專利名稱：一種高產(chǎn)肽聚糖的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐氧、耐高溫、高產(chǎn)肽聚糖的工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在發(fā)酵工藝過(guò)程中，發(fā)酵溫度由于受外界環(huán)境、細(xì)胞代謝等因素影響，造成發(fā)酵體系溫度升高，引起菌體內(nèi)的脂肪酸、蛋白質(zhì)等成分變化，影響細(xì)胞正常生理活動(dòng)。然而提高發(fā)酵溫度可大大減少工廠生產(chǎn)中冷卻水的消耗，降低發(fā)酵成本；同時(shí)，發(fā)酵溫度的提高可以減少雜菌污染的機(jī)會(huì)，減少倒灌幾率，所以如何提聞菌株的聞溫耐受:性引起了許多國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。申請(qǐng)?zhí)枮?00910204295. 3的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一株耐高溫釀酒酵母菌及其應(yīng)用，該發(fā)明的釀酒酵母菌是從米酒酒曲中篩選出來(lái)并通過(guò)高溫馴化得到，該菌株耐受溫度 高達(dá)36 44°C、乙醇產(chǎn)率高、可發(fā)酵糖范圍廣；申請(qǐng)為201110419568. 3的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一株耐高溫、耐高糖的乳酸菌，該發(fā)明通過(guò)高溫馴化、硫酸二乙酯(DES)誘變和亞硝基弧(NTG)誘變相結(jié)合的方法處理原始出發(fā)菌種，篩選得到在55°C下生長(zhǎng)良好，耐受250g/L葡萄糖的工程菌；申請(qǐng)?zhí)枮?01110360406. 7的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一株耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌株，通過(guò)離子束注入誘變處理出發(fā)菌株及高溫篩選，得到的菌株可耐受42°C的高溫，且在高溫條件下遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)酸水平較高。嗜酸乳桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性桿菌，其細(xì)胞形態(tài)呈多樣性，一般形成鏈桿狀或球桿狀，無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢。該菌屬厭氧或兼性厭氧菌，最適生長(zhǎng)溫度為35 38°C，最高生長(zhǎng)溫度43 48°C，耐熱性差，在微氧或無(wú)氧環(huán)境中生長(zhǎng)良好，但在有氧條件下生長(zhǎng)較緩慢。肽聚糖(peptidoglycan,PG),又稱為粘肽(Mucopeptide)、糖肽(glycopeptide)是細(xì)菌尤其是G+菌細(xì)胞壁的主要組成成分。它是一種強(qiáng)免疫增強(qiáng)劑(Immunostimulants),能通過(guò)誘導(dǎo)各種免疫調(diào)控物質(zhì)的釋放或表達(dá)來(lái)刺激免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫功能，發(fā)揮自穩(wěn)調(diào)節(jié)和抗感染、抗腫瘤效應(yīng)。Sekine等(1995)曾報(bào)道雙歧桿菌完整PG能激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，使其IL-I、IL-6及TNF- α的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，他認(rèn)為PG成分在雙歧桿菌提高機(jī)體免疫監(jiān)視功能方面可能起重要作用。馬西藝等(2003)研究認(rèn)為乳酸桿菌PG能激活NK細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-Y、TNF和NO，其可能部分街道了它的抗腫瘤作用。而關(guān)于嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁中PG的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，且肽聚糖作為功能性食品、新型藥物或飼料添加齊U，在國(guó)內(nèi)研究與開(kāi)發(fā)較少，目前尚無(wú)產(chǎn)品上市，更無(wú)廠家生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種耐氧、耐高溫、高產(chǎn)肽聚糖的工程菌，以解決現(xiàn)有菌株肽聚糖產(chǎn)量不高、菌株生長(zhǎng)緩慢和發(fā)酵成本過(guò)高的問(wèn)題。一種高產(chǎn)肽聚糖的工程菌，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)hz sb，保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6199。
