(qū)殘基的混合物，在本文中稱為“部分人框架區(qū)”。例如，抗CXCL13抗體的人源化過程可基本按照Winter和同事所述方法進(jìn)行(Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))，即用嚙齒動物或突變型嚙齒動物CDR或CDR序列取代人抗CXCL13抗體的相應(yīng)序列。也參見美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和5,859,205；通過引用納入本文。所得的人源化抗CXCL13抗體將在人源化抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的完全人框架區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)嚙齒動物或突變型嚙齒動物CDR。在一些情況下，人源化抗CXCL13抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)內(nèi)殘基被相應(yīng)非人(例如，嚙齒動物)殘基代替(參見例如，美國專利號5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370)，在這種情況下所得的人源化抗CXCL13抗體將在重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)內(nèi)包含部分人框架區(qū)。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能(例如，獲得所需親和性)。通常，人源化抗體將包含幾乎所有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)，其中全部或基本上全部的CDR對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR，全部或基本上全部的框架區(qū)是人免疫球蛋白序列的框架區(qū)。人源化抗體還任選包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的細(xì)節(jié)參見Jones等，Nature，331:522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596(1992)，通過引用納入本文。因此，所述“人源化”抗體可包括其中明顯小于完整的人可變區(qū)被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代的抗體。實(shí)踐中，人源化抗體通常是一些或所有CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒動物抗體中相似位點(diǎn)的殘基所取代的人抗體。參見例如，美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和5,859,205。也參見美國專利號6,180,370和國際公開號WO01/27160，其中公開了人源化抗體和用于產(chǎn)生對預(yù)定抗原親和性提高的人源化抗體的技術(shù)。本文所用的術(shù)語“連接”、“融合的”和“融合”可以互換使用。這些術(shù)語指通過包括化學(xué)偶聯(lián)或重組在內(nèi)的方式將兩個(gè)或更多元件或組件連接在在一起?！翱騼?nèi)融合”指以維持原始ORF正確翻譯讀框的方式，將兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸開放閱讀框(ORF)連接形成連續(xù)的較長ORF。因此，重組融合蛋白是包含兩個(gè)或多個(gè)片段的單一蛋白質(zhì)，所述片段對應(yīng)原始ORF編碼的多肽(這些片段在自然條件下通常不如此連接)。盡管閱讀框在融合片段中延續(xù)，但片段仍可被物理或空間分隔，如框內(nèi)接頭序列。例如，編碼免疫球蛋白可變區(qū)CDR的多核苷酸可框內(nèi)融合，但用編碼至少一個(gè)免疫球蛋白框架區(qū)或額外CDR區(qū)的多核苷酸間隔開，只要“融合的”CDR作為連續(xù)多肽的一部分共同翻譯。在多肽的情況下，“線性序列”或“序列”是多肽中從氨基到羧基末端方向上氨基酸的順序，在序列中彼此相鄰的殘基是多肽一級結(jié)構(gòu)中的毗連殘基。本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指基因生成生化物質(zhì)如多肽的過程。該過程包括在細(xì)胞內(nèi)基因功能存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于，基因敲除以及瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。它包括但不限于，基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)和這類mRNA翻譯成多肽。若最終期望產(chǎn)物是生化物質(zhì)，則表達(dá)包括產(chǎn)生該生化物質(zhì)和任何前體。基因表達(dá)產(chǎn)生“基因產(chǎn)物”。本文所用的基因產(chǎn)物可以是核酸，如基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA，或由轉(zhuǎn)錄物翻譯得到的多肽。本文所述的基因產(chǎn)物還包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻譯后修飾的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂質(zhì)、連接其它蛋白質(zhì)亞基、經(jīng)蛋白酶水解切割等。本文所用的術(shù)語“治療”或“處理”都指治療性處理和預(yù)防性或預(yù)防措施，其中目的是防止或減緩（緩解）不期望的生理改變或失調(diào)，例如多發(fā)性硬化、狼瘡、關(guān)節(jié)炎或癌癥的進(jìn)展。有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于可檢測或不可檢測的緩解癥狀、減輕疾病程度、疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)、延遲或減緩疾病進(jìn)展、改善或減輕疾病狀態(tài)和緩解(部分或完全)?！爸委煛币部梢灾概c不接受治療的期望存活相比延長生存期。需要治療的人包括已經(jīng)患有病癥或失調(diào)的人，以及傾向于患有病癥或失調(diào)的人或需預(yù)防病癥或失調(diào)的人?！皩ο蟆被颉皞€(gè)體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”指需要診斷、預(yù)防或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人、家養(yǎng)動物、家畜和動物園動物、運(yùn)動型動物或?qū)櫸?，如犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、奶牛等等。本文所用的術(shù)語“給予抗CXCL13抗體時(shí)能夠獲益的對象”和“需要治療的動物”包括能夠從給予抗CXCL13抗體和/或從抗CXCL13抗體治療，即減輕或預(yù)防疾病的治療中獲益的對象，如哺乳動物對象，該抗體可用于(例如)檢測抗CXCL13多肽(如用于診斷方法)。如本文更詳細(xì)所述，抗-CXCL13抗體可以非偶聯(lián)形式使用，或者可偶聯(lián)于(例如)藥物、前藥或同位素。II.靶標(biāo)多肽描述本文所用的術(shù)語“CXCL13”和“CXCL13多肽”可互換使用。在某些實(shí)施方式中，CXCL13可包括全長CXCL13或其片段，或者CXCL13變體多肽，其中CXCL13的片段或CXCL13變體多肽保持全長CXCL13的一些或全部功能特性。描述了所述人CXCL13多肽和多核苷酸序列(分別為SEQIDNO:19和20)，參見例如Legler等，J.Exp.Med.187(4):655-660(1998)。描述了所述小鼠CXCL13多肽和多核苷酸序列(分別為SEQIDNO:21和22)，參見例如Gunn等，Nature391(6669):799-803(1998)。另外，描述了所述短尾猴CXCL13多肽序列，如SEQIDNO:23所示。III.抗CXCL13抗體本領(lǐng)域公開了結(jié)合CXCL13的市售抗體，如大鼠抗小鼠MAb470(R&D系統(tǒng)公司（R&DSystems）)和小鼠抗人MAb801(R&D系統(tǒng)公司)。另外，鼠抗CXCL13抗體公開于美國專利申請公開號20080227704A1。本發(fā)明抗體包含結(jié)合于CXCL13的抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，如MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9。在某些實(shí)施方式中，抗CXCL13抗體結(jié)合人、靈長動物、鼠或者人和鼠的CXCL13。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13抗體是人源化的。在其它實(shí)施方式中，抗CXCL13抗體阻斷CXCL13結(jié)合其受體如CXCR5。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13抗體是MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2、3C9或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體和衍生物，所述分子特異性結(jié)合與參照抗體相同的CXCL13表位，如MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段，所述分子特異性結(jié)合CXCL13并且競爭抑制參照抗體（如MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9）與CXCL13（如人、靈長動物、鼠、或者人和鼠的CXCL13）的特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明結(jié)合分子的氨基酸序列與參照抗CXCL13抗體分子的氨基酸序列有至少約80%、約85%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%或約95%序列相同性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合分子與參照抗體共有至少約96%、約97%、約98%、約99%或100%序列相同性。在某些實(shí)施方式中，所述參照抗體是MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與SEQIDNO：3或13的CDR1、CDR2或CDR3至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與SEQIDNO：4、5或6至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO：3或13至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有除了1、2、3、4或5個(gè)保守氨基酸取代外，與SEQIDNO：3或13的CDR1、CDR2或CDR3相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有除了1、2、3、4或5個(gè)保守氨基酸取代外，與SEQIDNO：4、5或6相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含VH結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成，該VH結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO:3或13至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VH結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與SEQIDNO：8、15或17的CDR1、CDR2或CDR3至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與SEQIDNO：9、16、10或11至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO：8、15或17至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有除了1、2、3、4或5個(gè)保守氨基酸取代外，與SEQIDNO：8、15或17的CDR1、CDR2或CDR3相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有除了1、2、3、4或5個(gè)保守氨基酸取代外，與SEQIDNO：9、16、10或11相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含VL結(jié)構(gòu)域、基本由其組成或由其組成，該VL結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO:8、15或17至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VL結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。本發(fā)明抗CXCL13抗體的合適生物活性變體可用于本發(fā)明方法。這種變體將保持母體抗CXCL13抗體的所需結(jié)合性質(zhì)。制備抗體變體的方法一般在本領(lǐng)域可獲得。誘變和改變核苷酸序列的方法為本領(lǐng)域熟知。參見例如，Walker和Gaastra編(1983)TechniquesinMolecularBiology(《分子生物學(xué)技術(shù)》)(紐約麥克米蘭出版公司(MacMillanPublishingCompany))；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985)；Kunkel等，MethodsEnzymol.154:367-382(1987)；Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》)(紐約州冷泉港(ColdSpringHarbor，N.Y.))；美國專利號4,873,192；和其中引用的參考文獻(xiàn)；通過引用全文納入本文。有關(guān)不影響感興趣多肽生物學(xué)活性的合適氨基酸取代的指南可參見下述文獻(xiàn)中的模型：Dayhoff等(1978)，AtlasofProteinSequenceandStructure(《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖冊》)(華盛頓特區(qū)的國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))，第345-352頁，通過引用全文納入本文。Dayhoff等的模型利用單點(diǎn)可接受突變(PointAcceptedMutation，PAM)氨基酸相似矩陣(PAM250矩陣)來確定合適的保守性氨基酸取代。可能優(yōu)選保守取代，如用具有相似特性的另一氨基酸交換某種氨基酸。Dayhoff等的模型中PAM250矩陣教導(dǎo)的保守氨基酸取代示例包括但不限于：和構(gòu)建所述抗CXCL13結(jié)合分子的變體如抗體或其抗原結(jié)合片段、感興趣多肽時(shí)，生成修飾，從而變體持續(xù)擁有所需屬性，如能特異性結(jié)合CXCL13，如人、靈長動物、鼠、或者人和鼠的CXCL13。顯然，編碼變體多肽的DNA中產(chǎn)生的任何突變一定不能將序列置于閱讀框外，優(yōu)選不產(chǎn)生可生成二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見例如EP專利號EP0075444B1。測定抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合特異性的方法包括但不限于：標(biāo)準(zhǔn)競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)、T細(xì)胞或B細(xì)胞的免疫球蛋白分泌的監(jiān)測試驗(yàn)、T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)等。參見例如，WO93/14125；Shi等，Immunity13:633-642(2000)；Kumanogoh等，JImmunol169:1175-1181(2002)；Watanabe等，JImmunol167:4321-4328(2001)；Wang等，Blood97:3498-3504(2001)；和Giraudon等，JImmunol172(2):1246-1255(2004)公開的實(shí)驗(yàn)，其都通過引用納入本文。本文在討論本文公開的任何具體多肽（包括恒定區(qū)、CDR、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域）是否與另一多肽至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者甚至約100%相同時(shí)，相同性%可采用本領(lǐng)域已知的方法和計(jì)算機(jī)程序/軟件測定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析軟件包，用于Unix系統(tǒng)的第8版，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)團(tuán)隊(duì)(GeneticsComputerGroup)，威斯康星州麥迪遜科學(xué)大道575大學(xué)研究園(UniversityResearchPark)，53711)。BESTFIT利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489的局部同源性算法，找到兩條序列之間的最佳同源性區(qū)段。使用BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定某具體序列是否與本發(fā)明所述參照序列(例如)95%相同時(shí)，當(dāng)然要設(shè)定參數(shù)從而在參照多肽序列的全長上計(jì)算相同性百分?jǐn)?shù)，并且在參照序列的氨基酸總數(shù)中允許多至5%的同源性缺口。出于本發(fā)明目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法測定序列相同性百分?jǐn)?shù)，該算法使用仿射缺口搜索，其中缺口開放罰12分，缺口延伸罰2分，BLOSUM矩陣計(jì)62分。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489中公開了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。變體與參照抗CXCL13抗體(如MAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9)可以差異例如，少至1-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2、或者甚至1個(gè)氨基酸殘基。能夠特異性結(jié)合CXCL13并保留所需CXCL13阻斷活性的多肽的準(zhǔn)確化學(xué)結(jié)構(gòu)取決于多種因素。由于分子中存在可離子化的氨基和羧基，可獲得酸鹽或堿鹽或中性形式的特定多肽。置于合適環(huán)境條件時(shí)保持生物學(xué)活性的所有這類制品均落入本文所用的抗CXCL13抗體的定義范圍內(nèi)。另外，可利用糖部分(糖基化)或其它補(bǔ)充分子如脂質(zhì)、磷酸酯(鹽)、乙?；韧ㄟ^衍生化來擴(kuò)充所述多肽的一級氨基酸序列。也可通過與糖偶聯(lián)進(jìn)行擴(kuò)充。這種擴(kuò)充的某些方面通過生產(chǎn)宿主的翻譯后加工系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)；其它這類修飾可在體外引入。在任何情況下，這類修飾均包括在本文所用抗CXCL13抗體的定義范圍內(nèi)，只要抗CXCL13抗體的所需特性不被破壞。在不同實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)這類修飾可通過提高或降低多肽活性來定量或定性地影響活性。而且，可通過氧化、還原或其它衍生化方法修飾鏈內(nèi)單獨(dú)氨基酸殘基，可切割所述多肽以獲得保留活性的片段。不破壞所需特性(如對CXCL13的結(jié)合特異性、結(jié)合親和性和/或CXCL13阻斷活性)的這類改變不會使該多肽序列從本文所用的感興趣抗CXCL13抗體定義中去除。本領(lǐng)域提供有關(guān)制備和使用多肽變體的大量指南。在制備抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定對天然蛋白質(zhì)核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將產(chǎn)生適用作本發(fā)明方法所用藥物組合物的治療活性組分的變體?？梢远喾N方式使抗CXCL13抗體的恒定區(qū)突變從而改變效應(yīng)物功能。例如，參見美國專利號6,737,056B1和美國專利申請公開號2004/0132101A1，其公開了優(yōu)化抗體與Fc受體結(jié)合的Fc突變。在某些抗CXCL13抗體中，可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)突變Fc部分以降低效應(yīng)物功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點(diǎn)突變或其它方式)可降低循環(huán)修飾抗體與Fc受體的結(jié)合，從而提高腫瘤定位。在其它情況下，與本發(fā)明相一致的恒定區(qū)修飾可能降低互補(bǔ)物結(jié)合，從而縮短所偶聯(lián)細(xì)胞毒素的血清半衰期和非特異性結(jié)合?？衫煤愣▍^(qū)的其它修飾來改變二硫鍵連接或寡糖部分，能因抗原特異性或抗體靈活性提高而加強(qiáng)定位。無需過多實(shí)驗(yàn)，即可容易地利用熟知的免疫學(xué)技術(shù)測定或定量分析修飾所得的生理學(xué)概況、生物利用度和其它生化作用，如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期。本發(fā)明抗CXCL13抗體也包括修飾的衍生物，例如通過將任何類型的分子共價(jià)連接到抗體上，從而該共價(jià)連接不會防止抗體特異性結(jié)合其關(guān)聯(lián)表位。例如但不限于，抗體衍生物包括通過，例如糖基化、乙?；EG化、磷酸化、酰胺化、由已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生、蛋白水解切割、連接細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)等方法修飾的抗體。通過已知技術(shù)可進(jìn)行多種化學(xué)修飾，包括但不限于：特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?。此外，衍生物可包含一種或多種非經(jīng)典氨基酸。“保守性氨基酸取代”是氨基酸殘基被具有帶相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。