專利名稱：羧甲基化分子修飾制備高效低聚黃芪多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性多糖的制備和結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧甲基化分子修飾制備高效低聚黃芪多糖的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)黃芪中含多糖、皂甙、黃酮、氨基酸等多種有效成分，這些活性成分均有促進(jìn)抗體生成和免疫反應(yīng)的作用，其中以對(duì)黃芪多糖的研究報(bào)道為多。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，經(jīng)過(guò)高科技萃取、分離而得到的。目前萃取的黃芪多糖其免疫調(diào)控活性和抗氧化力差，浪費(fèi)原材料，且浪費(fèi)時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羧甲基化分子修飾制備高效低聚黃芪多糖的方法，它具有很好的調(diào)控活性和抗氧化力，節(jié)約材料，節(jié)省時(shí)間。為了解決背景技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案它的制備方法為采用氫氧化鈉-一氯乙酸體系法進(jìn)行羧甲基化分子修飾，以產(chǎn)物量、羧甲基替代度和免疫調(diào)控功能為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)優(yōu)選出黃芪多糖氫氧化鈉-一氯乙酸法修飾的最佳條件為反應(yīng)溫度65°C ;氫氧化鈉和一氯乙酸的配比1.6 1、反應(yīng)時(shí)間3. 5h。取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50%，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀得到粗多糖，黃芪多糖純化后用優(yōu)化的條件修飾，通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)研究比較，所得黃芪多糖經(jīng)純化和羧甲基化修飾后其促生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。羧甲基化黃芪多糖制備條件為稱取上述制備的IOg黃芪多糖，加入至IOOmL異丙醇溶劑中，加入I %氫氧化鈉溶液90mL，攪拌使堿液溶解后，在快速攪拌條件下，通過(guò)真空滴液漏斗滴入一氯乙酸的異丙醇溶液(I 1.2，501^)，控制溫度在651攪拌反應(yīng)3.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將上層異丙醇傾出并回收利用，下層加入5%鹽酸溶液，快速攪拌下加入乙醇50mL，過(guò)濾，固體物部分溶解于水中，用乙醇沉淀，過(guò)濾，干燥，得白色粉末狀固體，即羧甲基黃芪多糖。羧甲基化黃芪多糖的理化性質(zhì)測(cè)定一、多糖含量測(cè)定原黃芪多糖的含量最高為98. 46%，羧甲基化黃芪多糖的多糖含量均低于原黃芪多糖，表明羧甲基化修飾對(duì)于多糖含量是有損失的。由羧甲基化多糖得率可知最佳條件為反應(yīng)溫度65°C ;氫氧化鈉和一氯乙酸的配比1. 6 1、反應(yīng)時(shí)間3. 5h。其取代度為O. 82。
本發(fā)明具有很好的調(diào)控活性和抗氧化力，節(jié)約材料，節(jié)省時(shí)間。


圖1為本發(fā)明中 L9 (34)正交示意圖，
圖2為本發(fā)明中羧甲基化修飾對(duì)黃芪多糖含量的影響示意圖，圖3為本發(fā)明中羧甲基化黃芪多糖紅外光譜示意圖，圖4為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響示意圖，圖5為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響示意圖，圖6為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)肉仔雞一免和二免后不同階段血清BSA抗體效價(jià)(OD45tl)的影響示意圖，圖7為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)肉仔雞血液淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子的影響示意圖，圖8為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)肉仔雞外周全血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響示意圖，圖9為本實(shí)施例中日糧羧甲基化黃芪多糖對(duì)·肉仔雞脾臟抗氧化酶及脂質(zhì)過(guò)氧化物的影響示意圖。
具體實(shí)施例方式參看圖1-圖3，本具體實(shí)施方式
