鑒定細(xì)胞中的多個(gè)表位的方法交叉引用本申請(qǐng)要求以下共同未決的專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)：提交于2011年1月31日的序列號(hào)為61/437,854的申請(qǐng)；其通過引用并入本文。發(fā)明背景雖然人體內(nèi)的所有細(xì)胞都含有相同的遺傳物質(zhì)，但是相同的基因并非在所有這些細(xì)胞中都是活性的?；鶊F(tuán)表達(dá)模式的改變可對(duì)生物功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。此外，理解基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))、其變體以及相互作用配偶體的動(dòng)力學(xué)和調(diào)控在理解例如遺傳疾病/和環(huán)境誘導(dǎo)的疾病背后的機(jī)制或藥物介導(dǎo)治療的影響方面是必要的。這種理解有可能成為進(jìn)一步臨床和診斷分析的潛在基礎(chǔ)。因此，鑒定和量化細(xì)胞內(nèi)基因和/或其產(chǎn)物的表達(dá)和調(diào)控可有助于新的治療和診斷靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。對(duì)這些研究來說至關(guān)重要的是，定性地確定基因表達(dá)和整個(gè)蛋白質(zhì)的特定變體(例如，剪接變體、點(diǎn)突變、翻譯后修飾的形式和環(huán)境/治療誘導(dǎo)的修飾)的能力以及觀察它們的定量調(diào)節(jié)的能力。而且，對(duì)細(xì)胞內(nèi)不只一個(gè)而是多個(gè)靶分子進(jìn)行這些分析變得日益重要。迄今為止，可用的方法仍然需要大量的生物樣品或?qū)⒉惶峁┘?xì)胞特異性的信息。此外，由于蛋白質(zhì)樣品中固有的額外挑戰(zhàn)，所以只有有限的多路復(fù)用蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)的方法。因此，對(duì)于精確且靈敏地檢測(cè)、鑒定和量化復(fù)雜細(xì)胞群體的每個(gè)細(xì)胞中的靶分子并保留有關(guān)該靶分子的細(xì)胞特異性信息存在需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明總的涉及樣品中靶分子的檢測(cè)、鑒定和量化的領(lǐng)域。本發(fā)明部分地涉及復(fù)雜細(xì)胞群體的單細(xì)胞中單獨(dú)(individual)靶分子的檢測(cè)、鑒定和量化，同時(shí)保留有關(guān)該靶分子的細(xì)胞特異性信息。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定在多個(gè)細(xì)胞中是否存在多個(gè)靶標(biāo)的方法，該方法包括：將多個(gè)標(biāo)簽(tag)與靶標(biāo)結(jié)合，其中標(biāo)簽包含代碼(code)，該代碼代表a)靶標(biāo)身份和b)標(biāo)簽結(jié)合在其中的細(xì)胞的身份。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)的細(xì)胞的分開或分離對(duì)于結(jié)合步驟不是必要的。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含彼此直接或間接地相關(guān)聯(lián)(例如，通過共價(jià)結(jié)合或通過親和關(guān)聯(lián))的結(jié)構(gòu)單元。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽通過結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)?shù)奈恢镁酆隙纬?。在一些?shí)施方案中，在一個(gè)步驟中加入多個(gè)結(jié)構(gòu)單元。在一些實(shí)施方案中，在每個(gè)步驟中加入一個(gè)結(jié)構(gòu)單元。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是活的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是裂解的或固定的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定與靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞的方法，該方法包括：將標(biāo)簽與靶標(biāo)結(jié)合，其中標(biāo)簽包含代表a)靶標(biāo)和b)單細(xì)胞的代碼；其中在結(jié)合期間不從細(xì)胞群體中分離單細(xì)胞，并且其中代表單細(xì)胞的代碼在結(jié)合之前是未知的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定與靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞的方法，該方法包括：將標(biāo)簽與靶標(biāo)結(jié)合，其中標(biāo)簽包含代表a)靶標(biāo)和b)單細(xì)胞的代碼；其中在結(jié)合期間從細(xì)胞群體中分離單細(xì)胞，并且其中代表單細(xì)胞的代碼在結(jié)合之前是未知的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括檢測(cè)所述代碼，其中單獨(dú)的細(xì)胞的分開或分離對(duì)于檢測(cè)步驟不是必要的。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)靶標(biāo)是蛋白質(zhì)或核酸。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽是核酸或多肽。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽是包含可破譯代碼(decipherablecode)的一系列單體亞單位。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽是編碼的分子組分，其可被解碼。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含可被解碼以確定標(biāo)簽的性質(zhì)的部分的組合。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含UBA。在一些實(shí)施方案中，UBA對(duì)所述靶標(biāo)中的一種是特異性的。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含UBA。在一些實(shí)施方案中，UBA包含抗體。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含ESB。在一些實(shí)施方案中，ESB包含共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，ESB編碼靶標(biāo)身份。在一些實(shí)施方案中，ESB包含核酸。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含APS。在一些實(shí)施方案中，APS是可檢測(cè)的，是可檢測(cè)地不同的編碼單元。在一些實(shí)施方案中，在結(jié)合步驟期間，在連續(xù)數(shù)輪分配混合合成(splitpoolsynthesis)過程中將多個(gè)APS以有序的方式添加至標(biāo)簽上。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含至少10個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，APS包含核酸。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽包含通過連接作用(ligation)而連接的多個(gè)APS、一個(gè)ESB和一個(gè)UBA。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)APS、所述ESB和/或所述UBA能夠通過點(diǎn)擊化學(xué)(Clickchemistry)而連接。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS具有不同的可辨別成分(GPN：是指一部分代碼可以是核酸，另一部分可以是多肽，另一部分可以是小分子，等等)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含：a)第一靶分子，b)對(duì)該第一靶分子特異性的第一獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)，c)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)，和d)多個(gè)有序的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)，其中APS的順序是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含顆粒群體的組合物，每個(gè)顆粒包含至少第一靶分子，其中該第一靶分子關(guān)聯(lián)于：a)對(duì)第一靶分子特異性的第一獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)，b)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)，和c)第一多個(gè)有序的可測(cè)定第一聚合物亞單位(APS)，其中與該群體中第一顆粒的第一靶分子相關(guān)聯(lián)的多個(gè)有序APS可檢測(cè)地不同于與該群體中第二顆粒的第一靶分子相關(guān)聯(lián)的多個(gè)有序APS。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)有序APS包含2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)或20個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)有序APS包含多于20個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)離散顆粒選自細(xì)胞、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、膠束、小滴和珠。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實(shí)施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，所述第一靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述第一ESB直接與所述第一UBA結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)有序APS是通過在單獨(dú)的輪次中逐步添加APS而形成的。在一些實(shí)施方案中，每輪添加的APS與第一復(fù)合物連接。在一些實(shí)施方案中，連接按輪次的順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，連接通過結(jié)合親和力進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，使用化學(xué)方法進(jìn)行APS、ESB或UBA的連接。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)方法包含點(diǎn)擊化學(xué)。在一些實(shí)施方案中，連接在CuI的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。一些實(shí)施方案還包含第一連接寡核苷酸，該第一連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，使用包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)的連接寡核苷酸來連接UBA、APS或ESB。一些實(shí)施方案還包含第二連接寡核苷酸，該第二連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第三和第四互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，使用包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第三和第四互補(bǔ)區(qū)的連接寡核苷酸來連接UBA、APS或ESB。在一些實(shí)施方案中，第二和第四互補(bǔ)區(qū)是相同的。在一些實(shí)施方案中，第二和第四互補(bǔ)區(qū)是相同的。在一些實(shí)施方案中，在多個(gè)APS中的兩個(gè)APS之間共有第一或第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述連接通過連接作用進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源的子代碼。在一些實(shí)施方案中，APS具有編碼APS的起源的子代碼。在一些實(shí)施方案中，ESB具有編碼ESB的起源的子代碼。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽(countertag)。在一些實(shí)施方案中，獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，ESB共價(jià)連接至連接寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中APS和ESB在連接時(shí)能夠編碼次級(jí)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，次級(jí)產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實(shí)施方案中，APS和ESB在連接時(shí)包含聚合酶起始位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，肽包含親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含探針。在一些實(shí)施方案中，探針連接至表面。在一些實(shí)施方案中，表面包含陣列。在一些實(shí)施方案中，表面包含珠。在一些實(shí)施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽(peptoid)和核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用細(xì)胞起源條碼標(biāo)記細(xì)胞群體中細(xì)胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)，每個(gè)APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)靶分子特異性的獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用細(xì)胞起源條碼標(biāo)記細(xì)胞群體中細(xì)胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)，每個(gè)APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)多個(gè)靶分子特異性的獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)，每個(gè)UBA連接有UBA特異性的表位特異性條碼(ESB)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用細(xì)胞起源條碼標(biāo)記細(xì)胞群體中細(xì)胞的靶分子的試劑盒，其包含a)n組m個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)，每個(gè)APS包含不同的信息包；其中該信息包能夠以有序的方式連接；b)多個(gè)靶分子特異性的獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)；c)多個(gè)UBA特異性的表位特異性條碼(ESB)，其中每個(gè)ESB能夠與指定的UBA連接。在一些實(shí)施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實(shí)施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實(shí)施方案中，n大于10。在一些實(shí)施方案中，m大于20。在一些實(shí)施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，所述ESB能夠直接地與所述UBA結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述UBA能夠直接地與靶分子結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個(gè)是相同的。在一些實(shí)施方案中，第一組中的APS可與第二組中的APS連接。在一些實(shí)施方案中，第一組中的APS進(jìn)一步可與第二組中的APS以有序的方式連接。在一些實(shí)施方案中，APS、ESB或UBA能夠使用化學(xué)方法連接。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)方法包含點(diǎn)擊化學(xué)。在一些實(shí)施方案中，CuI的存在是連接所必需的。在一些實(shí)施方案中，試劑盒的組分可通過親和結(jié)合進(jìn)行組裝。在一些實(shí)施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含第一連接寡核苷酸，該第一連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含第二連接寡核苷酸，該第二連接寡核苷酸包含與選自UBA、APS和ESB的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第三和第四互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第一和第三互補(bǔ)區(qū)是相同的。在一些實(shí)施方案中，第二和第四互補(bǔ)區(qū)是相同的。在一些實(shí)施方案中，APS、ESB或UBA能夠通過連接作用而連接。在一些實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的原始組(originalset)的子代碼。在一些實(shí)施方案中，APS具有編碼APS的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，ESB具有編碼ESB的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)APS、ESB或連接寡核苷酸包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，APS和ESB在連接時(shí)能夠編碼次級(jí)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，次級(jí)產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實(shí)施方案中，APS和ESB在連接時(shí)包含聚合酶起始位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，肽包含親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含探針。