本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備育性減低植物的方法。

背景技術(shù)：
植物雄性不育是一個(gè)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)的植物學(xué)性狀，是植物在發(fā)育過(guò)程中基因型表達(dá)與環(huán)境相互作用的結(jié)果。植株本身的雄性不育就可以在免去人工去雄的情況下作為遺傳工具用于開發(fā)利用作物雜種優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行輪回選擇，回交等育種研究。利用植物的雄性不育性培育各種雄性不育系，再借助遺傳工程大量生產(chǎn)雜交種子，從而使許多作物特別是自花傳粉作物的雜種優(yōu)勢(shì)得以在生產(chǎn)上利用，為大規(guī)模生產(chǎn)雜交種子提供了可能性。水稻是我國(guó)重要的糧食作物，水稻雜種優(yōu)勢(shì)和雜交育種方式的發(fā)現(xiàn)與常規(guī)育種相比增產(chǎn)20％以上，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的貢獻(xiàn)，在發(fā)現(xiàn)環(huán)境敏感的核不育水稻材料后，袁隆平院士又提出了兩系選育法，使得水稻雜交育種策略更加簡(jiǎn)便，各方面的品質(zhì)也得到了提高，產(chǎn)量又能提高5-10％。農(nóng)墾58S是最早發(fā)現(xiàn)的光周期調(diào)節(jié)育型的雄性不育材料，它和它轉(zhuǎn)育的粳稻和秈稻光敏不育系在一定溫度范圍可被長(zhǎng)日照誘導(dǎo)不育，短日照誘導(dǎo)可育。由于同時(shí)又受到溫度的影響，它們又被稱為光溫敏不育系。人們通過(guò)基因定位發(fā)現(xiàn)一個(gè)非編碼的前體RNA調(diào)節(jié)了光溫敏不育。但夏季異常低溫(＜23度)會(huì)使得制種失敗，因此光溫敏不育材料的應(yīng)用受到了一定的影響。植物生長(zhǎng)發(fā)育除了收到光照和溫度的影響外，濕度也是一個(gè)重要的環(huán)境因素，雖然濕度和水稻雄性不育的關(guān)系國(guó)內(nèi)外都沒有任何報(bào)道。但早在1993年擬南芥的研究中人們?cè)缇桶l(fā)現(xiàn)一類濕度相關(guān)的雄性不育的突變體pop1，它是由于突變體花粉表面含油層(tryphine)缺少長(zhǎng)鏈脂肪酸和蠟質(zhì)而使得花粉不能從柱頭上吸水，從而導(dǎo)致授粉失敗和不育(但突變體從相對(duì)環(huán)境濕度70％的環(huán)境移入相對(duì)濕度為90％的高濕箱，育性得到了恢復(fù)Preussetal.，GeneDev.19937：947-985)。發(fā)明公開本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種RNA干擾載體。本發(fā)明提供的RNA干擾載體，為將序列表中的序列1所示的DNA分子插入pH7GWIWG2(II)中得到的載體。上述RNA干擾載體為將序列表中的序列1所示的DNA分子通過(guò)同源重組插入pH7GWIWG2(II)中得到的載體；具體為將序列表中的序列1所示的DNA分子通過(guò)同源重組正向插入和反向插入pH7GWIWG2(II)中得到的載體。上述RNA干擾載體按照如下方法制備：1)將序列表中序列1所示的DNA分子與pDONR221載體進(jìn)行BP反應(yīng)，得到中間載體；2)將所述中間載體與pH7GWIWG2(II)載體進(jìn)行LR反應(yīng)，得到RNA干擾載體。上述序列表中序列1所示的DNA分子具體通過(guò)如下方法制備：以水稻的cDNA為模板，用引物對(duì)A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物即為序列表中序列1所示的DNA分子。所述引物對(duì)A由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4組成的單鏈DNA組成。含有上述的RNA干擾載體的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的RNA干擾載體、上述的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在培育水稻不育系或降低水稻育性的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將上述的RNA干擾載體導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物為如下1)或2)：1)不育轉(zhuǎn)基因植物或2)所述轉(zhuǎn)基因植物的育性低于所述目的植物；所述目的植物具體為單子葉植物；所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。由上述的方法得到的轉(zhuǎn)基因植物也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述轉(zhuǎn)基因植物為不育轉(zhuǎn)基因植物或育性減低的轉(zhuǎn)基因植物；所述植物具體為單子葉植物；所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。