采用如下技術(shù)方案它的制備方法為采用氫氧化鈉-一氯乙酸體系法進(jìn)行羧甲基化分子修飾，以產(chǎn)物量、羧甲基替代度和免疫調(diào)控功能為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)優(yōu)選出黃芪多糖氫氧化鈉-一氯乙酸法修飾的最佳條件為反應(yīng)溫度95°C、氯磺酸與吡啶的配比1: 6、反應(yīng)Ih;取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50%，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀得到粗多糖，黃芪多糖純化后用優(yōu)化的條件修飾，通過(guò)系列抗病毒和增強(qiáng)免疫活性比較，所得黃芪多糖經(jīng)純化和羧甲基化修飾后其抗病毒和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。羧甲基化黃芪多糖制備條件為以反應(yīng)溫度A，氫氧化鈉和一氯乙酸摩爾比B和反應(yīng)時(shí)間C為因素，按3因素3水平的正交試驗(yàn)L9 (33)設(shè)計(jì)9種修飾條件(參看圖1):稱取上述制備的IOg黃芪多糖，加入至IOOmL異丙醇溶劑中，加入I %氫氧化鈉溶液90mL，攪拌使堿液溶解后，在快速攪拌條件下，通過(guò)真空滴液漏斗滴入一氯乙酸的異丙醇溶液(I 1.2，501^)，控制溫度在651攪拌反應(yīng)3.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將上層異丙醇傾出并回收利用，下層加入5%鹽酸溶液，快速攪拌下加入乙醇50mL，過(guò)濾，固體物部分溶解于水中，用乙醇沉淀，過(guò)濾，干燥，得白色粉末狀固體，即羧甲基黃芪多糖。羧甲基化黃芪多糖的理化性質(zhì)測(cè)定一、多糖含量測(cè)定參看圖2，原黃芪多糖的含量最高為98. 46%，羧甲基化黃芪多糖的多糖含量均低于原黃芪多糖，表明羧甲基化修飾對(duì)于多糖含量是有損失的。由羧甲基化多糖得率可知最佳條件為反應(yīng)溫度65°C ;氫氧化鈉和一氯乙酸的配比1.6 1、反應(yīng)時(shí)間3. 5h。其取代度為 O. 82。由圖3可知，在羧甲基化黃芪多糖的紅外光譜上，在1604、1424、1327cm-l處出現(xiàn)了 COO-的特征吸收峰，在1604cm-l左右有一個(gè)-C00-的C = O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，在1423、1327cm-l處兩個(gè)峰為中強(qiáng)峰，證明了黃芪多糖確實(shí)己羧甲基化。本具體實(shí)施方式
具有很好的調(diào)控活性和抗氧化力，節(jié)約材料，節(jié)省時(shí)間。
實(shí)施例一、材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物與材料120只AA(Arbor Acres)雄性肉仔雞(I日齡)隨機(jī)分為2個(gè)處理,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。每天光照23小時(shí)，自由采食，自由飲水。飼養(yǎng)按正常飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。1.2試驗(yàn)日糧試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧日糧配方參照NRC(1994)推薦的營(yíng)養(yǎng)水平配制，試驗(yàn)用羧甲基化多糖由本實(shí)驗(yàn)室制備。1.3樣品采集與分析1.3.1生長(zhǎng)性能試驗(yàn)雞第21、42日齡以每個(gè)重復(fù)為單位分別稱重，統(tǒng)計(jì)階段采食量、死亡率和料重比。1. 3. 2血液淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌采集21d，42d無(wú)菌肝素鈉抗凝血沿管壁緩慢加入預(yù)先放有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(抗凝血淋巴細(xì)胞分離液1: 2)，4800rpm離心30min，吸取中間淋巴細(xì)胞層，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌兩次，并用RPMI1640培養(yǎng)液配成I X IO7個(gè)/mL淋巴細(xì)胞懸濁液。將上述淋巴細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并在每孔加入ConA使最終濃度為45ug/mL，37°C 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48h收集培養(yǎng)上清，離心凍存。培養(yǎng)液IL-2、IL-4濃度的測(cè)定采用放射免疫法測(cè)定。1. 3. 4抗氧化指標(biāo)測(cè)定腸道和脾臟GSH-Px、SOD、CAT和MDA水平。1. 4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SAS 8. 02版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值以MeaniSD表示，ANOVA方差分析，Duncan’ s多重比較。二、結(jié)果與分析2.1生產(chǎn)性能參看圖4，本實(shí)施例中，日糧中添加羧甲基化多糖對(duì)全期肉仔雞體增重、采食量無(wú)顯著影響，日糧中添加羧甲基化多糖對(duì)全期肉仔雞體增重、采食量無(wú)顯著影響。2. 2免疫器官指數(shù)參看圖5，日糧添加CAPS對(duì)21日齡、42日齡肉仔雞胸腺和法式囊指數(shù)的影響達(dá)不到顯著水平(P > O. 05)。在42日齡，CAPS組脾臟指數(shù)明顯低于對(duì)照組。2. 3血清BSA抗體效價(jià)參看圖6，一免BSA后第7天，羧甲基化APS與對(duì)照組之間抗體效價(jià)無(wú)顯著差異；一免后第10天，羧甲基化APS添加組抗體效價(jià)明顯高于對(duì)照組；一免第14天，BSA抗體水平組間顯著性差異又消失；二免BSA后第三天和第六天，羧甲基化APS組抗體效價(jià)明顯高于對(duì)照組；到二免第9天，各處理組差異顯著性消失?？贵w效價(jià)結(jié)果表明，日糧中添加羧甲基化APS能提高肉仔雞體液免疫反應(yīng)。注數(shù)據(jù)以光密度(OD45tl)表示；同列中不同肩標(biāo)表示差異顯著(P < O. 05)。
