一種β-葡聚糖、其提取方法及用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種β-葡聚糖，其提取方法及其用途，具體而言，本發(fā)明涉及一種從灰樹(shù)花子實(shí)體中提取得到的一種β-葡聚糖，其提取方法，以及其在制備用于治療或預(yù)防腫瘤或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。

背景技術(shù)：
自從1971年美國(guó)總統(tǒng)尼克松簽署《國(guó)家癌癥法》向癌癥宣戰(zhàn)四十年以來(lái)，雖然癌癥的研究和防治取得了很大的進(jìn)步，但目前癌癥始終還是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的主要疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO的統(tǒng)計(jì)，全球每年癌癥患者的死亡人數(shù)高達(dá)六百萬(wàn)，繼心血管疾病、傳染性和寄生蟲(chóng)病之后位居第三位，并且在2015年將屈居第二[2]。對(duì)于癌癥(惡性腫瘤)的治療，由于傳統(tǒng)的放療和化療往往會(huì)具有常見(jiàn)的骨髓抑制、免疫抑制、白細(xì)胞減少等血液系統(tǒng)毒性。而近幾年來(lái)出現(xiàn)的包括細(xì)胞治療，疫苗治療，抗體藥物治療等在內(nèi)的免疫治療(Immunotherapy)作為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種癌癥治療方式將逐步成為癌癥治療的主要手段[3]。而其中利用真菌提取的多糖(尤其是β-葡聚糖)作為典型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BiologicalResponseModifiers，BRM)[4]或者免疫調(diào)節(jié)劑(Immunomodulator)通過(guò)動(dòng)員機(jī)體免疫系統(tǒng)間接達(dá)到抗腫瘤的作用越來(lái)越受到重視，并且在合并放、化療來(lái)聯(lián)合治療腫瘤將更有其臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)有的研究表明，多糖尤其是β-葡聚糖，在機(jī)體內(nèi)主要通過(guò)結(jié)合免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(PatternRecognitionReceptors，PRRs)進(jìn)而激活信號(hào)傳導(dǎo)，并最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及CTL細(xì)胞的活化和增殖，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫清除。同時(shí)多糖還能通過(guò)誘導(dǎo)釋放細(xì)胞因子(如TNF-α)以及激活補(bǔ)體系統(tǒng)而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體液免疫清除。目前發(fā)現(xiàn)的PRRs包括Dectin-1、補(bǔ)體受體3(CR3)、清道夫受體(Sc)、乳糖基神經(jīng)酰胺受體(LacCer)以及Toll樣受體(TLRs)等[5]。灰樹(shù)花，在日本稱(chēng)為“舞茸(Maitake)”，是一種藥、食兼用蕈菌，屬擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱目多孔菌科樹(shù)花菌屬。野生的灰樹(shù)花主要產(chǎn)于日本，在封建社會(huì)日本的民間主要由于其極佳的美味而用于烹調(diào)食材。直到上世紀(jì)八十年代，日本學(xué)者才對(duì)其中提取的多糖及其免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤的藥用價(jià)值進(jìn)行了深入研究[6]。Mizuno等曾經(jīng)從灰樹(shù)花的子實(shí)體中分離得到29個(gè)多糖組分，其中有20個(gè)具有抗腫瘤作用[7]，而對(duì)灰樹(shù)花的多糖組分及其抗腫瘤作用研究的最多的主要是有兩種：Grifolan(GRN)和MD組分。在20世紀(jì)80年代，Ohno等從灰樹(shù)花的子實(shí)體，培養(yǎng)的菌絲體以及液體培養(yǎng)基中分離得到了具有同樣結(jié)構(gòu)的每三個(gè)單元就連接一個(gè)1,6-β分支的β-(1,3)葡聚糖，命名為Grifolan(GRN)[8]。體外和體內(nèi)研究表明GRN具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用并且是通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子以及合成NO等免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。