專利名稱：含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域，特別涉及一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物及其制備方法，以及其作為生物醫(yī)用材料的潛在應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是目前用于癌癥及先天性免疫系統(tǒng)疾病治療的一種有效方法。該技術(shù)實(shí)施的關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒ǎM(jìn)而使基因能夠在細(xì)胞中獲得安全、 高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)。病毒載體因其高風(fēng)險(xiǎn)性、機(jī)體免疫反應(yīng)、不能大規(guī)模生產(chǎn)等缺陷在臨床應(yīng)用方面受到限制，因此具有高轉(zhuǎn)染效率的脂質(zhì)體及其它陽(yáng)離子聚合物日益受到重視。樹枝狀大分子是近年發(fā)展起來(lái)的一類具有三維規(guī)整結(jié)構(gòu)、高度支化和納米尺度的單分散性高分子材料，憑借其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)、無(wú)免疫原性、可生物降解、易于修飾等特性在基因載體方面顯示出重要應(yīng)用前景。1993年，Haensler等首次嘗試將聚酰胺-胺(PAMAM)用于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(BioconjugateChemistry 1993,4:372-379)。目前， PAMAM及其衍生物已被廣泛用作基因載體研究，在特定條件下，其基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性方面已優(yōu)于聚乙烯亞胺(PEI)等常用的基因載體(Cancer Letters 2010,298 :34-49 ； MolecularPharmaceutics 2010,5:1734-1746)。這其中，將樹枝狀基兀與多臂分子結(jié)合制備星型陽(yáng)離子聚合物成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。星形陽(yáng)離子聚合物由于其發(fā)散的分子結(jié)構(gòu)、臂數(shù)、臂長(zhǎng)及陽(yáng)離子的分布等參數(shù)易于設(shè)計(jì)和調(diào)節(jié)，在基因傳遞方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Uekama等通過化學(xué)偶聯(lián)將β -⑶連接到PAMAM的外圍,研究表明連接環(huán)糊精分子后的PAMAM抗血衆(zhòng)降解破壞的能力增強(qiáng)，其基因轉(zhuǎn)染能力明顯提高(Bioconjugate Chemistry 2003,14 :247-254)。Deng等通過點(diǎn)擊化學(xué)方法高效合成得到結(jié)構(gòu)規(guī)整的星型 β-CD-PAMAM,并將其用于基因與藥物的共傳遞研究(Journal of Materials Chemistry 2011，21，5273-5281)。然而，PAMAM在較高代數(shù)或較高濃度下仍顯示出明顯的細(xì)胞毒性，且其降解產(chǎn)物也有較大的毒性，使其在體內(nèi)實(shí)際應(yīng)用中受到限制。因此，如何得到生物相容性好、結(jié)構(gòu)規(guī)整可控的新型基因載體材料，便成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域亟待解決的重要課題。迄今為止，通過點(diǎn)擊化學(xué)方法合成星型環(huán)糊精接枝樹枝狀聚賴氨酸及其應(yīng)用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽(yáng)離子聚合物；該聚合物結(jié)構(gòu)規(guī)整、易于調(diào)控，分子量分布單一，生物相容性好，可生物降解，在基因傳遞方面顯示出重要應(yīng)用前景。本發(fā)明的另一目的在于提供上述含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽(yáng)離子聚合物的制備方法；該方法首先通過取代反應(yīng)合成疊氮基團(tuán)修飾的β-CD，通過連續(xù)交替的偶聯(lián)、脫保護(hù)反應(yīng)合成3代含炔基PLLD ;然后通過點(diǎn)擊化學(xué)方法將疊氮基團(tuán)修飾的β -CD
上述含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物的制備方法，包括以下操作步驟··(I)疊氮基團(tuán)修飾的β-環(huán)糊精(β_⑶-N3)的合成a、稱取三苯基膦溶解于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室溫條件下加入碘單質(zhì)，升溫至55 70°C ;再加入干燥的β-環(huán)糊精(β-ra)，N2氣氛下反應(yīng)24 48 小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴條件下加入甲醇鈉溶液; 所得產(chǎn)物在甲醇中沉淀4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -環(huán)糊精
與含炔基PLLD偶聯(lián)，合成得到可用作基因載體的星型陽(yáng)離子聚合物。本發(fā)明的再一目的在于提供上述含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽(yáng)離子聚合物作為基因載體材料在制備基因藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物，所述星型陽(yáng)離子聚合物的分子式如下
權(quán)利要求
1.一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物，其特征在于所述星型陽(yáng)離子聚合物的分子式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟(I)疊氮基團(tuán)修飾的β_環(huán)糊精的合成a、稱取三苯基膦溶解于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中，然后在室溫條件下加入碘單質(zhì)，升溫至55 70°C;再加入干燥的β -環(huán)糊精,N2氣氛下反應(yīng)24 48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺，冰水浴條件下加入甲醇鈉溶液；所得產(chǎn)物在甲醇中沉淀 4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -環(huán)糊精；b、將步驟a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-環(huán)糊精與疊氮鈉溶解于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中，N2氣氛下升溫至50 70°C后反應(yīng)24 48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去無(wú) 7jC N, N- 二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸餾水中進(jìn)行沉淀，再用去離子水反復(fù)洗滌3 5次，室溫條件下真空干燥，得到疊氮基團(tuán)修飾的環(huán)糊精；(2)含炔基的樹枝狀聚賴氨酸的合成CU代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將干燥的炔丙胺和N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護(hù)5 20分鐘后，再加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，然后在室溫條件下反應(yīng)12 24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺，所得產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應(yīng)2 4小時(shí)后減壓蒸餾除去溶劑，所得產(chǎn)物用無(wú)水乙醚洗滌后真空干燥，得到I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；d、2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將步驟c所得I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護(hù) 5 