專利名稱：一種硫酸軟骨素提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種硫酸軟骨素提取方法。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)又名牛磺軟骨素、康得寧,廣泛存在于人和一些動物如豬、牛、羊、魚等的軟骨組織中。CS在臨床上主要用于治療神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)炎、耳鳴以及促進(jìn)潰瘍愈合和防治高血脂等，動物口服后未發(fā)現(xiàn)臨床毒性癥狀。除此之外，CS也廣泛應(yīng)用于食品、化妝品行業(yè)。多年來，硫酸軟骨素一直是醫(yī)藥類的小品種，產(chǎn)銷量小。近年來，硫酸軟骨素作為一種新型藥用活性成分，在醫(yī)藥制劑、醫(yī)學(xué)材料、日化產(chǎn)品、化妝品、生發(fā)劑、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，越來越受到人們的重視，市場需求趨旺。我國生產(chǎn)和出口量逐年大幅度增長，現(xiàn)已成為生化藥物的第三出口，發(fā)展前景看好。
目前，硫酸軟骨素普遍提取的方法主要有鹽解、堿解、酶解法以及堿-酶法，其分離純化的方法有乙醇沉淀法、離子交換色譜法、季銨鹽配合法、吸附法和纖維素分離法等。但是上述方法在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中普遍存在一個問題生產(chǎn)工藝繁瑣不易操作、堿酸乙醇使用量大、硫酸軟骨素品質(zhì)不高、生產(chǎn)成本高昂，生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)率低并且污染嚴(yán)重，不適合企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)需求。CN101250237B提供了一種硫酸軟骨素?zé)o溶劑提取方法，該方法通過無溶劑化學(xué)反應(yīng)，彌補(bǔ)了一般有機(jī)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生雜質(zhì)的不足，但是其要利用球磨機(jī)中研磨體所產(chǎn)生的高強(qiáng)度機(jī)械力作用來達(dá)到使硫酸軟骨素組織中硫酸軟骨素連接在核心蛋白上糖肽鍵發(fā)生鍛煉，該方法對設(shè)備和技術(shù)的要求高，操作難度大，不利于企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。CN102093490A提供了一種高純度硫酸軟骨素的制備方法，該方法在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上通過使用陽離子交換方法，在一定程度上提高了硫酸軟骨素的收率和純度，但是該方法工藝繁瑣，易不能逃脫傳統(tǒng)工藝的局限。實踐中，由于制備硫酸軟骨素的原料軟骨原料表面附著許多脂肪和肌肉組織，這些組織往往成為了硫酸軟骨素提取的主要雜質(zhì)，又加上硫酸軟骨素本身比較粘稠，這就使得硫酸軟骨素的提取過濾非常困難，這也就直接導(dǎo)致規(guī)?；a(chǎn)硫酸軟骨素過濾效率低，生產(chǎn)周期長。本發(fā)明人經(jīng)多方研究，通過超聲波輔助，探索得出一種由超聲波輔助提取的堿-雙酶法提取硫酸軟骨素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種硫酸軟骨素提取方法，以期在縮短硫酸軟骨素生產(chǎn)周期，降低硫酸軟骨素提取的污染情況的同時提高產(chǎn)品的質(zhì)量，使得硫酸軟骨素的生產(chǎn)適合現(xiàn)代企業(yè)的規(guī)?；a(chǎn)，為企業(yè)和社會創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明一種硫酸軟骨素的提取方法，其具體實施的技術(shù)方案為
本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素提取方法，其特征在于該方法由預(yù)處理、滅活、水解、抽濾、離心、干燥粉碎六步驟組成。本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法實施的具體步驟為
(I)預(yù)處理將牛喉管置于沸水中煮8 IOmin后撈出，去除表面的油脂等殘留物自
然風(fēng)干后粉碎。(2)滅活將預(yù)處理的軟骨浸于NaOH溶液中，置于超聲波隔音箱中，在功率為491W條件下超聲處理13(Tl40min，然后用HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 8，添加一定量木瓜蛋白酶，恒溫水浴lh，升溫到90°C保溫15 20min滅酶。(3)水解調(diào)最適pH值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定溫度條件下水解一定時間，升溫至90°C滅酶15 20min。
(4)抽濾按濾液體積的1%加入活性炭，按原料干質(zhì)量的10%加入高嶺土，90°C吸附攪拌30min，快速冷卻后抽濾，將清液pH值調(diào)節(jié)至6. 8 7. 2，加入NaCl，然后緩慢加入無水乙醇，使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%。(5)離心靜置過夜收集沉淀，離心15 20min，用乙醇洗滌I 2次，
(6)干燥粉碎抽濾，置于恒溫干燥箱中干燥，粉碎即得產(chǎn)品。本發(fā)明所述的一種硫酸軟骨素制備方法，其特征在于該方法pH為5. 4 8、酶解溫度30 50°C、酶解時間90 120min。本發(fā)明所述的一種硫酸軟骨素制備方法，其特征在于該方法步驟(2)浸泡軟骨的溶液為5%的NaOH溶液，滅酶時間為20min。本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(3)胃蛋白酶添加量I 2:1000，滅酶時間為15min。本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(4) NaCl的添加量為濾液體積3%。本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(5)離心速度為6000r/min,離心時間為 15min。本發(fā)明所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(6)干燥的溫度為 60。。。