但是GRN在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中口服給藥并沒(méi)有體現(xiàn)抗腫瘤效果[10]。隨后，Namba等通過(guò)專(zhuān)有的提取工藝從灰樹(shù)花中分離得到了一種口服有效的MD組分[11]。MD組分由β-1,3分支的β-1,6葡聚糖，β-1,6分支的β-1,3葡聚糖以及蛋白質(zhì)組成，糖和蛋白的比例在80:20～99:1之間。研究表明MD組分通過(guò)激活宿主免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，它能激活巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞以及自然殺傷NK細(xì)胞同時(shí)誘導(dǎo)Th1主導(dǎo)的反應(yīng)[12]。另外，MD組分還能通過(guò)誘導(dǎo)臍帶血細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF增強(qiáng)生血作用以減少化療藥物阿霉素的副作用[13]以及動(dòng)員粒細(xì)胞治療環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的粒細(xì)胞減少癥[14]。目前，MD組分在I/II期臨床實(shí)驗(yàn)的乳腺癌患者身上也體現(xiàn)了免疫效果和抗腫瘤作用[15]。除此之外，也有很多從灰樹(shù)花中分離得到的組分具有抗高血壓，抗糖尿病，抗高膽固醇，以及抗HIV，HBV感染的報(bào)道[16]。本發(fā)明則利用一種簡(jiǎn)單有效的分離純化方法，從灰樹(shù)花子實(shí)體中提取獲得了一種均一的全新結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖(GFPBW2)，并對(duì)其免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用進(jìn)行了研究。主要參考文獻(xiàn)：1.MarshallE.CancerResearchandthe$90BillionMetaphor.Science,2011,331:1540-1541.2.WHO.TheGlobalBurdenofDisease:2004Update.Geneva:WorldHealthOrganization,2008.3.Dillman,RO."Cancerimmunotherapy."CancerBiotherRadiopharm,2011,26(1):1-64.4.LeungMY,LiuC,KoonJC,FungKP.Polysaccharidebiologicalresponsemodifiers.Immunologyletters,2006,105(2),101-114.5.ChenJ,SeviourR.Medicinalimportanceoffungalbeta-(1-->3),(1-->6)-glucans.MycolRes,2007,111(Pt6),635-652.6.MayellM.Maitakeextractsandtheirtherapeuticpotential.Alternativemedicinereview:ajournalofclinicaltherapeutic,2001,6(1):48-60.7.MizunoT,OhsawaK,HagiwaraN,KuboyamaR.FractionationandcharacterizationofantitumorpolysaccharidesfromMaitake,Grifolafrondosa.AgricBiolChem,1986,50,1679-16888.TadaR,AdachiY,IshibashiK,OhnoN.Anunambiguousstructuralelucidationofa1,3-beta-D-glucanobtainedfromliquid-culturedGrifolafrondosabysolutionNMRexperiments.CarbohydrRes,2009,344(3),400-404.9.HashimotoT,OhnoN,AdachiY,YadomaeT.Nitricoxidesynthesisinmurineperitonealmacrophagesbyfungalbeta-glucans.BiolPharmBull,1997,20(9),1006-1009.10.OhnoN,AdachiY,SuzukiI,OikawaS,SatoK,OhsawaM,YadomaeT.Antitumoractivityofabeta-1,3-glucanobtainedfromliquidculturedmyceliumofGrifolafrondosa.JPharmacobiodyn,1986,9(10),861-864.11.USPatentNo.5,854,404,1998.12.KodamaN,HaradaN,NanbaH.Apolysaccharide,extractfromGrifolafrondosa,inducesTh-1dominantresponsesincarcinoma-bearingBALB/cmice.JpnJPharmacol,2002,90(4),357-360.13.LinH,CheungSW,NesinM,CassilethBR,Cunningham-RundlesS.Enhancementofumbilicalcordbloodcellhematopoiesisbymaitakebeta-glucanismediatedbygranulocytecolony-stimulatingfactorproduction.ClinVaccineImmunol,2007,14(1),21-27.14.ItoK,MasudaY,YamasakiY,YokotaY,NanbaH.Maitakebeta-glucanenhancesgranulopoiesisandmobilizationofgranulocytesbyincreasingG-CSFproductionandmodulatingCXCR4/SDF-1expression.IntImmunopharmacol,2009,9(10),1189-1196.15.DengG,LinH,SeidmanA,FornierM,D'AndreaG,WesaK,YeungS,Cunningham-RundlesS,VickersAJ,CassilethB.AphaseI/IItrialofapolysaccharideextractfromGrifolafrondosa(Maitakemushroom)inbreastcancerpatients:immunologicaleffects.JCancerResClinOncol,2009,135(9),1215-1221.16.MayellM.Maitakeextractsandtheirtherapeuticpotential.Alternativemedicinereview:ajournalofclinicaltherapeutic,2001,6(1):48-60.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明利用一種簡(jiǎn)單有效的多糖提取工藝和方法，以灰樹(shù)花子實(shí)體為原料獲得了一種新的均一的β-葡聚糖(GFPBW2)，藥理實(shí)驗(yàn)表明GFPBW2能通過(guò)激活原代巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，而體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明GFPBW2具有免疫調(diào)節(jié)功能及相應(yīng)的抗腫瘤活性。因此GFPBW2有望開(kāi)發(fā)成為一種免疫調(diào)節(jié)劑作為抗腫瘤藥物或者輔佐藥物而用于臨床。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從灰樹(shù)花子實(shí)體分離提取出的具有確定化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的β-葡聚糖(GFPBW2)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該β-葡聚糖的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含有效劑量范圍的根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖作為有效成分，并且其可進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體及輔料。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該β-葡聚糖作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該β-葡聚糖在制備用于治療或預(yù)防腫瘤或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該β-葡聚糖在制備用于輔助治療腫瘤的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種β-葡聚糖GFPBW2，其結(jié)構(gòu)為其中，n為10～20。所述β-葡聚糖GFPBW2的重均分子量為約16,000～約35,000Da。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種提取根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖的方法，包括以下步驟：(1)將灰樹(shù)花子實(shí)體用C1～C6醇浸泡進(jìn)行脫脂處理；(2)將脫脂處理后的灰樹(shù)花子實(shí)體用沸水進(jìn)行提取；(3)將用沸水提取處理過(guò)的灰樹(shù)花子實(shí)體用堿溶液進(jìn)行提取，得到的提取液用酸中和，對(duì)流動(dòng)水透析，濃縮，用C1～C6醇沉淀；(4)將步驟(3)中得到的沉淀經(jīng)柱層析進(jìn)行分離，以水，約0.08-約0.12mol/L和約0.18-約0.22mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行分段洗脫，其中將用約0.18-約0.22mol/L的氯化鈉溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)濃縮、透析和干燥得到根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖。以下將對(duì)根據(jù)本發(fā)明的提取β-葡聚糖的方法進(jìn)行更詳細(xì)地描述。在上述方法中，所述C1～C6醇指的是具有1-6個(gè)碳原子的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、叔丁醇、戊醇、己醇等，優(yōu)選為乙醇，更優(yōu)選為95％乙醇。在步驟(1)中，對(duì)脫脂處理的條件沒(méi)有特別限制，只要能夠去除灰樹(shù)花子實(shí)體中的脂類(lèi)化合物即可。所述脫脂處理可以在室溫下或者在加熱條件下進(jìn)行。對(duì)所述脫脂處理的時(shí)間沒(méi)有具體限制，只要能夠去除灰樹(shù)花子實(shí)體中的脂類(lèi)化合物即可，但是可以根據(jù)具體脫脂處理的條件確定。當(dāng)通過(guò)在室溫下浸泡進(jìn)行脫脂處理時(shí)，優(yōu)選在3天至5周的范圍內(nèi)。在脫脂處理后，任選可以包括將脫脂處理后的灰樹(shù)花子實(shí)體干燥的步驟。所述干燥可以是風(fēng)干。在步驟(2)中，所述沸水提取用于去除灰樹(shù)花子實(shí)體中的水溶性多糖。對(duì)進(jìn)行沸水處理的時(shí)間和次數(shù)沒(méi)有特殊限制，只要檢測(cè)提取液測(cè)糖含量至糖反應(yīng)不明顯即可。所述沸水提取可以進(jìn)行1-6次，優(yōu)選3-5次，每次可以進(jìn)行2-10小時(shí)，優(yōu)選4-8小時(shí)。在步驟(3)中，所述堿溶液提取用于提取灰樹(shù)花子實(shí)體中的堿溶性多糖。對(duì)所述堿溶液提取的條件沒(méi)有具體限制，只要提取出灰樹(shù)花子實(shí)體中的堿溶性多糖即可。所述堿溶液提取可以在0-40℃，優(yōu)選0-10℃下用堿溶液浸泡1-24小時(shí)，優(yōu)選6-18小時(shí)。對(duì)所用的堿沒(méi)有特別限制，只要能夠提取灰樹(shù)花子實(shí)體中的堿溶性多糖即可。所述的堿可以是NaOH、KOH、LiOH、BaOH、CaOH2、Na2CO3、K2CO3等，優(yōu)選為NaOH。堿溶液的重量百分比濃度可以為1％-10％，優(yōu)選為3％-7％。用于中和的酸沒(méi)有特別限制，為本領(lǐng)域中常用的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸，如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸等，優(yōu)選為鹽酸。在步驟(4)對(duì)所述干燥的條件沒(méi)有具體限制，但是優(yōu)選為冷凍干燥。根據(jù)本發(fā)明的上述方法優(yōu)選還包括：在步驟(4)前，將步驟(3)得到的沉淀用C1～C6醇和丙酮依次洗滌并干燥。根據(jù)本發(fā)明的上述方法優(yōu)選還包括：在步驟(4)前，將步驟(3)中得到的沉淀用蒸餾水溶解，然后離心除去不溶物的步驟。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖在制備用于治療或預(yù)防腫瘤或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。所述腫瘤包括涉及多種組織系統(tǒng)的實(shí)體瘤，包括胃癌，肝癌，胰腺癌，卵巢癌，宮頸癌，膀胱癌，前列腺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤等，還包括可能的急性淋巴細(xì)胞白血病，慢粒性白血病等血液系統(tǒng)癌癥以及其它未特別指出的各種原發(fā)、繼發(fā)性惡性腫瘤以及惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖可經(jīng)口服或不經(jīng)過(guò)口給藥。經(jīng)口服給藥時(shí)，首先使該類(lèi)化合物與常規(guī)的藥用輔劑(如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等)混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式；非經(jīng)口給藥時(shí)，可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時(shí)，可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的β-葡聚糖GFPBW2作為有效成分，并且其可進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體及輔料。