在一些實(shí)施方案中，探針連接至表面。在一些實(shí)施方案中，表面包含陣列。在一些實(shí)施方案中，表面包含珠。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)UBA包含2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)、1000個(gè)或多于1000個(gè)UBA。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)UBA包含最多達(dá)2000個(gè)UBA。在一些實(shí)施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定共有共同顆粒起源的靶分子的方法，其包括用第一起源條碼標(biāo)記x個(gè)顆粒的群體中第一顆粒的第一多個(gè)靶標(biāo)；以及用第二起源條碼標(biāo)記x個(gè)顆粒的群體中第二顆粒的第二多個(gè)靶標(biāo)；其中每個(gè)起源條碼包含一組n個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)；其中第一和第二組APS中的n個(gè)APS中的每一個(gè)選自m個(gè)不同的APS；并且其中第一和第二起源條碼彼此可檢測(cè)地不同，具有c=1-[(1–1/x)^(mn)]的確定性。在一些實(shí)施方案中，x大于1,000,000。在一些實(shí)施方案中，c大于99.9%。在一些實(shí)施方案中，c大于99.99%。在一些實(shí)施方案中，c大于99.999%。在一些實(shí)施方案中，c大于99.9999%。在一些實(shí)施方案中，c大于99.99999%。在一些實(shí)施方案中，n為2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實(shí)施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實(shí)施方案中，n大于10。在一些實(shí)施方案中，m大于20。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)離散顆粒選自細(xì)胞、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、膠束、小滴和珠。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)含有m個(gè)不同APS的組是相同的。在一些實(shí)施方案中，在單獨(dú)的輪次中添加n個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，將單獨(dú)輪次的APS連接起來。在一些實(shí)施方案中，連接按輪次的順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，以所期望的確定性水平基于給定的細(xì)胞數(shù)x選擇合適的n和/或m。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及給顆粒群體中的顆粒的組分賦予顆粒特異性代碼的方法，該方法包括：將第一有序組的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第一顆粒的第一組分連接，其中APS的順序是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括檢測(cè)與第一組分連接的第一有序組的APS，從而確定第一組分的顆粒起源。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將第二有序組的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第一顆粒的第二組分連接，其中APS的順序是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括檢測(cè)與第二組分連接的第二有序組的APS，從而確定第二組分的顆粒起源。在一些實(shí)施方案中，與第一顆粒的第一和第二組分連接的第一和第二有序組的APS是相同的。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將第三有序組的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)與顆粒群體的第二顆粒的第一組分連接，其中APS的順序是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，與第一顆粒的第一組分連接的第一有序組的APS不同于與第二顆粒的第一組分連接的第三有序組的可測(cè)定聚合物亞單位。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將組分特異性的表位特異性條碼(ESB)與第一組分連接。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將組分特異性ESB與第二組分連接。在一些實(shí)施方案中，至少顆粒選自細(xì)胞、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、膠束、小滴和珠。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述ESB直接與所述UBA結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個(gè)是相同的。在一些實(shí)施方案中，來自有序組的APS的每個(gè)APS與第一復(fù)合物連接。在一些實(shí)施方案中，連接按輪次的順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS編碼次級(jí)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，次級(jí)產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，ESB還包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，使用計(jì)數(shù)器標(biāo)簽來估計(jì)分子的靶分子的量。在一些實(shí)施方案中，APS還包含輪次特異性子代碼。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)還包括確定來自指定輪次的APS的存在。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是數(shù)字化的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是間接的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括核酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括肽測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括質(zhì)量凝膠電泳。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括HPLC或其他色譜分離。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括檢測(cè)與一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)APS相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)是有序的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括使用一個(gè)或多個(gè)探針。在一些實(shí)施方案中，探針連接至表面。在一些實(shí)施方案中，表面包含陣列。在一些實(shí)施方案中，表面包含珠。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括分離。在一些實(shí)施方案中，分離是多維的。在一些實(shí)施方案中，分離將第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)與第二可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)拆分(resolve)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)、1000個(gè)或多于1000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)最多達(dá)2000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實(shí)施方案中，APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而連接。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞起源條碼(COB)由來自有序組APS的APS產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)復(fù)合物中的每個(gè)COB具有將其與所述細(xì)胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測(cè)信號(hào)或序列。在一些實(shí)施方案中，采用化學(xué)方法連接APS、ESB或UBA。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)方法包含點(diǎn)擊化學(xué)。在一些實(shí)施方案中，連接在CuI的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實(shí)施方案中，使用含有與待連接的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)的連接寡核苷酸進(jìn)行UBA、APS或ESB的連接。在一些實(shí)施方案中，在APS群體中的APS之間共有第一或第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于兩個(gè)不同的輪次特異性APS組，第一或第二互補(bǔ)區(qū)是不同的。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括連接。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實(shí)施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括檢測(cè)獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特計(jì)數(shù)器標(biāo)簽的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)到的獨(dú)特計(jì)數(shù)器標(biāo)簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，COB編碼肽序列。在一些實(shí)施方案中，COB包含聚合酶起始位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，肽包含親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)源自多個(gè)離散顆粒的多種特性的方法，該方法包括：a)提供：i)包含至少第一靶分子的顆粒群體；ii)對(duì)第一靶分子特異性的第一獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)；iii)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)；iv)多個(gè)輪次特異性的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組，每個(gè)組含有多個(gè)彼此可檢測(cè)地不同的APS；b)形成包含所述至少第一靶分子、所述第一UBA探針和所述第一ESB的至少第一復(fù)合物；c)進(jìn)行n輪分配混合合成，每輪包括：i)將顆粒群體分至m個(gè)反應(yīng)體積中；ii)使一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)體積與來自該輪特異性的APS組的APS接觸；iii)合并兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)體積；d)檢測(cè)來自顆粒群體的至少一個(gè)顆粒的多種特性；其中至少一種特性與關(guān)聯(lián)于該顆粒的靶分子的量或身份相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)源自多個(gè)離散顆粒的多種特性的方法，該方法包括：a)提供：i)包含至少第一靶分子的顆粒群體；ii)對(duì)第一靶分子特異性的第一獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)；iii)第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)；以及iv)多個(gè)輪次特異性的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組，每個(gè)組含有多個(gè)彼此可檢測(cè)地不同的APS；b)形成包含所述至少第一靶分子、所述第一UBA探針和所述第一ESB的至少第一復(fù)合物；c)進(jìn)行n輪分配混合合成，每輪包括：i)將顆粒群分至m個(gè)反應(yīng)體積中；ii)使一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)體積與來自該輪特異性的APS組的APS接觸；以及iii)合并兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)體積；d)進(jìn)行包括步驟c)i)和c)ii)的另一輪分配混合合成；e)檢測(cè)來自顆粒群體的至少一個(gè)顆粒的多種特性；其中至少一種特性與關(guān)聯(lián)于該顆粒的靶分子的量或身份有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，將分配混合方法替換為例如在微孔或微流體裝置中的顆粒的分離。在一些實(shí)施方案中，用細(xì)胞起源條碼標(biāo)記分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過逐步加入結(jié)構(gòu)單元而在合適的位置構(gòu)建細(xì)胞起源條碼。在一些實(shí)施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實(shí)施方案中，n大于20。在一些實(shí)施方案中，至少兩輪之間的m是不同的。在一些實(shí)施方案中，m為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實(shí)施方案中，m大于20。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)離散顆粒選自細(xì)胞、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、膠束、小滴和珠。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。在一些實(shí)施方案中，第一ESB包含第一共同連接體(CL)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)靶分子直接與所述第一UBA結(jié)合，并且所述ESB直接與所述UBA結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組中的至少兩個(gè)是相同的。在一些實(shí)施方案中，每輪添加的APS連接至第一復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，該連接按輪次的順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS編碼次級(jí)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，次級(jí)產(chǎn)物是RNA或肽。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB或APS是可模板化的。在一些實(shí)施方案中，ESB進(jìn)一步包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，使用計(jì)數(shù)器標(biāo)簽來估計(jì)分子的靶分子的量。在一些實(shí)施方案中，APS進(jìn)一步包含輪次特異性子代碼。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)還包括確定來自指定輪次的APS的存在。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是數(shù)字化的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是間接的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括核酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括肽測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括檢測(cè)與一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)APS相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)是有序的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括使用一個(gè)或多個(gè)探針。在一些實(shí)施方案中，探針連接至表面。在一些實(shí)施方案中，表面包含陣列。在一些實(shí)施方案中，表面包含珠。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括分離。在一些實(shí)施方案中，分離是多維的。在一些實(shí)施方案中，分離將第一可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)與第二可連接的UBA依賴性的表位特異性條碼(ESB)拆分。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)、1000個(gè)或多于1000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)最多達(dá)2000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述APS包含核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實(shí)施方案中，APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而連接。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞起源條碼(COB)由輪次特異性APS組的APS產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)復(fù)合物中的每個(gè)COB具有將其與所述細(xì)胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測(cè)信號(hào)或序列。