2. 4淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子參看圖7，血液淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液IL-2、IL_4檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)照組21日齡IL_2水平較極顯著低于CAPS組(P < O. 0001) ；42日齡時(shí)，CAPS組IL-2水平高于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)上的差異顯著性(P = O. 1070)。42日齡時(shí)，CAPS組IL-4水平極顯著高于對(duì)照組(P =O. 0004)。細(xì)胞因子統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明CAPS能明顯增強(qiáng)⑶4+T細(xì)胞分泌IL_2、IL-4。2. 5淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率參看圖8，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率不管刺激原是ConA還是LPS，羧甲基化APS組21日齡淋巴細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組(P < O. 05);在42日齡，采食羧甲基化APS的肉仔雞淋巴細(xì)胞經(jīng)LPS刺激，其淋巴細(xì)胞增殖活性高于對(duì)照組。 2. 6肉仔雞抗氧化力相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果參看圖9，CAPS可以增強(qiáng)21日齡肉仔雞脾臟GSH-Px活性。添加CAPS使得肉仔雞脾臟21日齡SOD活性得到提高，但差異未達(dá)到顯著平準(zhǔn)。與對(duì)照組相比，CAPS能顯著提升42日齡肉仔雞CAT活性；對(duì)照組和APS組間脾臟MDA含量在21日齡、42日齡均存在顯著性差異，表明機(jī)體添加CAPS增加機(jī)體抗氧化能力。
權(quán)利要求
1.羧甲基化分子修飾制備高效低聚黃芪多糖的方法，其特征在于它的制備方法為采用氫氧化鈉-一氯乙酸體系法進(jìn)行羧甲基化分子修飾，以產(chǎn)物量、羧甲基替代度和免疫調(diào)控功能為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)優(yōu)選出黃芪多糖氫氧化鈉-一氯乙酸法修飾的最佳條件為反應(yīng)溫度65°C;氫氧化鈉和一氯乙酸的配比1.6 1、反應(yīng)時(shí)間3. 5h。取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50%，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀得到粗多糖，黃芪多糖純化后用優(yōu)化的條件修飾，通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)研究比較，所得黃芪多糖經(jīng)純化和羧甲基化修飾后其促生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。
全文摘要
羧甲基化分子修飾制備高效低聚黃芪多糖的方法，它涉及生物活性多糖的制備和結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域；它的制備方法為采用氫氧化鈉-一氯乙酸體系法進(jìn)行羧甲基化分子修飾，以產(chǎn)物量、羧甲基替代度和免疫調(diào)控功能為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)優(yōu)選出黃芪多糖氫氧化鈉-一氯乙酸法修飾的最佳條件為反應(yīng)溫度65℃；氫氧化鈉和一氯乙酸的配比1.6∶1、反應(yīng)時(shí)間3.5h。取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50％，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60％，取沉淀得到粗多糖，黃芪多糖純化后用優(yōu)化的條件修飾，通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)研究比較，所得黃芪多糖經(jīng)純化和羧甲基化修飾后其促生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。它具有很好的調(diào)控活性和抗氧化力，節(jié)約材料，節(jié)省時(shí)間。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103030704SQ20121055494
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者楊小軍, 王思宇, 姚軍虎, 王筱霏 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)