所述藥物組合物可以用于治療或預(yù)防腫瘤，或抑制腫瘤生長(zhǎng)。附圖說(shuō)明圖1是根據(jù)本發(fā)明制備實(shí)施例1的灰樹(shù)花β-葡聚糖GFPBW2的分離純化示意圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的β-葡聚糖GFPBW2的紅外光譜(IR)圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的β-葡聚糖GFPBW2的13CNMR譜圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的β-葡聚糖GFPBW2的激活巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的β-葡聚糖GFPBW2的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和抗S-180腹水型肉瘤細(xì)胞同種移植瘤活性的圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，以下實(shí)施方式只以舉例的方式描述本發(fā)明。很明顯，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)內(nèi)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變通和修改。需要了解的是，本發(fā)明意欲涵蓋在所附權(quán)利要求書(shū)中包括的變通和修改。儀器：高效凝膠過(guò)濾色譜(HPGPC)：Agilent1200Series系統(tǒng)，配置為G1311AQudrapump，G1329AALS自動(dòng)進(jìn)樣器，G1362A示差檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，DADG1315D紫外檢測(cè)器，AgilentChemstation控制系統(tǒng)及GPC數(shù)據(jù)處理軟件。兩根多糖專(zhuān)用凝膠色譜柱串聯(lián)：ShodexsugarKS-804和KS-805(8mm×300mm，磺酸化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物凝膠，排阻極限分別為4×105和5×106Da)，色譜條件：以10mM的NaOH為流動(dòng)相，柱溫為40℃，流速為每分鐘0.8ml，進(jìn)樣量為40μl。LKB恒溫系統(tǒng)(瑞典LKB公司)，BSZ-100自動(dòng)部分收集器和HL-2恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)，Modulyo型冷凍干燥器(英國(guó)Edwords公司)，Labconco18型冷凍干燥器(英國(guó)Labconco公司)，日立20PR-52D型高速離心機(jī)(日本Hitachi公司)，電熱恒溫真空干燥箱(上海醫(yī)療器械七廠)，Buchi461型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA-N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，725N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精科儀器有限公司)。藥品和試劑：灰樹(shù)花子實(shí)體購(gòu)自于上海大山公司。DEAE-cellulose購(gòu)于Whatman公司；透析袋(分子截留為3500Da)和二甲亞砜(DMSO)為Merck公司產(chǎn)品。其他試劑來(lái)源與上海國(guó)藥集團(tuán)。制備實(shí)施例1灰樹(shù)花β-葡聚糖GFPBW2的分離純化如圖1所示，灰樹(shù)花β-葡聚糖GFPBW2的分離純化過(guò)程如下。1、脫脂干燥的灰樹(shù)花子實(shí)體(3公斤)加25L的95％乙醇浸泡2周，每周更換乙醇一次。之后，離心分離，過(guò)濾，固體物晾干。2、水提脫脂后的干品用沸水提取，每次加水20升，提取時(shí)間為5-6小時(shí)，以苯酚硫酸法檢測(cè)提取液的糖含量，直至糖反應(yīng)不明顯，共計(jì)提取4次。合并后獲得水提部分。3、堿提水提取結(jié)束后的固體殘?jiān)?℃下用5％NaOH浸泡過(guò)夜，離心，用約2mol/L的HCl中和至PH約7，出現(xiàn)渾濁，對(duì)流動(dòng)水透析2天，濃縮，加入3倍體積的95％的乙醇醇沉，8000rpm離心收集沉淀，經(jīng)無(wú)水乙醇和丙酮依次洗滌后，于40℃真空干燥，得50g棕黃色固體，為堿提多糖(GFPb，產(chǎn)率為1.6％)。4、純化取10g堿提多糖GFPb，加入適量蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAE-纖維素(氯型)柱層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.1，0.2和0.3mol/L的NaCl溶液洗脫，分別收取各流份，其中從0.2mol/LNaCl溶液洗脫組分中獲得β-葡聚糖組分GFPBW2(115mg)。