專利名稱：一種牛膝多糖的提取與純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分提取方法，尤其涉及的是一種牛膝多糖(ABP)的提取與純化方法。
背景技術(shù)：
i^B (Radix Achyranthis Bidentatae) ^ iItl 41 0 (Achyranthes bidentata Bi.)的干燥根，它具有活血、通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功用。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，牛膝被用于治療多種疑難雜癥，而且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床也證實(shí)牛膝對(duì)很多疾病有確切療效。又因其原植物牛膝分布廣泛，資源豐富，很有開發(fā)價(jià)值。牛膝含有多種次生代謝產(chǎn)物，如齊墩果酸及其皂甙、蒽醌類化合物、黃酮類化合物、生物堿、蛻皮素等，它們都具有生理活性。牛膝還含有較高比例的可溶性多糖。牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides,ABP) 有顯著的抗癌、抗放射、抗肝炎、抗衰老等功效，而且具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。牛膝多糖又有分子量小，水溶性好，毒性低的優(yōu)點(diǎn)，不但可以口服，還可以注射，是一種很有前景的治療用多糖藥物。提取、分離、純化牛膝多糖就顯得特別重要，總多糖含量及純度較高的牛膝多糖可為其藥理及制劑研究提供原料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種牛膝多糖的提取與純化方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下牛膝多糖的提取與純化方法，包括以下步驟Al牛膝多糖的粗提將新鮮牛膝根曬至干皺，含水份< 7 %，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩；稱取約60目牛膝根粉，裝入多功能提取罐，加工業(yè)乙醇，加熱80°C回流4h ；濾除乙醇，殘?jiān)鼫p壓蒸發(fā)至干，再裝入提取罐；每次加蒸餾水，在100°C下攪拌提取3次，每次時(shí)間分別為^i、4h、;3h ；3次提取液合并，加熱至沸，在攪拌下緩緩加入鞣酸溶液，待反應(yīng)完全，繼續(xù)煮沸15min，加入三次合并的提取液重量的2%活性炭，攪拌lOmin，抽濾除去沉淀及活性炭，得無(wú)色澄清濾液；濾液經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析至無(wú)鞣酸為止；然后真空濃縮至約為三次合并的提取液原體積的1/10 ；濃縮液內(nèi)加入3倍重量的80%乙醇，調(diào)PH至10，得白色沉淀；沉淀用80% 乙醇洗滌幾次，然后依次用90%、95(%和無(wú)水乙醇脫水，601真空干燥，得粗品ABP。A2牛膝多糖的純化A21 DEAE-Sepharose fast-flow 柱色譜ABP粗品溶于lOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6. 8，使其濃度約為30%，每次上樣量 60L ；DEAE-Sepharose fast-flow柱預(yù)先用上述緩沖液平衡，上樣后，用同樣緩沖液洗脫，流速約300ml/min，按旋光檢測(cè)收集多糖組份，然后減壓濃縮；A22 Sephadex G-150 柱色譜
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濃縮液ikphadex G-150柱，用0. 2mol/L NaCl洗脫，按旋光檢測(cè)收集多糖組分； 經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析脫鹽，減壓濃縮，冷凍干燥，得白色凍干粉ABP。目前有關(guān)牛膝多糖的提取、分離、純化方法所提取牛膝多糖的含量和純度都較低。 采用本發(fā)明的方法提高了總多糖的含量及其純度。