本領(lǐng)域已定義具有帶相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括：具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?；蛘?，也可沿所有或一部分編碼序列隨機(jī)引入突變例如通過飽和誘變，可篩選所得突變體的生物學(xué)活性，以鑒定保持活性(例如，對CXCL13的結(jié)合特異性、結(jié)合親和性和/或CXCL13阻斷活性)的突變體。例如，可能僅在抗體分子的框架區(qū)內(nèi)或僅在CDR區(qū)內(nèi)引入突變。引入的突變可能是沉默或中性錯義突變，即對抗體的抗原結(jié)合能力沒有影響或影響很小?？墒褂眠@些突變類型來優(yōu)化密碼子使用，或提高雜交瘤的抗體生成。或者，非中性錯義突變可改變抗體的抗原結(jié)合能力。大部分沉默和中性錯義突變的位置可能位于框架區(qū)內(nèi)，而大部分非中性錯義突變的位置可能在CDR內(nèi)，但這不是必然的要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)和檢測具有所需特性，例如抗原結(jié)合活性無改變或結(jié)合活性有改變(如抗原結(jié)合活性提高或抗體特異性改變)的突變分子。誘變后，可通過常規(guī)方式表達(dá)編碼蛋白，并可利用本文所述技術(shù)或本領(lǐng)域已知的常規(guī)修飾技術(shù)測定該編碼蛋白的功能和/或生物學(xué)活性(例如，免疫特異性結(jié)合CXCL13多肽的至少一個(gè)表位的能力)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明抗CXCL13抗體包含至少一個(gè)優(yōu)化的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?！皟?yōu)化CDR”指該CDR已被修飾，并且根據(jù)對包含該優(yōu)化CDR的抗CXCL13抗體賦予維持或提高的結(jié)合親和性和/或抗CXCL13活性來選擇優(yōu)化序列?！翱笴XCL13活性”或“CXCL13阻斷活性”可包括調(diào)節(jié)下列一種或多種CXCL13相關(guān)活性的活性：阻斷CXCL13與其受體的相互作用，造成干擾B細(xì)胞和濾泡型B輔助T細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織和生發(fā)中心形成(如在自身免疫疾病情況中);和抑制癌細(xì)胞增殖和在腫瘤疾病中擴(kuò)散的能力;或任何其他與CXCL13表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的活性。抗CXCL13活性也能歸因于CXCL13表達(dá)相關(guān)疾病的發(fā)生率或嚴(yán)重性下降，包括但不限于某些類型自身免疫疾病(如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、慢性胃炎、胃淋巴瘤、移植排斥、干燥綜合征(SS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、丙型肝炎病毒感染中的活性混合冷球蛋白血癥(MC)血管炎、幼年型皮肌炎和重癥肌無力)和某些癌癥(如伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、MALT淋巴瘤(如胃MALT淋巴瘤)、癌(如結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃、食道和胰腺)、和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL))以及其他炎性疾病如螺桿菌（Helicobacter）感染誘導(dǎo)的炎性疾病如胃炎、潰瘍和胃粘膜損傷。IV.編碼抗CXCL13抗體的多核苷酸本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與選自SEQIDNO：2或12的CDR1、CDR2或CDR3的多核苷酸序列至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR選自下組：(a)包含SEQIDNO：4所示氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQIDNO：5所示氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQIDNO：6所示氨基酸序列的CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，其包含VH結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，所述VH結(jié)構(gòu)域具有與包含SEQIDNO：3或SEQIDNO：13的參照VH結(jié)構(gòu)域多肽序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VH結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，其包含VH結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述多核苷酸序列具有與包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：12的序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VH結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR具有與SEQIDNO：8、SEQIDNO：15或SEQIDNO：17的CDR1、CDR2或CDR3多核苷酸序列至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)CDR選自下組：(a)包含SEQIDNO：9或16所示氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQIDNO：10所示氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQIDNO：11所示氨基酸序列的CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，其包含VL結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述VL結(jié)構(gòu)域具有與包含SEQIDNO：8、15或17的參照VL結(jié)構(gòu)域多肽序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VL結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，其包含VL結(jié)構(gòu)域的編碼核酸、基本由其組成或由其組成，其中所述多核苷酸序列具有與包含SEQIDNO：7、SEQIDNO：14或SEQIDNO:18的序列至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%相同的氨基酸序列，其中包含所編碼VL結(jié)構(gòu)域的抗CXCL13抗體特異性或優(yōu)選結(jié)合CXCL13。上述任何多核苷酸還可包含額外核酸，所述核酸編碼例如信號肽以指導(dǎo)編碼多肽、本文所述抗體恒定區(qū)或本文所述其它異源多肽的分泌。另外，如本文他處所詳述，本發(fā)明包括含一種或多種上述多核苷酸的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含第一多核苷酸和第二多核苷酸的組合物，其中所述第一多核苷酸編碼本文所述的VH結(jié)構(gòu)域，其中所述第二多核苷酸編碼本文所述的VL結(jié)構(gòu)域。具體地，組合物包含編碼VH結(jié)構(gòu)域的多核苷酸和編碼VL結(jié)構(gòu)域的多核苷酸、基本由其組成或由其組成，其中編碼VH結(jié)構(gòu)域的多核苷酸如SEQIDNO：2或12所示，編碼VL結(jié)構(gòu)域的多核苷酸如SEQIDNO：7、14或18所示。如本文另述，本發(fā)明還包括本發(fā)明多核苷酸的片段。此外，本發(fā)明還考慮編碼本文所述融合多肽、Fab片段和其它衍生物的多核苷酸。所述多核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生或生產(chǎn)。例如，如果抗體的核苷酸序列已知，則可由化學(xué)合成的寡核苷酸組裝編碼該抗體的多核苷酸(如Kutmeier等，BioTechniques17:242(1994)所述)，簡言之，該方法包括合成含有編碼該抗體的序列部分的重疊寡核苷酸，使這些寡核苷酸退火和連接，然后通過PCR擴(kuò)增連接的寡核苷酸。或者，編碼本發(fā)明抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸可由合適來源的核酸產(chǎn)生。如果無法獲得含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但該抗體分子的序列已知，則可通過化學(xué)合成或利用可與該序列3'和5'端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、或利用具體基因序列的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行克隆以鑒定cDNA文庫中編碼該抗體或其它抗CXCL13抗體的cDNA克隆，由合適來源(如抗體cDNA文庫，或由表達(dá)該抗體或其它抗CXCL13抗體的任何組織或細(xì)胞如選擇表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA文庫，或從中分離的核酸，優(yōu)選聚A+RNA)獲得編碼該抗體的核酸。然后，可利用本領(lǐng)域熟知的任何方法將PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆到可復(fù)制克隆載體中。一旦確定抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的核苷酸序列和相應(yīng)氨基酸序列，就可利用本領(lǐng)域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等操作其核苷酸序列。(參見例如，Sambrook等(1990)MolecularCloning，ALaboratoryManual(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》)(第2版；紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室公司(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.))和Ausubel等編(1998)CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(紐約州的約翰韋利森公司(JohnWiley&Sons，NY))所述技術(shù)，其通過引用全文納入本文)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體例如用于產(chǎn)生氨基酸取代、缺失和/或插入。編碼抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。例如，編碼抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸可由以下構(gòu)成：單鏈和雙鏈DNA、作為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA以及作為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的RNA、雜交分子，所述雜交分子包含可以是單鏈或更常見是雙鏈、或是單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA和RNA。此外，編碼抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸可由包含RNA或DNA、或者RNA和DNA的三鏈區(qū)域構(gòu)成。編碼抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸也可含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基，或者就穩(wěn)定性或其它原因修飾的DNA或RNA主鏈。“修飾的”堿基包括，例如三苯甲基堿基和非常見堿基如肌苷。可對DNA和RNA進(jìn)行多種修飾；因此“多核苷酸”涵蓋化學(xué)、酶或代謝修飾形式。編碼衍生自免疫球蛋白(如免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)的非天然多肽變體的分離多核苷酸可通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列來產(chǎn)生，從而將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入編碼蛋白。突變可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選在一個(gè)或多個(gè)非必需氨基酸殘基處完成保守性氨基酸取代。V．融合蛋白和抗體偶聯(lián)物如本文他處詳述，抗CXCL13結(jié)合分子如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物還可與異源多肽的N-或C-末端重組融合，或與多肽或其它組合物化學(xué)偶聯(lián)(包括共價(jià)和非共價(jià)偶聯(lián))。例如，抗CXCL13抗體可與用作檢測實(shí)驗(yàn)標(biāo)簽和效應(yīng)分子如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素的分子重組融合或偶聯(lián)。參見例如，PCT公開WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國專利號5,314,995；和EP396,387。本發(fā)明的抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可包括修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子與抗體共價(jià)連接，從而該共價(jià)連接不防止抗體結(jié)合抗CXCL13。例如但不限于，抗體衍生物包括通過，例如糖基化、乙?；?、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生、蛋白水解切割、連接于細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)等方法修飾的抗體。通過已知技術(shù)可進(jìn)行任意多種化學(xué)修飾，包括但不限于：特異性化學(xué)切割、乙?；?、甲酰化等。此外，衍生物可包含一種或多種非經(jīng)典氨基酸?？笴XCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可由通過肽鍵或經(jīng)修飾肽鍵即肽等構(gòu)物而彼此結(jié)合的氨基酸組成，并可包含20種基因編碼氨基酸以外的氨基酸。例如，可通過天然方法如翻譯后加工，或通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾抗CXCL13抗體。這些修飾在基礎(chǔ)教材和更具體的專著以及大量研究文獻(xiàn)中已有深入描述。可以在抗CXCL13結(jié)合分子的任何位置進(jìn)行修飾，包括在肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端、或者在某部分如糖上進(jìn)行修飾。應(yīng)當(dāng)了解相同類型的修飾可以在給定抗CXCL13結(jié)合分子的多個(gè)位置以相同或不同程度出現(xiàn)。并且，給定的抗CXCL13結(jié)合分子可包含許多類型的修飾?？笴XCL13結(jié)合分子可以是分支的，例如因泛素化造成，它們可以為有或沒有分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支、和分支環(huán)狀的抗CXCL13結(jié)合分子可以由翻譯后的天然過程產(chǎn)生也可通過合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、共價(jià)結(jié)合黃素、共價(jià)結(jié)合血紅素部分、共價(jià)結(jié)合核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)結(jié)合脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價(jià)結(jié)合磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸加入蛋白質(zhì)如精氨?；?、以及泛素化。(參見例如，Proteins--StructureandMolecularProperties(《蛋白質(zhì)—結(jié)構(gòu)和分子特性》)，T.E.Creighton，紐約的W.H.弗里曼公司(W.H.FreemanandCompany)；第2版(1993)；Johnson編(1983)PosttranslationalCovalentModificationofProteins(《蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾》)(紐約學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress))，第1-12頁；Seifter等，Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等，Ann.NYAcad.Sci.663:48-62(1992))。本發(fā)明也提供包含抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，以及異源多肽的融合蛋白。與抗體融合的異源多肽可用于某種功能或用于靶向表達(dá)抗CXCL13多肽的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白包含某一多肽、基本由其組成或由其組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任何一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、本發(fā)明抗體或其片段或變體的任何一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、以及異源多肽序列。在另一實(shí)施方式中，用于本文所述診斷和治療方法的融合蛋白包含某一多肽、基本由其組成或由其組成，所述多肽具有抗CXCL13抗體、或其片段、變體或衍生物的VH結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)CDR的氨基酸序列，和/或抗CXCL13抗體、或其片段、變體或衍生物的VL結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)CDR的氨基酸序列，以及異源多肽序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白包含某一多肽，所述多肽具有本發(fā)明抗CXCL13抗體的至少一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和本發(fā)明抗CXCL13抗體或其片段、衍生物或變體的至少一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，以及異源多肽序列。優(yōu)選地，所述融合蛋白的VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于特異性結(jié)合CXCL13中至少一個(gè)表位的單一來源抗體(或scFv或Fab片段)。在又一實(shí)施方式中，用于本文所述診斷和治療方法的融合蛋白包含某一多肽，所述多肽具有抗CXCL13抗體的VH結(jié)構(gòu)域的任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)CDR的氨基酸序列和抗CXCL13抗體或其片段或變體的VL結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)CDR的氨基酸序列，以及異源多肽序列。優(yōu)選地，VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)CDR對應(yīng)于本發(fā)明單一來源抗體(或scFv或Fab片段)。本發(fā)明也涵蓋編碼這些融合蛋白的核酸分子。文獻(xiàn)中報(bào)道的示范性融合蛋白包括以下的融合：T細(xì)胞受體(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936-2940(1987))；CD4(Capon等，Nature337:525-531(1989)；Traunecker等，Nature339:68-70(1989)；Zettmeissl等，DNACellBiol.USA9:347-353(1990)；和Byrn等，Nature344:667-670(1990))；L-選擇素(歸巢受體)(Watson等，J.Cell.Biol.110:2221-2229(1990)；和Watson等，Nature349:164-167(1991))；CD44(Aruffo等，Cell61:1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.173:721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174:561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等，Cell66:1133-1144(1991))；TNF受體(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27:2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.174:1483-1489(1991))；和IgE受體a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.卷115，摘要號1448(1991))。如本文它處所述，抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可與異源多肽融合，以提高所述多肽的體內(nèi)半衰期或在使用本領(lǐng)域已知方法的免疫實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可將PEG偶聯(lián)于本發(fā)明抗CXCL13抗體，以提高其體內(nèi)半衰期。參見Leong等，Cytokine16:106(2001)；Adv.inDrugDeliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions30:512(2002)。此外，抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可融合標(biāo)記物序列如肽，以利于其純化或檢測。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如pQE載體(凱杰公司(QIAGEN,Inc.)