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本方法提取的硫酸軟骨素純度高、質(zhì)量好。2.本方法工藝簡單，容易操作，適合企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施例方式下面的實施可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。將牛喉管置于沸水中煮8 IOmin后撈出，去除表面的油脂等殘留物自然風(fēng)干后粉碎。將預(yù)處理的軟骨浸于5%的NaOH溶液中，置于超聲波隔音箱中，在功率中國肉類食品綜合研究中心加工工藝為491W條件下超聲處理139min，然后用HCl調(diào)節(jié)pH值至5. 5 7. 5，添加一定量木瓜蛋白酶，45°C恒溫水浴lh，升溫到90°C保溫20min滅酶。調(diào)最適PH值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定溫度條件下水解一定時間，升溫至90°C滅酶15min，按濾液體積的1%加入活性炭，按原料干質(zhì)量的5 15%加入高嶺土，90°C吸附攪拌30min，快速冷卻后抽濾，將清液pH值調(diào)節(jié)至6. 8 7. 2，加入濾液體積3%的NaCl，然后緩慢加入無水乙醇，使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，靜置過夜收集沉淀，6000r/min離心15min，用乙醇洗滌I 2次，抽濾，置于恒溫干燥箱中60°C干燥，粉碎即得產(chǎn)品。紅外光譜法對樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定所得產(chǎn)品用紅外光譜對樣品結(jié)構(gòu)驗證，用標(biāo)準(zhǔn)品對照，得

圖1 : CS標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖；圖2提取樣品CS紅外光譜圖。由圖1、2可見，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，提取樣品在相應(yīng)的波段均存在特征吸收峰，在約3400CHT1處有特征吸收峰，說明存在一 OH和一NH伸縮振動，2920CHT1附近存在-CH2伸縮振動。1650CHT1附近存在NH彎曲振動，1560CHT1和HlOcnT1處分別存在一 COO不對陣伸縮振動和一 COO對稱伸縮振動，在約1560CHT1及840 cnT1處有硫酸基特征吸收峰。說明提取的樣品是CS.
產(chǎn)品各項指標(biāo)檢測
水分測定采用常壓恒溫干燥法；蛋白質(zhì)含量測定；采用Bradford法；澄清度測定采 用分光光度法測定640nm波長處50g/L溶液的吸光度，pH值測定；將產(chǎn)品配制成50mg/mL溶液，用pH計測定其pH值；CS純度測定；采用氨基己糖測定法。CS純度=氨基己糖含量X 2. 82
CS得率=(產(chǎn)品質(zhì)量/原料質(zhì)量)X 100
鑒定且純度達(dá)到87. 96%，其他各項指標(biāo)均符合《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》要求。
權(quán)利要求
1.一種硫酸軟骨素提取方法，其特征在于該方法由預(yù)處理、滅活、水解、抽濾、離心、干燥粉碎六步驟組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法實施的具體步驟為 預(yù)處理將牛喉管置于沸水中煮8 IOmin后撈出，去除表面的油脂等殘留物自然風(fēng)干后粉碎； 滅活將預(yù)處理的軟骨浸于NaOH溶液中，置于超聲波隔音箱中，在功率為491W條件下超聲處理13(Tl40min，然后用HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 8，添加一定量木瓜蛋白酶，恒溫水浴lh，升溫到90°C保溫15 20min滅酶； 水解調(diào)最適pH值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定溫度條件下水解一定時間，升溫至90°C滅酶15 20min ； 抽濾按濾液體積的1%加入活性炭，按原料干質(zhì)量的10%加入高嶺土，90°C吸附攪拌30min，快速冷卻后抽濾，將清液pH值調(diào)節(jié)至6. 8 7. 2，加入NaCl，然后緩慢加入無水乙醇，使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70% ； 離心靜置過夜收集沉淀，離心15 20min，用乙醇洗滌I 2次； 干燥粉碎抽濾，置于恒溫干燥箱中干燥，粉碎即得產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硫酸軟骨素制備方法，其特征在于該方法pH為5.4 8、酶解溫度30 50°C、酶解時間90 120min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種硫酸軟骨素制備方法，其特征在于該方法步驟(2)浸泡軟骨的溶液為5%的NaOH溶液，滅酶時間為20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(3)胃蛋白酶添加量I 2:1000，滅酶時間為15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(4)NaCl的添加量為濾液體積3%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(5)離心速度為6000r/min,離心時間為15min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法步驟(6)干燥的溫度為60°C。
全文摘要
本發(fā)明一種硫酸軟骨素的提取方法，該方法采用超聲波作為輔助由預(yù)處理、滅活、水解、抽濾、離心、干燥粉碎六步驟組成。該方法工藝簡單、無污染，所得的硫酸軟骨素質(zhì)量高，純度達(dá)到了87.96%，是生物醫(yī)藥領(lǐng)域一重大進(jìn)步。
文檔編號C08B37/08GK102993333SQ201210493550
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者曾培安, 郝芳, 吳健民, 賀蓮, 張靜, 劉娟 申請人:康普藥業(yè)股份有限公司