專利名稱：b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莢膜多糖純化技術(shù)領(lǐng)域，特別是ー種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化ェ藝。
背景技術(shù)：
流感嗜血桿菌迄今仍是導(dǎo)致人類侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌(Hib)引起，是導(dǎo)致2歲以下嬰幼兒腦膜炎和細(xì)菌性肺炎的主要病因。全世界估計毎年至少造成300萬例嚴(yán)重疾病和40萬 70萬人死亡，已成為全球性的一大公共衛(wèi)生問題。在エ業(yè)化國家和發(fā)展中國家，疫苗接種都是唯一能迅速降低Hib疾病發(fā)病的公 共衛(wèi)生措施。將Hib疫苗納入兒童常規(guī)免疫規(guī)劃的國家多數(shù)在數(shù)年內(nèi)就實(shí)際上消除了 Hib嚴(yán)重病例。由于細(xì)菌對ー些最有效的抗生素耐藥性正在不斷増加，通過疫苗預(yù)防Hib疾病就變得比以往更為重要。在Hib疫苗制備的過程中，莢膜多糖的制備是關(guān)鍵的步驟。在我國多采用和流行性腦膜炎球菌以及傷寒Vi多糖提取相似的エ藝來提取Hib莢膜多糖。此エ藝采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與酸性多糖形成季胺絡(luò)合物從而沉淀多糖。但是CTAB對核酸、蛋白質(zhì)也有不同程度的沉淀作用，因此要獲得純度較高的莢膜多糖，必須進(jìn)一歩去除一起沉淀的核酸和蛋白質(zhì)。常規(guī)的去除蛋白質(zhì)的方法是將Hib粗制多糖溶解于飽和中性醋酸鈉溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根據(jù)粗制多糖中含有的蛋白的情況，此步驟通常需要重復(fù)數(shù)次。該エ藝的缺點(diǎn)是會使用大量的苯酚，苯酚是ー種強(qiáng)腐蝕性的高毒性物質(zhì)，對人的皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。人吸入高濃度苯酚氣體可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等。皮膚接觸可致灼傷?？山?jīng)灼傷皮膚吸收，經(jīng)一定潛伏期后引起急性腎功能衰竭。同時，該エ藝會產(chǎn)生大量的廢棄苯酚，對水體和大氣可造成污染，對環(huán)境有嚴(yán)重危害。隨著對環(huán)保意識的增強(qiáng)，以及對工人工作環(huán)境狀況的重視，人們一直在尋找合適的方法來避免在疫苗制造過程中使用象苯酚這樣有毒的化學(xué)試劑。使用現(xiàn)代的技術(shù)對傳統(tǒng)的生產(chǎn)エ藝進(jìn)行改進(jìn)以減少或棄用有毒化學(xué)試劑對于保護(hù)人類健康以及減少環(huán)境污染都具有重要的意義。Hib粗多糖的制備參照文獻(xiàn)公開的方法(Anderson等，1977. INFECTION ANDIMMUNITY. 15(2) :472 477)。培養(yǎng)基采用CY培養(yǎng)基，I升培養(yǎng)基含IOg酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，Img氯化血紅素，Img輔酶1,0. IM磷酸鹽緩沖液,培養(yǎng)基的pH值為7. 6。培養(yǎng)溫度為37 °C，振蕩速度為220rpm，待菌種濃度OD66tl為O. 5后接種至發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)，維持培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度150rpm，培養(yǎng)8 IOh后加入濃度為O. 5% (v/v)的甲醛殺菌，收獲時菌液濃度OD66tl > 4. O0殺菌后的培養(yǎng)液采用IOOOOrpm離心30min沉淀菌體，收集上清液。將CTAB加入上清液中，CTAB與上清液的重量體積比(w/v)為I : 1000，室溫攪拌lh，得到的混合液IOOOOrpm離心30min后收集CTAB與Hib莢膜多糖的復(fù)合物沉淀。沉淀用O. 5 IM氯化鈉溶液溶解，室溫攪拌2小吋，使Hib莢膜多糖與CTAB解離。加入4°C預(yù)冷的無水こ醇至こ醇終濃度為25% (v/v)，4°C攪拌過夜。IOOOOrpm離心30min，收集上清液，上清液中繼續(xù)加入無水こ醇至こ醇終濃度為75% (v/v)，4°C攪拌過夜，IOOOOrpm離心30min，收集沉淀。沉淀用無水こ醇和丙酮各洗滌兩次，最終得到的沉淀即為Hib莢膜多糖粗多糖。國外的Pato 等人(Pato 等，2006. Purification of capsular polysaccharideirom Neisseria menmgitides serogroup C Dy 丄lquia chromatography. Jouranl oiChromatography B. 832 :262)通過層析法對C群流腦莢膜多糖進(jìn)行了了純化探索。