，加利福尼亞州查茨沃斯(Chatsworth)伊頓大街9259號，91311)提供的標(biāo)簽等，其中許多標(biāo)記可市售獲得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824所述，六組氨酸提供了方便的融合蛋白純化方法。用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但不限于：對應(yīng)于流感血凝素蛋白衍生表位的“HA”標(biāo)簽(Wilson等，Cell37:767(1984))，以及“flag”標(biāo)簽。可采用本領(lǐng)域熟知方法制備融合蛋白(參見例如，美國專利號5,116,964和5,225,538)?？蓱{經(jīng)驗(yàn)選擇進(jìn)行融合的準(zhǔn)確位點(diǎn)，以優(yōu)化融合蛋白的分泌或結(jié)合特性。然后，將編碼融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中以用于表達(dá)?？笴XCL13結(jié)合分子如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，可以非偶聯(lián)形式使用，或者可偶聯(lián)于各種分子中的至少一種，例如，以改善該分子的治療特性、促進(jìn)靶標(biāo)檢測、或用于患者成像或治療?？梢栽诩兓盎蚣兓?，或者在進(jìn)行純化時(shí)標(biāo)記或偶聯(lián)抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。具體地，本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可偶聯(lián)于治療劑、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物反應(yīng)修飾劑、藥物試劑或PEG。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)所選的待偶聯(lián)物質(zhì)還可采用各種技術(shù)組裝偶聯(lián)物。例如，可通過使結(jié)合多肽與生物素的活化酯如生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，制備有生物素的偶聯(lián)物。相似地，可以在偶聯(lián)劑如本文所列偶聯(lián)劑存在下或通過與異硫氰酸酯優(yōu)選熒光素-異硫氰酸酯反應(yīng)來制備有熒光標(biāo)記的偶聯(lián)物。以類似方式制備本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括偶聯(lián)于診斷劑或治療劑的抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物?？蓪⒈景l(fā)明抗CXCL13抗體(包括其抗原結(jié)合片段、變體和衍生物)用于診斷目的，例如，作為臨床測試步驟的一部分監(jiān)測疾病的發(fā)展或進(jìn)展，從而(例如)確定給定治療和/或預(yù)防方案的功效。例如，將抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物偶聯(lián)于可檢測物質(zhì)能促進(jìn)檢測?？蓹z測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用各種正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)的正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子。參見例如，美國專利號4,741,900中的金屬離子，可根據(jù)本發(fā)明將其與抗體偶聯(lián)用于診斷。合適酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙?；憠A酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的例子包括：傘形花內(nèi)酯、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括：螢光素酶、螢光素和發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、111In、90Y或99Tc?？笴XCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可偶聯(lián)治療部分，如細(xì)胞毒素、治療劑或放射性金屬離子。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對細(xì)胞有害的任何物質(zhì)?？笴XCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物還可通過偶聯(lián)于化學(xué)發(fā)光化合物進(jìn)行可檢測標(biāo)記。然后，通過檢測化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的發(fā)光存在，確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗CXCL13結(jié)合分子的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾、異魯米諾、熱性(theromatic)吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。對抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物進(jìn)行可檢測標(biāo)記的一種方式是將其連接于酶，并在酶促免疫實(shí)驗(yàn)(EIA)中使用連接產(chǎn)物(Voller,A.,TheEnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)(“酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)”)，微生物協(xié)會季刊(MicrobiologicalAssociatesQuarterlyPublication)，馬里蘭州沃克斯維爾(Walkersville，Md.)；DiagnosticHorizons2:1-7(1978)；Voller等，J.Clin.Pathol.31:507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73:482-523(1981)；Maggio編(1980)EnzymeImmunoassay(《酶促免疫實(shí)驗(yàn)》)，佛羅里達(dá)州伯克萊屯的CRC出版社(CRCPress,BocaRaton,Fla.)；Ishikawa等編(1981)EnzymeImmunoassay(《酶促免疫實(shí)驗(yàn)》)(KgakuShoin，東京)。結(jié)合于抗CXCL13抗體的酶會與合適底物例如發(fā)色底物反應(yīng)，其反應(yīng)方式產(chǎn)生可通過(例如)分光光度法、熒光測定法或目測法檢測的化學(xué)部分。能用于可檢測標(biāo)記抗體的酶包括但不限于：蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。此外，可通過利用酶發(fā)色底物的比色法完成檢測。也可通過目測比較底物與類似制備標(biāo)準(zhǔn)品的酶反應(yīng)程度完成檢測。也可利用各種其它免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。例如，通過放射性標(biāo)記抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，可以使用放射性免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)檢測結(jié)合分子(參見例如，Weintraub(1986年3月)PrinciplesofRadioimmunoassays(《放射性免疫實(shí)驗(yàn)原理》)，第七屆放射性配體實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)課程(SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques)(內(nèi)分泌協(xié)會(TheEndocrineSociety))，通過引用納入本文)。放射性同位素可通過包括但不限于以下的方式檢測：γ計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影。也可利用熒光發(fā)射金屬如152Eu或其它鑭系元素對抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物進(jìn)行可檢測標(biāo)記?？捎弥T如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團(tuán)將這些金屬連接于結(jié)合分子。將不同部分偶聯(lián)于抗體如抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的技術(shù)是眾所周知的，參見例如，Amon等(1985)MonoclonalAntibodiesforImmunotargetingofDrugsinCancerTherapy(“癌癥治療中用于免疫靶向藥物的單克隆抗體”)，收錄于MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(《單克隆抗體和癌癥治療》)，Reisfeld等編(ARL公司(AlanR.Liss，Inc.))，第243-56頁；Hellstrom等(1987)AntibodiesforDrugDelivery(“用于藥物遞送的抗體”)，收錄于ControlledDrugDelivery(《控制藥物遞送》)，Robinson等編(第2版；馬塞爾德克爾公司(MarcelDekker，Inc.))，第623-53頁)；Thorpe(1985)AntibodyCarriersofCytotoxicAgentsinCancerTherapy:AReview(“癌癥治療中細(xì)胞毒性劑的抗體運(yùn)載體：綜述”)，收錄于MonoclonalAntibodies'84:BiologicalandClinicalApplications(《單克隆抗體'84：生物學(xué)和臨床應(yīng)用》)，Pinchera等編，第475-506頁；Analysis,Results,andFutureProspectiveoftheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyinCancerTherapy(“在癌癥治療中治療性應(yīng)用放射性標(biāo)記抗體的分析、結(jié)果和展望”)，收錄于MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy(《用于檢測和治療癌癥的單克隆抗體》)，Baldwin等編，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，第303-16頁(1985)；和Thorpe等，Immunol.Rev.62:119-58(1982)。VI.抗體多肽的表達(dá)編碼抗體的輕鏈和重鏈的DNA序列可根據(jù)熟知方法利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時(shí)或單獨(dú)制備?？筛鶕?jù)公開的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列，用共有恒定區(qū)引物或更具特異性的引物啟動PCR。如上所述，也可利用PCR分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況下，可通過共有引物或較大的同源探針，如小鼠恒定區(qū)探針篩選文庫。DNA通常是質(zhì)粒DNA，可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)從細(xì)胞中分離，按照例如涉及重組DNA技術(shù)的上面文獻(xiàn)中詳述的標(biāo)準(zhǔn)熟知技術(shù)進(jìn)行限制性作圖和測序。當(dāng)然，可以在分離過程或后續(xù)分析期間的任何時(shí)間點(diǎn)按照本發(fā)明合成DNA。操作分離的遺傳物質(zhì)以提供本發(fā)明抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物后，通常將編碼該抗CXCL13抗體的多核苷酸插入表達(dá)載體，以便引入可用于產(chǎn)生所需量抗CXCL13抗體的宿主細(xì)胞中。重組表達(dá)抗體或其片段、衍生物或類似物，例如結(jié)合本文所述靶分子如CXCL13的抗體重鏈或輕鏈，需要構(gòu)建含有一個(gè)或多個(gè)編碼該抗體多核苷酸的表達(dá)載體。一旦獲得編碼本發(fā)明抗體分子、或抗體的重鏈或輕鏈、或其一部分(優(yōu)選含有重鏈或輕鏈可變區(qū))的多核苷酸，可使用本領(lǐng)域熟知方法通過重組DNA技術(shù)生成產(chǎn)生抗體分子的載體。因此，本文描述了通過表達(dá)含抗體編碼核苷序列的多核苷酸來制備蛋白質(zhì)的方法。可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。因此，本發(fā)明提供可復(fù)制載體，其包含操作性連接啟動子的編碼本發(fā)明抗體分子、或其重鏈或輕鏈、其重鏈或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。這種載體可包括，編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列(參見例如，PCT公開WO86/05807；PCT公開WO89/01036；和美國專利號5,122,464)，可將抗體可變區(qū)克隆到這類載體中以便表達(dá)完整的重鏈或輕鏈。本文所用的術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”指根據(jù)本發(fā)明用作運(yùn)載體以在宿主細(xì)胞中引入和表達(dá)所需基因的載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這種載體可容易地選自質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，與本發(fā)明相容的載體包含選擇標(biāo)記物、有利于克隆所需基因的合適限制性位點(diǎn)和進(jìn)入真核或原核細(xì)胞和/或在其中復(fù)制的能力。出于本發(fā)明目的，可采用多種表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，一類載體利用衍生自動物病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它包括使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順反子系統(tǒng)。此外，通過引入能夠選擇已轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)記物，可選擇將DNA整合入染色體中的細(xì)胞。該標(biāo)記物可向營養(yǎng)缺陷型宿主提供原營養(yǎng)，以及殺生體抗性(如抗生素)或?qū)χ亟饘偃玢~的抗性。選擇標(biāo)記基因可直接連接于待表達(dá)的DNA序列，或者通過共同轉(zhuǎn)化引入同一細(xì)胞內(nèi)。mRNA的優(yōu)化合成也可能需要其它元件。這些元件可包括信號序列、剪接信號以及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子和終止信號。在某些實(shí)施方式中，將克隆的可變區(qū)基因以及如上所述合成的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(例如人)插入表達(dá)載體內(nèi)。當(dāng)然，能夠在真核細(xì)胞中引發(fā)表達(dá)的任何表達(dá)載體均可用于本發(fā)明。合適載體的例子包括但不限于：質(zhì)粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可獲自加州圣地亞哥的英杰公司(Invitrogen,SanDiego,Calif.))和質(zhì)粒pCI(可獲自威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(Promega,Madison,Wis.))。通常，篩選大量轉(zhuǎn)化細(xì)胞以選出表達(dá)適當(dāng)高水平免疫球蛋白重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是可通過(例如)機(jī)器人系統(tǒng)進(jìn)行的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。更一般地，一旦制備得到編碼抗CXCL13抗體單體亞基的載體或DNA序列，可將表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞內(nèi)。這些技術(shù)包括但不限于：轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、細(xì)胞與包膜DNA融合、顯微注射和用完整病毒感染。參見Ridgway(1988)MammalianExpressionVectors(“哺乳動物表達(dá)載體”)，收錄于Vectors(《載體》)，Rodriguez和Denhardt編(馬薩諸塞州波士頓的巴特沃思公司(Butterworths，Boston，Mass.))，第24.2章，第470-472頁。通常，通過電穿孔將質(zhì)粒引入宿主。在適合產(chǎn)生輕鏈和重鏈的條件下培養(yǎng)攜帶表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞，并測定重鏈和/或輕鏈蛋白的合成。示范性實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)或熒光活化的細(xì)胞分選分析(FACS)、免疫組化等。通過常規(guī)技術(shù)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生用于本文所述方法的抗體。因此，本發(fā)明包括含有操作性連接異源啟動子的本發(fā)明抗體或其重鏈或輕鏈的編碼多核苷酸的宿主細(xì)胞。在表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實(shí)施方式中，可以在宿主細(xì)胞中共同表達(dá)編碼重鏈和輕鏈的載體以表達(dá)整個(gè)免疫球蛋白分子，如下詳述。本文所用的“宿主細(xì)胞”指攜帶用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一種異源基因的載體的細(xì)胞。在描述從重組宿主中分離抗體的方法時(shí)，除非另有明確說明，術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用來指示抗體來源。換言之，從“細(xì)胞”回收多肽可以指從瞬時(shí)離心的全細(xì)胞或含有培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物回收?？衫酶鞣N宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)用于本文所述方法的抗體分子。這類宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表可產(chǎn)生并隨后純化感興趣編碼序列的載體，但也代表用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。它們包括但不限于微生物，例如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(如畢赤酵母(SaccharomycesPichia))；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS、CHO、BLK、293和3T3細(xì)胞)，其攜帶含有衍生自哺乳動物細(xì)胞基因組啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒啟動子(如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建物。在某些實(shí)施方式中，利用細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(Escherichiacoli)，并且在其他實(shí)施方式中用真核細(xì)胞(特別是表達(dá)完整重組抗體分子時(shí))表達(dá)重組抗體分子。例如，哺乳動物細(xì)胞如中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與某載體如來自人巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件聯(lián)用，是抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，Gene45:101(1986)；和Cockett等，Bio/Technology8:2(1990))。用于表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞系常常是哺乳動物來源的；本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠優(yōu)先確定最適合所需基因產(chǎn)物在其中表達(dá)的具體宿主細(xì)胞系。示范性宿主細(xì)胞系包括但不限于：CHO(中華倉鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中華倉鼠卵巢細(xì)胞系、DHFR-)、HELA(人宮頸癌)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼倉鼠腎)、MDCK、293、WI38、R1610(中華倉鼠成纖維細(xì)胞)BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉鼠腎細(xì)胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI(人淋巴細(xì)胞)和293(人腎)。宿主細(xì)胞系通?？蓮纳虡I(yè)服務(wù)來源如美國組織培養(yǎng)物保藏中心或公開文獻(xiàn)獲得。此外，可選擇以所需的特定方式調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)、或修飾和加工該基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對蛋白質(zhì)功能重要。不同宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾具有特征性和特定的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證對所表達(dá)的外來蛋白進(jìn)行正確的修飾和加工。為此，可采用具有適當(dāng)加工初始轉(zhuǎn)錄物、對基因產(chǎn)物進(jìn)行糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。為了長期、高產(chǎn)率地生產(chǎn)重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可工程改造穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。