固定化漆酶微球載體及其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化酶微球載體及其制備方法與應用。該制備固定化漆酶載體的方法，包括如下步驟：將聚乙烯醇微球進行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶載體。本發(fā)明提供的固定化漆酶微球載體，可與漆酶發(fā)生化學偶聯(lián)、螯合反應。本發(fā)明的固定化漆酶載體不僅可用于工業(yè)廢水的處理，還可應用于環(huán)境監(jiān)測領域，具有比表面積大、粒徑小、生物相容性好、物理化學性能穩(wěn)定、成本低廉等特點。
【專利說明】固定化漆酶微球載體及其制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于及環(huán)境監(jiān)測領域，涉及一種固定化酶微球載體及其制備方法與應用。【背景技術】
[0002]漆酶是一種結合多個銅離子的蛋白質(zhì)，廣泛存在于植物、真菌甚至昆蟲體內(nèi)。漆酶具有相當寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，能催化許多酚類、芳香胺類物質(zhì)、羧酸類、甾體激素和生物色素、金屬有機化學物等，且反應產(chǎn)物是水，綠色、環(huán)保。因而在廢水處理、紙漿漂白、生物傳感器和生物監(jiān)測等方面具有較大的應用潛力。但是漆酶存在價格較高，易受各種環(huán)境因素的干擾變性失活，不可重復利用等缺點。
[0003]漆酶的固定化可以實現(xiàn)漆酶的重復性使用和穩(wěn)定性使用。固定化漆酶主要有吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法四種方法:1)吸附法固定漆酶具有吸附條件溫和、簡便，成本低，載體可反復使用的優(yōu)點。但是這種方法固定的漆酶存在對離子強度、pH、溫度等因子敏感的缺點。2)載體與漆酶共價偶聯(lián)的方法有很多，且固定化的漆酶非常穩(wěn)定，損漏少。但是偶聯(lián)試劑對漆酶有一定毒性，易引起漆酶失效，成本較高。3)交聯(lián)法可用的交聯(lián)試劑多，技術簡易；穩(wěn)定性較高。但是交聯(lián)條件較激烈，常出現(xiàn)擴散限制，使用有一定難度。4)包埋法可進行大量的固定化，并可做成任意大小。缺點是僅可用于低分子量的底物，不適用于柱系統(tǒng)，反應常受擴散限制。
[0004]近年來，不同類型載體固定化漆酶的方法和應用成為研究熱點。國內(nèi)外常采用的固定化載體包括殼聚糖、硅膠、活性炭、高分子濾膜、電紡纖維等材料。但現(xiàn)有的酶固定化材料不同程度存在酶的固定化效率低、可分離性差、操作工藝復雜、成本較高等問題。如此硅膠活性炭等材料作為載體，存在與水分離、親水表面與酶鏈接不緊密等問題；而高分子濾膜、殼聚糖、電紡纖維等存在生物相容性不好、機械強度差、且操作過程復雜等問題。目前，各種漆酶檢測儀反應器中的固定化酶載體大多為玻璃珠微球等無機載體。然而，玻璃珠表面功能化比較困難，且生物 相容性不好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種固定化酶微球載體及其制備方法與應用。
[0006]本發(fā)明提供的制備固定化漆酶載體的方法，包括如下步驟:將聚乙烯醇微球進行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶載體。
[0007]上述方法中，所述聚乙烯醇微球的粒徑為10-1000 μ m ；
[0008]所述聚乙烯醇微球的制備方法為反相懸浮交聯(lián)法。
[0009]所述反相懸浮交聯(lián)法包括如下步驟:將聚乙烯醇和水于沸水浴中混勻至溶解，冷卻至30-80° C后再加入液體石蠟，室溫攪拌后再加入酸溶液和戊二醛的水溶液攪拌離心分離后得到所述聚乙烯醇微球；
[0010]所述聚乙烯醇、水和液體石蠟的用量比為Ig:7.5-15mL:15_50mL，優(yōu)選Ig =IOmL:20mL ；[0011]所述室溫攪拌步驟中，轉(zhuǎn)速為200-2000rpm，優(yōu)選500rpm ;攪拌槳半徑為2cm ;時間為0.5-24小時，優(yōu)選2小時；
[0012]所述酸溶液的濃度為0.1-lmol/L，優(yōu)選lmol/L ;所述戊二醛的水溶液的質(zhì)量百分濃度為10-100%，優(yōu)選50% ；
[0013]所述攪拌離心分離的攪拌步驟中，轉(zhuǎn)速為200-2000rpm,優(yōu)選500rpm ;攪拌槳半徑為2cm ;時間為10-60分鐘，優(yōu)選30分鐘；所述離心分離步驟中，轉(zhuǎn)速為lOOO-lOOOOrpm，優(yōu)選4000rpm,離心機半徑為13.5cm。