該菌株已于2012年06月08日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6199。該菌株具有良好的耐氧、耐高溫特性，在37 62°C條件下均具有較高的活性，使用MRS液體培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)24h，37°C條件下，活菌數(shù)達(dá)到8. 17 X 109cfu/mL,為原始菌株LA。的6. 92倍；62°C條件下， 活菌數(shù)可達(dá)5. 89X 109cfu/mL ;同時(shí)，該菌株每IOOOmL發(fā)酵液，可得肽聚糖25. 89g，為原始菌株LAtl的4. 53倍。本發(fā)明還提供了一種利用所述工程菌生產(chǎn)肽聚糖的方法，包括(I)將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)取發(fā)酵液，離心收集菌體；(3)從所述菌體中提取肽聚糖。所述發(fā)酵培養(yǎng)基以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)正交設(shè)計(jì)等方法分別進(jìn)行初始pH、碳源、氮源、碳氮比例以及增值因子的優(yōu)化。以體積IL計(jì),優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖4 16g、乳糖4 6g、蛋白胨14 16g、酵母粉9 llg、番茄汁145 155ml、胡蘿卜汁115 125ml、啤酒55 65ml、吐溫-80 O. 9 I. 1ml、乙酸鈉 4 6g、K2HP04 ·3Η20 2· 6 2. 7g、檸檬酸二胺 I. 8 2. 2g、MgSO4 · 7H20 0. 18 0. 22g、MnSO4 · H2O 0. 045 0. 055g。更優(yōu)選為，以體積IL計(jì),所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番茄汁150ml、胡蘿卜汁120ml、啤酒60ml、吐溫_801ml、乙酸鈉5g、K2HP04 ·3Η20
2.62g、檸檬酸二胺 2g、MgSO4 · 7Η200· 2g、MnSO4 · H2O 0. 05g。使用該最優(yōu)化的培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)嗜酸乳桿菌hzsb菌株，IOh達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，pH值為4. 01，活菌數(shù)達(dá)到6. 24X1010cfu/mLo所述胡蘿卜汁和番茄汁的濃度均為I I. 5g/ml，優(yōu)選為lg/ml。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6. 2 6. 6，更優(yōu)選為6. 4，在該初始pH值條件下，按4%接種量，37°C培養(yǎng)24h，活菌數(shù)均在8. OX 109cfu/mL左右。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37 62°C，更優(yōu)選為37°C ;所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為10 14h，更優(yōu)選為12h ;所述嗜酸乳桿菌hzsb在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為4%。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌hzsb在上述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6. 4、培養(yǎng)溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為12h時(shí)，每1000ml發(fā)酵液中，可得25. 89g肽聚糖，為原始菌株的4. 53倍。就肽聚糖的提取方法而言，可以是現(xiàn)有技術(shù)中的提取方法，本發(fā)明所采用的提取肽聚糖的方法為(I)將所述菌體裂解，去除胞內(nèi)物，得到破碎的菌體；(2)對(duì)破碎的菌體進(jìn)行脫脂、蛋白酶酶解處理，制得所述肽聚糖。所述菌體裂解，去除胞內(nèi)物的方法為將所述菌體懸浮于三氯乙酸溶液，水浴加熱裂解菌體，完成后離心收集沉淀；菌體與三氯乙酸的體積比一般在I : 10，三氯乙酸濃度達(dá)到10%，水浴溫度選擇為70°C，2h以上就可以完成裂解，離心轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心收集的沉淀最好有生理鹽水清洗三次以上。
所述脫脂是指將沉淀溶于有機(jī)溶劑中，攪拌一定時(shí)間后離心分離，脫脂采用的有機(jī)溶劑選用乙酸鈉、氯仿和甲醇混合液，體積比優(yōu)選為4 5 10，沉淀與有機(jī)溶劑的重量體積比為I : 20,離心轉(zhuǎn)速同樣為8000r/min。所述酶解為將沉淀溶于含胰酶和堿性蛋白酶的磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩反應(yīng)10h。酶解完成后肽聚糖處于溶液狀態(tài)，可以將酶解液離心，收集沉淀，沉淀經(jīng)無(wú)菌水清洗后進(jìn)行真空冷凍干燥，制得固態(tài)狀的肽聚糖；離心轉(zhuǎn)速選擇為12000r/min，磷酸緩沖液的pH值一般為8.0。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明綜合應(yīng)用了傳統(tǒng)的馴化育種、誘變育種及基因重組等手段構(gòu)建一株具有明顯的耐氧、耐高溫性、生長(zhǎng)周期短、遺傳形狀較穩(wěn)定的高產(chǎn)肽聚糖工程菌株，并提供了實(shí)用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、周期短、步驟簡(jiǎn)便合理的肽聚糖提取方法，解決了嗜酸乳桿菌在有氧條件 下生長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題，有效提高了肽聚糖的產(chǎn)量，同時(shí)大大減少大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中冷卻水的消耗,顯著降低發(fā)酵成本,具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖I是不同碳源對(duì)hzsb菌株生長(zhǎng)情況的影響圖。圖2是不同氮源對(duì)hzsb菌株生長(zhǎng)情況的影響圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例所使用的培養(yǎng)基組分及其濃度如下MRS培養(yǎng)基葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、吐溫-80lml、乙酸鈉5g、K2HPO4 · 3H20 2. 