用合適表達(dá)控制元件(如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)記來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,而不是使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體。引入外來DNA后，使工程改造細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后換到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記提供對選擇的抗性，使得細(xì)胞能夠?qū)⒃撡|(zhì)粒穩(wěn)定整合入染色體，生長形成細(xì)胞灶，進(jìn)而可克隆并擴(kuò)增成細(xì)胞系。可有利地使用這種方法工程改造穩(wěn)定表達(dá)該抗體分子的細(xì)胞系。可采用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell11:223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，Cell22:817(1980))基因。另外，抗代謝劑抗性可用作選擇以下基因的基礎(chǔ)：dhfr，產(chǎn)生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980，Natl．Acad．Sci．USA，77:357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78:1527)；gpt，產(chǎn)生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78:2072)；neo，產(chǎn)生氨基糖苷G-418抗性(ClinicalPharmacy12:488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann．Rev．Pharmacol．Toxicol．32:573-596；Mulligan，1993，Science260:926-932；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；TIBTECH11(5):155-215(1993年5月))；和hygro，產(chǎn)生潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene，30:147)。重組DNA技術(shù)領(lǐng)域已知的可使用方法描述于Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，紐約州的約翰韋利父子公司(JohnWiley&Sons，NY)(1993)；Kriegler，GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual(“基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室手冊”)，紐約的斯托克頓出版社(StocktonPress)(1990)；Dracopoli等(編)(1994)CurrentProtocolsinHumanGenetics(《新編人類遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(紐約州的約翰韋利父子公司)，第12和13章；Colberre-Garapin等(1981)J.Mol.Biol.150:1，通過引用全文納入本文。可通過載體擴(kuò)增提高抗體分子的表達(dá)水平(綜述參見Bebbington和Hentschel，“TheUseofVectorsBasedonGeneAmplificationfortheExpressionofClonedGenesinMammalianCellsinDNACloning”(在DNA克隆中使用基于基因擴(kuò)增的載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)克隆的基因)，(紐約州的學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)))，第3卷。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記可擴(kuò)增時(shí)，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平會增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增區(qū)域與抗體基因相連，抗體產(chǎn)量也會提高(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。體外生產(chǎn)允許按比例放大規(guī)模產(chǎn)生大量所需多肽。本領(lǐng)域已知在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)，包括均一懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中培養(yǎng)，或者固定或捕獲式細(xì)胞培養(yǎng)，例如在中空纖維中、微囊中、瓊脂糖微珠上或陶瓷筒上培養(yǎng)。如果必要和/或需要，多肽溶液可通過常規(guī)色譜法進(jìn)行純化，例如，在優(yōu)選生物合成合成絞鏈區(qū)多肽之后或者在本文所述的HIC色譜步驟之前或之后，進(jìn)行如凝膠過濾、離子交換色譜、DEAE-纖維素色譜或(免疫-)親和性色譜。編碼本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的基因也可在非哺乳動物細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá)。易于攝入核酸的細(xì)菌包括腸桿菌科成員，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或沙門菌屬(Salmonella)菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)。還應(yīng)理解，在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，異源多肽通常是包含體的一部分。異源多肽必須被分離、純化、然后組裝成功能分子。需要抗體的四價(jià)形式時(shí)，亞基隨后會自組裝成四價(jià)抗體(WO02/096948A2)。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)所表達(dá)抗體分子的指定應(yīng)用對許多表達(dá)載體進(jìn)行有利地選擇。例如，要生成大量這類蛋白質(zhì)時(shí)，為了產(chǎn)生抗體分子的藥物組合物，可能需要能夠指導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)的載體。這類載體包括但不限于：大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，EMBOJ.2:1791(1983))，其中抗體編碼序列可單獨(dú)連接到載體內(nèi)，與lacZ編碼區(qū)位于同一讀框內(nèi)，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye，NucleicAcidsRes.13:3101-3109(1985)；VanHeeke和Schuster，J.Biol.Chem.，24:5503-5509(1989))；等等。也可采用pGEX載體表達(dá)外來多肽作為有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這類融合蛋白可溶，并可通過吸附和結(jié)合于基質(zhì)谷胱甘肽瓊脂糖珠然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫而從裂解細(xì)胞中容易地純化。pGEX載體設(shè)計(jì)成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點(diǎn)，從而能從GST部分釋放克隆的靶基因產(chǎn)物。除原核生物外，還可使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常見的面包酵母是最常使用的真核微生物，盡管許多其它菌株市售可得，例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。為了在酵母(Saccharomyces)中表達(dá)，常常使用質(zhì)粒YRp7，例如(Stinchcomb等，Nature282:39(1979)；Kingsman等，Gene7:141(1979)；Tschemper等，Gene10:157(1980))。這種質(zhì)粒已經(jīng)含有TRP1基因，其為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變菌株如ATCC編號44076或PEP4-1(Jones，Genetics85:12(1977))提供選擇標(biāo)記物。然后，酵母宿主細(xì)胞基因組特征性trp1損傷的存在提供了用于通過在無色氨酸環(huán)境下生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多面體病病毒(AcNPV)通常用作表達(dá)外來基因的載體。該病毒在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞中生長?？蓪⒖贵w編碼序列單獨(dú)克隆到病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)中，并置于AcNPV啟動子(如多角體蛋白啟動子)的控制下。本發(fā)明抗體分子一旦重組表達(dá)后，可通過本領(lǐng)域已知的任何免疫球蛋白分子純化方法進(jìn)行純化，例如，通過色譜(如離子交換色譜，親和性色譜，特別是在蛋白A之后對特定抗原的親和性色譜，以及大小篩分柱色譜)、離心、差異溶解度或任何其它蛋白質(zhì)純化標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?；蛘撸岣弑景l(fā)明抗體親和性的方法公開于美國專利申請公開號20020123057A1。VII.使用治療性抗CXCL13抗體的治療方法濾泡型樹突細(xì)胞(FDC)和巨噬細(xì)胞表達(dá)淋巴趨化因子CXCL13。通過在各種免疫細(xì)胞(如B細(xì)胞、濾泡型輔助T細(xì)胞、和近期活化T細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的其受體CXCR5，CXCL13誘導(dǎo)了胞內(nèi)改變，所述改變對維持免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、淋巴器官發(fā)生、白細(xì)胞運(yùn)輸和趨化遷移以及次級淋巴組織(如生發(fā)中心)的發(fā)育是必需的。CXCL13和其受體CXCR5的過量表達(dá)參與了各種自身免疫疾病(如多發(fā)性硬化(參見例如Corcione等,PNAS101(30):11064–11069(2004);Serafini等,BrainPathol.14:164-174(2004);Magliozzi等,Brain130:1089-1104(2007))、關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(參見例如Rioja等,Arthritis&Rheumatism58(8):2257–2267(2008);Shi等,J.Immuno.166:650-655(2001);Schmutz等,ArthritisRestearchandTherapy7:R217-R229(2005);等,J.LeukocyteBio.69:331-339(2001))、慢性胃炎(參見例如等;Mazzucchelli等,Brain130:1089-1104(2007))、胃淋巴瘤(參見例如同上;Nobutani等,FEMSImmunolMedMicrobiol60:156-164(2010))、移植排斥(參見如Steinmetz等,KidneyInternational67:1616-1621(2005))、干燥綜合征(SS)(參見如Barone等,J.Immuno.180:5130-5140(2008);等)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)(參見如Steinmetz等,Lee等,J.Rheum.37(1):45-52(2010);Schiffer等,J.Immun.171:489-497(2003))、丙型肝炎病毒感染中的活性混合冷球蛋白血癥(MC)血管炎(參見如Sansonno等,Blood112(5):1620-1627(2008))、幼年型皮肌炎(參見如dePadilla等,Arthritis&Rheumatism60(4):1160–1172(2009))、和重癥肌無力(參見如Matsumoto等,J.Immuno.176:5100-5107(2006);Meraouna等,Blood108(2):432-440(2006);Saito等,J.Neuroimmunol170:172-178(2005))和某些癌癥(如伯基特淋巴瘤(參見如等,Blood84:830-840(1994);等,Cell87:1037-1047(1996))、非霍奇金淋巴瘤(參見如Trentin等,Ann.Rev.Immunol.6:251-81(1988);Gong等,J.Immunol.174:817-826(2005);Hamaguchi等,J.Immunol.174:4389-4399(2005))、癌(如結(jié)腸和胰腺)(參見如Günther等,Int.J.Cancer116:726–733(2005);Meijer等,CancerRes.66:9576-9582(2006))、乳腺癌(參見如Panse等,BritishJournalofCancer99:930–938(2008))、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)(參見如Bürkle等,Blood110:3316-3325(2007))、和前列腺癌(參見如Singh等,CancerLetters283(1):29-35(2009))。可以期望本發(fā)明抑制CXCL13活性的方法對上述疾病有治療作用。本發(fā)明的某些方法涉及使用抗CXCL13結(jié)合分子如抗體治療患者，所述抗體包括其抗原結(jié)合片段、變體和衍生物，所述患者有與CXCL13表達(dá)細(xì)胞如CXCL13過量表達(dá)細(xì)胞相關(guān)的疾病?！氨磉_(dá)CXCL13的細(xì)胞”指表達(dá)CXCL13抗原的正常和惡性細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知檢測細(xì)胞內(nèi)CXCL13表達(dá)的方法，包括但不限于：PCR技術(shù)、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡、ELISA等。雖然下述討論涉及用本發(fā)明抗CXCL13抗體的多種疾病和失調(diào)的診斷方法和治療，但本文所述方法也可應(yīng)用于保持本發(fā)明抗CXCL13抗體的所需特性，例如能夠特異性結(jié)合CXCL13，如人、靈長動物、小鼠或者人和小鼠的CXCL13，并具有CXCL13中和活性的抗CXCL13抗體的抗原結(jié)合片段、變體和衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療包括將本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⒖笴XCL13結(jié)合分子應(yīng)用于或給予由患者分離的組織或細(xì)胞系，其中所述患者有疾病、疾病癥狀或疾病傾向。在另一實(shí)施方式中，治療還意在包括將含抗CXCL13結(jié)合分子如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予患者，或?qū)笴XCL13結(jié)合分子的藥物組合物應(yīng)用于或給予由患者分離的組織或細(xì)胞系，其中所述患者有疾病、疾病癥狀或疾病傾向。本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其結(jié)合片段可用于治療各種惡性和非惡性腫瘤?！翱鼓[瘤活性”指表達(dá)CXCL13的惡性細(xì)胞增殖或累積速率降低，因此已有腫瘤或在治療期間出現(xiàn)的腫瘤的生長速率降低，和/或已有的贅生性(腫瘤)細(xì)胞或新形成的贅生性細(xì)胞被破壞，因而治療期間腫瘤總體尺寸縮小。例如，用至少一種抗CXCL13抗體進(jìn)行治療引起生理響應(yīng)，這對人體中CXCL13表達(dá)細(xì)胞相關(guān)性疾病狀態(tài)的治療有益。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用作藥物，具體是用于治療或預(yù)防癌癥或用于癌前病癥或病損的本發(fā)明所述抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，用抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其結(jié)合片段如MAb5261治療過度表達(dá)CXCL13的癌癥。在某些實(shí)施方式中，用本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其結(jié)合片段治療表達(dá)或過量表達(dá)CXCL13的白血病、淋巴瘤(如MALT淋巴瘤)、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、乳腺癌或前列腺癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，用本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其結(jié)合片段用于治療癌癥，如結(jié)腸或前列腺癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其結(jié)合片段用于治療表達(dá)或過量表達(dá)CXCR5的癌癥。能使用動物模型顯示抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段對治療或預(yù)防癌癥的有效性。例如本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段對治療或預(yù)防前列腺癌的有效性能使用前列腺癌動物模型顯示，所述動物模型例如用PC3-luc人前列腺癌細(xì)胞注射并且用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子治療的小鼠。在另一個(gè)示例中，本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段對治療或預(yù)防結(jié)腸癌的有效性能使用結(jié)腸癌動物模型顯示，所述動物模型例如用CT26結(jié)腸癌細(xì)胞注射并且用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子治療的小鼠。在另一個(gè)示例中，本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段對治療或預(yù)防MALT淋巴瘤的有效性能使用胃MALT淋巴瘤動物模型顯示，所述動物模型例如用螺桿菌感染(參見Nobutani等(2010))并且用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子治療的小鼠。所述Nobutani等模型也可以用于評價(jià)本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段對降低螺桿菌感染組織的胃淋巴濾泡的有效性。按照本發(fā)明方法，對于惡性人細(xì)胞，利用至少一種抗CXCL13結(jié)合分子如本文另述的抗體或其抗原結(jié)合片段提高陽性治療響應(yīng)。癌癥治療的“陽性治療響應(yīng)”指與這些結(jié)合分子如抗體或其片段的抗腫瘤活性有關(guān)的疾病改善，和/或與疾病相關(guān)癥狀的改善。也就是說，可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進(jìn)一步擴(kuò)散、腫瘤尺寸縮小、腫瘤血管減少、癌細(xì)胞數(shù)量減少和/或一種或多種疾病相關(guān)癥狀減輕。因此，例如，疾病改善的特征可以是完全響應(yīng)?！巴耆憫?yīng)”指歸一化任何之前異常的射線照片研究、骨髓和腦脊液(CSF)時(shí)，不存在臨床上可檢測的疾病。這種響應(yīng)必須在本發(fā)明方法治療后，持續(xù)至少一個(gè)月?；蛘?，疾病改善可分類為部分響應(yīng)?！安糠猪憫?yīng)”指不存在新病損的情況下，所有可檢測的腫瘤負(fù)荷(即，對象中存在的腫瘤細(xì)胞數(shù)量)降低至少約50%，并持續(xù)至少一個(gè)月。這種響應(yīng)僅適用于可檢測的腫瘤?？刹捎煤Y選技術(shù)如生物發(fā)光成像，例如熒光素酶成像、骨掃描成像和包括骨髓抽吸(BMA)在內(nèi)的腫瘤生物活檢采樣，通過腫瘤形態(tài)改變(即總體腫瘤負(fù)荷、腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)等)評估腫瘤響應(yīng)。除這些陽性治療響應(yīng)外，接收抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段治療的對象可產(chǎn)生疾病相關(guān)癥狀改善的有益效果。例如，所述對象可出現(xiàn)所謂的B癥狀，如夜汗、發(fā)熱、體重降低和/或蕁麻疹減輕?？笴XCL13結(jié)合分子，如本文所述抗體或其抗原結(jié)合片段也可用于治療或防止與CXCL13表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的炎性疾病和免疫系統(tǒng)缺陷或失調(diào)。炎性疾病的特征是炎癥和組織破壞，或其組合。“抗炎活性”指減輕或預(yù)防炎癥。“炎性疾病”包括任何炎癥免疫介導(dǎo)的過程，其中免疫應(yīng)答的啟動事件或靶標(biāo)包括非自身抗原，包括例如，同種抗原、異種抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、未知抗原或變應(yīng)原。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述炎性疾病是與細(xì)菌感染有關(guān)的疾病，例如螺桿菌感染如幽門螺旋桿菌（H.pylori）、海爾曼螺桿菌（H.heilmannii）、豹螺桿菌（H.acinonychis）、鵝螺桿菌（H.anseris）、金倉鼠螺桿菌（H.aurati）、棒狀螺桿菌（H.baculiformis）、膽型螺旋桿菌(H.bilis）、H.bizzozeronii、白雁螺桿菌(H.brantae）、加拿大螺桿菌(H.candadensis）、犬螺桿菌(H.canis）、膽囊螺桿菌(H.cholecystus）、辛氏螺桿菌（H.cinaedi）、犬胃螺桿菌（H.cynogastricus）、馬螺桿菌(H.equorum）、貓螺桿菌（H.felis）、芬奈爾螺桿菌（H.fenelliae）、H.ganmani、肝螺桿菌（H.hepaticus）、倉鼠螺桿菌(H.mesocricetorum）、旱獺螺桿菌（H.marmotae）、小家鼠螺桿菌（H.muridarum）、雪貂螺桿菌（H.mustelae）、巴梅河螺桿菌（H.pametensis）、雛螺桿菌（H.pullorum）、羊螺桿菌（H.rappini）、嚙齒類螺桿菌（H.rodentium）、所羅門螺桿菌（H.salomonis）、豬螺桿菌（H.suis）、H.trogontum、盲腸螺桿菌（H.typhlonius）和H.winghamensis感染。