上述育性減低的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因植物的育性低于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種將目的植物培育為不育突變體或育性降低突變體的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：1)誘變目的植物種子和設(shè)計(jì)用于特異擴(kuò)增目的植物中的三萜合酶編碼基因的引物對(duì)B及標(biāo)記熒光標(biāo)記物的引物對(duì)B；所述誘變目的植物種子為用疊氮化鈉誘變多粒目的植物種子，得到誘變種子；所述設(shè)計(jì)用于特異擴(kuò)增目的植物中的三萜合酶編碼基因的引物對(duì)B為根據(jù)所述目的植物中的三萜合酶編碼基因設(shè)計(jì)用于特異擴(kuò)增的引物對(duì)B，所述標(biāo)記熒光標(biāo)記物的引物對(duì)B中的每條引物標(biāo)記不同熒光標(biāo)記物，所述不同熒光標(biāo)記物的波長(zhǎng)不同；2)將所述誘變種子培養(yǎng)，得到第一代突變M1代群體；將所述第一代突變M1代群體自交，得到第二代突變M2代群體；3)提取第二代突變M2代群體中單株的基因組DNA；將n個(gè)M2代單株的基因組DNA混合得到一個(gè)DNA池；n為2-8；4)以每個(gè)所述DNA池為模板，用所述引物對(duì)B和所述標(biāo)記熒光標(biāo)記物的引物對(duì)B共同作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；5)將所述PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸內(nèi)切酶CELI酶切，得到DNA池對(duì)應(yīng)酶切產(chǎn)物；6)電泳檢測(cè)每一個(gè)所述DNA池對(duì)應(yīng)酶切產(chǎn)物，若所述DNA池對(duì)應(yīng)酶切產(chǎn)物在不同熒光標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)下均產(chǎn)生亮點(diǎn)，則所述DNA池對(duì)應(yīng)的n個(gè)M2代單株中有或候選有育性降低突變體或者不育突變體；若所述DNA池對(duì)應(yīng)酶切產(chǎn)物在不同熒光標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)下沒有均產(chǎn)生亮點(diǎn)，則所述DNA池對(duì)應(yīng)的n個(gè)M2代單株中沒有或候選沒有育性降低突變體或者不育突變體；所述育性降低突變體為育性低于所述目的植物的植株。上述方法中，在所述步驟6)后還包括如下步驟：將有或候選有育性降低突變體或者不育突變體的n個(gè)M2代M2代單株的基因組DNA分別與所述目的植物的基因組DNA混合作為模板，重復(fù)步驟4)-5)，得到M2代單株對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物；電泳檢測(cè)每一個(gè)所述M2代單株M2代單株對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物，若所述M2代單株對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物在不同熒光標(biāo)記物對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下均產(chǎn)生亮點(diǎn)，則所述M2代單株為或候選為不育突變體或育性降低突變體；若所述M2代單株對(duì)應(yīng)的酶切產(chǎn)物在不同熒光標(biāo)記物對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下沒有均產(chǎn)生亮點(diǎn)，則所述M2代單株不為或候選不為不育突變體或育性降低突變體。上述方法中，步驟1)中，所述疊氮化鈉誘變多粒目的植物種子為將所述多粒目的植物種子浸泡在濃度為2mM的疊氮化鈉水溶液中6h；室溫浸泡即可。所述三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列2；所述不同熒光標(biāo)記物為波長(zhǎng)為682nm的熒光標(biāo)記物DY-682和波長(zhǎng)為782nm的熒光標(biāo)記物DY-782；所述三萜合酶編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列5；所述引物對(duì)B為如下1)-3)中的任意一種：1)由序列表中序列6所示的單鏈DNA分子和序列表中序列7所示的單鏈DNA分子組成；2)由序列表中序列8所示的單鏈DNA分子和序列表中序列9所示的單鏈DNA分子組成；3)由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子和序列表中序列11所示的單鏈DNA分子組成；所述目的植物為單子葉植物；所述單子葉植物為單子葉禾本科植物；所述單子葉禾本科植物具體為水稻。上述育性降低突變體為育性低于目的植物的突變體，在具體實(shí)施例中，目的植物具體為水稻，育性降低突變體具體為育性低于水稻的突變體。由上述的方法制備的不育突變體或育性降低突變體也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述育性降低突變體，其保藏號(hào)為CGMCCNO.6150。