在一些實(shí)施方案中，采用化學(xué)方法來連接APS、ESB或UBA。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)方法包含點(diǎn)擊化學(xué)。在一些實(shí)施方案中，該連接在CuI的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實(shí)施方案中，使用包含與待連接的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)的連接寡核苷酸進(jìn)行UBA、APS或ESB的連接。在一些實(shí)施方案中，在APS群體中的APS之間共有第一或第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于兩個(gè)不同的輪次特異性APS組，第一或第二互補(bǔ)區(qū)是不同的。一些實(shí)施方案進(jìn)一步包括連接作用。在一些實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，APS具有編碼輪次特異性APS組的子代碼。在一些實(shí)施方案中，ESB具有編碼ESB的原始存在的子代碼。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括檢測(cè)獨(dú)特的計(jì)數(shù)器標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特計(jì)數(shù)器標(biāo)簽的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)到的獨(dú)特計(jì)數(shù)器標(biāo)簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，COB編碼肽序列。在一些實(shí)施方案中，COB包含聚合酶起始位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，肽包含親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，通過最近的分配而創(chuàng)建的每個(gè)反應(yīng)體積接收來自APS組的不同APS。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的至少一個(gè)靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個(gè)靶分子的細(xì)胞群體，(ii)對(duì)第一靶分子特異性的第一UBA，(iii)對(duì)第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼ESB，其中該ESB包含第一共同連接體部分，和(iv)COB群體，其中該COB群體包含第二共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補(bǔ)的；(b)形成包含至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個(gè)靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)加入COB群體，其中由至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一COB形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一COB的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合，并且其中來自COB群體的COB與來自細(xì)胞群體的細(xì)胞相關(guān)；以及(d)檢測(cè)第二復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的至少一個(gè)靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個(gè)靶分子的細(xì)胞群體，(ii)對(duì)第一靶分子特異性的第一獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)，(iii)對(duì)第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中該ESB包含第一共同連接體部分，和(iv)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)群體，其中該APS包含第二共同連接體部分和第三共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補(bǔ)的；(b)形成包含至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個(gè)靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)將該群體分成兩個(gè)或更多個(gè)樣品；(d)將來自APS群體的APS以每個(gè)樣品一個(gè)APS加入來自步驟(c)的兩個(gè)樣品或更多個(gè)樣品中，其中由至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一APS形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一APS的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合；(e)將來自步驟(c)的兩個(gè)或更多個(gè)樣品合并成一個(gè)樣品；(f)將來自步驟(e)的樣品分成兩個(gè)或更多個(gè)樣品；(g)將來自APS群體的APS以每個(gè)樣品一個(gè)APS加入來自步驟(e)的兩個(gè)或更多個(gè)樣品中，其中由至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針、第一ESB、第一APS和第二APS形成第三復(fù)合物，其中來自第二APS的第二共同連接體部分與來自第一APS的第三連接體部分結(jié)合，并且其中第一APS和第二APS形成細(xì)胞起源條碼(COB)；以及(c)檢測(cè)第三復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括重復(fù)步驟(e)至(g)。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括通過在步驟(b)中形成多個(gè)復(fù)合物來檢測(cè)多個(gè)靶分子，每個(gè)復(fù)合物包含(i)至少一個(gè)靶分子、(ii)第一UBA和(iii)對(duì)第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中該ESB包含第一共同連接體部分，其中至少一個(gè)靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)復(fù)合物中的每個(gè)COB具有將其與細(xì)胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測(cè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)序或質(zhì)譜法檢測(cè)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，通過包括對(duì)第三復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)分子的存在進(jìn)行單獨(dú)計(jì)數(shù)的方法來檢測(cè)第三復(fù)合物，其中第三復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)分子的存在是細(xì)胞中靶分子濃度的指示。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)檢測(cè)還包括檢測(cè)數(shù)字信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)、1000個(gè)或多于1000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)最多達(dá)2000個(gè)不同的靶分子。在一些實(shí)施方案中，UBA選自抗體、肽、適體、類肽和核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB選自核酸、珠和化學(xué)亞單位。在一些實(shí)施方案中，APS是核酸、小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。在一些實(shí)施方案中，APS包含與其上已連接有可檢測(cè)標(biāo)記物的互補(bǔ)多核苷酸序列雜交的單鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，第一APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而與第一ESB連接。在一些實(shí)施方案中，第二APS通過連接作用或通過經(jīng)由聚合的延伸而與第一APS連接。在一些實(shí)施方案中，共同連接體部分是核酸。在一些實(shí)施方案中，ESB連接于USB。在一些實(shí)施方案中，所述第一COB包含多個(gè)APS。一些實(shí)施方案進(jìn)一步包括通過一種方法來檢測(cè)多個(gè)靶分子，該方法包括：在步驟(b)中形成多個(gè)復(fù)合物，每個(gè)復(fù)合物包含(i)至少一個(gè)靶分子、(ii)第一UBA和(iii)對(duì)所述第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼(ESB)，其中所述ESB包含第一共同連接體部分，其中所述至少一個(gè)靶分子與所述第一UBA相關(guān)聯(lián)，并且所述ESB與所述UBA相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)復(fù)合物中的每個(gè)COB具有將其與所述細(xì)胞群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測(cè)信號(hào)或序列。在一些實(shí)施方案中，采用化學(xué)方法進(jìn)行APS、ESB或UBA的連接。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)方法包含點(diǎn)擊化學(xué)。在一些實(shí)施方案中，該連接在CuI的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，利用結(jié)合親和力進(jìn)行ABS、ESB或UBA的連接。在一些實(shí)施方案中，UBA、APS或ESB包含核酸。在一些實(shí)施方案中，使用包含與待連接的兩個(gè)組分互補(bǔ)的第一和第二互補(bǔ)區(qū)的連接寡核苷酸進(jìn)行UBA、APS或ESB的連接。在一些實(shí)施方案中，APS群體中的APS之間共有第一或第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第一或第二互補(bǔ)區(qū)對(duì)于不同APS群體而言是不同的。一些實(shí)施方案進(jìn)一步包括連接作用。在一些實(shí)施方案中，連接寡核苷酸包含編碼APS或ESB的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，APS具有編碼APS的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，ESB具有編碼ESB的起源群體的子代碼。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)APS、ESB或連接寡核苷酸分子包含獨(dú)特標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括檢測(cè)獨(dú)特標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，確定與特異性ESB相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特標(biāo)簽的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)到的獨(dú)特標(biāo)簽的數(shù)目與特異性ESB的初始量相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，ESB與連接寡核苷酸共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，APS或ESB包含擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，COB編碼肽序列。在一些實(shí)施方案中，COB包含聚合酶起始位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，肽包含親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)樣品包含至少5個(gè)樣品。在一些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)樣品包含至少10個(gè)樣品。在一些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)樣品包含至少20個(gè)樣品。在一些實(shí)施方案中，通過最近的分配而創(chuàng)建的每個(gè)樣品接收不同的APS。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用細(xì)胞起源條碼(COB)來標(biāo)記細(xì)胞群體中細(xì)胞的連接有ESB的靶分子的方法，其包括：將每個(gè)細(xì)胞分離至單獨(dú)的反應(yīng)體積中；以及通過化學(xué)或親和手段將COB添加至ESB上。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)體積選自微泡、微滴、孔、微孔和微流體裝置中的包圍體(enclosure)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及以下方法：其包括將來源于細(xì)胞的各種類型的組分分離，并將這些組分置于顆粒上，其中這些組分在所述顆粒上被標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記包括根據(jù)細(xì)胞起源進(jìn)行標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記包括根據(jù)組分類型進(jìn)行標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟中的信號(hào)是有序的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括使用一個(gè)或多個(gè)探針。在一些實(shí)施方案中，探針連接至表面。在一些實(shí)施方案中，表面包含陣列。在一些實(shí)施方案中，表面包含珠。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括分離。在一些實(shí)施方案中，分離是多維的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備如本文所述的至少一個(gè)UBA、ESB和/或APS的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的UBA、ESB和/或APS的群體。在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含如本文所述的UBA、ESB和APS群體及其使用說明書的試劑盒。援引并入本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)均通過引用而以相同的程度并入本文，猶如每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e地和單獨(dú)地被指出為通過引用而并入。附圖說明本發(fā)明的新特征在隨附的權(quán)利要求中具體闡述。通過參考以下對(duì)在其中利用到本發(fā)明原理的說明性實(shí)施方案加以闡述的詳細(xì)描述和附圖，將會(huì)獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)更好的理解，附圖中：圖1描述了代表針對(duì)每個(gè)表位的細(xì)胞起源的不同特征(條碼)的信息量子。圖2示出了本發(fā)明的表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼的組分及其組裝的一個(gè)實(shí)施方案的圖示。圖3示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的UBA-ESB-CL試劑。圖4描述了用UBA-ESB-CL試劑標(biāo)記本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中的細(xì)胞。圖5描述了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的ESB-COB試劑。圖6描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的ESB-COB組裝。圖7描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案的ESB-COB組裝。圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案的ESB-COB組裝。圖9描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案的ESB-COB組裝。圖10描述了根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案的ESB-COB組裝。圖11描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的基于肽的ESB-COB讀出值。具體實(shí)施方案術(shù)語“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括能夠以與天然存在的核苷酸相似的方式起作用(例如，雜交)的、天然核苷酸的已知類似物。術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們是指任意長(zhǎng)度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任意三維結(jié)構(gòu)，并且可行使任何已知的或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性實(shí)例：基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、基因間DNA、由連鎖分析限定的多個(gè)基因座(一個(gè)基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、小核仁RNA、核酶、互補(bǔ)DNA(cDNA)，cDNA是mRNA的DNA呈現(xiàn)，通常通過信使RNA(mRNA)的逆轉(zhuǎn)錄或通過擴(kuò)增而獲得；合成或擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA分子、基因組DNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、分離的任意序列DNA、分離的任意序列RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，在聚合物組裝之前或之后可對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。