檢測(cè)分析：經(jīng)高效凝膠柱層析(HPGPC)分析表明多糖組分GFPBW2的重均分子量為27.3kDa。比旋度[α]D＝-11°(c2.5H2O)。多糖GFPBW2經(jīng)糖組成分析為一葡聚糖。如圖2所示，紅外光譜中，無(wú)1730cm-1左右的糖醛酸吸收峰，提示該β-葡聚糖為一中性糖。如圖3所示，13CNMR譜中，位于δ103.69ppm的碳信號(hào)，提示該多糖的葡萄糖殘基為吡喃環(huán)型，且糖苷鍵連接方式為β型。13CNMR譜中，位于103.850ppm的碳信號(hào)，提示該多糖的葡萄糖殘基為吡喃環(huán)型，且糖苷鍵連接方式為β型。在13CNMR譜的非異頭碳區(qū)域，位于87ppm左右的C-3取代信號(hào)以及69.37ppm左右的C-6取代信號(hào)，從該圖可以看出C-6取代的比例大于C-3取代。而在δ170ppm附近沒(méi)有峰出現(xiàn)則進(jìn)一步說(shuō)明GFPBW2不含糖醛酸。β-葡聚糖GFPBW2中糖殘基連接方式的種類(lèi)以及比例用甲基化分析得到闡明。甲基化方法(Needs法)如下：取干燥多糖樣品6～8mg于甲基化反應(yīng)瓶中，加入2ml干燥DMSO，密塞，室溫?cái)嚢?5min，使樣品完全溶解，加入預(yù)先研磨成粉狀的NaOH約20mg，繼續(xù)攪拌10min，然后冰浴約5min，在冰水浴下緩慢滴加約0.3ml碘甲烷，然后在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)30min。減壓除去過(guò)量的碘甲烷后，溶液對(duì)去離子水透析24h(2L×4),透析內(nèi)頁(yè)減壓濃縮至2～3ml，加入等體積的氯仿萃取。氯仿層保留，丟棄水層。重復(fù)3次。用氮?dú)鈱⒙确麓蹈?，加入少量蒸餾水后冷凍干燥。重復(fù)甲基化反應(yīng)3～4次，取少量樣品進(jìn)行IR光譜檢測(cè)，當(dāng)IR譜圖中在3300cm-1左右的O-H振動(dòng)吸收峰消失時(shí)，表明該多糖樣品已經(jīng)完全甲基化；否則表明樣品未甲基化完全，還需要繼續(xù)進(jìn)行甲基化反應(yīng)1～2次。結(jié)果表明，GFPBW2的葡萄糖殘基有四種連接方式，分別為1,3-、1,6-、1,3,6-以及末端連接葡萄糖基，其比例為1:1.5:1:1。為了闡明該多糖的主鏈為1,3-還是1,6-葡聚糖，我們進(jìn)行了Smith降解以及部分酸水解反應(yīng)。Smith降解后從袋內(nèi)得到一多糖，HPGPC測(cè)量為8000Da，產(chǎn)率為20％，甲基化分析可知，1,6-連接的比例明顯下降，為10％，說(shuō)明該多糖為一1,3-葡聚糖。通過(guò)部分酸水解，得到一次級(jí)多糖，其重均分子量為17.7KD，且寡糖部分經(jīng)過(guò)液相分析，沒(méi)有四糖以上的寡糖出現(xiàn)。只有三糖、二糖以及單糖。綜上所述，該多糖的結(jié)構(gòu)為：藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)驗(yàn)實(shí)施例11、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備a)處死ICR小鼠(6～8周，雌性，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，用75％酒精浸泡5min，取出小鼠，置于無(wú)菌紙上，腹面朝上。b)剪開(kāi)小鼠下腹部皮膚，完全暴露腹膜。c)10ml注射器裝上大號(hào)針頭，用鑷子提起腹膜，向腹腔中注入6ml冷的PBS。。d)用剪刀在腹膜上剪開(kāi)一個(gè)小口，然后迅速用無(wú)針頭注射器通過(guò)開(kāi)口插入腹腔內(nèi)吸出細(xì)胞懸液。e)將細(xì)胞懸液200g離心10min(德國(guó)Eppendorf公司)，用PBS洗一次，用RPMI1640+10％FBS培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×106個(gè)細(xì)胞/ml。f)細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)箱(SerialII，美國(guó)Thermo公司)，37℃培養(yǎng)2h后，吸棄上清，用預(yù)熱RMPI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)洗二次，留下貼壁細(xì)胞，即為腹腔巨噬細(xì)胞，純度一般大于90％。2、細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，具體方法如下：a)捕獲抗體1︰180用PBS稀釋?zhuān)尤隕LISA板(Costar，美國(guó)Corning公司)中，100μl每孔，封板膜封板后，4℃包被過(guò)夜。b)第二天，用洗滌液(含0.5％Tween-20的PBS)洗滌3次后，用含1％BSA的PBS，100μl每孔，封板膜封板后，室溫封閉1h。