20分鐘后，加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室溫條件下反應(yīng)24 48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應(yīng)2 4小時(shí)，然后減壓蒸餾除去溶劑；所得產(chǎn)物用無(wú)水乙醚洗滌后真空干燥，得到2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；e、3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將步驟d所得2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護(hù) 5 20分鐘后，加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室溫條件下反應(yīng)24 48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應(yīng)2 4小時(shí)，然后減壓蒸餾除去溶劑；所得產(chǎn)物用無(wú)水乙醚洗滌后真空干燥，得到3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；(3)星型陽(yáng)離子聚合物的合成將步驟b所得疊氮基團(tuán)修飾的β-環(huán)糊精和步驟e所得3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護(hù)20 30分鐘后，加入硫酸銅和抗壞血酸鈉，升溫至40 50°C反應(yīng)24 48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于透析袋中透析2 3 天，冷凍干燥，得到星型陽(yáng)離子聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(I) (3)所述室溫為5 35 0C ；步驟(I) (2)所述無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺的制備方法按照以下操作步驟將氫化鈣加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌6 24小時(shí)，然后減壓蒸懼，得到無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺，所述氫化鈣的加入量以每500mL N, N- 二甲基甲酰胺中加入I 2克計(jì)；步驟a所述干燥的β-環(huán)糊精的制備方法按照以下操作步驟將β-環(huán)糊精置于真空干燥箱中，50 80°C條件下干燥12 48小時(shí)；步驟c所述干燥的炔丙胺的制備方法按照以下操作步驟將氫化鈣加入到炔丙胺中攪拌6 24小時(shí)，然后減壓蒸餾，得到干燥的炔丙胺；所述氫化鈣的加入量以每IOmL炔丙胺中加入O. I O. 2克計(jì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所述β-環(huán)糊精、三苯基膦和碘單質(zhì)的摩爾比為I : I. 2 I. 5 I. 4 1.6 ;所述無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5 20克干燥的環(huán)糊精計(jì)；所述甲醇鈉溶液中甲醇鈉的摩爾數(shù)為干燥的 β -環(huán)糊精摩爾數(shù)的I. 5 2. O倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所述七(6-碘基-6-去氧)-β-環(huán)糊精與疊氮鈉的摩爾比為I : 8 12;所述無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 20克七(6-碘基-6-去氧)-β -環(huán)糊精計(jì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟c所述炔丙胺、N，N’- 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : O. 9 I. O I. O I. 2 I. O 1.2 ;所述無(wú)水Ν，Ν-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 10克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計(jì)；所述過柱分離是使用硅膠規(guī)格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比2 8 I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產(chǎn)物；所述三氟乙酸的使用量為分離產(chǎn)物質(zhì)量的5 10倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟d所述I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : 2. 2 2. 4 2. 4 2. 8 2. 4 2. 8 ;所述無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 15克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計(jì)； 所述過柱分離是使用硅膠規(guī)格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比5 12 I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產(chǎn)物； 所述三氟乙酸的使用量為分尚產(chǎn)物質(zhì)量的5 10倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟e所述2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : 4. 2 4. 8 4. 4 5. O 4. 4 5. O ;所述無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10 20克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計(jì)；所述過柱分離是使用硅膠規(guī)格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比12 18 : I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產(chǎn)物； 所述三氟乙酸的使用量為分離產(chǎn)物質(zhì)量的5 10倍；所述3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的分子式如下
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述疊氮基團(tuán)修飾的β_環(huán)糊精、含炔基樹枝狀聚賴氨酸、硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為I : 8 10 : 4 5 : 10 15 ;所述無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5 10克疊氮基團(tuán)修飾的 β -環(huán)糊精計(jì)；所述透析袋的截留分子量為1000 3000。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的星型陽(yáng)離子聚合物作為基因載體材料在制備基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物及其制備方法和應(yīng)用。該方法包括如下操作步驟先通過取代反應(yīng)在β-環(huán)糊精C6位上引入疊氮基團(tuán)，同時(shí)利用炔丙胺與N，N’-二叔丁氧羰基-L-賴氨酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)以及重復(fù)多步的縮合、脫保護(hù)反應(yīng)合成含炔基的樹枝狀聚賴氨酸，然后將上述兩產(chǎn)物通過點(diǎn)擊化學(xué)方法偶聯(lián)得到含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PLLD。所得聚合物具有結(jié)構(gòu)規(guī)整、易于調(diào)控、分子量分布單一、生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，有望在基因治療領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08B37/16GK102604114SQ201210005079
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者張黎明, 曹凱迪, 陳弟虎, 馬棟 申請(qǐng)人:中山大學(xué)