核苷酸序列可被非核苷酸組分打斷。在聚合后可對(duì)多核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，如通過與標(biāo)記組分偶聯(lián)。當(dāng)提供時(shí)，多核苷酸序列以5’到3’的方向列出，除非另有說明。術(shù)語核酸包括雙鏈或三鏈核酸以及單鏈分子。在雙鏈或三鏈核酸中，核酸鏈不必是共同延伸的(即，雙鏈核酸不必沿兩條鏈的全長(zhǎng)都是雙鏈的)。術(shù)語核酸還包含其任何化學(xué)修飾，如通過甲基化和/或通過加帽。核酸修飾可包括將附加電荷、可極化性、氫鍵、靜電相互作用以及官能性引入單獨(dú)的核酸堿基或整個(gè)核酸的化學(xué)基團(tuán)的添加。此類修飾可包括堿基修飾，如2′位的糖修飾、5位的嘧啶修飾、8位的嘌呤修飾、在胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修飾、異常堿基配對(duì)組合如異堿基異胞苷和異胍等。更具體地，在某些實(shí)施方案中，核酸可以包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)和為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷的任何其他類型的核酸，以及含有正核苷酸(normucleotidic)骨架的其他聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚嗎啉基(可從Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.作為Neugene購(gòu)得)聚合物，以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，條件是該聚合物以一種構(gòu)型含有核堿基，該構(gòu)型允許如在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的堿基配對(duì)和堿基堆積。術(shù)語核酸還包括美國(guó)專利6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中所述的連接核酸(LNA)，通過引用將其對(duì)LNA的公開內(nèi)容整體并入本文。核酸可來自于完全化學(xué)合成過程如固相介導(dǎo)的化學(xué)合成，來自于生物來源如通過從任何產(chǎn)生核酸的物種中分離，或來自于涉及通過分子生物學(xué)工具操縱核酸的過程如DNA復(fù)制、PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄，或來自于這些過程的組合。核酸“探針”是通過一種或多種類型的化學(xué)鍵，一般是通過互補(bǔ)堿基配對(duì)，常常是通過氫鍵的形成，能夠與具有互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合，從而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。探針與“探針結(jié)合位點(diǎn)”結(jié)合或雜交。可用可檢測(cè)標(biāo)記物來標(biāo)記探針以允許便捷的探針檢測(cè)，尤其是一旦探針已與其互補(bǔ)靶標(biāo)雜交時(shí)。然而，備選地，探針可以是未標(biāo)記的，但通過直接地或間接地與標(biāo)記的配體特異性結(jié)合而可以是可檢測(cè)的。探針的大小可顯著變化。通常，探針長(zhǎng)度為至少7至15個(gè)核苷酸。其他探針為至少20、30或40個(gè)核苷酸長(zhǎng)。再其他的探針稍長(zhǎng)，為至少50、60、70、80或90個(gè)核苷酸長(zhǎng)。又其他的探針更長(zhǎng)，并且為至少100、150、200個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。探針還可以具有以任何上述值為界限的任何范圍內(nèi)的任何長(zhǎng)度(例如，15-20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)。引物或探針可與靶核酸序列完全互補(bǔ)或可小于完全互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，在至少7個(gè)核苷酸的序列上，更典型地在10-30個(gè)核苷酸的序列上，并且常常在至少14-25個(gè)核苷酸的序列上，引物與靶核酸序列的互補(bǔ)序列具有至少65%的同一性，并且更通常地具有至少75%的同一性，至少85%的同一性、至少90%的同一性或至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。應(yīng)當(dāng)理解，通常期望地，某些堿基(例如，引物的3′堿基)與靶核酸序列的相應(yīng)堿基完全互補(bǔ)。引物和探針通常在嚴(yán)格的雜交條件下與靶序列退火。混合物中存在的、依賴于親和力的可用結(jié)合相互作用限定了對(duì)于兩種或更多種組分的結(jié)合特異性的特異性。通常，與對(duì)于第一相互作用中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體可用的其他可用相互作用的結(jié)合親和力相比，對(duì)于第一相互作用的高結(jié)合親和力將導(dǎo)致高特異性。具有高特異性的結(jié)合配偶體形成指定的結(jié)合配偶體?，F(xiàn)在將對(duì)本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例在以下實(shí)施例部分進(jìn)行闡述。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文引用的所有專利和出版物均通過引用整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和量化生物分子樣品中的單獨(dú)靶分子的方法、組合物和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和量化復(fù)雜細(xì)胞群體的每個(gè)細(xì)胞中的單獨(dú)靶分子而同時(shí)保留關(guān)于該靶分子的細(xì)胞特異性信息的方法、組合物和試劑盒。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和量化具有復(fù)雜細(xì)胞群體的樣品中基于單細(xì)胞的單獨(dú)靶分子的方法、組合物和試劑盒。因此，在一些實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)細(xì)胞測(cè)定與該細(xì)胞相關(guān)的每個(gè)靶分子的量。尤其是，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合單獨(dú)靶分子的獨(dú)特結(jié)合劑。本發(fā)明還提供了使用表位特異性條碼來標(biāo)記靶分子。本發(fā)明還提供了使用細(xì)胞起源條碼來指示起源細(xì)胞。通過表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼，獨(dú)特結(jié)合劑與靶分子的結(jié)合導(dǎo)致靶分子的鑒定。還提供了制備和使用此類獨(dú)特結(jié)合劑和/或表位特異性條碼和/或細(xì)胞起源條碼的方法。本文所述的方法和組合物可用于多種應(yīng)用中，如診斷、預(yù)后、質(zhì)量控制和篩選應(yīng)用。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及用于單獨(dú)標(biāo)記細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。術(shù)語“表位”和“靶分子”在本文中可互換使用，是指通過本文所述的方法檢測(cè)和/或量化的感興趣的分子(其部分或整個(gè)分子)。本發(fā)明的某些方面涉及多個(gè)靶分子的檢測(cè)。本文所述的方法在多個(gè)靶分子的檢測(cè)、量化和靈敏度方面提供了潛在的益處。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于研究多蛋白質(zhì)測(cè)定和/或多核酸測(cè)定的靈敏且可靠的方法和組合物。在單細(xì)胞水平上在一個(gè)樣品中的多路復(fù)用(multiplexing)是該方法的主要優(yōu)勢(shì)。一個(gè)樣品中的多路復(fù)用節(jié)約大量勞力，降低與測(cè)量數(shù)成比例的樣品量需求，并且通過消除由獨(dú)立樣品處理和測(cè)量步驟所復(fù)雜化的誤差來提高精確度。此外，獲得對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群體中單細(xì)胞中的多個(gè)靶分子的測(cè)量提供了對(duì)每個(gè)單獨(dú)細(xì)胞內(nèi)生理學(xué)過程的更好的理解。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法允許在處理過程中將不同的樣品合并在一起以同時(shí)進(jìn)行分析。這提供了通量?jī)?yōu)勢(shì)并且可以加速不同樣品的分析。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于分析靶分子的獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于多路復(fù)用分析的UBA群體。群體中的每個(gè)UBA對(duì)靶分子是特異性的。因此，UBA提供了對(duì)在細(xì)胞中識(shí)別的靶分子的特異性。而后使用表位特異性條碼(ESB)和細(xì)胞起源條碼(COB)來檢測(cè)靶分子與UBA的結(jié)合。每個(gè)ESB包含可能與特定靶分子相關(guān)的獨(dú)特代碼。每個(gè)COB包含可能與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼。在一些實(shí)施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實(shí)施方案中，ESB與細(xì)胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。獨(dú)特的COB與特定細(xì)胞中的UBA相關(guān)聯(lián)，以使得每個(gè)COB可與該細(xì)胞中與UBA結(jié)合的靶分子相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，特定的ESB/COB組合被稱為代表每個(gè)靶分子或表位的信息量子(參見圖1)。在一些實(shí)施方案中，COB由一個(gè)或多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位(APS)組成。本發(fā)明的某些方面涉及設(shè)計(jì)的(例如，合成序列)APS的文庫(kù)或群體的選擇。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)的(例如，合成的)APS的群體，其中所述APS包含獨(dú)特序列和/或可檢測(cè)分子，并且其中每個(gè)COB中的一個(gè)或多個(gè)不同APS的組合具有將其與所述群體中的其他COB區(qū)別開的可檢測(cè)信號(hào)或序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含獨(dú)特序列(例如，合成的)的APS，該獨(dú)特序列與其上已連接有可檢測(cè)標(biāo)記物的獨(dú)特互補(bǔ)多核苷酸序列雜交。在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)序來檢測(cè)APS。因此，本發(fā)明的某些方面提供了獨(dú)特COB或ESB/COB群體，每一個(gè)包含獨(dú)特的基于APS的組合，其中該群體中每個(gè)COB或ESB/COB與群體中其他COB或ESB/COB不同。APS通常能夠形成包含COB的構(gòu)建體。允許這種形成的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)均可用于APS。獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)UBA是設(shè)計(jì)為與至少一個(gè)靶分子、至少一個(gè)靶分子替代物或兩者結(jié)合的分子或組裝體；并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，可形成包含UBA和靶分子的分子復(fù)合物。靶分子的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、離子、小分子、有機(jī)單體和藥物。僅為了方便起見，本文所述的大部分實(shí)施方案在與靶蛋白或靶mRNA結(jié)合的UBA的背景下進(jìn)行解釋。然而，這些實(shí)施方案還可應(yīng)用于其他靶分子。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”、“肽”和“氨基酸序列”在本文中可互換使用，是指任意長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可包含修飾的氨基酸，并且可被非氨基酸或合成氨基酸中斷。這些術(shù)語還包含已修飾(例如，通過二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如與標(biāo)記組分偶聯(lián))的氨基酸聚合物。如本文所用的術(shù)語“氨基酸”是指天然的和/或非天然的抑或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L旋光異構(gòu)體以及氨基酸類似物和擬肽(peptidomimetics)。UBA包含至少一個(gè)反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分使其能夠與至少一個(gè)靶分子、至少一個(gè)靶分子的至少一部分、至少一個(gè)靶分子替代物、靶分子替代物的至少一部分或其組合結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于抗原-抗體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合等。在某些實(shí)施方案中，UBA包含身份部分或身份部分的至少一部分，例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體(oligo)。在某些實(shí)施方案中，UBA包含捕獲區(qū)。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)用于UBA的分離和/或UBA向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標(biāo)簽、珠、載玻片、陣列、微滴、微流體裝置中的包圍體或本領(lǐng)域中任何其他合適的捕獲區(qū)。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)是ESB，例如，ESB可以是可檢測(cè)的珠，如具有獨(dú)特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團(tuán)進(jìn)行了內(nèi)部染色的珠)。捕獲區(qū)可限定反應(yīng)體積，在該反應(yīng)體積中可進(jìn)行本發(fā)明的組合物的操作。在一些實(shí)施方案中，UBA是抗體。如本文所用的術(shù)語抗體在廣義上使用，不僅包括完整的抗體分子，例如但不限于免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M，而且包括免疫特異性地與至少一個(gè)表位結(jié)合的抗體分子的任何免疫反應(yīng)性組分。這類免疫反應(yīng)性組分包括但不限于FAb片段、FAb'片段、FAb'2片段、單鏈抗體片段(scFv)、迷你抗體(miniantibodies)、雙抗體、交聯(lián)抗體片段、AffibodyTM、環(huán)肽(cyclotides)、分子等。使用抗體工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到的免疫反應(yīng)性產(chǎn)物也明顯處于術(shù)語抗體的含義內(nèi)。關(guān)于抗體和/或蛋白質(zhì)工程的詳細(xì)描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于J.Maynard和G.Georgiou,Ann.Rev.Biomed.Eng.2:33976(2000)；AntibodyEngineering,R.Kontermann和S.Dubel,編,SpringerLabManual,SpringerVerlag(2001)；美國(guó)專利5,831,012；和S.Paul,AntibodyEngineeringProtocols,HumanaPress(1995)。技術(shù)人員將會(huì)理解抗體可從多種來源獲得，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、重組表達(dá)的抗體、人源化抗體、植物抗體等；并且可從各種動(dòng)物物種獲得，包括兔、小鼠、山羊、大鼠、人、馬、牛、豚鼠、雞、綿羊、驢、人等。許多抗體是可購(gòu)買到的，并且可從許多合約實(shí)驗(yàn)室獲得定制的抗體。關(guān)于抗體的詳細(xì)描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于CurrentProtocolsinImmunology,Coligan等人,編,JohnWiley&Sons(1999,包括截至2003年8月的更新內(nèi)容)；TheElectronicNotebook；BasicMethodsinAntibodyProductionandCharacterization,G.Howard和D.Bethel,編,CRCPress(2000)；J.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第3版,AcademicPress(1996)；E.Harlow和D.Lane,UsingAntibodies,ColdSpringHarborLabPress(1999)；P.Shepherd和C.Dean,MonoclonalAntibodies:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000)；A.Johnstone和M.Turner,Immunochemistry1and2,OxfordUniversityPress(1997)；C.Borrebaeck,AntibodyEngineering,第2版,OxforduniversityPress(1995)；A.Johnstone和R.Thorpe,ImmunochemistryinPractice,BlackwellScience,Ltd.(1996)；H.Zola,MonoclonalAntibodies:PreparationandUseofMonoclonalAntibodiesandEngineeredAntibodyDerivatives(Basics:FromBackgroundtoBench),SpringerVerlag(2000)；以及S.Hockfield等人,SelectedMethodsforAntibodyandNucleicAcidProbes,ColdSpringHarborLabPress(1993)。此外，大量可商購(gòu)的抗體(包括標(biāo)記的或未標(biāo)記的)；多克隆、單克隆和單特異性抗體，及其免疫反應(yīng)性組分；定制抗體供應(yīng)者等，都可在萬維網(wǎng)上找到，尤其是biocompare.com的抗體搜索頁、antibodyresource.com的抗體資源頁和sigmaaldrich.com的抗體瀏覽頁。在一些實(shí)施方案中，本文所述的抗體連接至核酸，例如連接體寡聚體或核酸ESB。