在某些實(shí)施方式中，所述螺桿菌感染是幽門螺桿菌或海爾曼螺桿菌感染。在其他實(shí)施方式中，所述螺桿菌相關(guān)炎性疾病是MALT淋巴瘤、胃癌(如食道或胃癌)、胃或十二指腸潰瘍、胃炎(胃內(nèi)壁炎癥)、或胃損傷(參見例如Chen等,JClinPathol55(2):133-7(2002);Genta等,HumPathol24(6):577-83(1993);Okiyama等,PatholInt55(7):398-404(2005))。在一個(gè)實(shí)施方式中，炎性疾病是外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性疾病。另外，出于本發(fā)明目的，術(shù)語“炎性疾病”包括但不限于“自身免疫病”。本文所用的術(shù)語“自身免疫病”通常理解為包括涉及“自身抗原”的炎癥免疫介導(dǎo)的過程。在自身免疫病中，自身抗原引發(fā)宿主免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或抗原結(jié)合片段治療多發(fā)性硬化(MS)。MS也稱為彌散性硬化癥或彌散性腦脊髓炎，是免疫系統(tǒng)攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而導(dǎo)致脫髓鞘的自身免疫病癥?！岸喟l(fā)性硬化”這個(gè)名稱指神經(jīng)系統(tǒng)中形成的疤痕(硬化，也稱為斑塊或病損)。MS病損通常包括接近小腦腦室、腦干、基底神經(jīng)節(jié)和脊髓以及視神經(jīng)的白質(zhì)區(qū)域。MS導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞破壞，該細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生和維持髓鞘。MS導(dǎo)致髓磷脂變薄或完全消失，隨著疾病進(jìn)展，還導(dǎo)致軸突橫斷。神經(jīng)系統(tǒng)癥狀可隨著MS改變，該疾病常常發(fā)展到身體和認(rèn)知障礙。MS有多種形式，新癥狀獨(dú)立發(fā)作(復(fù)發(fā)形式)或隨時(shí)間緩慢累積(漸進(jìn)形式)。在發(fā)作之間，癥狀可能完全消失，但常常產(chǎn)生永久的神經(jīng)損傷，特別是隨著疾病進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是廣泛接受的多發(fā)性硬化的動物模型。EAE是CNS的脫髓鞘性疾病，逐步造成主要靶向脊髓炎癥的上行性麻痹程度增加。所述疾病能采用急性、慢性或復(fù)發(fā)緩解過程，所述過程依賴于誘導(dǎo)方法和使用的動物類型。Bagaeva等顯示了在有復(fù)發(fā)緩解EAE的小鼠發(fā)炎腦膜中形成包含B細(xì)胞和CXCL13表達(dá)樹突細(xì)胞的濾泡，CXCL13表達(dá)水平在整個(gè)疾病過程中穩(wěn)定上升。CXCL13缺陷型小鼠經(jīng)歷了復(fù)發(fā)率下降的輕微疾病，并且用抗CXCL13MAb阻斷CXCL13引起B(yǎng)10.PL小鼠中被動誘導(dǎo)EAE的疾病衰減。Bagaeva等,J.Immuno.176:7676-7685(2006)。使用本發(fā)明抗CXCL13單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段如MAb5261來中和CXCL13，可以通過數(shù)種不同機(jī)制用于降低MS的嚴(yán)重性，所述機(jī)制如阻斷CXCL13與其受體的相互作用，造成如干擾B和濾泡型B輔助T細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織和生發(fā)中心形成。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或抗原結(jié)合片段治療或預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE或狼瘡)。SLE是涉及多種器官的自身免疫疾病，其表性為異位生發(fā)中心的自發(fā)形成和針對大量核抗原的自動抗體生成。SLE最經(jīng)常影響所述心臟、關(guān)節(jié)、皮膚、肺、血管、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)。活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和其促遷移趨化因子CXCL13在多種自身免疫疾?。ò琒LE）的發(fā)炎異常位點(diǎn)中所見有序淋巴組織形成中起重要作用。狼瘡-俯臥新西蘭黑色品系（NewZealandBlack）X新西蘭白色品系（NewZealandWhite）F1(NZB/NZWF1)小鼠自發(fā)發(fā)展出高效價(jià)抗dsDNA抗體和腎小球中免疫復(fù)合物形成造成的嚴(yán)重增殖型腎小球性腎炎。這些小鼠中狼瘡樣癥狀的發(fā)展伴隨著腎和胸腺中樹突細(xì)胞的CXCL13表達(dá)增加(Ishikawa等,J.Exp.Med.193(12):1393-1402(2001);Schiffer等,J.Immun.171:489-497(2003))。使用本發(fā)明抗CXCL13單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段如MAb5261來中和CXCL13，可以通過數(shù)種不同機(jī)制用于降低SLE的嚴(yán)重性，所述機(jī)制如阻斷CXCL13與其受體的相互作用，造成如干擾B和濾泡型B輔助T細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織和生發(fā)中心形成。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或抗原結(jié)合片段治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是影響美國2-4%人的最常見自身免疫疾病之一。其是慢性、累進(jìn)性、系統(tǒng)炎性疾病，表征為滑膜關(guān)節(jié)融合、軟骨侵蝕和骨破壞。在RA中，T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)在形成血管翳的滑膜層(溶蝕到軟骨和骨的滑膜侵入性區(qū)域)中聚集。另外，所述滑膜損傷中的T和B細(xì)胞組織成淋巴生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)支持自體抗體(類風(fēng)濕因子)生成，并且因此直接對疾病發(fā)病機(jī)制起作用(Takemura等,J.Immuno.167:1072-1080(2001);Shi等,J.ofImmuno.166:650-655(2001))?；こ衫w維細(xì)胞生成的淋巴趨化因子CXCL13、選定內(nèi)皮細(xì)胞、滑膜抗原致敏T輔助細(xì)胞和FDC(Takemura等(2001);Shi等(2001);Manzo等,Arthritis&Rheumatism58(11):3377-3387(2008))，通過指導(dǎo)CXCR5陽性淋巴細(xì)胞(主要是B細(xì)胞和濾泡型T輔助細(xì)胞)遷移進(jìn)入所述發(fā)炎滑膜而在所述滑膜組織的生發(fā)中心形成中起重要作用。臨床上，RA患者中CXCL13的血漿水平與疾病嚴(yán)重性相關(guān)，因?yàn)橄噍^對照和有靜息疾病的患者，在有活性RA患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了顯著更高水平的CXCL13(Rioja等,Arthritis&Rheumatism58(8):2257-2267(2008))。另外，CXCR5受體在RA患者滑膜中上調(diào)，和在浸潤B和T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中存在(Schmutz等,ArthritisResearchTherapy7:R217-R229(2005))。小鼠和大鼠中膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)是完善的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型。所述疾病通常由肌肉注射完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的牛II型膠原誘導(dǎo)，并且特性為生成小鼠膠原抗體，和隨后爪中逐步發(fā)展關(guān)節(jié)炎。Stannard等顯示了用大鼠抗鼠CXCL13抗體中和CXCL13引起關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠中關(guān)節(jié)炎評分和關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重性的顯著降低。Stannard等,"NeutralizationofCXCL13impactsB-celltraffickingandreducesseverityofestablishedexperimentalarthritis（中和CXCL13影響B(tài)細(xì)胞運(yùn)輸和降低已建立實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性）"美國風(fēng)濕病學(xué)會2008年科學(xué)年會(2008)。使用本發(fā)明抗CXCL13單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段如MAb5261來中和CXCL13，可以通過數(shù)種不同機(jī)制用于降低關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性，所述機(jī)制如阻斷CXCL13與其受體的相互作用，造成如干擾B和濾泡型B輔助T細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織和生發(fā)中心形成。另外，本發(fā)明抗CXCL13單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段如MAb5261，可以用于降低如過量表達(dá)RANKL的對象中的RANKL表達(dá)和骨質(zhì)損失。按照本發(fā)明方法，利用至少一種抗CXCL13結(jié)合分子，如本文另述的抗體或其抗原結(jié)合片段提高對自身免疫病癥和/或炎性疾病的治療或預(yù)防的陽性治療響應(yīng)。提及自身免疫病和/或炎性疾病時(shí)，“陽性治療響應(yīng)”指與這些抗體的抗炎活性、抗血管新生活性、抗凋亡活性等相關(guān)的疾病改善，和/或疾病相關(guān)癥狀的改善。也就是說，可觀察到抗增殖作用、防止CXCL13表達(dá)細(xì)胞的進(jìn)一步增殖、減輕炎癥反應(yīng)，包括但不限于：炎性細(xì)胞因子、粘著分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在攜帶CXCL13的細(xì)胞是B細(xì)胞的情況下)、其組合等的分泌減少，抗炎蛋白產(chǎn)量增加，自身反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)量減少，免疫耐受提高，自身反應(yīng)性細(xì)胞存活被抑制，凋亡減少，內(nèi)皮細(xì)胞遷移減少，自發(fā)性單核細(xì)胞遷移增加，通過刺激CXCL13表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的一種或多種癥狀減輕和/或降低。這種陽性治療響應(yīng)不僅限于給藥途徑，可包括給予供體、供體組織(如器官灌注)、宿主、其任何組合等?？衫煤Y選技術(shù)評估臨床響應(yīng)，如磁共振成象(MRI)掃描、x-射線成像、計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)掃描、流式細(xì)胞術(shù)或熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)分析、組織學(xué)分析、大體病理學(xué)分析和血液化學(xué)分析，包括但不限于可通過ELISA、RIA、色譜等檢測到的改變。除這些陽性治療響應(yīng)外，接受抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段治療的對象可產(chǎn)生疾病相關(guān)癥狀改善的有益效果。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是使用抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段診斷性監(jiān)測組織中的蛋白質(zhì)水平作為臨床測試步驟的一部分，例如用于確定給定治療方案的功效。例如，將抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)可利于探測?？蓹z測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適熒光材料的例子包括：傘形花內(nèi)酯、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括：螢光素酶、螢光素和發(fā)光蛋白；合適的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。VIII.藥物組合物和給藥方法本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知或不難確定制備和給予本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的方法?？笴XCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的給藥途徑可以是(例如)，口服、胃腸道外、吸入或外用。本文所用的術(shù)語“胃腸道外”包括例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥。雖然所有這些給藥形式均明確認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)，但給藥形式的例子是注射液，特別是用于靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射或滴注。通常，合適的注射用藥物組合物可包含緩沖劑(如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑)、表面活性劑(如聚山梨酯)，以及任選的穩(wěn)定劑(如人白蛋白)等。然而，在與本文所教授內(nèi)容相符的其它方法中，本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可直接遞送到不良細(xì)胞群的位點(diǎn)，從而提高患病組織與治療劑的接觸。如本文所用，本發(fā)明抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以藥學(xué)有效量給予以在體內(nèi)治療CXCL13表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，如某些類型的癌癥、自身免疫病、炎性疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)炎性疾病。在這方面，應(yīng)理解，將配制本發(fā)明公開的結(jié)合分子以利于給藥并提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的無毒無菌運(yùn)載體，如生理鹽水、無毒緩沖液、防腐劑等。出于本申請目的，偶聯(lián)或未偶聯(lián)的抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的藥學(xué)有效量應(yīng)認(rèn)為指足以實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合靶標(biāo)和足以實(shí)現(xiàn)某一益處例如改善疾病或失調(diào)癥狀或者檢測物質(zhì)或細(xì)胞的量。本發(fā)明所用的藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，包括例如，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂，血清蛋白質(zhì)如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。胃腸道外給藥制劑包括無菌的水性或非水性溶液、混懸液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。水性運(yùn)載體包括例如，水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。在本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體包括但不限于：0.01-0.1M例如0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。其它常見的胃腸道外載體包括磷酸鈉溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格溶液或固定油。靜脈內(nèi)載劑包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于林格右旋糖的那些物質(zhì)等。也可包含防腐劑和其它添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更具體地，適于注射應(yīng)用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性時(shí))或分散液，以及用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。在這種情況下，該組合物必須無菌，并應(yīng)該是達(dá)到存在注射容易性(easysyringability)程度的流體。它應(yīng)該在制造和儲存條件下穩(wěn)定，并且優(yōu)選抵抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用而保存。運(yùn)載體可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？赏ㄟ^使用涂覆材料如卵磷脂、分散液情況下通過保持所需粒度以及使用表面活性劑，來維持合適的流動性。用于本文所述治療方法的合適制劑可參見Remington'sPharmaceuticalSciences(《雷明頓藥物科學(xué)》)(馬克出版公司(MackPublishingCo.))第16版(1980)。也可通過各種抗菌劑和抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用。在某些情況下，組合物中優(yōu)選包含等張劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。通過組合物中包含延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠能延長可注射組合物的吸收。在任何情況下，制備無菌注射溶液可通過將所需量的活性化合物(如抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，本身或與其它活性劑聯(lián)合)摻入含有本文所列一種成分或多種成分組合的合適溶劑，然后如需要進(jìn)行過濾除菌。通常，將活性活化物摻入含有堿性分散介質(zhì)和上述其它所需成分的無菌載體中制備分散液。在制備無菌注射液制備所需的無菌粉末時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，由之前無菌過濾的溶液得到活性組分和任何其它所需組分的粉末。注射制劑在無菌條件下按照本領(lǐng)域已知方法加工，裝入容器如安瓿、袋、瓶、注射器或小管中，并密封。另外，可包裝該制劑，并以藥盒形式出售，如美國專利申請系列號09/259,337所述。這類制品優(yōu)選具有標(biāo)簽或藥品說明書，表明相關(guān)組合物可用于治療患有或傾向于患有疾病或失調(diào)的對象。胃腸道外制劑可以是單次推注劑量，輸注或負(fù)荷推注劑量，隨后是維持劑量。這些組合物可以特定的固定間隔或可變間隔給予，例如每天一次，或“按需”給予。本發(fā)明所用的某些藥物組合物可以可接受的劑型口服給予，包括例如，膠囊、片劑、水性懸液或溶液。某些藥物組合物也可通過鼻噴霧或吸入方式給予。這類組合物可制備成鹽水溶液，其中采用芐醇或其它合適的防腐劑、吸收促進(jìn)劑以提高生物利用度，和/或采用其它常規(guī)的增溶劑或分散劑?？膳c載體材料組合生成單一劑型的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其片段、變體或衍生物的量可以根據(jù)治療宿主以及具體的給藥模式而變化。該組合物可作為單一劑量、多個(gè)劑量或在確定時(shí)間段通過輸注給予。也可調(diào)整給藥方案，以提供最優(yōu)所需響應(yīng)(例如，治療或預(yù)防性響應(yīng))。在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可按照上述治療方法給予人或其它動物，其給予量足以產(chǎn)生療效。本發(fā)明抗CXCL13抗體，或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以常規(guī)劑型給予所述人或其它動物，該劑型根據(jù)已知技術(shù)將本發(fā)明抗體如MAb5261與常規(guī)的藥學(xué)上可接受運(yùn)載體或稀釋劑混合來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，藥學(xué)上可接受運(yùn)載體或稀釋劑的形式和特點(diǎn)由混合的活性成分含量、給藥途徑和其它熟知變量決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，包含一種或多種抗CXCL13結(jié)合分子，如本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的混合物可證明為特別有效?！爸委熡行┝炕蛑委熡行Я俊被蛘摺坝行Я俊敝附o予時(shí)，在患有待治療疾病患者的治療方面帶來陽性治療響應(yīng)的抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段的用量。用于治療CXCL13表達(dá)細(xì)胞所介導(dǎo)疾病的本發(fā)明組合物的治療有效劑量取決于多種不同因素而變化，所述疾病例如某些類型的癌癥，如白血病、淋巴瘤(如MALT淋巴瘤)、結(jié)腸癌、乳腺癌、食道癌、胃癌和前列腺癌；自身免疫病，如狼瘡、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、和炎性疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)炎性疾病，所述因素包括給藥方式、目標(biāo)部位、患者生理狀態(tài)、患者是人或是動物、給予的其它藥物和該治療是預(yù)防性治療或是治療性治療。通常，患者是人，但也可治療非人哺乳動物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法確定治療劑量，以優(yōu)化安全性和效能。鑒于本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過多實(shí)驗(yàn)即可確定至少一種抗CXCL13結(jié)合分子如抗體或其結(jié)合片段的給予量。影響給藥方式以及至少一種抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物各自用量的因素包括但不限于：接受治療的個(gè)體的疾病嚴(yán)重程度、病史、年齡、身高、重量、健康和身體狀況。類似地，抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其片段、變體或衍生物的給予量取決于給藥方式、對象是否接受單一劑量或多劑量的此種藥劑。本發(fā)明還提供抗CXCL13結(jié)合分子，如抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物在制造治療自身免疫病和/或炎性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病包括例如MS、關(guān)節(jié)炎、狼瘡、胃炎、潰瘍或癌癥。IX.診斷本發(fā)明還提供可用于診斷CXCL13表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的診斷方法，所述疾病例如某些類型的癌癥和炎性疾病，包含自身免疫病，所述方法包括測定來自個(gè)體的組織或其它細(xì)胞或體液中CXCL13蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，并將所測表達(dá)水平與正常組織或體液中的標(biāo)準(zhǔn)CXCL13表達(dá)水平作比較，從而相較標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平上升表明存在疾病。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體和衍生物如MAbMAb5261、MAb5378、MAb5080、MAb1476、3D2或3C9，用于診斷癌癥、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎或狼瘡。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法，可利用本發(fā)明抗CXCL13抗體及其抗原結(jié)合片段、變體和衍生物測定生物樣品中的CXCL13蛋白水平(參見例如Jalkanen等，J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等，J.CellBiol.105:3087-3096(1987))。用于檢測CXCL13蛋白表達(dá)的其它基于抗體的方法包括免疫實(shí)驗(yàn)，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫沉淀或蛋白質(zhì)印跡。合適的實(shí)驗(yàn)在本文中另有詳述。“測定CXCL13多肽表達(dá)水平”指對第一生物樣品中的CXCL13多肽水平以直接(例如，通過測定或估計(jì)絕對蛋白質(zhì)水平)或相對(例如，通過與第二生物樣品中的疾病相關(guān)多肽水平作比較)方式進(jìn)行定性或定量測定或估計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，測定或估計(jì)第一生物樣品中的CXCL13多肽表達(dá)水平，并與標(biāo)準(zhǔn)CXCL13多肽水平作比較，該標(biāo)準(zhǔn)取自未患該疾病的個(gè)體所得的第二生物樣品或通過未患該疾病的個(gè)體群的平均水平確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一旦“標(biāo)準(zhǔn)”CXCL13多肽水平已知，可以重復(fù)地用作比較標(biāo)準(zhǔn)?！吧飿悠贰敝赣煽赡鼙磉_(dá)CXCL13的個(gè)體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或其它細(xì)胞來源獲得的任何生物樣品。從哺乳動物獲得組織活檢樣品和體液的方法為本領(lǐng)域熟知。X．免疫實(shí)驗(yàn)可通過本領(lǐng)域的任何已知方法測定本發(fā)明抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的免疫特異性結(jié)合?？墒褂玫拿庖邔?shí)驗(yàn)包括但不限于，使用如下技術(shù)的競爭和非競爭實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)印跡、放射性免疫實(shí)驗(yàn)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))、“夾心”免疫實(shí)驗(yàn)、免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、凝集實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體固定實(shí)驗(yàn)、免疫放射測定實(shí)驗(yàn)、熒光免疫實(shí)驗(yàn)、蛋白A免疫實(shí)驗(yàn)等等。這類實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域常規(guī)且熟知的(參見例如，Ausubel等編，(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，紐約約翰韋利父子公司(JohnWiley&Sons，Inc.,NY)，第1卷，通過引用全文納入本文)?？赏ㄟ^競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定抗體與抗原的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率。競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子是放射性免疫實(shí)驗(yàn)，包括在含量遞增的未標(biāo)記抗原存在下用感興趣抗體培育標(biāo)記抗原(如3H或125I)和檢測結(jié)合于標(biāo)記抗原的抗體?？赏ㄟ^Scatchard作圖分析的數(shù)據(jù)確定感興趣的抗體與特定抗原的親和性和結(jié)合解離速率。也可利用放射性免疫實(shí)驗(yàn)確定與第二抗體的競爭。在這種情況下，在含量遞增的未標(biāo)記第二抗體存在下，將抗原與偶聯(lián)于標(biāo)記化合物(如3H或125I)的感興趣抗體一起培育?？梢园凑帐熘椒ù_定給定批次的抗CXCL13抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的結(jié)合活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定每次測定的操作和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。有各種方法可用于測定抗體-抗原相互作用的親和性，但測定速率常數(shù)的相對較少。大部分方法依賴于標(biāo)記抗體或抗原，其不可避免地使常規(guī)測定復(fù)雜化并在測定量中引入不確定性。與測定抗體-抗原相互作用親和性的常規(guī)方法相比，用進(jìn)行的表面等離振子共振(SPR)提供若干優(yōu)點(diǎn)：(i)無需標(biāo)記抗體或抗原；(ii)抗體不需要事先純化，細(xì)胞培養(yǎng)物上清液可直接使用；(iii)實(shí)時(shí)測定，能夠快速半定量地比較不同單克隆抗體相互作用，能夠且足以用于許多評價(jià)目的；(iv)生物特異性表面可再生，從而能容易地在相同條件下比較一系列不同單克隆抗體；(v)分析步驟完全自動化，大量測定可以在沒有操作人員干預(yù)的情況下進(jìn)行。BIAapplicationsHandbook(《BIA應(yīng)用手冊》)，AB版(1998再版)，編號BR-1001-86；BIAtechnologyHandbook(《BIA技術(shù)手冊》)，AB版(1998再版)，編號BR-1001-84?；赟PR的結(jié)合研究需要將結(jié)合對的一個(gè)成員固定到傳感器表面上。固定的結(jié)合伙伴稱為配體。溶液中的結(jié)合伙伴稱為分析物。在某些情況下，配體通過結(jié)合被稱為捕獲分子的另一固定分子而間接地連接于表面。SPR響應(yīng)反映出隨著分析物結(jié)合或解離，檢測器表面上質(zhì)量濃度的改變。根據(jù)SPR，實(shí)時(shí)測定直接監(jiān)測正在發(fā)生的相互作用。該技術(shù)非常適合測定動力學(xué)參數(shù)。比較親和性排序簡單易行，動力學(xué)和親和性常數(shù)都可獲自傳感圖數(shù)據(jù)。以獨(dú)立脈沖在配體表面上注射分析物時(shí)，所得的傳感器圖可分成三個(gè)基本相：(i)樣品注射期間分析物與配體的結(jié)合；(ii)樣品注射期間平衡或穩(wěn)態(tài)，其中分析物結(jié)合速率通過從復(fù)合物解離達(dá)到平衡；(iii)緩沖液流動期間分析物與表面解離。結(jié)合和解離相提供有關(guān)分析物-配體相互作用的動力學(xué)信息(ka和kd是復(fù)合物形成和解離的速率，kd/ka=KD)。平衡相提供有關(guān)分析物-配體相互作用親和性(KD)的信息。BIA評估軟件提供綜合的曲線擬合工具，其采用數(shù)值積分和全局?jǐn)M合算法。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治?，可由簡單研究獲得相互作用的分離速率和親和性常數(shù)。可通過此種技術(shù)測定的親和性范圍非常寬泛，從mM級到pM級。表位特異性是單克隆抗體的重要特征。與采用放射性免疫實(shí)驗(yàn)、ELISA或其它表面吸附方法的常規(guī)技術(shù)不同，用進(jìn)行表位作圖不需要標(biāo)記或純化的抗體，并允許用若干單克隆抗體的序列進(jìn)行多位點(diǎn)特異性測試。此外，大量分析可自動進(jìn)行。逐對結(jié)合實(shí)驗(yàn)測試兩種MAb同時(shí)結(jié)合同一抗原的能力。針對單獨(dú)表位的MAb將獨(dú)立結(jié)合，而針對相同或緊密相關(guān)表位的MAb將互相干擾結(jié)合。采用的這些結(jié)合實(shí)驗(yàn)簡單易行。例如，可使用捕獲分子結(jié)合第一Mab，隨后依次加入抗原和第二MAb。傳感器圖將揭示：(1)多少抗原結(jié)合第一Mab，(2)第二MAb結(jié)合表面連接抗原的程度，(3)如果第二MAb不結(jié)合，逆轉(zhuǎn)逐對測試的順序是否會改變結(jié)果。肽抑制是用于表位作圖的另一項(xiàng)技術(shù)?？乖囊患壭蛄幸阎獣r(shí)，這種方法可補(bǔ)充逐對抗體結(jié)合研究，并可將功能表位與結(jié)構(gòu)特征相關(guān)聯(lián)。測定肽或抗原片段對不同MAb與固定抗原結(jié)合的抑制作用。假定干擾給定MAb結(jié)合的肽與該MAb限定的表位在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見例如，Sambrook等編(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》)(第2版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))；Sambrook等編(1992)MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》，(紐約州的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringsHarborLaboratory，NY))；D.N.Glover編，(1985)DNACloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait編(1984)OligonucleotideSynthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美國專利號4,683,195；Hames和Higgins編(1984)NucleicAcidHybridization(《核酸雜交》)；Hames和Higgins編(1984)TranscriptionAndTranslation(《轉(zhuǎn)錄和翻譯》)；Freshney(1987)CultureOfAnimalCells(《動物細(xì)胞培養(yǎng)》)(ARL公司(AlanR.Liss，Inc.))；ImmobilizedCellsAndEnzymes(《固定的細(xì)胞和酶》)(IRL出版社(IRLPress))(1986)；Perbal(1984)APracticalGuideToMolecularCloning(《分子克隆實(shí)踐指南》)；論文，MethodsInEnzymology(《酶學(xué)方法》)(紐約州的學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress，Inc.))；Miller和Calos編(1987)GeneTransferVectorsForMammalianCells(《哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratory))；Wu等編，MethodsInEnzymology(《酶學(xué)方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker編(1987)ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》)(倫敦的學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress，London))；Weir和Blackwell編(1986)HandbookOfExperimentalImmunology(《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》)，第I-IV卷；ManipulatingtheMouseEmbryo(《小鼠胚胎操作》)，紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1986)；和Ausubel等(1989)CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(馬里蘭州巴爾的摩的約翰韋利父子公司(JohnWiley&Sons，Baltimore，Md.))?？贵w工程的一般原理可參見Borrebaeck編(1995)AntibodyEngineering（《抗體工程》)(第2版；牛津大學(xué)出版社(OxfordUniv.Press))。蛋白質(zhì)工程的一般原理可參見Rickwood等編(1995)ProteinEngineering，APracticalApproach（《蛋白質(zhì)工程，實(shí)踐方法》)，(英國牛津的牛津大學(xué)出版社的IRL出版公司(IRLPressatOxfordUniv.Press，Oxford，Eng.))。抗體和抗體-半抗原結(jié)合的一般原理可參見：Nisonoff(1984)MolecularImmunology（《分子免疫學(xué)》)(第2版；馬薩諸塞州桑德蘭的辛奧爾聯(lián)合公司(SinauerAssociates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies,TheirStructureandFunction（《抗體的結(jié)構(gòu)和功能》)(Chapman和Hall，紐約州紐約市)。此外，本領(lǐng)域已知且沒有具體描述的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法通常按照下述文獻(xiàn)所述進(jìn)行：CurrentProtocolsinImmunology（《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，紐約州的約翰韋利父子公司(JohnWiley&Sons)；Stites等編(1994)，BasicandClinicalImmunology（《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》)(第8版；Appleton和Lange，康涅狄格州的諾沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(編)(1980)SelectedMethodsinCellularImmunology（《細(xì)胞免疫學(xué)的選用方法》)(紐約州的W.H.弗里曼公司(W.H．FreemanandCo.，NY))。列出免疫學(xué)一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括：CurrentProtocolsinImmunology（《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，紐約州的約翰韋利父子公司(JohnWiley&Sons)；Klein(1982)J.，Immunology:TheScienceofSelf-NonselfDiscrimination（《免疫學(xué)：自身-非自身區(qū)分的科學(xué)》)(紐約州的約翰韋利父子公司)；Kennett等編(1980)MonoclonalAntibodies,Hybridoma:ANewDimensioninBiologicalAnalyses（《單克隆抗體，雜交瘤：生物學(xué)分析的新領(lǐng)域》)(紐約州普萊努公司(PlenumPress，NY))；Campbell(1984)"MonoclonalAntibodyTechnology"inLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology"（《生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》中的“單克隆抗體技術(shù)”)，Burden等編(阿姆斯特丹的埃爾斯威爾公司(Elsevere，Amsterdam))；Goldsby等編(2000)KubyImmunnology（《酷比免疫學(xué)》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫學(xué)》)(第6版；倫敦：莫斯比公司(Mosby))；Abbas等(2005)CellularandMolecularImmunology(《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》)(第5版；埃爾斯威爾健康科學(xué)分公司(ElsevierHealthSciencesDivision))；Kontermann和Dubel(2001)AntibodyEngineering(《抗體工程》)(施普林格公司(SpringerVerlan))；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress))；Lewin(2003)GeneVIII(《基因VIII》)(普倫蒂斯霍爾出版社(PrenticeHall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCRPrimer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。將上文中引用的所有參考文獻(xiàn)以及其中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用全文納入本文。通過說明的方式、而非限制性方式提供以下實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1選擇和定性對人CXCL13特異的小鼠抗體生成雜交瘤用鑰孔血藍(lán)素(KLH)偶聯(lián)的人CXCL13免疫SwissWebster小鼠。三次免疫后，從有最高抗CXCL13效價(jià)的小鼠中收集脾，并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過融合脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞生成雜交瘤。通過ELISA篩選結(jié)合人和小鼠CXCL13蛋白的雜交瘤克隆。使用約100nM人(派普羅泰克公司(Peprotech):#300-47)或小鼠(派普羅泰克公司:#250-24)CXCL13蛋白室溫(RT)過夜涂層ELISA板在洗滌和封閉所述板后，加入標(biāo)準(zhǔn)抗CXCL13抗體溶液(R&D系統(tǒng)公司（R&DSystems）:大鼠抗小鼠MAb470和小鼠抗人MAb801)或雜交瘤上清液并且室溫孵育1小時(shí)。洗滌所述板，并且加入第二抗體(用于雜交瘤上清液和MAb801的山羊抗小鼠IgG-HRP；用于MAb470的驢抗大鼠IgG-HRP)并且室溫孵育1小時(shí)。洗滌所述板，并且避光等體積混合15分鐘的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑A和B(BD生物科學(xué)公司（BDBiosciences）:#555214)來顯影，并在450/570波長讀數(shù)。選擇都是小鼠IgG1抗體的兩個(gè)陽性雜交瘤克?。?biāo)記為"3D2"和"3C9"）用于進(jìn)一步定性。雜交瘤生成的小鼠抗人抗體3D2和3C9的特異性用ELISA(如上述)在包含以下的組上評估：重組趨化因子(派普羅泰克公司:小鼠和人CXCL13、人IL-8/CXCL8(#200-08)、人IP-10/CXCL10(#200-10)、人MIG/CXCL9(#300-26)、人SDF-1α/CXCL12(#300-28A)和短尾猴CXCL13)以及數(shù)種非特異性對照抗原(重組人C35、鏈霉親和素(賽默公司（Thermo）:#21122)、牛血清白蛋白(BSA)(SC公司（SeraCore）:#AP-4510-01))、人血清白蛋白(HAS)(西格瑪公司（Sigma）:#A8763)、胰島素(吉布可公司（Gibco）:#12585-014)和血紅蛋白(西格瑪公司:#H7379)。市售抗體MAb470和MAb801(R&D系統(tǒng)公司)分別用作小鼠和人/短尾猴CXCL13結(jié)合的陽性對照。3D2和3C9顯示特異性結(jié)合CXCL13。由于其結(jié)合重組人、小鼠和短尾猴CXCL13，3D2和3C9克隆都顯示了多物種CXCL13特異性(圖1A-1C)。圖1顯示了至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩重測量結(jié)果。3D2抗體顯示了強(qiáng)烈結(jié)合重組人、小鼠和猴CXCL13。特別地，相較3C9和MAb801，3D2更強(qiáng)烈結(jié)合重組小鼠CXCL13。在體外和體內(nèi)進(jìn)一步定性3D2(結(jié)果如下所示)。所述3D2抗體也用作生成嵌合和人源化CXCL13抗體(結(jié)果如下所示)的原型。相較3D2、MAb470和MAb801，3C9抗體顯示最強(qiáng)烈結(jié)合重組人CXCL13。3C9和3D2用作生物試驗(yàn)顯影（Bioassaydevelopment）的試劑(如下述表位競爭ELISA)。通過測量3D2親和性通過測量3D2、3C9、MAb801和MAb470對重組人和小鼠CXCL13的親和性。趨化因子固定于C1芯片上的乙酸鹽緩沖液(pH=5)，其中人CXCL13是1μg/ml，小鼠CXCL13是0.3μg/ml和陰性對照SDF-1α是0.5μg/ml。3D2和3C9在HBS-EP緩沖液中兩倍稀釋，從100nM到0.78nM和從38nM到0.594nm。MAb801和MAB470兩倍稀釋，從50nM到0.78nM和從19nM到0.594nm。所述結(jié)果顯示人和小鼠CXCL13上3D2的親和性測量(nM)分別顯著低于市售抗體MAb801和MAb470。