上述的轉(zhuǎn)基因植物或上述的不育突變體或育性降低突變體在雜交制種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述育性降低突變體為育性低于目的植物的突變體，所述目的植物為單子葉植物；所述單子葉植物為單子葉禾本科植物；所述單子葉禾本科植物具體為水稻；在具體實(shí)施例中，育性降低突變體具體為育性低于水稻的突變體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種獲得不育突變體或育性降低突變體的方法。本發(fā)明提供的方法，為沉默或失活目的植物中的三萜合酶編碼基因，得到不育突變體或育性降低突變體；所述育性降低突變體為育性低于所述目的植物的植株。上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為單子葉禾本科植物；所述單子葉禾本科植物為水稻、小麥、大麥、高粱或玉米；所述水稻的三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列2；所述水稻的三萜合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5；所述小麥的三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列15；所述小麥的三萜合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列14；所述大麥的三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列17；所述大麥的三萜合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列16；所述高粱的三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列18；所述高粱的三萜合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列19；所述玉米的三萜合酶的氨基酸序列為序列表中的序列20；所述玉米的三萜合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列21。上述沉默或失活目的植物中的三萜合酶編碼基因的方式具體可以采用RNA干擾目的植物中三萜合酶編碼基因表達(dá)或點(diǎn)突變目的植物中三萜合酶編碼基因；上述方法中，所述沉默或失活水稻中的三萜合酶編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中至少一種：1)將所述水稻中的三萜合酶編碼基因的第764核苷酸殘基G突變?yōu)锳；2)將所述水稻中的三萜合酶編碼基因的第809核苷酸殘基G突變?yōu)锳；3)將所述水稻中的三萜合酶編碼基因的第1431核苷酸殘基G突變?yōu)锳。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種恢復(fù)或提高出發(fā)植物育性的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：在出發(fā)植物的開花期，保持植物花序生長(zhǎng)濕度為80-100％；所述出發(fā)植物為不育突變體或育性降低突變體。上述方法中，所述不育突變體或育性降低突變體為上述的轉(zhuǎn)基因植物或上述的不育突變體或育性降低突變體。上述方法中，所述保持植物花序生長(zhǎng)濕度的時(shí)間為1周；所述保持植物花序生長(zhǎng)濕度的方法為將所述出發(fā)植物的整個(gè)花序包裹；所述包裹具體采用塑料袋套在整個(gè)花序上或保鮮膜覆蓋整個(gè)花序。上述篩選的育性降低突變體P34E8為OsOSC8突變株(即為突變體S6)，已于2012年05月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.6150，分類命名為水稻Oryzasativa。除非特別指出或是單獨(dú)定義，本文所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員共知的、無(wú)歧義的相同含義。另外，本文所述的材料、方法以及實(shí)施案例本意在于說(shuō)明和闡述而非限制或限定。附圖說(shuō)明圖1為RNAi株系蛋白的westernblot檢測(cè)結(jié)果圖2為RNAi株系的自然結(jié)實(shí)率和保濕處理后結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖3為檢測(cè)到的突變體的電泳圖圖4為野生型(WT)和突變體(P34E8)的花序(A、B)、小花(C、D，bars＝0.5cm)、碘-碘化鉀染色(E、F，bars＝100μm)和Alexander染色(G、H，bars＝100μm)圖5為野生型(WT)和突變體(P34E8)花粉在培養(yǎng)液中的萌發(fā)情況，bars＝100μm圖6為不同時(shí)間野生型(WT)和突變體(P34E8)花粉在柱頭上的粘附、萌發(fā)情況，bars＝100μm圖7為野生型(WT)和突變體(P34E8)正反交后花粉在柱頭上的粘附、萌發(fā)情況，bars＝100μm圖8為野生型(WT)、突變體(P34E8)及保濕處理后純合突變體花序結(jié)實(shí)情況，bars＝2cm圖9為大麥和小麥中同源基因的片段的擴(kuò)增圖10為禾本科作物中OsOSC8的同源蛋白序列的比對(duì)和可能有效的突變位點(diǎn)實(shí)施發(fā)明的最佳方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。