將核酸與抗體連接的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的方法中包括將核酸與抗體連接的任何合適的方法?？赏ㄟ^在Gullberg等人,PNAS101(22):228420–8424頁(2004)和Boozer等人,AnalyticalChemistry,76(23):6967-6972頁(2004)(均通過引用并入本文)中所述的方法將本文所述的抗體與核酸連接?？赏ㄟ^隨機(jī)胺連接而將本文所述的抗體與核酸連接。在一些實(shí)施方案中，可使用10:1的核酸:抗體比，通過隨機(jī)胺連接將本文所述的抗體與核酸連接。可通過在Kozlov等人,Biopolymers5:73(5):621–630頁(2004)(通過引用并入本文)中所述的方法將本文所述的抗體與核酸連接?？赏ㄟ^肼化學(xué)將本文所述的抗體與核酸連接?？扇鏝olan,NatureMethods2,11-12(2005)(通過引用并入本文)中所述，使用蝌蚪(tadpoles)將本文所述的抗體與核酸連接。可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法將本文所述的抗體與核酸連接，以產(chǎn)生包括本文所述的抗體的工程抗體。在一些實(shí)施方案中，UBA是適體。適體包括核酸適體(即，單鏈DNA分子或單鏈RNA分子)和肽適體。適體以高度特異性的、構(gòu)象依賴性的方式結(jié)合靶分子，通常具有極高的親和力，但是如果需要，也可選擇具有較低結(jié)合親和力的適體。已經(jīng)表明，適體可基于非常小的結(jié)構(gòu)差異如甲基或羥基的存在與否來區(qū)分靶標(biāo)，并且某些適體可區(qū)分D對(duì)映體和L對(duì)映體。已獲得了結(jié)合小分子靶標(biāo)的適體，該小分子靶標(biāo)包括藥物、金屬離子和有機(jī)染料、肽、生物素和蛋白質(zhì)，包括但不限于鏈霉親和素、VEGF和病毒蛋白質(zhì)。已經(jīng)表明，在生物素化、熒光素標(biāo)記之后以及當(dāng)連接至玻璃表面和微球時(shí)，適體保留功能活性。包括Speigelmer在內(nèi)的核酸適體通過被稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法(SELEX)的體外選擇過程進(jìn)行鑒定。在SELEX過程中，通過體外選擇和擴(kuò)增的反復(fù)過程定期篩選寡核苷酸的非常大的組合文庫(kù)，例如1014-1015個(gè)單獨(dú)序列，常常長(zhǎng)達(dá)60-100個(gè)核苷酸。大多數(shù)靶標(biāo)在8-15個(gè)循環(huán)內(nèi)被親和富集，并且該過程已經(jīng)自動(dòng)化，從而允許更快的適體分離。肽適體通常通過幾種不同的、本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行鑒定，這些蛋白質(zhì)工程技術(shù)包括但不限于噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、選擇性感染噬菌體技術(shù)(SIP)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，核酸適體和肽適體可通過以下常規(guī)程序獲得，而無需過多的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于適體的詳細(xì)描述，包括相關(guān)方案，尤其可見于L.Gold,J.Biol.Chem.,270(23):1358184(1995)；S.Jayasena,Clin.Chem.,45:1628-50(1999)；V.Sieber等人,NatBiotechnol.16(10):955-60(1998)；D.Wilson和J.Szostak,Ann.Rev.Biochem.68:611-47(1999)；L.Jermutus等人,Eur.Biophys.J.,31:179-84(2002)；SS.Spada等人,Biol.Chem.,378:445-56(1997)；B.Wlotzka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,99:8898-8902(2002)。在一些實(shí)施方案中，適體將與核酸如連接體寡聚體或核酸ESB連接或雜交。適體的雜交或連接可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來完成。例如，連接可由至少一種DNA連接酶或至少一種RNA連接酶來酶促進(jìn)行，該酶例如但不限于：T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、嗜熱棲熱菌(Tth)連接酶、水生棲熱菌(Taq)DNA連接酶或激烈火球菌(Pfu)連接酶。連接還可通過化學(xué)連接來進(jìn)行，可使用激活劑或還原劑，如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外線。在一些實(shí)施方案中，UBA是類肽。類肽是能結(jié)合蛋白質(zhì)的N-取代甘氨酸合成肽的短序列。在一些實(shí)施方案中，小尺寸的類肽改善了本文所述的方法的擴(kuò)散和動(dòng)力學(xué)。本文所述的方法包括本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生類肽的任何合適的方法。參見Simon等人,PNAS15;89(20):9367–9371(1992)，其通過引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，UBA是核酸序列，例如，靶mRNA的反義DNA。核酸序列優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，更優(yōu)選為至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在特定的實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性序列約為10至500、20至400、30至300、40至200或50至100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在其他實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性序列約為30至70、40至80、50至90或60至100、30至120、40至140或50至150個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。表位特異性條碼(ESB)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表位特異性條碼(ESB)。每個(gè)ESB包含可與特定靶分子相關(guān)的獨(dú)特代碼。ESB是設(shè)計(jì)為與至少一個(gè)UBA或UBA的一部分結(jié)合的分子或組裝體；并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，可形成包含ESB、UBA和靶分子的分子復(fù)合物。ESB可包含至少一個(gè)身份確認(rèn)部分，該身份確認(rèn)部分使其能夠與至少一個(gè)UBA結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于UBA-抗體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合等。在一些實(shí)施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實(shí)施方案中，ESB與細(xì)胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。在某些實(shí)施方案中，ESB是固體表面或捕獲區(qū)，例如，ESB可以是可檢測(cè)的珠，如具有獨(dú)特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團(tuán)進(jìn)行了內(nèi)部染色的珠)。在一些實(shí)施方案中，UBA直接或間接地與捕獲區(qū)連接。在某些實(shí)施方案中，ESB包含共同連接體部分，例如，連接體寡聚體。在某些實(shí)施方案中，該共同連接體寡聚體與形成細(xì)胞起源條碼(COB)的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)中的共同連接體寡聚體互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，ESB包含捕獲區(qū)。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)用于ESB的分離和/或ESB向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標(biāo)簽、珠、載玻片或陣列。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)是可檢測(cè)的珠，如具有獨(dú)特光譜特征的珠(例如，已用紅色或紅外熒光團(tuán)進(jìn)行了內(nèi)部染色的珠)。在一些實(shí)施方案中，ESB是如上所述的抗體或其片段、適體、核酸或類肽。在一些實(shí)施方案中，ESB是核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸的一部分用本領(lǐng)域已知的支鏈或滾環(huán)方法進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，ESB是類肽。類肽是能結(jié)合蛋白質(zhì)的N-取代甘氨酸合成肽的短序列。在一些實(shí)施方案中，小尺寸的類肽改善了本文所述的方法的擴(kuò)散和動(dòng)力學(xué)。本文所述的方法包括本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生類肽的任何合適的方法。參見Simon等人,PNAS15;89(20):9367–9371(1992)，其通過引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，ESB是核酸序列，例如，互補(bǔ)靶核酸序列的反義核酸。核酸序列優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，更優(yōu)選為至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在特定的實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性序列約為10至500、20至400、30至300、40至200或50至100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在其他實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性序列約為30至70、40至80、50至90或60至100、30至120、40至140或50至150個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。細(xì)胞起源條碼(COB)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了細(xì)胞起源條碼(COB)。每個(gè)COB提供了可能與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼。在一些實(shí)施方案中，在COB與和ESB相關(guān)聯(lián)的共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)結(jié)合后，COB代碼確定出與UBA/ESB復(fù)合物結(jié)合的靶分子的起源細(xì)胞。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的COB包含兩個(gè)主要部分：(i)對(duì)于與UBA/ESB探針相關(guān)聯(lián)的共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)具有特異性的序列；和(ii)可能與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼。在一些實(shí)施方案中，COB是模塊結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，COB包含多個(gè)不同的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)。在一些實(shí)施方案中，COB包含多個(gè)以線性組合方式連接的APS。在一些實(shí)施方案中，COB是含有以下某些基本元件的分子實(shí)體：(i)多個(gè)包含標(biāo)記物連接區(qū)的APS，它們以線性組合方式連接形成骨架，和(ii)包含標(biāo)記物的互補(bǔ)多核苷酸序列，它們與骨架的標(biāo)記物連接區(qū)互補(bǔ)并且與之連接。術(shù)語標(biāo)記物連接區(qū)包括給定骨架內(nèi)限定的多核苷酸序列的區(qū)域，其可作為可檢測(cè)的分子的單獨(dú)連接點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，COB包含以線性組合方式連接的多個(gè)不同的APS，其中APS包含具有確定性重量的小分子。在一些實(shí)施方案中，COB包含以線性組合方式連接的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特APS。在一些實(shí)施方案中，COB包含以線性組合方式連接的4個(gè)或更多個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，以線性組合方式連接的多個(gè)APS可包含獨(dú)特設(shè)計(jì)的核酸序列。此外，COB中以線性組合方式連接的多個(gè)APS可包含至少一個(gè)模板，例如但不限于至少一個(gè)核酸序列，如線性或可線性化的病毒基因組的至少一部分，如腺病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等或諸如λ、M13、ΦX-174、T系列噬菌體等噬菌體的基因組，包括包含克隆盒、多接頭等的其衍生物；質(zhì)粒，如pBR322和pUC系列質(zhì)粒等，包括包含克隆盒、多接頭等的其衍生物；合成模板；包含人工序列的模板；等等。技術(shù)人員將會(huì)理解，實(shí)際上任何核酸片段都可作為用于構(gòu)造COB的模板，只要其大到足以包括至少兩個(gè)APS，或其可與至少一個(gè)其他的核酸序列組合，使得組合的序列大到足以包括至少兩個(gè)APS。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的ESB、APS或COB涉及可模板化的結(jié)構(gòu)單元。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的UBA涉及可模板化的分子。在一些實(shí)施方案中，COB還包含一個(gè)或多個(gè)含有共同連接體部分(例如，共同連接體寡聚體)的APS。共同連接體部分可與APS直接或間接連接。因此，共同連接體部分可與COB共價(jià)連接，或者共同連接體可稍后在試驗(yàn)中與COB結(jié)合。術(shù)語共同連接體部分包括約10至約25個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。共同連接體部分可在COB的5'區(qū)或3'區(qū)進(jìn)行連接，并且可用于COB的捕獲或固定以供成像或檢測(cè)，例如通過將與共同連接體部分互補(bǔ)的序列連接到固體基質(zhì)上。COB的元件可存在于單個(gè)分子實(shí)體(單COB)或兩個(gè)不同的分子實(shí)體(雙COB)中。每個(gè)分子實(shí)體可由一個(gè)分子或通過共價(jià)或非共價(jià)方式彼此連接的多于一個(gè)分子組成。在一些實(shí)施方案中，雙COB的每種組分具有與相同靶分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合的靶分子特異性UBA/ESB。當(dāng)使用雙COB系統(tǒng)時(shí)，其中一個(gè)COB可以是未標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，未標(biāo)記的COB可包含捕獲區(qū)。在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中，COB由單獨(dú)APS結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建而成。在一些實(shí)施方案中，APS以線性方式組合。在一些實(shí)施方案中，由APS構(gòu)建的COB保留了APS的順序。在一些實(shí)施方案中，COB包含分支結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，分支的COB結(jié)構(gòu)包含關(guān)于APS添加順序的信息。在許多實(shí)施方案中，可將形成COB的單獨(dú)APS進(jìn)行解碼。在一些實(shí)施方案中，可將形成COB的APS的順序或添加順序進(jìn)行解碼。不受理論所限制，允許保護(hù)和解碼APS添加順序的平臺(tái)支持由同等數(shù)目的APS結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生更高數(shù)目的不同COB。利用較高數(shù)目的總COB分子類型，群體中的兩個(gè)細(xì)胞/顆粒被相同COB標(biāo)記的可能性降低。因此，本發(fā)明的許多實(shí)施方案的方法為細(xì)胞/顆粒身份的確定給出了更高的統(tǒng)計(jì)顯著性。在一些實(shí)施方案中，與APS連接的互補(bǔ)多核苷酸序列用于將可檢測(cè)分子或標(biāo)記物單體與APS連接。互補(bǔ)多核苷酸序列可被直接標(biāo)記，例如通過將一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)分子共價(jià)引入互補(bǔ)多核苷酸序列中?；蛘?，互補(bǔ)多核苷酸序列可被間接標(biāo)記，例如通過將能夠進(jìn)行特異性配體相互作用的生物素或其他分子引入互補(bǔ)多核苷酸序列中。在這類情況下，配體(例如，在生物素引入互補(bǔ)多核苷酸序列中的情況下的鏈霉親和素)可共價(jià)連接于可檢測(cè)分子。在不直接將與APS連接的可檢測(cè)分子引入互補(bǔ)多核苷酸序列的情況下，該序列作為可檢測(cè)分子與APS之間的橋梁，并且可稱為橋接分子，例如橋接核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于核酸的COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物包含核酸，該核酸可使用與COB的恒定區(qū)(例如，共同連接體部分、捕獲區(qū)或親和標(biāo)簽)互補(bǔ)的核酸如寡核苷酸進(jìn)行親和純化或固定。如上所述，在一些實(shí)施方案中，COB包含可作為用于純化和/或固定(例如固定至固體表面)的親和標(biāo)簽的至少一個(gè)共同連接體部分。共同連接體部分可包含重復(fù)核苷酸(如一系列15個(gè)堿基的重復(fù))的兩個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。在這類示例性實(shí)施方案中，與ESB、ESB/UBA、靶分子/UBA/ESB復(fù)合或不與之復(fù)合的COB均可用涂覆有15個(gè)堿基的寡核苷酸的親和試劑進(jìn)行純化或固定化，該15個(gè)堿基的寡核苷酸是重復(fù)單元的反向互補(bǔ)序列?？稍趦蓚€(gè)或更多個(gè)親和選擇步驟中純化COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物。