[0014]上述固定化漆酶載體的方法中，所述磷酸化改性步驟包括:將所述聚乙烯醇微球浸于溶質(zhì)為磷酸水溶液和脲、溶劑為水的溶液中，水洗至中性。
[0015]所述磷酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為80-98% ；
[0016]所述聚乙烯醇微球、磷酸水溶液、脲和水的用量比為Ig:5-50mL:l-10g:0.1-10L，優(yōu)選 Ig:10mL:3g:1L ；
[0017]所述浸泡步驟中，時間為10-3000分鐘，優(yōu)選30分鐘。
[0018]按照上述方法制備得到的固定化漆酶載體，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019]本發(fā)明還提供了一種固定化漆酶的方法，該方法，包括如下步驟:將前述本發(fā)明提供的固定化漆酶載體、漆酶與緩沖溶液混合靜置。
[0020]該方法中，所述緩沖溶液的pH值為2-8，優(yōu)選4.5 ;所述緩沖溶液選自乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸和檸檬酸-檸檬酸鈉中的至少一種；
[0021]所述靜置步驟中，時間為1-48小時，優(yōu)選24小時。
[0022]按照上述方法得到的固定化的漆酶及所述固定化的漆酶在環(huán)境監(jiān)測或廢水處理中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]上述本發(fā)明提供的制備固定化漆酶載體和固定化漆酶的反應方程式如圖1所示:
[0024]1.反相懸浮交聯(lián)法制備聚乙烯醇微球及磷酸化方法(圖1a)
[0025]2.聚乙烯醇微球的醛基與漆酶反應固定漆酶原理(注:漆酶內(nèi)的2價銅離子可以轉(zhuǎn)變成I價，以下同)(圖1b)
[0026]3.聚乙烯醇微球的磷酸根基團與漆酶的銅離子活性中心發(fā)生螯合吸附(圖1c)
[0027]本發(fā)明克服現(xiàn)有固定化漆酶載體的不足，提供了一種漆酶固定化載體，該載體是通過反相懸浮交聯(lián)的方式制備PVA微球，能與漆酶發(fā)生化學偶聯(lián)作用，經(jīng)磷酸功能化之后可與漆酶發(fā)生螯合作用。其制備原理如下在PVA和漆酶的水溶液中加入液體石蠟，形成水油兩相，攪拌后的水相以小液滴的形態(tài)懸浮于油相中。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點在于:(1)本發(fā)明提供的固定化漆酶載體，制備工藝簡單，成本低廉；(2)本發(fā)明提供的固定化漆酶載體固定漆酶時條件溫和，只需靜置；(3)本發(fā)明提供的固定化漆酶酶活高，受溫度和PH影響較?。?4)本發(fā)明提供的固定漆酶載體可應用于環(huán)境監(jiān)測領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明提供的制備固定化漆酶載體和固定化漆酶的反應方程式。
[0030]圖2為實施例1中PVA微球的SEM圖。
[0031 ] 圖3為實施例2中PVA微球的SEM圖。[0032]圖4為固定化漆酶用于酶熱儀中BPA濃度檢測標準曲線。
[0033]圖5為PVA微球固定化漆酶用于酶熱儀檢測水環(huán)境中ABTS濃度
【具體實施方式】
[0034]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。
[0035]實施例1、固定化漆酶的制備
[0036]I)制備固定化的漆酶載體:
[0037]先將3g PVA (1799)在30ml水中溶解，在沸水浴中用機械攪拌I小時，撤離沸水浴，待反應物冷卻至50° C，加入60ml液體石蠟。室溫條件下，將混合液在500rpm(攪拌槳半徑為2cm)下攪拌2小時使形成微球,然后在三頸圓底燒瓶中加入Iml Imol I71的鹽酸溶液和2ml質(zhì)量百分濃度為50%的戊二醛水溶液，轉(zhuǎn)速500rpm (攪拌槳半徑為2cm)，攪拌30分鐘后，在轉(zhuǎn)速4000rpm (離心機半徑為13.5cm)下離心分離出微球，用石油醚洗三次，然后真空干燥48小時，得到聚乙烯醇微球，該聚乙烯醇微球如圖2所示。由圖2可知，用以上方法制備的微球表面光滑，球體形狀規(guī)則，該微球的粒徑為29.5 μ m。
[0038]再將IOml磷酸、3g脲溶于IL水中，加入Ig前述所得PVA微球浸泡30分鐘，離心，水洗直至載體被洗成中性，得到固定化的漆酶載體；