結(jié)果示于表2。表2.親和性測量11親和性是針對重組人和小鼠CXCL13;NB=沒有結(jié)合3D2表位制圖。使用表位競爭ELISA進(jìn)行表位制圖研究。用100nM重組人CXCL13涂層板并用0.033nM生物素化3D2孵育，然后加入超過3D2量的不同濃度的競爭性未標(biāo)記抗體。代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2。所述結(jié)果顯示3C9與3D2競爭結(jié)合人CXCL13，但是MAb801不與3D2競爭結(jié)合人CXCL13。3D2與天然CXCL13結(jié)合。捕獲表位競爭ELISA用于評估3D2與天然人和小鼠CXCL13的結(jié)合。這個(gè)試驗(yàn)中，天然人CXCL13獲自從人IFN-γ刺激的THP-1細(xì)胞收集的上清液。用6.6nMMAb801捕獲人CXCL13(1:4稀釋THP1上清液或者0.097nM(1ng/ml)rhuCXCL13)，并用0.66nM生物素-3C9檢測。對于合適的抗原呈遞，通過MAb801在ELISA板上捕獲來自組織培養(yǎng)上清液的所述趨化因子(或用作對照的重組人CXCL13)。所述板然后與生物素化3C9在各種量的未標(biāo)記3D2存在下孵育。通過鏈霉親和素-HRP檢測與人CXCL13結(jié)合的競爭，所述競爭造成生物素化3C9結(jié)合的降低。由圖3A明顯可見，3D2強(qiáng)烈結(jié)合天然和重組人CXCL13，生成統(tǒng)計(jì)學(xué)相似的EC50值。來自TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠的小鼠富CXCL13器官提取物用作天然小鼠CXCL13的來源。用33nMMAb470捕獲小鼠CXCL13(1:40稀釋TNF-Tg器官提取物或0.5nMrmuCXCL13)，并用3.3nM生物素-3D2檢測。用MAb470在ELISA板上捕獲來自所述提取物的趨化因子(和用作對照的重組小鼠CXCL13)。所述板然后與生物素化3D2在各種量的未標(biāo)記3D2存在下孵育。然后通過鏈霉親和素-HRP檢測與小鼠CXCL13結(jié)合的競爭，所述競爭造成生物素化3C9結(jié)合的降低。由圖3B可見，3D2能與自身生物素化形式（version）競爭，并且以相同效能結(jié)合天然和重組小鼠CXCL13。對圖3A和3B而言，各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的兩重測量的平均。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.99)。使用非配對t檢驗(yàn)分析EC50值的差異，并且不顯著（P>0.05）。這些結(jié)果顯示所述小鼠抗人3D2抗體不僅結(jié)合所述針對其生成的重組趨化因子，而且結(jié)合天然人和小鼠趨化因子。實(shí)施例2抗CXCL13抗體抑制人B細(xì)胞遷移使用確立的模型評價(jià)對CXCL13功能如B細(xì)胞遷移的抑制，所述模型刺激人和小鼠系統(tǒng)中的B細(xì)胞遷移。趨向非CXCL13趨化因子、SDF-1α(也稱作CXCL12)遷移用作對照以確證抗CXCL13抗體對抑制B細(xì)胞遷移的特異性。因此，就抑制人CXCL13誘導(dǎo)的遷移和缺失對SDF-1α-誘導(dǎo)遷移的影響來檢測抗CXCL13抗體。抑制人B細(xì)胞趨向人CXCL13的遷移。測試3D2、3C9和MAb801對人CXCL13誘導(dǎo)的B細(xì)胞遷移的影響。兩個(gè)克隆細(xì)胞系即人前B-697-hCXCR5和人前-B-697-hCXCR4，分別用于評價(jià)抗CXCL13抗體對重組人CXCL13依賴性遷移和重組人SDF-1α-依賴性遷移的影響。使用有8μm孔徑和6.5mm直徑的Transwell組織培養(yǎng)處理板(康寧克斯公司（CorningCostar）:3422)。人前B-697-hCXCR5細(xì)胞用于rhCXCL13誘導(dǎo)的遷移，和人前B-697-hCXCR4用于rhSDF-1誘導(dǎo)的遷移(陰性對照)。細(xì)胞以5x106/ml重新懸浮于趨化緩沖液((有l(wèi)-谷氨酰胺、10mMHEPES、青霉素鏈霉素和0.5%BSA的RPMI1640)預(yù)熱到RT)，并且回到37℃持續(xù)30分鐘。稀釋的趨化因子(溶于趨化緩沖液的97nm(1μg/ml)rhCXCL13或12.5nM(0.1μg/ml)rhSDF-1α)+/-抗體以590μl/孔加入到下室，并且RT預(yù)孵育30分鐘。所述細(xì)胞以100μl(5x105)細(xì)胞/上室加入。37℃孵育平板過夜。移除插入物并且以60μl每孔加入阿拉馬藍(lán)，并且所述板在37℃孵育4小時(shí)。熒光在波長530nm和590nm測量。對下面各情況計(jì)算遷移指數(shù)：((遷移指數(shù)[同種型對照]–遷移指數(shù)[抗體])*100)/(遷移指數(shù)[同種型對照])。遷移抑制百分比針對log[nM抗體]使用GraphpadPrism5作圖，以獲得滴定曲線。所述對人CXCL13誘導(dǎo)遷移的結(jié)果示于圖4A。所述結(jié)果表示為兩個(gè)hCXCL13誘導(dǎo)遷移和三個(gè)hSDF-1誘導(dǎo)遷移獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。在3D2、3C9和MAb801中抑制人CXCL13誘導(dǎo)遷移程度的差異對應(yīng)于人CXCL13親和性的差異(見上表2)。因此，對趨化因子(3D2)親和性最低的所述抗體似乎是人前B-hCXCR5趨化作用的最弱抑制劑，而有更高、幾乎相同親和性的抗體(MAb801和3C9)產(chǎn)生高百分比的細(xì)胞遷移抑制(圖4A)?？谷薈XCL13抗體(3D2、3C9或MAb801)無一對人前B-hCXCR4(5)細(xì)胞的人SDF-1α-介導(dǎo)的趨化作用產(chǎn)生任何影響(圖4B)。然而，陽性對照山羊抗人SDF-1α抗體(MAb87A)強(qiáng)烈抑制SDF-1α依賴性遷移。小鼠脾細(xì)胞的小鼠CXCL13依賴性遷移的抑制。就抑制小鼠脾細(xì)胞(獲自機(jī)械分離的脾)的重組小鼠CXCL13所介導(dǎo)趨化作用的能力測試抗CXCL13抗體。使用如上述與人CXCL13依賴性B細(xì)胞遷移試驗(yàn)基本相同的方案進(jìn)行所述試驗(yàn)，有較小改動，包含使用485nM(5μg/ml)rmuCXCL13，使用孔徑更小的transwell板(即用5μm孔徑和直徑6.5mm的Transwell組織培養(yǎng)處理板(康寧克斯公司:#3421))，和每孔使用更高量的細(xì)胞(106)。測試抗體對來自兩個(gè)不同小鼠品系C57/BL6和SJL的脾細(xì)胞遷移的影響分別示于圖5A和5B。MAb470用作陽性對照。包含大鼠和小鼠IgG以及人CXCL13特異性小鼠抗體3C9作為陰性對照。如圖5A和5B所示，MAb470和3D2之間的抑制模式不同。特別地，3D2以可滴定方式抑制趨化作用，然而MAb470的效果僅在最高抗體濃度396nM時(shí)明顯。生成P值>0.05的非配對t檢驗(yàn)分析比較3D2對C57Black/6和SJL/J遷移影響的數(shù)據(jù)，指示了兩個(gè)曲線之間沒有顯著區(qū)別。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.99)。3D2對SJL/J和C57Black/6脾細(xì)胞遷移影響的比較示于圖5C。顯示了兩個(gè)小鼠品系之間3D2抑制概況沒有顯著區(qū)別。實(shí)施例3抗CXCL13抗體抑制CXCL13介導(dǎo)的人CXCR5胞吞作用使用人CXCL13所介導(dǎo)人CXCR5受體胞吞作用的確立模型通過抗CXCL13抗體評價(jià)CXCL13趨化因子功能的抑制，例如CXCL13介導(dǎo)的CXCR5受體胞吞作用(Burke等,Blood110:2216-3325(2007))。抑制CXCL13介導(dǎo)的人CXCR5受體胞吞作用。趨化因子與其趨化因子受體的結(jié)合造成所述配體-受體復(fù)合物的內(nèi)化，隨后活化胞內(nèi)信號級聯(lián)(Neel等,ChemokineandGrowthFactorReviews16:637-658(2005))。修改Burkle等所述基于流動的方法以測定人和小鼠細(xì)胞中，3D2抑制CXCL13介導(dǎo)的CXCR5受體內(nèi)化的能力。對人CXCL13介導(dǎo)的胞吞作用而言，hCXCL13與3D2、MAb470或小鼠IgG(濃度為0、33、66、132、264和528nM)組合，并且在4℃孵育過夜。第二天，所述細(xì)胞在稀釋液(RPMI+0.5%BSA)中以107細(xì)胞/ml重新懸浮。用10μg/ml抗人Fc阻斷物在37℃預(yù)先阻斷所述細(xì)胞15分鐘。所述細(xì)胞然后用所述CXCL13/抗體混合物(50μl細(xì)胞:50μl混合物)在37℃孵育2小時(shí)。所述細(xì)胞然后用抗人CXCR5抗體(BD法敏公司（BDPharmingen）:#558113)在4℃染色30分鐘，并通過流式細(xì)胞儀分析。類似地，聯(lián)用mCXCL13和3D2或小鼠IgG(濃度為0、20、59、198和528nM)測試小鼠CXCL13介導(dǎo)的胞吞作用。如下計(jì)算胞吞作用的抑制:%抑制=100-[100*(0CXCL13-幾何平均數(shù))/(0CXCL13-0mAB)]。圖6顯示了來自代表性人和小鼠CXCL13實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖6A顯示了3D2抗體對485nM(5μg/ml)人CXCL13治療的人前B-697-hCXCR5細(xì)胞表面上CXCR5受體表達(dá)的影響。圖6B顯示了在用1000nM(10μg/ml)小鼠CXCL13預(yù)培養(yǎng)的Wehi-231細(xì)胞中，3D2介導(dǎo)的小鼠CXCR5受體內(nèi)化抑制。在兩個(gè)示例中，3D2有效并以可滴定方式干擾所述CXCL13誘導(dǎo)的CXCR5受體下調(diào)。圖6C顯示了從R2值等于1(小鼠胞吞作用)和0.994(人胞吞作用)的S型劑量反應(yīng)曲線(如圖所示)中計(jì)算的EC50值。用生成P值>0.05的非配對t檢驗(yàn)分析比較3D2對人和小鼠受體胞吞作用影響的數(shù)據(jù)，指示了在人CXCL13和小鼠CXCL13曲線之間沒有顯著區(qū)別。實(shí)施例4對多發(fā)性硬化的小鼠疾病模型中抗CXCL13抗體的評價(jià)多發(fā)性硬化的鼠模型。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是廣泛接受的多種硬化的動物模型。EAE是CNS的脫髓鞘性疾病，逐步造成主要靶向脊髓炎癥的上行性麻痹程度增加。所述疾病能呈現(xiàn)急性、慢性或復(fù)發(fā)緩解過程，所述過程依賴于誘導(dǎo)方法和使用的動物類型。因此，EAE能用CNS成分、肽誘導(dǎo)(主動誘導(dǎo))，并且也通過從一個(gè)動物向另一動物的細(xì)胞轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)(被動誘導(dǎo))。完全弗氏佐劑(CFA)與所述提取物或肽一起使用，并且經(jīng)常與百日咳毒素一起使用。RR-EAE-1:3D2對SJL小鼠中復(fù)發(fā)緩解EAE的影響。使用EAE主動免疫模型測試3D2抗體。在“RR-EAE-1”研究中，在SJL/J小鼠中通過5mg熱滅活結(jié)核分枝桿菌株H37RA增強(qiáng)的1mg/mlCFA中蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)139-151肽表位(HSLGKWLGHPDKF;SEQIDNO:1)皮下免疫來誘導(dǎo)復(fù)發(fā)緩解(RR)疾病。所述研究包含下列治療組:A.對照(小鼠IgG)，在第0天開始B.3D2，在第0天開始C.3D2，在評分≥1時(shí)開始給予所述小鼠腹膜內(nèi)注射0.3mg(15mg/kg)抗體，每周兩次。所述治療在第0天對組A和B開始，并且在臨床評分≥1時(shí)對組C(所述評分系統(tǒng)在下表3描述)開始。表3.評價(jià)EAE臨床癥狀的總結(jié)評分癥狀說明0正常行為無神經(jīng)學(xué)癥狀。1遠(yuǎn)端尾無力尾巴的遠(yuǎn)端部分無力且下垂。1.5完全尾無力全尾松弛且下垂。2翻正反射動物背臥時(shí)翻正困難。3共濟(jì)失調(diào)行走不穩(wěn)定-小鼠行走時(shí)后腿不穩(wěn)。4早期癱瘓小鼠難以靠其后腿站立，但仍能作少許移動。5完全癱瘓小鼠完全無法移動四肢，表觀較瘦且衰弱。6垂死/死亡在圖7所示，用3D2治療引起疾病緩解。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自9只小鼠的平均評分。使用單向ANOVA然后接Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值(GMS)。在對照組(小鼠IgG)和各3D2治療組(P<0.05)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，但是在兩個(gè)3D2治療組(P>0.05)之間沒有觀察到。甚至當(dāng)直到小鼠顯示了活性疾病（組C）才開始治療時(shí)，觀察到所述疾病衰減。RR-EAE-2:3D2對SJL小鼠中復(fù)發(fā)緩解EAE的影響。在誘導(dǎo)方案中使用百日咳毒素完成第二研究("RR-EAE-2")，以在更嚴(yán)重疾病模型中測試3D2。對于所述第二復(fù)發(fā)緩解EAE研究，用5mg熱滅活結(jié)核分枝桿菌株H37RA增強(qiáng)的1mg/mlCFA中PLP139-151皮下免疫SJL/J小鼠，并且在第0天和免疫后第2天腹膜內(nèi)給予100納克百日咳毒素。治療包含分別向下列組每兩周腹膜內(nèi)注射0.3mg(15mg/kg)抗體：A.對照(小鼠IgG)，在第0天開始B.3D2，在第0天開始C.3D2，在第7天開始D.3D2，在EAE發(fā)作(評分≥2)時(shí)開始RR-EAE-2的結(jié)果列于圖8。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示取自9只小鼠的平均評分。使用單向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)來比較組平均值。在對照(小鼠IgG)和各3D2治療組(P<0.05)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，但是在三個(gè)3D2治療組(P>0.05)之間沒有觀察到。再次，甚至當(dāng)治療在EAE癥狀發(fā)作（評分≥2）(組D)時(shí)開始，3D2治療對所述疾病嚴(yán)重性有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著影響。實(shí)施例5對狼瘡的小鼠疾病模型中抗CXCL13抗體的評價(jià)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的鼠模型。SLE是涉及多種器官的自身免疫疾病，其特性為異位生發(fā)中心的自發(fā)形成和針對大量核抗原的自身抗體生成。在狼瘡的鼠模型中測試抗CXCL133D2抗體的影響。狼瘡-俯臥新西蘭黑色品系（NewZealandBlack）X新西蘭白色（NewZealandWhite）品系F1(NZB/NZWF1)小鼠自發(fā)發(fā)展出高效價(jià)抗dsDNA抗體和腎小球中免疫復(fù)合物形成造成的嚴(yán)重增殖型腎小球性腎炎。SLE-1:治療晚期疾病。在研究"SLE-1"中，在蛋白尿癥≥2(蛋白尿癥評分系統(tǒng)在下表4中描述)的24-30周齡NZB/NZWF1小鼠中開始治療，并且所述治療持續(xù)8周。所述治療包含每兩周腹膜內(nèi)注射0.3mg(15mg/kg)3D2或小鼠IgG(對照)。表4.蛋白尿癥評分蛋白尿癥評分尿中[蛋白],mg/dl1+302+1003+300如圖9A所示，3D2治療使蛋白尿癥停止發(fā)展。使用良好確立的評分系統(tǒng)對腎進(jìn)行組織學(xué)分析(表5)也顯示了抗CXCL13治療的有益影響，因?yàn)?D2治療組的腎小球腎炎(GN)、間質(zhì)性腎炎(IN)、和血管炎(VI)病理學(xué)評分比對照組(小鼠IgG)低。參見圖9B。表5.腎病理學(xué)評分對于蛋白尿癥評分(圖9A)和腎病理學(xué)評分(圖9B)，各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示十次測量的平均值。用雙向ANOVA然后Bonferroni多重比較事后檢驗(yàn)（用于鑒定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)）沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。SLE-2:在有早期疾病(自體抗體誘導(dǎo)后，但是顯著蛋白尿癥前)的小鼠中的預(yù)防試驗(yàn)。在研究"SLE-2"中，治療在24周齡NZB/NZWF1小鼠中開始，并且持續(xù)12周。所述治療包含每兩周腹膜內(nèi)注射0.3mg(15mg/kg)3D2或小鼠IgG(對照)。如圖10A所示，3D2治療產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的蛋白尿癥進(jìn)展抑制，特別是在前8周治療中。8周后，3D2治療組中七分之零(0%)的小鼠和對照組中九分之四(44%)的小鼠有>2+蛋白尿癥評分。在12周治療結(jié)束時(shí)，平均尿蛋白為3D2治療的2.1+/-0.2對比小鼠IgG(對照)抗體的3.1+/-0.15。也在3D2治療組和小鼠IgG治療組的小鼠中測量腎病理學(xué)評分。腎小球腎炎(GN)和間質(zhì)性腎炎(IN)病理學(xué)評分的總結(jié)示于圖10B。在7只3D2治療組小鼠和9只小鼠IgG治療組小鼠中測量蛋白尿癥水平(圖10A)和腎病理學(xué)評分(圖10B)。組之間的蛋白尿癥評分顯著不同(P=0.0042;有Bonferroni多重比較測試的雙向ANOVA)。腎病理學(xué)評分沒有顯著區(qū)別(P>0.05)。盡管，平均病理學(xué)評分沒有顯著區(qū)別，在七分之二(29%)3D2治療組小鼠中有嚴(yán)重腎疾病的病理學(xué)證據(jù)，而九分之四(44%)對照組小鼠中顯示嚴(yán)重疾病的證據(jù)。注意到3D2阻斷CXCL13沒有防止自體抗體的發(fā)展(數(shù)據(jù)未顯示)。評價(jià)了3D2治療對狼瘡小鼠腎中生發(fā)中心(GC)和初級濾泡數(shù)目的影響。脾切片用GL-7(GC染色)、B220抗體(B細(xì)胞標(biāo)記)、或針對來自3D2治療和小鼠IgG治療(對照)NZB/NZWF1小鼠的濾泡型樹突細(xì)胞(FDC)的抗體來染色。圖11A-B中顯示了CXCL13抑制對脾淋巴結(jié)構(gòu)的影響。所述初級濾泡保持完整。用3D2治療的小鼠顯示了脾中自發(fā)生發(fā)中心(GC)尺寸和頻率的顯著下降。當(dāng)表示為初級:次級(GC)濾泡比率(p=0.19)時(shí)，用3D2(“tx”)治療的小鼠顯示了GC數(shù)目降低的趨勢(圖12A)，以及GC大小的顯著降低(p=0.03)(圖12B)。每組5只小鼠，值顯示為平均值+/-SEM。上述SLE結(jié)果顯示了3D2抗體對CXCL13的抑制引起狼瘡NZB/NZWF1小鼠模型中腎炎的下降，特別是在疾病的更早階段，并且可以影響脾結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6嵌合和人源化抗CXCL13單克隆抗體的制備分離3D2雜交瘤V基因和克隆嵌合3D2抗體。小鼠3D2抗體用作生成嵌合抗CXCL13單克隆抗體的原型。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從3D2雜交瘤中分離所述可變(V)基因。3D2的所述重鏈(H1609)和所述輕鏈(L0293)的多核苷酸和氨基酸序列示于圖13。所述VH和VK互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以下劃線顯示(分別是SEQIDNO:4、5、6、9、10和11)。所述可變重鏈（VH）基因克隆到含有人γ1重鏈基因的哺乳動物表達(dá)載體中，產(chǎn)生全長嵌合重鏈。所述可變鏈（VK）克隆到具有人κ恒定區(qū)基因的哺乳動物表達(dá)載體中，產(chǎn)生全長嵌合輕鏈。為了制備嵌合抗體，將含有嵌合重鏈和嵌合輕鏈的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到CHO-S細(xì)胞內(nèi)。產(chǎn)生的單克隆抗體(MAb)由細(xì)胞分泌，3-6天表達(dá)期之后收獲。利用蛋白質(zhì)A色譜純化所得MAb并進(jìn)行表征。所得嵌合IgG1抗體("MAb1476")通過ELISA顯示對人和小鼠CXCL13的特異性，顯示對小鼠和人CXCL13有相似的親和性，并且顯示有與親本小鼠抗體3D2相似的功能活性(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，在表位競爭ELISA中，MAb1476能與生物素化3D2和3C9競爭結(jié)合小鼠和人CXCL13(數(shù)據(jù)未顯示)。嵌合3D2的人源化(MAb1476)。嵌合3D2抗體的人源化概括如下。從嵌合MAb1476引入重鏈(H1609)和輕鏈(L0293)框架區(qū)(FWR)的修飾分別示于圖14A和14B。H1609中的推定N連接糖基化位點(diǎn)(Asn-Leu-Thr)用Ser-Leu-Thr取代(圖14A)。所述突變不影響抗體親和性(見表6)并且引起"MAb5080"生成。為了提高M(jìn)Ab5080親和性和功能，生成很多可變區(qū)突變，并且通過人CXCL13上的IC50ELISA篩選。L5055-CDR1位點(diǎn)31處的單個(gè)絲氨酸(S)-甲硫氨酸(M)突變以及所述輕鏈框架區(qū)的改變(見圖14B和15)引起"MAb5261"生成，其顯示了相較3D2和MAb5080的親和性顯著提高(表6)。所述氨基酸序列H1609(SEQIDNO:3)和H2177(SEQIDNO:13)的比較示于圖14A，并且L0293(SEQIDNO:8)、L5055(SEQIDNO:17)和L5140(SEQIDNO:15)的比較示于圖14B。表6.重組人和小鼠CXCL13的抗體親和性MAb5080VH和VK:H2177(SEQIDNO:13)和L5055(SEQIDNO:17)；以及MAb5261VH和VK:H2177(SEQIDNO:12)和L5140(SEQIDNO:15)的多核苷酸和氨基酸序列分別示于圖15。MAb5261對CXCL13的特異性:與3D2相似，MAb5261的特異性通過組中特異性ELISA和捕獲表位競爭ELISA評價(jià)，所述組包含重組趨化因子(重組小鼠、人和短尾猴CXCL13、人IL-8/CXCL8;人IP-10/CXCL10、人MIG/CXCL9和人SDF-1α/CXCL12);天然人和小鼠CXCL13;和各種非特異性抗原(重組人C35、鏈霉親和素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、胰島素和血紅蛋白)。對特異性ELISA而言，重組人、短尾猴和小鼠CXCL13各以100nM涂層。MAb5261顯示了對CXCL13的多物種特異性(圖16A-C)。重組人(圖16A)和短尾猴CXCL13(圖16B)上MAb5261的結(jié)合與其直接“親本”MAb5080的結(jié)合相當(dāng)，但是比MAb1476的結(jié)合更強(qiáng)(嵌合3D2)。相較MAb1476和MAb5080，MAb5261在結(jié)合重組小鼠CXCL13上顯著優(yōu)越(圖16C)。各趨化因子的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三重測量的平均值。從四參數(shù)S形曲線擬合中計(jì)算出EC50值(生成EC50值的所述曲線的R2是0.99)。MAb5261與天然人和小鼠CXCL13的結(jié)合通過捕獲表位競爭ELISA測定。