例如，在COB與ESB/UBA復(fù)合物連接的實(shí)施方案中，COB可包含親和標(biāo)簽。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)使用雙COB時(shí)，一個(gè)COB可包含第一親和標(biāo)簽，而另一個(gè)COB可包含第二(不同的)親和標(biāo)簽。將COB與靶分子混合，并通過針對(duì)一個(gè)或兩個(gè)單獨(dú)親和標(biāo)簽的親和純化將包含雙COB的兩個(gè)探針的復(fù)合物從未結(jié)合的材料中分離出來。在第一步中，可將混合物與針對(duì)第一親和標(biāo)簽的親和試劑結(jié)合，以使得僅有包含第一親和標(biāo)簽和所需復(fù)合物的探針得到純化。結(jié)合的材料從第一親和試劑中釋放出來，并且任選地與針對(duì)第二親和標(biāo)簽的親和試劑結(jié)合，從而允許從包含第一親和標(biāo)簽的COB中分離出復(fù)合物。此時(shí)，僅有完整復(fù)合物將會(huì)被結(jié)合。最后，復(fù)合物從針對(duì)第二親和標(biāo)簽的親和試劑中釋放出來，然后通過本文所述的方法進(jìn)行分析。親和試劑可以是涂覆有親和標(biāo)簽的結(jié)合配偶體的任何固體表面，如柱、珠(例如，乳膠珠或磁珠)，或涂覆有結(jié)合配偶體的載玻片。本領(lǐng)域已知的許多親和標(biāo)簽，例如，可以用于純化和/或固定COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，生物素錨與COB、ESB和/或UBA連接，這允許COB、COB-ESB復(fù)合物或COB/ESB/UBA復(fù)合物在鏈霉親和素表面(例如，涂覆的載玻片或珠)上的固定。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽與UBA連接，例如，用于純化和/或固定UBA。親和標(biāo)簽可用于為了多種有用的應(yīng)用而連接至珠或其他基質(zhì)上，這些應(yīng)用包括但不限于純化。親和標(biāo)簽的實(shí)例及其制備方法和/或其與核酸連接的方法在美國(guó)專利7,473,767；美國(guó)申請(qǐng)10/542,458；12/324,357；11/645,270和12/541,131中有述，它們通過引用整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，ESB、UBA、APS和COB中的至少兩個(gè)包含本文所述的不同的化學(xué)組合物或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的組合物。例如，ESB可包含肽和/或核酸，而APS包含肽或類肽。所述化學(xué)成分的任意組合預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在許多實(shí)施方案中，ESB、APS和/或COB可以是模板、有序的和/或解碼的。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)構(gòu)建體中這些亞單位中任何一個(gè)的順序。ESB、APS和/或COB可為添加ESB、APS和/或COB中的任意另一個(gè)提供模板，例如，通過核酸互補(bǔ)性或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的化學(xué)互補(bǔ)性進(jìn)行添加。ESB、APS和/或COB可編碼次級(jí)產(chǎn)物，如編碼另一種核酸或肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)ESB、APS和/或COB的檢測(cè)包括對(duì)其進(jìn)行解碼，例如從ESB、APS和/或COB產(chǎn)生擴(kuò)增子或表達(dá)肽，以及測(cè)序或以其他方式檢測(cè)產(chǎn)物。與給定細(xì)胞的COB的各種APS相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物單體所提供的序列、重量或信號(hào)允許對(duì)COB的獨(dú)特鑒定。例如，當(dāng)使用核酸序列時(shí)，具有獨(dú)特身份或獨(dú)特序列特征的COB與識(shí)別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對(duì)COB序列的檢測(cè)允許檢測(cè)混合物中靶分子的存在(定性分析)。在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)使用熒光標(biāo)記物時(shí)，具有獨(dú)特身份或獨(dú)特光譜特征的COB與識(shí)別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對(duì)COB信號(hào)如熒光標(biāo)記的COB的光譜代碼的檢測(cè)允許檢測(cè)混合物中靶分子的存在(定性分析)。在又一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)依據(jù)組合合成程序使用小分子時(shí)，具有獨(dú)特確定性重量的COB與識(shí)別特定靶分子或其一部分的UBA相關(guān)聯(lián)。對(duì)COB確定性重量的檢測(cè)(例如，經(jīng)由質(zhì)譜法)允許檢測(cè)混合物中靶分子的存在(定性分析)。對(duì)與給定特征(例如，光譜代碼、獨(dú)特序列或獨(dú)特的確定性重量)相關(guān)的代碼(例如，序列、標(biāo)記物單體或確定性重量)的計(jì)數(shù)或量化允許計(jì)數(shù)或量化混合物中與COB偶聯(lián)的UBA相關(guān)聯(lián)的所有分子(定量分析)。因此，通過對(duì)已知生物標(biāo)志物的定量分析，UBA/ESB/COB復(fù)合物對(duì)于不同生物狀態(tài)(例如，疾病與健康)的診斷或預(yù)后是有用的。此外，由本發(fā)明的COB提供的單分子檢測(cè)和量化的高靈敏度允許鑒定新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，包括那些在不同生物狀態(tài)間的波動(dòng)太微弱因而不能使用傳統(tǒng)分子方法檢測(cè)與特定生物狀態(tài)的相關(guān)性的那些標(biāo)志物。基于COB的分子檢測(cè)的靈敏度允許對(duì)小生物樣品中的治療劑和診斷劑進(jìn)行詳細(xì)的藥代動(dòng)力學(xué)分析。COB合成可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法(包括本文所述的方法)來進(jìn)行。在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將要通過逐步添加包含寡核苷酸的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)而合成的COB。COB可通過共同連接體(CL)與UBA連接。CL也可以是寡核苷酸的一部分。在一些實(shí)施方案中，還提供了作為寡核苷酸的表位特異性條碼。在一些情況下，表位特異性條碼可包括在包含共同連接體的寡核苷酸中。在一些實(shí)施方案中，CL、ESB和APS都包含寡核苷酸序列。因此，可將寡核苷酸CL與寡核苷酸ESB或APS連接?？衫没旧匣パa(bǔ)或完全互補(bǔ)的退火區(qū)域進(jìn)行雜交?？稍诠押塑账酔SB或APS的兩端設(shè)置退火區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，APS在分配混合合成或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的逐步合成的各個(gè)步驟中加入?？蓪?duì)于逐步合成的每一步特異性的退火區(qū)引入寡核苷酸中。不受理論所限制，只要在步驟期間跳過寡核苷酸添加，下一個(gè)寡核苷酸的步驟特異性退火區(qū)將不會(huì)與前一個(gè)可用的寡核苷酸的步驟特異性退火區(qū)有效地雜交。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了停止缺少一個(gè)或多個(gè)APS的COB的合成的方法。在一些實(shí)施方案中，用不同的CL寡核苷酸來標(biāo)記UBA，每個(gè)CL寡核苷酸都具有UBA特異性的獨(dú)特ESB序列和共有退火區(qū)。在許多情況下，在多輪分配混合合成過程中將APS組裝至COB中。在這些情況下，在每一輪，將樣品分入n個(gè)不同的容器中。可向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共m個(gè)不同的APS。在一些實(shí)施方案中，n和m是相同的。在其他實(shí)施方案中，n大于m或m大于n?？稍O(shè)計(jì)每個(gè)APS以使其將選擇性地與前一輪中加入的退火區(qū)雜交(圖6)。在許多實(shí)施方案中，將一對(duì)輪次特異性退火區(qū)引入每個(gè)APS中?？上駻PS的每一端引入退火區(qū)。引入APS每一端的退火區(qū)可以是不同的。因此，加入的APS的退火區(qū)可與來自前一輪的可用退火區(qū)互補(bǔ)從而促進(jìn)組裝。在一些實(shí)施方案中，可使用退火引物將APS訂合在一起和/或與CL訂合(圖7和圖8)。退火引物可包含與CL互補(bǔ)的或與在逐步合成的前一輪中添加的APS互補(bǔ)的第一互補(bǔ)區(qū)。退火引物還可包含與在當(dāng)前一輪中加入的APS互補(bǔ)的第二互補(bǔ)區(qū)。因此，退火引物可與后幾輪的兩個(gè)寡核苷酸亞單位雜交，從而將它們訂合在一起。在一些實(shí)施方案中，每輪的退火引物的第一互補(bǔ)區(qū)不同于其他幾輪的退火引物的第一互補(bǔ)區(qū)(圖7)。在一些實(shí)施方案中，每輪的退火引物的第二互補(bǔ)區(qū)不同于其他幾輪的退火引物的第二互補(bǔ)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，不同輪次的退火引物的第一或第二互補(bǔ)區(qū)在輪次之間是共同的(圖8)。在一些實(shí)施方案中，CL寡核苷酸包含成對(duì)環(huán)狀退火區(qū)(圖9和圖10)。因此，APS可設(shè)計(jì)為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，其沿著環(huán)狀退火區(qū)在每一端與CL雜交。環(huán)狀退火區(qū)可以是輪次特異性的。雜交可沿著CL填充(populate)APS?？墒褂帽疚乃龅娜魏畏椒ɑ虮绢I(lǐng)域已知的其他普通方法將APS連接起來。APS可以設(shè)計(jì)為使得它們不會(huì)沿著對(duì)于其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接在一起，這取決于連接過程?；蛘撸衫萌笔У腁PS合成COB，其位置的側(cè)翼為一對(duì)環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對(duì)得到的COB進(jìn)行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。在給定輪次中的每個(gè)APS可包含獨(dú)特的子代碼序列，該序列不同于該輪中其余的APS(圖6-11)。該子代碼可包含獨(dú)特的核苷酸序列。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS可進(jìn)一步包含允許隨后對(duì)檢測(cè)到的COB進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)(圖6-11)。利用這類隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)的合適方法的變化是本領(lǐng)域已知的，例如，參見Casbon等人(NucleicAcidsResearch,2011,39:12,e81)。在一些情況下，隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)可作為分子計(jì)數(shù)器用來估計(jì)與每個(gè)序列變體相關(guān)的模板分子的數(shù)目。在一些情況下，在擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR之前將分子計(jì)數(shù)器引入CL、ESB、APS或組裝的COB中。可將包含簡(jiǎn)并堿基區(qū)(DBR)的分子計(jì)數(shù)器文庫(kù)引入CL、ESB、APS或組裝的COB。文庫(kù)中獨(dú)特DBR的數(shù)目通常受到DBR的長(zhǎng)度和堿基組成的限制。例如，DBR中的一個(gè)核苷酸將允許有四個(gè)不同的可能的計(jì)數(shù)器，一個(gè)計(jì)數(shù)器針對(duì)一個(gè)堿基。較長(zhǎng)的DBR可以產(chǎn)生較高數(shù)目的獨(dú)特計(jì)數(shù)器序列。可將每個(gè)來自序列文庫(kù)的分子計(jì)數(shù)器引入CL、ESB、APS或組裝的COB。分子計(jì)數(shù)器可用于確定序列變體是與一個(gè)模板分子相關(guān)還是與多個(gè)模板分子相關(guān)。與一個(gè)序列變體相關(guān)的不同DBR序列的數(shù)目可作為初始模板分子數(shù)目的直接量度。該信息可以補(bǔ)充或替代由每個(gè)序列變體的讀數(shù)(包括例如擴(kuò)增反應(yīng)如PCR后的讀數(shù))提供的信息。DBR還可用于確定序列變體源自擴(kuò)增反應(yīng)期間的聚合酶錯(cuò)誤或?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)如PCR之前的真實(shí)的原始變體的可能性。在一些實(shí)施方案中，在COB組裝之前或同時(shí)將獨(dú)特結(jié)合劑(UBA)固定于它們的靶標(biāo)上。本發(fā)明的許多實(shí)施方案涉及COB在細(xì)胞表面上的組裝。例如，COB可與靶向細(xì)胞表面組分的UBA組裝結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，在COB組裝之前或同時(shí)將UBA固定于細(xì)胞表面組分上。在一些實(shí)施方案中，將UBA遞送至細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞區(qū)室內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，COB與細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的UBA組裝結(jié)合。可在加入U(xiǎn)BA、ESB之前或在COB組裝之前將細(xì)胞固定。合適的細(xì)胞透化方法是本領(lǐng)域已知的，并且可用于將該試驗(yàn)的組分遞送至細(xì)胞和細(xì)胞區(qū)室內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，該試驗(yàn)在非細(xì)胞的物體上進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的合適的支持材料，如珠或表面涂層，能用來以與細(xì)胞相同的方式提供原始結(jié)合表面。支持材料可用結(jié)合靶標(biāo)來裝飾。在一些實(shí)施方案中，支持材料在空間上將結(jié)合靶標(biāo)彼此拆分。在一些實(shí)施方案中，該試驗(yàn)可包含主要結(jié)合靶標(biāo)和能與主要結(jié)合靶標(biāo)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)次要靶標(biāo)。支持材料可以例如涂覆有一個(gè)或多個(gè)主要靶標(biāo)?？商峁┐我袠?biāo)文庫(kù)以結(jié)合主要靶標(biāo)?？商峁︰BA以結(jié)合主要靶標(biāo)和/或次要靶標(biāo)的表位。如對(duì)于其他類型的靶標(biāo)所述，COB可與這些UBA組裝結(jié)合。可通過分析COB來監(jiān)測(cè)次要靶標(biāo)與主要靶標(biāo)的相互依賴性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)COB在同一UBA分子上組裝。在一些實(shí)施方案中，ESB或組裝的COB編碼衍生物序列。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或COB包含多核苷酸序列。在一些情況下，ESB和/或COB可編碼RNA序列。在一些情況下，ESB和/或COB編碼肽序列。ESB和/或COB可直接編碼肽序列。或者，COB可間接地例如通過中間RNA序列來編碼肽序列。例如，多核苷酸ESB或COB可編碼開放閱讀框。在一些情況下，在將ESB或COB引入能夠進(jìn)行肽表達(dá)的構(gòu)建體后，肽序列得到翻譯。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是載體。在一些實(shí)施方案中，ESB和COB由寡核苷酸組裝。連接劑可以是連接酶。在一些實(shí)施方案中，連接酶是T4DNA連接酶，采用眾所周知的程序(Maniatis,T.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1982))。還可使用其他DNA連接酶。關(guān)于連接，可使用其他連接酶，如來源于嗜熱生物的連接酶，從而允許在較高溫度下連接，這允許使用較長(zhǎng)的寡核苷酸(具有增強(qiáng)的特異性)作為ESB、CL或APS，其在通常允許這類寡核苷酸退火的較高溫度下可同時(shí)退火和連接。然而，連接并非必須通過酶，相應(yīng)地，連接劑可以是這樣的化學(xué)試劑：其將導(dǎo)致ESB和APS連接，除非在退火區(qū)存在核苷酸堿基對(duì)錯(cuò)配。為簡(jiǎn)單起見，本發(fā)明的一些實(shí)施方案將用T4DNA連接酶作為連接劑來描述。該酶需要在將要與相鄰寡核苷酸上的3'OH基團(tuán)連接的5'端存在磷酸基團(tuán)。當(dāng)寡聚體堆積在一起而結(jié)合至在其末端接合處完全匹配的退火區(qū)時(shí)，導(dǎo)致與退火區(qū)的特異性結(jié)合?？蓪L、ESB和APS連接起來以形成連接有ESB的COB。連接有ESB的COB轉(zhuǎn)而可用于檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或COB組裝包括采用點(diǎn)擊化學(xué)。采用點(diǎn)擊化學(xué)連接多個(gè)分子的合適方法是本領(lǐng)域已知的(對(duì)于寡核苷酸的點(diǎn)擊化學(xué)連接，參見，例如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011))。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或COB組裝在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或APS首先在細(xì)胞內(nèi)組裝。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或APS在細(xì)胞內(nèi)連接。在一些實(shí)施方案中，ESB和/或APS在細(xì)胞外連接。在一些實(shí)施方案中，對(duì)組裝的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，并任選地將結(jié)果與來自參比樣品的相似靶核酸的擴(kuò)增進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，對(duì)APS的連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，并任選地將結(jié)果與來自參比樣品的相似COB的擴(kuò)增進(jìn)行比較。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行擴(kuò)增。