[0039]2)固定化漆 酶
[0040]稱取Ig所得固定化的漆酶載體和20mg漆酶放入IOmL HAC-NaAC緩沖液(pH值為
4.5)中，放置24小時，用水洗干凈后即可使用，得到本發(fā)明提供的固定化的漆酶。
[0041]該實施例制備所得固定化的漆酶的酶活性測試方法采用以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)為底物，測定酶對其的氧化速度。取固定化漆酶0.1g JPAHac-NaAc(ρΗ4.5)緩沖液2.5ml，混勻，加入ABTS 0.4ml，放置30s，每15s讀取一次420nm下吸光值。共讀取6-7個數(shù)值。以經(jīng)驗判斷，若吸光值增長迅速，則將固定化漆酶量降低2-5倍再次測定，直至吸光值數(shù)值變化不是太快，且數(shù)值均在0.2-0.8之間。酶活的計算:吸光度變化的斜率X4000X稀釋倍數(shù)。得到該實施例制備所得固定化的漆酶的酶活性為154U/g。
[0042]實施例2、固定化漆酶的制備
[0043]I)制備固定化的漆酶載體:
[0044]先將3g PVA (1799)在40ml水中溶解，在沸水浴中用機械攪拌2小時，撤離沸水浴，待反應物冷卻至80° C，加入80ml液體石蠟。室溫條件下，將混合液在IOOOrpm (攪拌槳半徑為2cm)下攪拌24小時使形成微球,然后在三頸圓底燒瓶中加入2mllmol L—1的鹽酸溶液和3ml質(zhì)量百分濃度為50%的戊二醛水溶液，轉(zhuǎn)速IOOOrpm (攪拌槳半徑為2cm)，攪拌60分鐘后,在轉(zhuǎn)速IOOOOrpm (離心機半徑為13.5cm)下離心分離出微球,用石油醚洗三次，然后真空干燥48小時，得到聚乙烯醇微球，該聚乙烯醇微球如圖3所示。由圖3可知，用以上方法制備的微球表面光滑，球體形狀規(guī)則，該微球的平均粒徑為22.7 μ m。
[0045]再將15ml磷酸，5g脲溶于IL水中，加入Ig PVA微球浸泡3000分鐘，離心，水洗直至載體被洗成中性。
[0046]2)固定化漆酶
[0047]稱取Ig所得微球和2mg漆酶放入IOmL HAC-NaAC緩沖液(pH 7.0)中，放置48小時，用水洗干凈后即可使用，得到本發(fā)明提供的固定化的漆酶。
[0048]按照與實施例1相同的方法測定酶活性，得到該實施例制備所得固定化的漆酶的酶活性為133U/g。
[0049]實施例3、固定化漆酶的熱穩(wěn)定性
[0050]分別將實施例1制備所得固定化漆酶與游離漆酶置于30° C_70° C的水浴中保溫6h，取樣檢測其酶活性，酶活性檢測同實施例1。
[0051]結果表明，固定化漆酶的最適溫度為40° C，比游離酶最適溫度30° C有所升高，且在30° C-70° C內(nèi)，固定化漆酶酶活高于游離漆酶酶活，特別在70° C時，固定化漆酶保留酶活仍能達到40.7%，而游離漆酶酶活僅為7.4%，顯示漆酶經(jīng)固定化后其熱穩(wěn)定性顯著提聞。
[0052]實施例4、固定化漆酶的pH穩(wěn)定性
[0053]取適量實施例1制備所得固定化漆酶與游離漆酶，分別懸浮于不同pH的乙酸緩沖溶液中，室溫條件下保存6小時，取 樣檢測其酶活性。
[0054]結果表明，在pH 2.0 — 9.0范圍內(nèi)，固定化漆酶保留酶活在40%以上，而游離漆酶的酶活性受PH影響較大，在pH = 2.0時，酶活損失80%。
[0055]實施例5、微球載體在酶熱儀中的應用
[0056]采用固定化漆酶降解雙酚A (BPA)的酶反應熱力學來檢測分析BPA的濃度，儀器選用武漢歐米克生物科技公司開發(fā)的酶熱生物分析儀(Enzyme Thermistor)。
[0057]在水樣檢測分析中，緩沖液通過流動泵連續(xù)注入，待測水樣通過加樣器定量進樣，與緩沖液在進樣閥混合后進入酶反應柱。水樣進入固定化漆酶反應柱會與漆酶發(fā)生酶促反應，此時反應器內(nèi)的溫度會發(fā)生變化，溫度變化(AT)遵循如下公式:
[0058]Δ Τ=-η Δ H/Cs
[0059]其中，η為分析物的摩爾濃度，Λ H為熱焓量，Cs為熱容量。所用固定化漆酶為實施例I制備所得。
[0060]圖4為PVA微球固定化漆酶用于酶熱儀檢測水環(huán)境中BPA濃度。由圖4可知，BPA濃度與酶熱儀檢測到的熱量信號有良好的線性關系，證明實施例1所得的PVA微球載體固定化漆酶在酶熱儀中應用是可行的。
[0061]實施例6、固定化漆酶的熱穩(wěn)定性
[0062]分別將實施例2制備所得固定化漆酶與游離漆酶置于30° C70° C的水浴中保溫6h,取樣檢測其酶活性，酶活性檢測同實施例3。