62g、檸檬酸二胺 2g、MgSO4 · 7Η200· 2g、MnSO4 · H2O 0. 05g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)pH6. 4，固體培養(yǎng)基加入15g瓊脂，120°C滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番爺汁150ml、胡蘿卜汁120ml、啤酒60ml、吐溫-801ml,乙酸鈉5g、K2HPO4 · 3H20 2. 62g、檸檬酸二胺2g、MgSO4 · 7H20 O. 2g、MnSO4 · H2OO. 05g，加蒸餾水至 1000ml，調(diào) ρΗ6· 4，120°C滅菌 30min。再生培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基MRS (不含吐溫-80)、明膠25. 0g、MgCl25. 0g、CaCl22. 8g、蔗糖 171. 2g、胎牛血清(BSA) 5. OmL、瓊脂 15 18g，調(diào) ρΗ6· 4，121°C 滅菌 20min。高滲溶液0.01mol/L Tris_HCl、20mmol/L MgCl2、0. 5mol/L 鹿糖,去離子水配制，調(diào)ρΗ7· 0,121°C滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?5% PEG溶液PEG_600035g，用高滲溶液溶解，配成IOOmL PEG溶液。溶菌酶酶溶液稱取Ig溶菌酶(酶活> 20000U/mg)溶解在IOOmL高滲溶液中，配成終濃度為10mg/mL的酶溶液，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例I :耐氧嗜酸乳桿菌的篩選(I)菌株的活化與培養(yǎng)嗜酸乳桿菌原始菌株(CGMCC I. 1878)購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，接種于10%脫脂乳中，于37°C、24h活化2次，然后按4%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)24h后，備用。
(2)嗜酸乳桿菌的逐級(jí)有氧馴化取活化的嗜酸乳桿菌LA。為出發(fā)菌株，于MRS液體培養(yǎng)基中(C0217% )，37°C增菌培養(yǎng)24h，制得增菌液涂布于MRS瓊脂平板，置CO217%厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行微厭氧培養(yǎng)(CO215 % +O2 2% ),制得菌液涂布于MRS瓊脂平板，置C0215% +025%環(huán)境中培養(yǎng)；重復(fù)以上步驟，逐漸使CO2和O2的含量接近于大氣，篩選得到兩株具有耐氧能力的嗜酸乳桿菌LAn-I和LAn-2。將LAn-I和LAn_2接種于MRS培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48h，可見(jiàn)菌落呈圓形、隆起、乳白色、光滑、直徑I 2_，與馴化前的菌落形態(tài)無(wú)差別。通過(guò)革蘭氏染色驗(yàn)證為革蘭氏陽(yáng)性菌，電鏡掃描觀察細(xì)胞為鏈桿狀或球桿狀，約(O. 6 O. 9) X (I. 5 6) μ m,無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。 實(shí)施例2 :耐高溫嗜酸乳桿菌突變株的篩選(I)60Co-Y射線誘變育種取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的耐氧嗜乳酸桿菌LAn-I菌液，6000r/min離心lOmin，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀2次，收集菌體并懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，配成濃度為IO8個(gè)/mL菌液用于誘變，誘變劑量1400Gy。(2)化學(xué)誘變育種用O. lmol/L磷酸緩沖液(pH7. O)制備新鮮的耐氧嗜乳酸桿菌LAn_2菌懸液，細(xì)胞濃度控制在IO8個(gè)/mL左右，加入I. 0% (v/v)硫酸二乙酯(DES)，混勻后在37°C下水浴40min,加入等體積的終止劑2%的硫代硫酸鈉,終止誘變,6000r/min離心IOmin,再用磷酸緩沖液洗滌沉淀2次，最后用生理鹽水將菌體稀釋。(3)突變株的篩選經(jīng)過(guò)6tlCo- Y射線和DES誘變處理后的菌液涂布于MRS瓊脂平板上，以出發(fā)菌為對(duì)照，于45、50、55、60、65、70°C條件下培養(yǎng)48h。將其中生長(zhǎng)較快、菌落較大的菌株挑出，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。最終篩選得到5株在55°C條件下生長(zhǎng)周期較短、耐溫性較好的突變菌株。(4)基因組重組及篩選將步驟(3)獲得的5株突變菌株在55°C、MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，各取5mL菌液混合后離心，用高滲溶液洗滌2次，重新收集菌體懸浮于8mL溶菌酶溶液中，37°C水浴處理45min制備原生質(zhì)體。酶解結(jié)束后以5000r/min離心lOmin，高滲溶液洗滌沉淀2次,然后加入8mL 35% PEG溶液,37°C水浴保溫2min, 5000r/min離心lOmin,棄上清液，用2mL高滲溶液充分懸浮，然后涂布于再生培養(yǎng)基平板上，置于55 70°C條件下培養(yǎng)48h，將其中生長(zhǎng)較快、菌落較大的菌株挑出，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。篩選得到生長(zhǎng)速度快、耐溫性好的重組菌作為第一輪菌株Fl，進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、融合與篩選，所得重組菌株作為第二輪菌株F2，依次類推進(jìn)行5輪改組。