水稻中三萜合酶OsOSC8蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2；編碼該蛋白的基因的核苷酸序列為序列表中的序列5。實(shí)施例1、RNA干擾制備育性降低的轉(zhuǎn)基因水稻一、OsOSC8的RNA干擾載體的獲得1、Gateway中間載體pDONR221/osc8-1的獲得根據(jù)OsOSC8的基因序列涉及引物如下：引物對(duì)采用invitrogen公司gateway技術(shù)，在正義鏈引物5’端加入attB1序列，反義鏈引物5’端加入attB2序列。引物對(duì)1：sense：5′-AAAAAGCAGGCTGGCTGCACGGATAGAGTT-3′(序列3)antisense：5′-AGAAAGCTGGGTGCCTGTATGGCTGAGAAA-3′(序列4)提取水稻中花11(OrazysativaL.sspjaponica；記載在Zhong-HaiRenetal.，2005，Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter.NatureGenetics37，1141-1146；公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以上述得到的cDNA為模板，用引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為200bp左右的片段1；經(jīng)過(guò)測(cè)序，片段1的核苷酸序列為序列表中的序列1；引物對(duì)1各2pmol，PCRMix(GenestarA112-01)10ul，cDNA2ul，加水至20ul，PCR程序94℃3分鐘，30次循環(huán)(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)，72℃，10分鐘。將得到的片段1等摩爾與pDONR221載體(invitrogen12535-037)混合，在25度下保溫1小時(shí)，即進(jìn)行BP反應(yīng)(invitrogen11789-020)生成入門載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在飽含50mg/L卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)過(guò)夜得到轉(zhuǎn)化子(簡(jiǎn)單原理：由于原質(zhì)粒pDONR221包含一段致死基因ccdB，其轉(zhuǎn)化子不能成活，只有將ccdB基因替換為外源片段的菌落才能生長(zhǎng))。BP反應(yīng)程序：25℃孵育1h后，加入1μl蛋白酶K，混勻后37℃孵育10min。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，用引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將能夠得到200bpPCR產(chǎn)物條帶的單菌落保存為陽(yáng)性克隆。取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒為將序列表中的序列1插入pDONR221載體中得到的載體，命名為pDONR/osc8-1。2、Gateway終端載體pH7GWIWGII-osc8-1的獲得(即OsOSC8RNAi干擾載體)將上述1得到的載體pDONR/osc8-1與pH7GWIWG2(II)(Dammeetal.，SomaticCytokinesisandPollenMaturationinArabidopsisDependonTPLATE，WhichHasDomainsSimilartoCoatProteins.plantcell，2006，18：3502-3518，公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)進(jìn)行等摩爾混合，在25度保溫1小時(shí)，即進(jìn)行LR反應(yīng)(invitrigen11791-020)，混合物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布到含有100mg/L的壯觀霉素平板上，37度培養(yǎng)過(guò)夜，分別得到轉(zhuǎn)化子(原理同BP反應(yīng))。LR反應(yīng)程序：25℃孵育1h后，加入2μl蛋白酶K，混勻后37℃孵育10min。提取轉(zhuǎn)化子中單個(gè)菌落的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為轉(zhuǎn)化子單克隆中包含的質(zhì)粒命名為pH7GWIWGII-osc8-1，其包括正向插入pH7GWIWG2(II)載體的序列表中的序列1所示的DNA分子和反向插入pH7GWIWG2(II)載體的序列表中的序列1所示的DNA分子，為RNA干擾載體。二、OsOSC8的RNA干擾載體獲得育性降低的轉(zhuǎn)基因植物1、重組農(nóng)桿菌的獲得將由上述一得到的RNA干擾載體pH7GWIWGII-osc8-1在1800V電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)...