[0063]結果表明，固定化漆酶的最適溫度為40° C，比游離酶最適溫度30° C有所升高，且在30° C-70° C內(nèi)，固定化漆酶酶活高于游離漆酶酶活，特別在70° C時，固定化漆酶保留酶活為43.5%，而游離漆酶酶活僅為7.4%，顯示漆酶經(jīng)固定化后其熱穩(wěn)定性顯著提高。
[0064]實施例7、固定化漆酶的pH穩(wěn)定性
[0065]取適量實施例2制備所得固定化漆酶與游離漆酶，分別懸浮于不同pH的乙酸緩沖溶液中，室溫條件下保存6小時，取樣檢測其酶活性。
[0066]結果表明，在pH 2.0-9.0范圍內(nèi)，固定化漆酶保留酶活在43%以上，而游離漆酶的酶活性受PH影響較大，在pH=2.0時，酶活損失80%。
[0067]實施例8、微球載體在酶熱儀中的應用[0068]采用固定化漆酶降解3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)的酶反應熱力學來檢測分析ABTS的濃度，儀器選用武漢歐米克生物科技公司開發(fā)的酶熱生物分析儀(EnzymeThermistor)。所用固定化漆酶為實施例2制備所得。檢測方法同實施例5。
[0069]圖5為PVA微球固定化漆酶用于酶熱儀檢測水環(huán)境中ABTS濃度。由圖5可知，ABTS濃度與酶熱儀檢測到的熱量信號有良好的線性關系，證明實施例2所得PVA微球載體固定化漆酶在酶熱儀中應用 是可行的。
【權利要求】
1.一種制備固定化漆酶載體的方法，包括如下步驟:將聚乙烯醇微球進行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚乙烯醇微球的粒徑為10-1000 μ m ； 所述聚乙烯醇微球的制備方法為反相懸浮交聯(lián)法。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:所述反相懸浮交聯(lián)法包括如下步驟:將聚乙烯醇和水于沸水浴中混勻至溶解，冷卻至30-80° C后再加入液體石蠟，室溫攪拌后再加入酸溶液和戊二醛的水溶液攪拌離心分離后得到所述聚乙烯醇微球； 所述聚乙烯醇、水和液體石蠟的用量 比為Ig:7.5-15mL:15-50mL,優(yōu)選Ig =IOmL:2 OmL ； 所述室溫攪拌步驟中，轉(zhuǎn)速為200-2000rpm，優(yōu)選500rpm ;攪拌槳半徑為2cm ;時間為0.5-24小時，優(yōu)選2小時； 所述酸溶液的濃度為0.Ι-lmol/L，優(yōu)選lmol/L ;所述戊二醛的水溶液的質(zhì)量百分濃度為 10-100%，優(yōu)選 50% ； 所述攪拌離心分離的攪拌步驟中，轉(zhuǎn)速為200-2000rpm,優(yōu)選500rpm ;攪拌槳半徑為2cm ;時間為10-60分鐘，優(yōu)選30分鐘；所述離心分離步驟中，轉(zhuǎn)速為lOOO-lOOOOrpm，優(yōu)選4000rpm,離心機半徑為13.5cm。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述磷酸化改性步驟包括:將所述聚乙烯醇微球浸于溶質(zhì)為磷酸水溶液和脲、溶劑為水的溶液中，再水洗至中性。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述磷酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為80-98% ； 所述聚乙烯醇微球、磷酸水溶液、脲和水的用量比為Ig:5-50mL:l-10g:0.1-10L，優(yōu)選Ig:10mL:3g:1L ； 所述浸泡步驟中，時間為10-3000分鐘，優(yōu)選30分鐘。
6.權利要求1-5任一所述方法制備得到的固定化漆酶載體。
7.一種固定化漆酶的方法，包括如下步驟:將權利要求6所述固定化漆酶載體、漆酶與緩沖溶液混合靜置。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:所述緩沖溶液的pH值為2-8，優(yōu)選4.5 ；所述緩沖溶液選自乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸和檸檬酸-檸檬酸鈉中的至少一種； 所述靜置步驟中，時間為1-48小時,優(yōu)選24小時。
9.權利要求7或8所得固定化的漆酶。
10.權利要求9所述固定化的漆酶在環(huán)境監(jiān)測或廢水處理中的應用。
【文檔編號】C08L29/04GK103450496SQ201210176608
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權日:2012年5月31日
【發(fā)明者】施漢昌, 白雪, 王青, 李冰 申請人:清華大學