(5)遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)將步驟(4)中經(jīng)過(guò)5輪改組后篩選得到的重組菌株，接種MRS液體培養(yǎng)基，連續(xù)傳代10次，最終獲得一株生長(zhǎng)周期短、具有明顯的耐高溫性、遺傳形狀較穩(wěn)定的重組菌株。該菌株在37 62 °C條件下均具有較高的活性，其在MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C條件下培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達(dá)到8. 17X109cfu/mL，為原始菌株LAtl的6. 92倍；62°C條件下培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達(dá)到5. 89X 109cfu/mL。通過(guò)形態(tài)學(xué)及生化特性鑒定表明，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，與原始菌株LAtl相t匕，菌落形態(tài)及菌體形態(tài)特征基本一致，但更為纖細(xì)，生化特性未發(fā)生改變，屬嗜酸乳桿菌。將該菌株于2012年06月08日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb,保藏編號(hào)CGMCC NO. 6199。實(shí)施例3 :發(fā)酵培養(yǎng)基(增菌培養(yǎng)基)的優(yōu)化(I)培養(yǎng)pH條件的確定考慮到生產(chǎn)工藝要求培養(yǎng)基必須基于菌體產(chǎn)量高、容易分離收獲細(xì)胞，因此選用易分離菌體的MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改良。用無(wú)菌的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，得到一系列pH不同的培養(yǎng)基，按4%接種量，37°C培養(yǎng)24h，檢測(cè)活菌數(shù)，最終確定培養(yǎng)基初始pH值為6. 4。(見(jiàn)表I) 表I初始pH值對(duì)hzsb菌株活菌數(shù)的影響
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)肽聚糖的工程菌，其特征在于，命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)hzsb，保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6199。
2.一種利用如權(quán)利要求I所述工程菌生產(chǎn)肽聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (2)取發(fā)酵液，離心收集菌體； (3)從所述菌體中提取肽聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以IL計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖4 16g、乳糖4 6g、蛋白胨14 16g、酵母粉9 llg、番爺汁145 155ml、胡蘿卜汁115 125ml、啤酒 55 65ml、吐溫-800. 9 I. 1ml、乙酸鈉 4 6g、K2HPO4 · 3Η20 2· 6 ·2.7g、檸檬酸二胺 I. 8 2. 2g、MgSO4 · 7Η200· 18 O. 22g、MnSO4 · H2O O. 045 O. 055g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.2 6.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37 62°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為10 14h。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取肽聚糖的方法為 (1)將所述菌體裂解，去除胞內(nèi)物，得到破碎的菌體； (2)對(duì)破碎的菌體進(jìn)行脫脂、蛋白酶酶解處理，制得所述肽聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌體裂解的方法為將所述菌體懸浮于三氯乙酸溶液，水浴加熱裂解菌體，完成后離心收集沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述脫脂采用的溶劑為乙酸鈉、氯仿和甲醇的混合液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶為胰酶和堿性蛋白酶的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)肽聚糖的工程菌及其應(yīng)用，高產(chǎn)肽聚糖的工程菌命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb，保藏號(hào)為CGMCCNO.6199；該菌株通過(guò)菌種馴化、誘變育種及基因重組技術(shù)手段構(gòu)建；將所述嗜酸乳桿菌hzsb活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；取發(fā)酵液離心收集菌體；從菌體中提取肽聚糖，每1000ml發(fā)酵液中，可得25.89g肽聚糖，為原始菌株的4.53倍。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102876606SQ20121035956
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者胡向東, 葉茂, 胡偉卿, 朱靜, 許美芳 申請(qǐng)人:杭州世博生物技術(shù)開(kāi)發(fā)研究所有限公司