在一些情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴(kuò)增連接的產(chǎn)物?？墒褂玫腜CR技術(shù)的實(shí)例包括但不限于定量PCR、定量熒光PCR(QF-PCR)、多重?zé)晒釶CR(MF-PCR)、實(shí)時(shí)PCR(RTPCR)、單細(xì)胞PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、PCK-RFLPIRT-PCR-IRFLP、熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、原位聚合酶群落(polonony)PCR、原位滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、橋式PCR、picotiterPCR和乳液PCR。其他合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、自動(dòng)維持序列復(fù)制、靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)。本文可用的其他擴(kuò)增方法包括美國(guó)專利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的方法。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。在任何實(shí)施方案中，連接產(chǎn)物的擴(kuò)增可在載體如珠或表面上發(fā)生。在本文的任何實(shí)施方案中，COB可在來自單細(xì)胞的靶標(biāo)上進(jìn)行組裝。探針群體中每個(gè)UBA/ESB探針的獨(dú)特性允許對(duì)多個(gè)靶分子進(jìn)行多路復(fù)用分析。而且，探針群體中每個(gè)COB探針的獨(dú)特性允許對(duì)單細(xì)胞中的多個(gè)靶分子進(jìn)行多路復(fù)用分析。例如，在一些實(shí)施方案中，每個(gè)COB含有六個(gè)APS。如果打算對(duì)APS進(jìn)行測(cè)序，并且對(duì)于APS存在20個(gè)可能的獨(dú)特序列。在該實(shí)例中將存在3.84x108個(gè)可能的COB。因此，在該實(shí)例中可分析3.84x108個(gè)細(xì)胞及其相應(yīng)的UBA/ESB探針?？紤]到在測(cè)序中沒有在一些熒光方法中存在的顏色限制，所以每個(gè)細(xì)胞可以分析多個(gè)UBA/ESB探針。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)細(xì)胞分析10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、65個(gè)、70個(gè)、90個(gè)、100個(gè)不同的UBA/ESB。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)細(xì)胞分析最多達(dá)100個(gè)不同的UBA/ESB。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)細(xì)胞分析最多達(dá)1000個(gè)不同的UBA/ESB。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)細(xì)胞分析最多達(dá)2000個(gè)不同的UBA/ESB。在某些實(shí)施方案中，在多路復(fù)用分析中執(zhí)行檢測(cè)方法，以此在同一分析(單一反應(yīng)混合物)中檢測(cè)多個(gè)靶分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中在單細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶分子。在某些實(shí)施方案中，在同一分析中檢測(cè)的多個(gè)靶分子是至少2個(gè)、至少5個(gè)不同的靶分子、至少10個(gè)不同的靶分子、至少20個(gè)不同的靶分子、至少50個(gè)不同的靶分子、至少75個(gè)不同的靶分子、至少100個(gè)不同的靶分子、至少200個(gè)不同的靶分子、至少500個(gè)不同的靶分子，或至少750個(gè)不同的靶分子，或至少1000個(gè)不同的靶分子。在其他實(shí)施方案中，在同一分析中檢測(cè)的多個(gè)靶分子是最多達(dá)50個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)100個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)150個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)200個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)300個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)500個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)750個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)1000個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)2000個(gè)靶分子或最多達(dá)5000個(gè)靶分子。在另外其他的實(shí)施方案中，所檢測(cè)的多個(gè)靶分子處于前述不同靶分子的數(shù)目之間的任何范圍內(nèi)，例如但不限于20至50個(gè)不同的靶分子、50至200個(gè)不同的靶分子、100至1000個(gè)不同的靶分子、500至5000個(gè)不同的靶分子等等。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是數(shù)字化檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是直接的，即該方法獲得直接由所檢測(cè)的實(shí)體產(chǎn)生的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)是間接的，即在獲得信號(hào)之前發(fā)生對(duì)待檢測(cè)的實(shí)體的操作。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的實(shí)體的多種組分直接地或間接地產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，可通過本文所述的檢測(cè)方法確定多個(gè)組分的順序。此類檢測(cè)方法還被描述為有序檢測(cè)方法或具有有序信號(hào)的檢測(cè)方法。在任何實(shí)施方案中，COB的檢測(cè)或量化分析可通過測(cè)序來完成。可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如IlluminaHiSeq2000，包括本文所述的測(cè)序方法，經(jīng)過對(duì)所有DNA標(biāo)簽的完整測(cè)序來檢測(cè)APS亞單位或整個(gè)COB?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的經(jīng)典Sanger測(cè)序法來完成測(cè)序。還可使用高通量系統(tǒng)來完成測(cè)序，其中一些高通量系統(tǒng)允許在測(cè)序的核苷酸并入增長(zhǎng)中的鏈時(shí)或之后立即對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，即，實(shí)時(shí)或基本上實(shí)時(shí)地檢測(cè)序列。在一些情況下，高通量測(cè)序產(chǎn)生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000次序列讀取/小時(shí)；其中每次讀取為至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150個(gè)堿基/讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過Illumina的HiSeq2000機(jī)器獲得的技術(shù)。該機(jī)器采用通過合成化學(xué)進(jìn)行的基于可逆終止子的測(cè)序。該機(jī)器在八天內(nèi)可進(jìn)行2千億次DNA讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過ABISolidSystem獲得的技術(shù)。這種遺傳分析平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)與珠連接的克隆擴(kuò)增的DNA片段的大規(guī)模并行測(cè)序。該測(cè)序方法基于與染料標(biāo)記的寡核苷酸的相繼連接。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過IonTorrentPersonalGenomeMachine(PMG)獲得的技術(shù)。PGM在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)可以進(jìn)行1千萬次讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過HelicosBioSciencesCorporation(Cambridge,Massachusetts)獲得的技術(shù)，如單分子合成測(cè)序(SMSS)法。SMSS是獨(dú)一無二的，因?yàn)槠湓试S在最多達(dá)24小時(shí)內(nèi)對(duì)整個(gè)人類基因組進(jìn)行測(cè)序。這種快速測(cè)序方法還允許基本實(shí)時(shí)地或?qū)崟r(shí)地檢測(cè)序列中的SNP核苷酸。最后，SMSS是強(qiáng)大的，因?yàn)槿鏜IP技術(shù)一樣，其在雜交之前不需要預(yù)擴(kuò)增步驟。實(shí)際上，SMSS不需要任何擴(kuò)增。在公開號(hào)為20060024711、20060024678、20060012793、20060012784和20050100932美國(guó)申請(qǐng)中對(duì)SMSS進(jìn)行了部分描述。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過454Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)獲得的技術(shù)，如PicoTiterPlate裝置，該裝置包括光纖板，該光纖板傳輸將由該儀器中的CCD照相機(jī)記錄的、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。光纖的這種使用允許在4.5小時(shí)內(nèi)檢測(cè)最少2千萬個(gè)堿基對(duì)。先采用珠擴(kuò)增而后進(jìn)行光纖檢測(cè)的方法在Marguiles,M.等人,"Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypricolitrereactors",Nature,doi:10.1038/nature03959以及公開號(hào)為20020012930、20030058629、20030100102、20030148344、20040248161、20050079510、20050124022和20060078909的美國(guó)申請(qǐng)中有所描述。在一些實(shí)施方案中，使用克隆單分子序列(ClonalSingleMoleculeArray)(Solexa,Inc.)或利用可逆終止子化學(xué)的合成測(cè)序(SBS)來進(jìn)行高通量測(cè)序。在美國(guó)專利6,969,488、6,897,023、6,833,246、6,787,308和公開號(hào)為20040106130、20030064398、20030022207的美國(guó)申請(qǐng)和Constans,A.,TheScientist2003,17(13):36中對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行了部分描述。在一些實(shí)施方案中，RNA或DNA的高通量測(cè)序可使用AnyDot.chips(Genovoxx,Germany)進(jìn)行。特別是，AnyDot-chips允許將核苷酸熒光信號(hào)檢測(cè)增強(qiáng)10-50倍。AnyDot.chips及其使用方法在公開號(hào)為WO02/088382、WO03/020968、WO03/031947、WO2005/044836、PCT/EP05/105657、PCT/EP05/105655的國(guó)際申請(qǐng)和德國(guó)專利申請(qǐng)DE10149786、DE10214395、DE10356837、DE102004009704、DE102004025696、DE102004025746、DE102004025694、DE102004025695、DE102004025744、DE102004025745和DE102005012301中有部分描述。其他高通量測(cè)序系統(tǒng)包括在Venter,J.等人,Science,2001年2月16日、Adams,M.等人,Science,2000年3月24日和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月以及公開號(hào)為20030044781和2006/0078937的美國(guó)申請(qǐng)中公開的系統(tǒng)。總體上這類系統(tǒng)涉及通過經(jīng)由在核酸分子上測(cè)定的聚合反應(yīng)暫時(shí)添加堿基而對(duì)具有多個(gè)堿基的靶核酸分子進(jìn)行測(cè)序，即實(shí)時(shí)跟蹤待測(cè)序的模板核酸分子上核酸聚合酶的活性。而后可通過確定在堿基添加順序的每一步中哪個(gè)堿基正在經(jīng)由核酸聚合酶的催化活性而并入靶核酸的增長(zhǎng)互補(bǔ)鏈中來推斷序列。在適合沿著靶核酸分子移動(dòng)并在活性位點(diǎn)處延伸寡核苷酸引物的位置上提供靶核酸分子復(fù)合物上的聚合酶。在接近活性位點(diǎn)處提供多種標(biāo)記類型的核苷酸類似物，其中每個(gè)可區(qū)分類型的核苷酸類似物與靶核酸序列中的不同核苷酸互補(bǔ)。通過使用聚合酶將核苷酸類似物添加到核酸鏈的活性位點(diǎn)處，來延伸增長(zhǎng)的核酸鏈，其中添加的核苷酸類似物與活性位點(diǎn)處的靶核酸的核苷酸互補(bǔ)。對(duì)作為聚合步驟的結(jié)果而添加到寡核苷酸引物上的核苷酸類似物進(jìn)行鑒定。重復(fù)進(jìn)行提供標(biāo)記的核苷酸類似物、使增長(zhǎng)的核酸鏈聚合和鑒定添加的核苷酸類似物的步驟，以使得核酸鏈進(jìn)一步延伸并且確定靶核酸的序列。在許多實(shí)施方案中，直接鑒定寡核苷酸ESB或COB。直接鑒定可包含以上所述的核酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，APS序列編碼衍生物序列，轉(zhuǎn)而鑒定該衍生物序列。例如，多核苷酸ESB和COB可翻譯成肽序列。而后可采用本領(lǐng)域已知的合適的方法鑒定該肽序列。在一些實(shí)施方案中，采用質(zhì)譜分析來鑒定代表COB或ESB的序列。包含質(zhì)譜法的測(cè)序方法是本領(lǐng)域已知的。在許多實(shí)施方案中，衍生物序列如肽采用質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜法包含片段化(fragmentation)。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜法包含N末端測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜法包含C末端測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜法包含Edman降解。在許多實(shí)施方案中，衍生物序列在鑒定之前經(jīng)歷分離過程。在一些實(shí)施方案中，分離過程包含色譜法。在一些實(shí)施方案中，分離過程包含HPLC。用于分離過程的合適的分離方法包含，例如，離子交換色譜法或疏水相互作用色譜法。離子交換色譜法可使用包含強(qiáng)酸性(通常為磺酸基團(tuán)，例如聚苯乙烯磺酸鈉或聚AMPS)、強(qiáng)堿性(季氨基，例如三甲基銨基團(tuán)，如聚APTAC)、弱酸性(主要是羧酸基團(tuán))或弱堿性(伯、仲和/或叔氨基，如聚乙烯胺)官能團(tuán)的任何基質(zhì)材料。分離方法可以例如使用磺化聚苯乙烯作為基質(zhì)，在酸溶液中加入氨基酸，并使pH穩(wěn)定增加的緩沖液過柱。當(dāng)pH達(dá)到其各自的等電點(diǎn)時(shí)氨基酸洗脫下來。可通過采用反向色譜法來使用疏水相互作用色譜法。已證明許多可商購(gòu)的C8和C18硅膠柱通過使用梯度洗脫而成功分離了溶液中的肽。在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)代表ESB、APS和所得的COB的肽序列來提高檢測(cè)的容易程度。在一些情況下，可設(shè)計(jì)肽序列以改善質(zhì)譜儀中的片段化模式。本領(lǐng)域眾所周知，肽序列中鍵的片段化效率是序列依賴性的(參見，例如Tabb等人,AnalChem.2003March1；75(5):1155以及Klammer等人,Bioinformatics2008,24:348-356)?？衫眯蛄幸蕾囆缘钠位试O(shè)計(jì)具有期望的片段化模式的代表性肽序列。在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)代表ESB、APS和所得的COB的肽序列來賦予肽分子某些理化特性。例如，可設(shè)計(jì)代表性肽序列以得到在水溶液中的溶解度處于所需范圍內(nèi)的肽分子。再如，可設(shè)計(jì)代表性肽序列以得到具有或缺乏所需程度的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽分子。又如，可設(shè)計(jì)代表性肽序列以得到具有或缺乏二硫鍵的肽分子。再如，可設(shè)計(jì)代表性肽序列以得到與選定的靶標(biāo)具有期望的結(jié)合特性的肽分子?？蛇M(jìn)一步設(shè)計(jì)ESB、CL、APS和所得的COB的序列以在蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中利用特別負(fù)載的tRNA。于是，可完成非天然氨基酸向所得肽分子中的并入。許多實(shí)施方案涉及在檢測(cè)之前分離與ESB連接的COB或衍生物序列，如肽序列。在一些實(shí)施方案中，分離是基于分子的合適的理化性質(zhì)。這些類型的分離對(duì)于將分子連續(xù)地引導(dǎo)至檢測(cè)器從而增加它們?cè)跈z測(cè)時(shí)的相對(duì)豐度以及信號(hào)的復(fù)雜度是特別有用的。許多實(shí)施方案包含以針對(duì)序列的方式對(duì)分子的分離。例如，包含特定ESB的所有分子可通過使ESB序列與充分互補(bǔ)的序列雜交、使用ESB特異性連接標(biāo)簽的親和純化、使用由ESB序列編碼的衍生物序列的親和純化或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的方法而得到分離。分離方法還可針對(duì)細(xì)胞特異性COB或其一部分。在一些實(shí)施方案中，對(duì)包含ESB和COB的構(gòu)建體進(jìn)行分離。例如，可根據(jù)ESB對(duì)該構(gòu)建體進(jìn)行梯度或親和純化分選。在一些實(shí)施方案中，分離可包含多維度，例如2、3、4、5、6、7個(gè)或更多維度。例如，該構(gòu)建體可根據(jù)一維上的第一APS的分選和根據(jù)另一維上的第二APS的分選以及任選地根據(jù)第三維上的ESB分選而得到分離。