根據(jù)b型流感嗜血桿菌莢膜多糖可以用陽離子型去污劑十六烷基三甲基溴化銨沉淀這ー現(xiàn)象推斷該類多糖是帶有負(fù)電荷的酸性多糖，按照離子交換層析的理論可以選用陰離子交換層析進(jìn)行純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供ー種安全有效、減輕對人體和環(huán)境危害的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、用緩沖液A平衡離子交換層析柱2個柱體積直至電導(dǎo)基線平穩(wěn)并且與上柱之前的緩沖液的電導(dǎo)值一致；b、用20mM Tirs, 1% (w/v)脫氧膽酸鈉，pH8. O溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖濃度為5 10mg/ml，用0. 45 μ m的濾膜澄清過濾后，將濾液上樣于已經(jīng)平衡好的離子交換層析柱；C、采用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫，監(jiān)測吸收波長為206nm和280nm的吸收曲線，收集206nm吸收值較高，280nm吸收值較低的洗脫峰；d、將收集的洗脫峰上樣于預(yù)先用生理鹽水平衡好的S^hadex G_25凝膠柱，監(jiān)測吸收波長為206nm的吸收曲線，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化樣品。所述的緩沖液A為20mM Tirs，pH8. O溶液；所述的緩沖液B為20mM Tris, IM NaCl，pH8. O溶液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明制備的Hib多糖的質(zhì)量指標(biāo)可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。2、本發(fā)明的純化過程不使用苯酚，避免了對人體健康和環(huán)境造成的危害。3、本發(fā)明通過凝膠過濾層析改變離子交換洗脫液的緩沖體系，使所獲得的洗脫液可以直接用于制劑的配制，而無須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少了處理步驟中可能造成的污染與損失。4、本發(fā)明操作簡單、方便，有利于規(guī)?；a(chǎn)。 本發(fā)明制備的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的質(zhì)量指標(biāo)如下表
權(quán)利要求
1.b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝，其特征在于它包括以下步驟 a、用緩沖液A平衡離子交換層析柱2個柱體積直至電導(dǎo)基線平穩(wěn)并且與上柱之前的緩沖液的電導(dǎo)值一致； b、用20mMTirs, 1% (w/v)脫氧膽酸鈉，pH8. O溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖濃度為5 10mg/ml，用O. 45 μ m的濾膜澄清過濾后，將濾液上樣于已經(jīng)平衡好的離子交換層析柱； C、采用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫，監(jiān)測吸收波長為206nm和280nm的吸收曲線，收集206nm吸收值較高，280nm吸收值較低的洗脫峰； d、將收集的洗脫峰上樣于預(yù)先用生理鹽水平衡好的S^hadex G_25凝膠柱，監(jiān)測吸收波長為206nm的吸收曲線，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化樣品O
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝，其特征在于所述的緩沖液A為20mM Tirs, pH8. O溶液；所述的緩沖液B為20mM Tris, IM NaCl，pH8. O溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了b型流感嗜血桿菌莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、用緩沖液A平衡離子交換層析柱2個柱體積；b、用20mMTirs，1%(w/v)脫氧膽酸鈉，pH8.0溶液溶解粗多糖，過濾后，將濾液上樣于已經(jīng)平衡好的離子交換層析柱；c、用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫，收集206nm吸收值較高，280nm吸收值較低的洗脫峰；d、將收集的洗脫峰上樣于平衡好的SephadexG-25凝膠柱，收集206nm的吸收峰。本發(fā)明的有益效果是質(zhì)量指標(biāo)可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，純化過程不使用苯酚，避免了對人體健康和環(huán)境造成的危害，減少了處理步驟中可能造成的污染與損失，操作簡單、方便，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/00GK102633897SQ20121012129
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者伍長華, 關(guān)曉峰, 吳強(qiáng), 樊紹文 申請人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司