圖1為苯酚-硫酸法測(cè)定牛膝多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1試驗(yàn)方法1.1牛膝多糖的粗提將新鮮牛膝根曬至干皺(含水份< 7% )，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩。稱取約60 目牛膝根粉200kg，裝入多功能提取罐，加工業(yè)乙醇400L，加熱80°C回流4h。濾除乙醇(回收)，殘?jiān)鼫p壓蒸發(fā)至干，再裝入提取罐。每次加蒸餾水300L，在10(TC下攪拌提取3次，每次時(shí)間分別為^i、4h、;3h。3次提取液合并，加熱至沸，在攪拌下緩緩加入鞣酸溶液，待反應(yīng)完全(至滴入鞣酸溶液不出現(xiàn)混濁時(shí)為止)，繼續(xù)煮沸15min，加入2%的活性炭，攪拌 lOmin，抽濾除去沉淀及活性炭，得無(wú)色澄清濾液。濾液經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析至無(wú)鞣酸為止。然后真空濃縮至約為原體積的1/10。濃縮液內(nèi)加入3倍量的80%乙醇，調(diào) PH至10，得白色沉淀；沉淀用80%乙醇洗滌幾次，然后依次用90%、95%和無(wú)水乙醇脫水， 60°C真空干燥，得粗品ABP約48kg。1.2牛膝多糖的純化1. 2. 1 DEAE-Sepharose fast-flow 柱色譜ABP粗品溶于lOmmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6. 8)，使其濃度約為30%，每次上樣量 60L。DEAE-Sepharose fast-flow柱(30 X 45cm)預(yù)先用上述緩沖液平衡，上樣后，用同樣緩沖液(含lmol/L NaCI)洗脫，流速約300ml/min，按旋光檢測(cè)收集多糖組份，然后減壓濃縮。1. 2. 2 Sephadex G-150 柱色譜濃縮液ikphadex G-150柱GX 47cm)，用0. 2mol/L NaCl洗脫，按旋光檢測(cè)收集多糖組分。經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析脫鹽，減壓濃縮，冷凍干燥，得白色凍干粉ABP 約 1. 16kgo1. 3多糖含量的測(cè)定1. 3. 1最大吸收波長(zhǎng)的選擇精確稱取105°C干燥至恒重的葡萄糖24. 76mg，定容至100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻。精確吸取該溶液0. 5ml，加水1. 5ml，加入5 %苯酚溶液1.0ml,濃硫酸5. Oml， 室溫放置15min，然后置100°C恒溫水浴中加熱15min，取出，冷水中冷卻至室溫。以蒸餾水 2. Oml同上法作空白對(duì)照，于380 580nm范圍內(nèi)測(cè)定吸收度，其最大吸收波長(zhǎng)為490nm。1. 3. 2牛膝總多糖樣品液的制備取干燥至恒重的牛膝約0. 5g(5份)，精確稱取，用95%乙醇回流lh，醇提后藥材揮散醇后用IOOml蒸餾水回流lh，提取多糖，過(guò)濾，藥渣用熱水洗滌3次，合并濾液和洗液，置于500ml容量瓶中用蒸餾水定容，使其濃度約20μ g/ml，供總多糖含量分析用。1.3. 3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以干燥至恒重的葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱取，用蒸餾水溶解定容，使其濃度為 1. 16μ g/μ 1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。另外取苯酚10g，加水150mL溶解，置于棕色瓶?jī)?nèi)，即苯酚試液。 精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液10，20，40，60，80，100μ 1，分別置于有塞的試管中，各加蒸餾水使體積為 lml，再各加苯酚試液1.0ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5. 0ml，搖勻后置沸水浴中加熱15min， 取出冷卻至室溫；另取蒸餾水1ml，加苯酚和硫酸，同上操作為空白對(duì)照。用721型分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸收度，以吸收度(A)為橫坐標(biāo)，濃度(C)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1)，得到回歸方程:C = 138. 07A-1. 4216，R2 = 0. 9993。1.3. 4總多糖的含量測(cè)定精確吸取樣品液Iml按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸收度，根據(jù)回歸方程，求得牛膝中總多糖平均含量為28. 86%，RSD = 2. 30，η = 5。1. 