c)洗滌液洗滌3次，加入用稀釋液(含0.1％BSA的PBS)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣品，100μl每孔，封板膜封板后，室溫孵育2h。d)洗滌液洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體(稀釋液1︰180稀釋)，100μl每孔，封板膜封板后，室溫孵育2h。e)洗滌液洗滌3次，加入HRP-鏈親和素(Streptavidin)(1︰200稀釋)，100μl每孔，封板膜封板后，室溫孵育0.5h。f)洗滌3次，加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色底物，100μl每孔，顯色10～20min，加入終止液(1MH2SO4)，100μl每孔。g)酶標(biāo)儀(Novostar，德國(guó)BMGLabtech公司)檢測(cè)450nm吸光度(OD450)。將制備實(shí)施例1制備的β-葡聚糖GFPBW2配置成不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml)來(lái)處理上述從ICR小鼠分離的腹腔巨噬細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)4小時(shí)后，按照上述細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的水平，其結(jié)果列于圖4中，其中*表示p<0.05同空白組(0μg/ml)相比具有顯著差別。圖4表明，GFPBW2能夠劑量依賴(lài)地誘導(dǎo)小鼠腹腔居留巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子TNFα(圖4A)和IL-6(圖4B)的分泌。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2體內(nèi)對(duì)小鼠S-180移植瘤模型的抗腫瘤作用評(píng)價(jià)a)復(fù)蘇S-180細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，RPMI1640+10％FBS培養(yǎng)傳2代后，收集細(xì)胞，用PBS重懸至1-2×106個(gè)細(xì)胞/0.2ml/鼠，腹腔注射(i.p.)接種ICR或者BALB/cnu/nu小鼠(6～8周，雌性，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。b)8-9天后，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)取0.5ml種鼠腹部腹水，放置于冰上，直接用PBS稀釋3-6倍后，接種到新的ICR小鼠腹腔。第二代以后，在6-7天的時(shí)候傳代，三代后可用于實(shí)驗(yàn)。c)第0天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，處死種鼠后，吸取腹水。經(jīng)過(guò)一定的稀釋后(一般為1︰1-1︰4，細(xì)胞濃度為1×107～5×107個(gè)細(xì)胞/ml之間)，接種到小鼠的右側(cè)腋下。d)腋下接種24h后，隨機(jī)分組，每組12只，腹腔注射(i.p.)不同劑量的用生理鹽水配制的GFPBW2溶液(0.1，0.4，2mg/kg體重)，同時(shí)設(shè)溶媒組以及陽(yáng)性藥30mg/kg環(huán)磷酰胺(CTX，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)組，每天1次，連續(xù)腹腔注射給藥10天。e)第11天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，處死小鼠，剝?nèi)ツ[瘤，稱(chēng)瘤重。采用制備實(shí)施例1制備的β-葡聚糖GFPBW2利用上述體內(nèi)對(duì)小鼠S-180移植瘤模型的抗腫瘤作用評(píng)價(jià)方法，GFPBW2每天1次腹腔注射給藥ICR荷S-180肉瘤小鼠不同劑量(0.1mg/kg、0.4mg/kg、2mg/kg)連續(xù)10天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖5中，其中*表示p<0.05，溶媒組相比具有顯著差別。**表示p<0.01，具有極其顯著差別。如圖5中所示，10天后，同單獨(dú)給溶媒(Vehicle)相比，GFPBW2能夠劑量依賴(lài)地抑制S-180肉瘤在ICR小鼠皮下的生長(zhǎng)(圖5A)，卻對(duì)免疫缺陷的BALB/cnu/nu裸鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)移植S-180的生長(zhǎng)沒(méi)有影響(圖5B)，這說(shuō)明GFPBW2通過(guò)激活免疫系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用的。