對人ELISA而言，用6.6nMMAb801捕獲人CXCL13(1:4稀釋THP1上清液或者0.097nM)，并用0.66nM生物素-3C9檢測。對小鼠ELISA而言，用33nMMAb470捕獲小鼠CXCL13(1:40稀釋TNF-Tg器官提取物)，并用3.3nM生物素-3D2檢測。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的兩重測量的平均值。當(dāng)在天然人(圖17A)和小鼠CXCL13(圖17B)上進(jìn)行捕獲表位競爭ELISA測試時(shí)，MAb5261顯示了就結(jié)合人和小鼠天然CXCL13而言，比3D2和5080抗體更優(yōu)越。圖17A-B所示曲線使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合(R2=0.99)。實(shí)施例7抗CXCL13MAb5261的功能定性抑制人和小鼠B細(xì)胞遷移在穩(wěn)定細(xì)胞系人前B-697-hCXCR5和原代人扁桃體細(xì)胞上測試MAb5261抑制人CXCL13誘導(dǎo)人B細(xì)胞趨化的能力。使用上面實(shí)施例2所述的方案在穩(wěn)定細(xì)胞系人前B-697-hCXCR5上測試MAb5261對人CXCL13誘導(dǎo)人B細(xì)胞趨化的抑制。通過MAb5261抑制人前-B-697-hCXCR5細(xì)胞遷移示于圖18A。對人原代扁桃體細(xì)胞研究而言，所述扁桃體細(xì)胞獲自組織的機(jī)械分離。使細(xì)胞(106/5-μmTranswell板上室)在37℃向5μg/ml人CXCL13遷移2小時(shí)。通過MAb5261抑制人原代扁桃體細(xì)胞遷移示于圖18B。圖18A-B所示的結(jié)果表示來自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值+/-SEM。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.98-0.99)。如上面實(shí)施例2所述，在來自C57Black/6和SJL/J小鼠的小鼠脾細(xì)胞上評價(jià)MAb5261對小鼠CXCL13介導(dǎo)的小鼠B細(xì)胞趨化作用的影響。向人或鼠SDF-1α(0.1μg/ml)的遷移再次用作陰性對照以確?？贵w效果的CXCL13特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過MAb5261抑制脾細(xì)胞遷移示于圖19(來自代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示為兩次重復(fù)測量平均值+/-SD)?；谟孟鄳?yīng)同種型對照獲得的值計(jì)算遷移抑制值。如圖18和19所示，MAb5261抑制人和小鼠CXCL13依賴性趨化作用。在培養(yǎng)和原代細(xì)胞之間EC50值差異(見圖18)可能歸因于人CXCL13濃度的區(qū)別，如97nM(1μg/ml)用于人前-B-697-hCXCR5細(xì)胞遷移和485nM(5μg/ml)用于人扁桃體細(xì)胞遷移。抑制人CXCL13介導(dǎo)的人CXCR5受體胞吞作用。根據(jù)實(shí)施例3所述的方法，使用人CXCL13治療的人前B-697-hCXCR5細(xì)胞完成這個(gè)實(shí)驗(yàn)，以誘導(dǎo)人CXCR5受體的胞吞作用。人CXCL13的量是2μM，高于實(shí)施例3所示3D2胞吞作用試驗(yàn)中使用的量(即0.485μM)，因此觀察到EC50值的區(qū)別。通過MAb5261抑制CXCR5受體胞吞示于圖20。所示結(jié)果顯示為來自至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.99)。實(shí)施例8生成和定性抗CXCL13MAb5261的鼠樣式MAb5261包含人重和輕可變區(qū)，與人IgGamma1-F同種異型以及人κ。用小鼠IgG2a(γ2a鏈)工程改造鼠對應(yīng)物("MAb5378")。IgG2a同種型有與人IgG1緊密的相似性，包含固定補(bǔ)體和結(jié)合Fc受體的能力。MAb5378分別包含與MAb5261相同的重和輕鏈可變基因以及小鼠IgG2a恒定區(qū)和小鼠κ。所述重鏈和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒中的常見限制性位點(diǎn)能用于改變同種型。通過限制性消化、連接和轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)所述同種型物質(zhì)生成。特別地，對MAb5261重鏈而言，所述基因的可變區(qū)用限制性內(nèi)切核酸酶消化并且連接到表達(dá)質(zhì)粒的可比較位點(diǎn)，所述質(zhì)粒包含小鼠IgG2a恒定區(qū)從而生成MAb5378的重鏈(H5188)。相似地，對MAb5261輕鏈而言，所述基因的可變區(qū)用限制性內(nèi)切核酸酶消化并且連接到表達(dá)質(zhì)粒的可比較位點(diǎn)，所述質(zhì)粒包含小鼠Igκ恒定區(qū)從而生成MAb5378的輕鏈(L5153)。所述MAb5378輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽和氨基酸序列與MAb5261相同，并且示于圖21。所述VH和VK互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以下劃線顯示(分別是SEQIDNO:4、5、6、16、10和11)。MAb5378親和性測量。對重組人和小鼠CXCL13的MAb5378親和性測量通過使用與實(shí)施例1所述相似的方法測量。將Mab5378對重組人和小鼠CXCL13的親和性與MAb5261和3D2作比較。如表7所示，MAb5261和MAb5378對人和小鼠趨化因子的親和性測量(nM)相較3D2顯著提高。表7.5261、5378和3D2對重組人和小鼠CXCL13的親和性MAb5378表位作圖。進(jìn)行表位競爭ELISA實(shí)驗(yàn)以測定MAb5378是否在小鼠CXCL13上與MAb5261共有結(jié)合表位。用1μg/mlMAb470、5378或5261(對照)在板上捕獲重組小鼠CXCL13。用0.5μg/ml(3.3nM)生物素化MAb5261然后鏈霉親和素-HRP檢測抗體/趨化因子相互作用。所述研究也包含市售大鼠抗小鼠抗體MAb470。使用表位競爭ELISA評價(jià)經(jīng)MAb470或5378預(yù)培養(yǎng)小鼠CXCL13結(jié)合生物素化MAb5261的能力。顯示（圖22）MAb5378與MAb5261而不是MAb470，共有小鼠CXCL13結(jié)合表位。因此，MAb5378顯示了保留表位結(jié)合和親和性，對MAb5378而言需要這些以用作動物模型研究中MAb5261的替代物。另外，實(shí)施例通篇所述的表位結(jié)合結(jié)果能概括成：3D2、3C9、MAb1476、MAb5080、MAb5261和MAb5378都結(jié)合人CXCL13的相同表位。MAb5378對CXCL13的特異性。在重組人、小鼠和短尾猴CXCL13(圖23)和一組重組趨化因子和各種抗原(重組趨化因子(小鼠、人和短尾猴CXCL13、人IL-8/CXCL8、人IP-10/CXCL10、人MIG/CXCL9和人SDF-1α/CXCL12)；天然人和小鼠CCL13;和各種非特異性抗原(重組人C35、鏈霉親和素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、胰島素、血紅蛋白)上評價(jià)MAb5378的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。如實(shí)施例1所述進(jìn)行特異性ELISA。特別地，以100nM涂層各趨化因子。如圖23所示，MAb5378與小鼠抗體3D2和對照(小鼠IgG)作比較。在結(jié)合來自所有三個(gè)種類的趨化因子方面，MAb5378以各種程度優(yōu)于3D2。在小鼠CXCL13上觀察到最顯著的結(jié)合差異，顯示了動物研究中MAb5378比3D2的潛在優(yōu)勢。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三重測量的平均值。從四參數(shù)S形曲線擬合中計(jì)算出EC50值(生成EC50值的所述曲線的R2是0.99)。對MAb5378測試人和小鼠B細(xì)胞遷移的抑制。在遷移試驗(yàn)中分別使用實(shí)施例2、7和2所述的方法，測試MAb5378干擾小鼠和人B細(xì)胞的CXCL13依賴性趨化能力，所示試驗(yàn)涉及培養(yǎng)的(人前-B-697-hCXCR5細(xì)胞;圖24A)和原代(人扁桃體細(xì)胞;圖24B)人細(xì)胞以及小鼠脾細(xì)胞(圖24C)。所述趨化因子濃度是:用于人前B-697-huCXCR5遷移的97nMhuCXCL13;用于人扁桃體細(xì)胞遷移的485nMhuCXCL13;和用于小鼠脾細(xì)胞遷移的500nMmuCXCL13。向人或鼠SDF-1α的遷移用作陰性對照(未顯示)?；谟孟鄳?yīng)同種型對照獲得的值計(jì)算遷移抑制值。圖24A-C所示的結(jié)果顯示來自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值+/-SEM。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.99)。在人遷移試驗(yàn)中，將MAb5378與MAb5261作比較，和在小鼠遷移試驗(yàn)中，將MAb5378與3D2作比較。在兩個(gè)示例中，MAb5378成功抑制CXCL13誘導(dǎo)的人和小鼠細(xì)胞遷移，程度與MAb5261相當(dāng)并且略微優(yōu)于3D2。抑制人CXCL13介導(dǎo)的人CXCR5受體胞吞作用。使用實(shí)施例3所述的方法在人CXCL13介導(dǎo)人CXCR5受體內(nèi)化試驗(yàn)中，將MAb5378與其原型MAb5261和小鼠抗人CXCL13抗體3D2作比較。如圖25所示，在其抑制人CXCR5受體內(nèi)化能力上，MAb5378與MAb5261相同，并且顯著優(yōu)于3D2。MAb5261和MAb5378的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均測量。3D2和同種型對照的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自單個(gè)實(shí)驗(yàn)的三重測量的平均值。使用四參數(shù)S型曲線擬合來擬合曲線(R2=0.99)。實(shí)施例8對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠疾病模型中抗CXCL13抗體的評價(jià)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠模型。小鼠和大鼠中膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)是人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的充分確立模型。所述疾病通常由皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的牛II型膠原誘導(dǎo)，并且特性為生成小鼠抗體和隨后爪中關(guān)節(jié)炎的逐步發(fā)展。CIA-1:MAb5378在使用DBA1/J小鼠的CIA模型中的抗關(guān)節(jié)炎功效。所述疾病在DBA1/J小鼠中誘導(dǎo)，所述誘導(dǎo)通過用100μg熱滅活結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）H37Ra增強(qiáng)的CFA中100μg牛II型膠原皮下免疫，然后在第21天用不完全福氏佐劑(IFA)中100μg牛II型膠原加強(qiáng)免疫。所述動物每周三次對關(guān)節(jié)炎的目測癥狀進(jìn)行評分(見表8)，并且所述關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)通過加入個(gè)體爪評分來計(jì)算(在給定動物中能實(shí)現(xiàn)的所述最大關(guān)節(jié)炎指數(shù)是16)。表8.小鼠中CIA的目測癥狀關(guān)節(jié)炎評分說明0沒有可見的關(guān)節(jié)炎效應(yīng)11個(gè)足趾出現(xiàn)水腫和/或紅斑22個(gè)足趾出現(xiàn)水腫和/或紅斑3多于2個(gè)足趾出現(xiàn)水腫和/或紅斑4整個(gè)爪和全部足趾出現(xiàn)嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎在加強(qiáng)免疫的前一天開始預(yù)防治療，即有2-6低AI的動物誘導(dǎo)后第20天，并且由下列治療組組成(每組10只小鼠):A.小鼠IgG同種型（對照）B.MAb5378C.依那西普（etenercept）(TNF抑制劑;陽性對照)給予所述小鼠腹膜內(nèi)(小鼠IgG和MAb5378)或皮下(依那西普（etenercept）)注射0.6mg(30mg/kg)抗體，每周兩次持續(xù)三周。在誘導(dǎo)后第41天終止所述研究。如圖26所示，MAb5378預(yù)防治療引起疾病發(fā)展速度減慢和顯著抑制疾病嚴(yán)重性，這在研究終點(diǎn)變得明顯。在研究終點(diǎn)(第41天)，在小鼠IgG和MAb5378治療組之間(P<0.05)與小鼠IgG和依那西普治療組(P<0.05)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。所述MAb5378的抑制影響與陽性對照試劑依那西普的抑制影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。CIA-2:MAb5378在CIA模型DBA1/J小鼠中的抗關(guān)節(jié)炎功效。進(jìn)行用MAb5378的第二CIA研究，“CIA-2”。在這個(gè)研究中，如上就CIA-1所述，在DBA1/J小鼠中誘導(dǎo)所述疾病。在誘導(dǎo)后第20天有低AI2-6值的動物中，在加強(qiáng)免疫前1天再次開始預(yù)防性治療。除了依那西普，市售大鼠抗鼠CXCL13抗體MAb470用作對照。因此所述研究包含下列組:A.小鼠IgG同種型對照B.MAb5378C.依那西普（etenercept）(TNF抑制劑;陽性對照)D.MAb470給予所述小鼠腹膜內(nèi)(小鼠IgG、MAb470和MAb5378)或皮下(依那西普（etenercept）)注射0.6mg(30mg/kg)抗體，每周兩次持續(xù)三周。在誘導(dǎo)后第42天終止所述研究。如圖27所示，在整個(gè)研究以及所述終點(diǎn)(第42天)，MAb5378預(yù)防性治療再次引起疾病發(fā)展速度減慢和顯著抑制疾病嚴(yán)重性。在小鼠IgG和MAb5378治療組之間(P<0.05)與小鼠IgG和MAb470治療組(P<0.05)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。所述MAb5378的抑制影響與陽性對照試劑依那西普和大鼠抗鼠CXCL13抗體MAb470的抑制影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。GC-1:MAb5378對免疫BALB/c小鼠中生發(fā)中心形成的影響。鑒于抗CXCL13抗體在自身免疫的動物模型中的成功表現(xiàn)，測試了涉及破壞異位生發(fā)中心形成的可能作用機(jī)制。檢測了用沉淀于100ul明礬的100μg4-羥基-3-硝基苯乙酰-雞-g-球蛋白(NP-CGG)所免疫的MAb5378治療BALB/C小鼠中的生發(fā)中心。所述動物用總共0.6mg(30mg/kg)小鼠同種型對照(0.6-mg每周注射)或MAb5378(0.3-mg每兩周注射)腹膜內(nèi)注射一周。所述注射在NP-GCC免疫前一周開始，并且在NP-GCC免疫后持續(xù)一周。在攻擊后第10天評價(jià)生發(fā)中心形成。就各種B細(xì)胞(活化的GCB細(xì)胞;濾泡和邊緣區(qū)B細(xì)胞)和T細(xì)胞(CD4+和CD8+)亞組的存在而言，通過流式細(xì)胞儀分析獲自脾和淋巴結(jié)的單個(gè)細(xì)胞懸液。盡管MAb5378對T細(xì)胞或?yàn)V泡和邊緣區(qū)B細(xì)胞沒有產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)，生發(fā)中心B細(xì)胞(B220+/CD38low/PNA+)分別在脾和淋巴結(jié)中下降43%和41%(圖28)。使用未配對學(xué)生t檢驗(yàn)比較脾組平均值。MAb5378治療脾相較小鼠IgG治療組有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的GC-B細(xì)胞下降(P<0.05)。從淋巴結(jié)恢復(fù)的所述細(xì)胞數(shù)目非常低，并且因而積聚(結(jié)果，沒有用來自淋巴結(jié)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)。實(shí)施例9對螺桿菌感染的小鼠模型中抗CXCL13抗體的評價(jià)螺桿菌感染的鼠模型。螺桿菌物種如海爾曼螺桿菌和幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)患者中的胃MALT淋巴瘤。螺桿菌誘導(dǎo)的胃淋巴濾泡的小鼠模型描述于Nobutani等,FEMSImmunolMedMicrobiol60:156-164(2010)，其通過引用全文納入本文。本文使用所述Nobutani等小鼠模型以測試抗CXCL13抗體在減少胃淋巴濾泡中的影響。用于此實(shí)施例的海爾曼螺桿菌感染小鼠的治療方案和抗體給予示于圖29。特別地，用海爾曼螺桿菌感染C57BL/6J小鼠。感染后一周開始，每周給予所述小鼠同種型抗體對照或抗CXCL13抗體(MAb5378)，共12周?？笴XCL13MAb5378(小鼠IgG2a同種型)在PBS,pH7.2中以3mg/ml配制。在感染后第7天開始并在其后每周，用200微升(600微克)腹膜內(nèi)注射小鼠。所述同種型對照是非依賴性單克隆小鼠IgG2a抗體。通過PCR評價(jià)小鼠胃樣品的海爾曼螺桿菌特異性16srRNA基因的表達(dá)以確證感染。PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括1x反應(yīng)緩沖液[20mMTris/HCl(pH8.0)、100mMKCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、0.5%吐溫（Tween）-20、0.5%NonidetP40和50%甘油]，其含有1單位TaqDNA聚合酶(日本大阪的東洋有限公司(TOYOBO));10nmol各脫氧核苷三磷酸;10pmol各寡核苷酸引物;和1μl稀釋DNA，通過用DNA濃度約20-100ng/μl的1:10稀釋的原始樣品來制備，終體積為50μl。16srRNA反應(yīng)的循環(huán)條件包括35輪循環(huán)的94℃30秒、56℃30秒、和72℃30秒。所述海爾曼螺桿菌特異性16srRNA基因PCR引物如下所示：F:5’-TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA-3’(SEQIDNO:24)R:5’-GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT-3’(SEQIDNO:25)獲自海爾曼螺桿菌感染小鼠的所有胃樣品中擴(kuò)增的海爾曼螺桿菌特異性16srRNA基因的表達(dá)結(jié)果示于圖30。這些結(jié)果顯示所有經(jīng)治療小鼠對海爾曼螺桿菌感染都為陽性。海爾曼螺桿菌感染小鼠的胃粘膜中CXCL13的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)定量PCR測定海爾曼螺桿菌感染和未感染小鼠的胃粘膜中CXCL13mRNA表達(dá)的水平。海爾曼螺桿菌感染小鼠相較未感染野生型對照小鼠在感染1個(gè)月或3個(gè)月后胃粘膜中CXCL13mRNA表達(dá)的水平分別示于圖31A和31B。這些結(jié)果顯示了海爾曼螺桿菌感染小鼠中CXCL13表達(dá)的增加。抗體治療的海爾曼螺桿菌感染小鼠的胃粘膜中CXCL13的表達(dá)。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR測定用同種型對照和抗CXCL13抗體治療后，海爾曼螺桿菌感染小鼠的胃粘膜中CXCL13的表達(dá)水平。所述胃的粘膜和粘膜下層從肌層和絨毛膜中除去，并且然后用1mlTRIZOLRegent(英杰公司)勻質(zhì)化。根據(jù)生產(chǎn)商說明書，從勻漿物中提取RNA。根據(jù)生產(chǎn)商方案，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems）)對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括1x反應(yīng)緩沖液[20mMTris/HCl(pH8.0)、100mMKCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、0.5%吐溫-20、0.5%NonidetP40和50%甘油]，其含有1單位TaqDNA聚合酶(日本大阪的東洋有限公司);10nmol各脫氧核苷三磷酸;10pmol各寡核苷酸引物;和1μl稀釋DNA，通過用DNA濃度約100ng/μl的1:10稀釋的原始樣品來制備，終體積為50μl。所述CXCL13和β肌動蛋白反應(yīng)的循環(huán)條件包括94℃2分鐘，35輪循環(huán)的94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘。圖32顯示同種型對照或抗CXCL13抗體治療后，海爾曼螺桿菌感染小鼠胃中CXCL13和β肌動蛋白對照mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果顯示CXCL13在未感染的野生型小鼠中不表達(dá)，但是在所有海爾曼螺桿菌感染小鼠中表達(dá)?？笴XCL13抗體治療減少螺桿菌感染小鼠中的胃淋巴濾泡。海爾曼螺桿菌感染后三個(gè)月，切除小鼠胃，并且在較大彎部打開。半個(gè)胃包埋入石蠟中，所述石蠟包埋組織進(jìn)行切片并且用蘇木精和伊紅(H&E)染色。圖33顯示來自同種型對照（左圖）和抗CXCL13抗體（右圖）治療小鼠胃的H&E染色圖片。對同種型對照和抗CXCL13抗體樣品計(jì)數(shù)胃淋巴濾泡的數(shù)目。所述結(jié)果示于圖33的下圖。這些結(jié)果顯示相對于對照治療，抗CXCL13抗體治療的海爾曼螺桿菌感染小鼠中胃濾泡降低。以上具體實(shí)施方式的描述完全揭示了本發(fā)明的一般性質(zhì)，通過應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的知識，他人無需過多實(shí)驗(yàn)即能很容易地就各種應(yīng)用改良和/或修改這些具體實(shí)施方式而不背離本發(fā)明總體理念。因此，基于本文所列出的教導(dǎo)和指南，這些修改和改良意在包括于所公開實(shí)施方式的含義和等同物范圍之內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解本文中的措詞和術(shù)語僅僅是描述性的而非限制性的,從而本說明書的術(shù)語或措詞可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述教導(dǎo)和指南解讀。本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)受限于任何上述示例性實(shí)施方式，而應(yīng)僅根據(jù)下列權(quán)利要求書和其等同項(xiàng)來定義。