3. 5穩(wěn)定性試驗(yàn)提取供試液，每隔30min測(cè)定一次吸光度，連續(xù)6次，以考察其穩(wěn)定性。結(jié)果在顯色池內(nèi)吸收度值無(wú)變化。1. 3. 6回收率測(cè)定精確稱取牛膝樣品1. Og (3份)，再分別精確加入一定量標(biāo)準(zhǔn)牛膝多糖(0. 5g)，按樣品溶液制備和多糖含量測(cè)定項(xiàng)進(jìn)行操作，計(jì)算回收率平均值為99. ll%,RSD=1.92,n = 5。1. 4純度鑒定高壓液相色譜法(HPLC)分析柱TSK-2000SW，洗脫液為雙蒸水，流速為1. OmL/ min，檢測(cè)方式為示差檢測(cè)(RI)。經(jīng)粗提取后進(jìn)行純化得到的牛膝多糖經(jīng)HPLC分析柱，示差檢測(cè)(RI)，測(cè)得其純度為98. 62 %。2 小結(jié)本方法中牛膝根經(jīng)熱水提取、乙醇分級(jí)沉淀，酸去除蛋白質(zhì)，再經(jīng)DEAE-kpharose fast-flow柱和kphadex G-150凝膠過(guò)濾，洗脫液對(duì)蒸餾水透析、凍干，得到純度為 98. 62%的牛膝多糖。因此，本方法提取、分離、純化的牛膝多糖能作為其生物學(xué)功能研究的實(shí)驗(yàn)樣品。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種牛膝多糖的提取與純化方法，其特征在于，包括以下步驟Al牛膝多糖的粗提將新鮮牛膝根曬至干皺，含水份< 7%，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩；稱取約60目牛膝根粉， 裝入多功能提取罐，加工業(yè)乙醇，加熱80°C回流4h ；濾除乙醇，殘?jiān)鼫p壓蒸發(fā)至干，再裝入提取罐；每次加蒸餾水，在100°C下攪拌提取3次，每次時(shí)間分別為^i、4h、;3h ；3次提取液合并，加熱至沸，在攪拌下緩緩加入鞣酸溶液，待反應(yīng)完全，繼續(xù)煮沸15min，加入三次合并的提取液重量的2%活性炭，攪拌lOmin，抽濾除去沉淀及活性炭，得無(wú)色澄清濾液；濾液經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析至無(wú)鞣酸為止；然后真空濃縮至約為三次合并的提取液原體積的1/10 ；濃縮液內(nèi)加入3倍重量的80%乙醇，調(diào)PH至10，得白色沉淀；沉淀用80%乙醇洗滌幾次，然后依次用90%、95(%和無(wú)水乙醇脫水，601真空干燥，得粗品ABP ；A2牛膝多糖的純化A21 DEAE-Sepharose fast-flow 柱色譜ABP粗品溶于lOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6. 8，使其濃度約為30%，每次上樣量60L ； DEAE-Sepharose fast-flow柱預(yù)先用上述緩沖液平衡，上樣后，用同樣緩沖液洗脫，流速約 300ml/min,按旋光檢測(cè)收集多糖組份，然后減壓濃縮；A22 Sephadex G-150 柱色譜濃縮液ikphadex G-150柱，用0. 2mol/L NaCl洗脫，按旋光檢測(cè)收集多糖組分；經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析脫鹽，減壓濃縮，冷凍干燥，得白色凍干粉ABP。
全文摘要
本發(fā)明公開了牛膝多糖的提取與純化方法，包括以下步驟A1牛膝多糖的粗提；A2牛膝多糖的純化A21 DEAE-Sepharose fast-flow柱色譜ABP粗品溶于10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.8，使其濃度約為30％，每次上樣量60L；DEAE-Sepharose fast-flow柱預(yù)先用上述緩沖液平衡，上樣后，用同樣緩沖液洗脫，流速約300ml/min，按旋光檢測(cè)收集多糖組份，然后減壓濃縮；A22 Sephadex G-150柱色譜濃縮液上Sephadex G-150柱，用0.2mol/L NaCl洗脫，按旋光檢測(cè)收集多糖組分；經(jīng)中空纖維透析器對(duì)蒸餾水透析脫鹽，減壓濃縮，冷凍干燥，得白色凍干粉ABP。采用本發(fā)明的方法提高了總多糖的含量及其純度。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102558380SQ20121001654
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者陳清華 申請(qǐng)人:陳清華