在一些實(shí)施方案中，分離方法包含通過梯度、在凝膠上、使用電磁場(chǎng)和/或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的分離方法進(jìn)行的分離。在一些實(shí)施方案中，可在檢測(cè)之前對(duì)包含ESB和/或COB的構(gòu)建體進(jìn)行分離。例如，可根據(jù)ESB來分離該構(gòu)建體，并且可在分離后檢測(cè)該構(gòu)建體中的ESB和/或COB。檢測(cè)可以是摩爾比檢測(cè)、酶檢測(cè)、測(cè)序、梯度或凝膠中的差別親和力、電磁場(chǎng)例如UV、熒光或化學(xué)發(fā)光、本文所述的任何檢測(cè)方法或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的檢測(cè)方法。在一些實(shí)施方案中，分離包含固定該構(gòu)建體。例如，可將構(gòu)建體固定至陣列表面或珠上。ESB和/或COB的一部分可用于固定該構(gòu)建體?？蓮墓潭ㄎ恢脵z測(cè)ESB和/或COB。在一個(gè)實(shí)例中，可將包含寡核苷酸的ESB和/或COB固定至涂覆有互補(bǔ)寡核苷酸的珠或微陣列上。a.可檢測(cè)的分子或標(biāo)記物單體本發(fā)明的COB可用多種標(biāo)記物單體中的任一種進(jìn)行標(biāo)記，如放射性同位素、熒光染料、染料、酶、納米顆粒、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、生物素或本領(lǐng)域已知的可直接(例如，通過光發(fā)射)或間接(例如，通過熒光標(biāo)記的抗體的結(jié)合)檢測(cè)的其他單體。通常，COB中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的APS是用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物單體標(biāo)記的，并且由與COB的APS連接的標(biāo)記物單體提供的信號(hào)構(gòu)成了鑒定UBA、COB所結(jié)合的靶標(biāo)的可檢測(cè)代碼。在某些實(shí)施方案中，缺乏來自APS的給定信號(hào)(例如，暗點(diǎn))也可構(gòu)成COB代碼的一部分?？膳c本文所述的COB一起使用的標(biāo)記物單體和將標(biāo)記物單體引入COB的方法的實(shí)例在美國(guó)專利7,473,767、美國(guó)申請(qǐng)10/542,458、12/324,357、11/645,270和12/541,131中有所描述，它們通過引用整體并入本文。當(dāng)將可檢測(cè)分子或標(biāo)記物單體添加至COB時(shí)，除了由本發(fā)明的COB提供的定性分析能力和基于其的分析技術(shù)，本發(fā)明的COB也獨(dú)特地適合于進(jìn)行定量分析。通過在本發(fā)明的COB與生物分子樣品中的其靶分子之間提供一對(duì)一結(jié)合，可對(duì)樣品中存在的所有靶分子或其代表性部分進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。這種對(duì)多種分子種類的單獨(dú)計(jì)數(shù)為確定生物分子樣品中靶分子的絕對(duì)或相對(duì)濃度提供了精確而直接的方法。此外，單獨(dú)針對(duì)混合物中的每個(gè)分子的能力提供了小型化的益處，包括高靈敏度、最小樣品量需求、由小體積中的溶液相動(dòng)力學(xué)提供的高反應(yīng)速率和最終非常低的試劑成本。靶分子靶分子或表位是通過UBA的結(jié)合來檢測(cè)或測(cè)定的分子，該UBA的靶標(biāo)特異性區(qū)域能識(shí)別該靶分子或表位。靶分子的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、小分子、有機(jī)單體或藥物?？赏ㄟ^本文的方法分析的核酸包括：雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈DNA發(fā)夾、DNA/RNA雜合體、RNA(例如，mRNA或miRNA)和RNA發(fā)夾。僅為了方便起見，本文所述的方法主要在分析蛋白質(zhì)或mRNA的背景下進(jìn)行說明。然而，本文所述的實(shí)施方案也可用于檢測(cè)非蛋白質(zhì)或非mRNA靶標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，靶分子選自肽、多肽、寡肽、蛋白質(zhì)、磷蛋白、抗體、核酸、肽核酸、合成小分子、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂質(zhì)、類固醇和磷脂。靶分子可以是含有其他成分的生物分子樣品的一部分，或可以是樣品的唯一成分或主要成分。靶分子可以是全細(xì)胞或組織的成分、細(xì)胞或組織提取物、其分級(jí)分離的裂解物或基本純化的分子。靶分子可在溶液或固相中連接至，包括，例如，固體表面，如芯片、微陣列或珠。靶分子也可具有已知的或未知的結(jié)構(gòu)或序列。本文公開的組合物、方法和試劑盒還可用于許多應(yīng)用中來確定樣品中靶分子的存在。例如但不限于，該組合物、方法和試劑盒可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，包括但不限于藥物代謝、ADME譜分析和毒性研究；用于藥物發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)驗(yàn)證；基因表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析；蛋白質(zhì)組分析；代謝物組學(xué)研究；翻譯后修飾研究，包括但不限于糖基化、磷酸化、乙酰化和氨基酸修飾，如谷氨酸修飾而形成γ-羧基谷氨酸以及脯氨酸羥基化而形成羥基化；特異性血清或粘膜抗體水平的分析；非核酸診斷指標(biāo)的評(píng)估；外來抗原檢測(cè)；等等。在某一實(shí)施方案中，至少一個(gè)UBA、至少一個(gè)ESB或UBA和ESB兩者包含與至少一個(gè)靶分子特異性反應(yīng)的至少一個(gè)抗體、適體或類肽。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)UBA、至少一個(gè)ESB或UBA和ESB兩者包含與至少一個(gè)靶分子特異性相互作用的結(jié)合蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，ESB包含共同連接體部分。技術(shù)人員將會(huì)理解，尤其可根據(jù)特定分子復(fù)合物或可切割組分的性質(zhì)和所采用的SMD技術(shù)和檢測(cè)裝置，在束縛或連接至基底上的同時(shí)或在溶液中的同時(shí)，單獨(dú)地檢測(cè)本文所述的分子復(fù)合物和分子復(fù)合物的至少一部分。方法本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和量化生物分子樣品中的靶分子的方法。特別是，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合單獨(dú)靶分子的UBA。本發(fā)明還提供了ESB和COB的應(yīng)用(參見圖2)。通過ESB和COB的代碼，UBA與靶分子的結(jié)合導(dǎo)致單細(xì)胞中的靶分子的鑒定。在一些實(shí)施方案中，ESB/COB復(fù)合物代表信息量子，該信息量子代表靶分子和起源細(xì)胞(參見圖1)。還提供了制備和使用此類UBA和/或ESB以及COB的方法。一方面，本發(fā)明提供了鑒定復(fù)雜細(xì)胞群體的每個(gè)分子中的多個(gè)靶分子并保留有關(guān)該靶分子的細(xì)胞特異性信息的方法。因此，對(duì)于每個(gè)細(xì)胞測(cè)定與該細(xì)胞相關(guān)的每個(gè)靶分子的量。在一些實(shí)施方案中，確定多個(gè)信息量子以鑒定復(fù)雜細(xì)胞群體的每個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)靶分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的至少一個(gè)靶分子的方法，其包括以下步驟：(a)提供：(i)可能包含至少一個(gè)靶分子的細(xì)胞群體，(ii)對(duì)第一靶分子特異性的第一UBA，(iii)對(duì)第一UBA的區(qū)域具有特異性的第一表位特異性條碼ESB，其中該ESB包含第一共同連接體部分，以及(iv)COB群體，其中該COB群體包含第二共同連接體部分，其中第二連接體部分與第一ESB中的第一共同連接體部分是互補(bǔ)的；(b)形成包含至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針和第一ESB的至少第一復(fù)合物，其中至少一個(gè)靶分子與第一UBA結(jié)合，并且ESB與UBA結(jié)合；(c)加入COB群體，其中由至少一個(gè)靶分子、第一UBA探針、第一ESB和第一COB形成第二復(fù)合物，并且其中來自第一COB的第二共同連接體部分與來自第一ESB的第一連接體部分結(jié)合，并且其中來自COB群體的COB與來自細(xì)胞群體的細(xì)胞相關(guān)；以及(d)檢測(cè)第二復(fù)合物或第三復(fù)合物的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA與靶分子結(jié)合來檢測(cè)和/或量化靶分子的方法。UBA包含至少一個(gè)反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分允許UBA與靶分子結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于抗原-抗體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合等(參見圖2和3)。在一些實(shí)施方案中，UBA可以是至少一個(gè)探針組的一部分，其包含至少一個(gè)第一探針和至少一個(gè)第二探針。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA探針組與靶分子結(jié)合來檢測(cè)和/或量化靶分子的方法，其中UBA探針組包含第一UBA探針和第二UBA探針。第一UBA探針和第二UBA探針包含至少一個(gè)反應(yīng)部分，該反應(yīng)部分允許探針與靶分子的不同區(qū)域例如以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式結(jié)合或相互作用。在一些實(shí)施方案中，UBA探針和/或第二UBA探針含有如本文所述的捕獲區(qū)。在某些實(shí)施方案中，UBA包含身份部分或身份部分的至少一部分，例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體。身份部分允許在本文所述的方法的檢測(cè)步驟中鑒定與靶分子結(jié)合的UBA的存在與否。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過將UBA與靶分子結(jié)合來檢測(cè)和/或量化靶分子的方法，其中UBA含有身份部分(例如，ESB、COB、ESB和/或連接體寡聚體)。在一些實(shí)施方案中，靶分子在細(xì)胞內(nèi)直接用表位特異性條碼(ESB)來標(biāo)記。每個(gè)ESB包含可與特定靶分子相關(guān)的獨(dú)特代碼。ESB是設(shè)計(jì)為與至少一個(gè)UBA或UBA的一部分結(jié)合的分子或組裝體；并且在合適的條件下可形成包含ESB、UBA和靶分子的分子復(fù)合物。ESB包含至少一個(gè)身份鑒定部分，該身份鑒定部分允許它們與至少一個(gè)UBA結(jié)合或相互作用；通常以序列特異性的方式、構(gòu)象特異性的方式或這兩種方式；例如但不限于UBA-抗體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合等。在一些實(shí)施方案中，ESB與UBA直接或間接地連接。在其他實(shí)施方案中，ESB與細(xì)胞或樣品中的UBA結(jié)合，例如，作為分析過程的一部分。在某些實(shí)施方案中，UBA和/或ESB包含捕獲區(qū)。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)用于UBA/ESB的分離和/或UBA/ESB向表面內(nèi)的固定。捕獲區(qū)可以是親和標(biāo)簽、珠、載玻片或陣列。在某些實(shí)施方案中，ESB包含共同連接體部分，例如，連接體寡聚體。在某些實(shí)施方案中，共同連接體寡聚體與形成細(xì)胞起源條碼(COB)的可測(cè)定聚合物亞單位(APS)中的共同連接體寡聚體互補(bǔ)。圖3和圖4示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其中采用分配混合合成法將COB附加到靶分子/UBA/ESB復(fù)合物上。圖3在步驟1中示出了用UBA-ESB-CL試劑標(biāo)記細(xì)胞。UBA提供了對(duì)細(xì)胞中待識(shí)別的靶分子的特異性。在一些實(shí)施方案中，UBA可以是對(duì)表面標(biāo)志物如CD8或細(xì)胞內(nèi)表位如激酶如Stat-3上的磷酸表位具有特異性的抗體。在一些實(shí)施方案中，UBA可以是固定的細(xì)胞中的靶mRNA的反義DNA。UBA由具有CL部分的ESB來鑒定，CL用于隨后細(xì)胞特異性標(biāo)記信息的加入。圖4在步驟2中示出了分配混合合成的開始。在該實(shí)例中，將細(xì)胞群體分配至20個(gè)管中。可將細(xì)胞群體分入孔、珠或本領(lǐng)域已知的任何合適的表面。在步驟3中，將APS單位加入每個(gè)管中。APS通過APS和ESB中的互補(bǔ)CL結(jié)合UBA/ESB復(fù)合物。在步驟4中，給定管中的每個(gè)細(xì)胞現(xiàn)在已附加到每個(gè)UBA-ESB對(duì)上，如由管的內(nèi)容物限定的相同亞單位(在該實(shí)例中，1-20個(gè)APS中的一個(gè))。來自步驟3的每個(gè)分配群體現(xiàn)在具有添加至該細(xì)胞中所有DBAA上的DAPS“標(biāo)簽”聚合物亞單位。在步驟5中，將來自20個(gè)管的細(xì)胞合并到一個(gè)管中。1/20的細(xì)胞具有相同的APS亞單位。在步驟6中，重復(fù)步驟2-4以將第二APS添加到先前的APS上。在該實(shí)例中，一個(gè)管中的細(xì)胞將具有細(xì)胞混合物，所有細(xì)胞都以統(tǒng)計(jì)學(xué)平均分布的方式具有來自第2輪的APS亞單位和在第1輪中使用的20個(gè)APS中的一個(gè)。因此，在第2輪，在每個(gè)單獨(dú)管混合物中，所有聚合物通過加入相同的APS而得到延伸。根據(jù)需要重復(fù)該過程。通過本領(lǐng)域已知的任何方法(包括本文所述的方法)來讀取表位/條碼以及連接的細(xì)胞起源特征。所需的分配混合輪數(shù)由試驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)以及對(duì)導(dǎo)致確保每個(gè)細(xì)胞有獨(dú)特COB的標(biāo)簽數(shù)過度表示的統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)所限定。這由以下方程給出：所需其中C=過度表示的確定性，以及其中N=細(xì)胞數(shù)因此，如果你有1百萬個(gè)細(xì)胞并且你想得到99.9%的標(biāo)簽獨(dú)特性的確定性，則你需要：或大約7百萬個(gè)標(biāo)簽。在許多實(shí)施方案中，標(biāo)簽獨(dú)特性的高確定性確保將細(xì)胞/顆粒鑒定為不同實(shí)體的高統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。不受理論所限制，標(biāo)簽獨(dú)特性的高確定性提供了兩種相同的COB標(biāo)簽來源于相同細(xì)胞/顆粒的高可能性。然而，對(duì)于106個(gè)細(xì)胞，7百萬個(gè)標(biāo)簽意味著1000個(gè)細(xì)胞對(duì)可被標(biāo)記為“相同”細(xì)胞。因此，為了獲得僅1/10的存在單對(duì)復(fù)制細(xì)胞的幾率，該方程應(yīng)設(shè)定為99.99999%因此需要比細(xì)胞多16倍的標(biāo)簽。為了確定給定的輪數(shù)，給定的用于條碼創(chuàng)建的亞單位數(shù)：xy＝T得出如果你有20個(gè)亞單位，對(duì)于1.7x107個(gè)標(biāo)簽，你需要以下的APS添加循環(huán)：這可以向上舍入(roundup)為6個(gè)APS添加循環(huán)。如果你有100個(gè)亞單位，你將僅需要3.6輪，或向上舍入為4個(gè)APS添加循環(huán)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用ESB間接地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的靶分子的方法。細(xì)胞群體在分配混合合成方法中進(jìn)行處理，該方法將指示起源細(xì)胞或細(xì)胞起源條碼的第二特征附加至表位特異性條碼上。對(duì)于蛋白質(zhì)，UBA可以是抗體、雙抗體等，或者對(duì)于RNA，可以是反義DNA標(biāo)簽，而對(duì)于核酸，可以是DNA。ESB可以是可由高通量測(cè)序方法讀取的核酸或可由質(zhì)譜法測(cè)定的化學(xué)亞單位。COB可以是可由高通量測(cè)序方法讀取的核酸或可由質(zhì)譜法測(cè)定的化學(xué)亞單位。APS可以是DNA或DNA模擬物的特定鏈。APS可通過連接酶連接?？捎糜谶B接的酶的實(shí)例包括但不限于DNA連接酶和RNA連接酶如T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、嗜熱棲熱菌(Tth)連接酶、水生棲熱菌(Taq)DNA連接酶或激烈火球菌(Pfu)連接酶。化學(xué)連接可使用激活劑和還原劑如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外線進(jìn)行。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也有連接技術(shù)如缺口填補(bǔ)連接，包括但不限于缺口填補(bǔ)OLA和LCR、橋接寡核苷酸連接和校正連接。關(guān)于這些技術(shù)的描述尤其可見于美國(guó)專利5,185,243、已公布的歐洲專利申請(qǐng)EP320308和EP439182以及PCT公開號(hào)WO90/01069和WO01/57268。APS可通過聚合酶進(jìn)行延伸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如IlluminaHiSeq2000，包括本文所述的測(cè)序方法，經(jīng)由對(duì)所有DNA標(biāo)簽的完全測(cè)序來檢測(cè)這些APS亞單位。APS可以是按照組合合成程序得到的小分子或具有確定性重量的可構(gòu)建的復(fù)合分子。這些亞單位可通過質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。因此，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞特異性信息經(jīng)由與其相關(guān)COB(信息來源于該細(xì)胞)連接的UBA(針對(duì)將被識(shí)別的表位的條碼)而組裝(參見圖5)。在一些實(shí)施方案中，UBA/ESB/COB復(fù)合物經(jīng)由如本文所述的捕獲區(qū)來分離。在一些實(shí)施方案中，捕獲區(qū)用于將UBA/ESB/COB復(fù)合物固定至表面內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可在隨后的COB程序(分配混合)之前，利用本領(lǐng)域已知的任何合適的擴(kuò)增技術(shù)(包括本文所述的技術(shù)，如支鏈或滾環(huán)方法)來擴(kuò)增UBA上的信息。在一些實(shí)施方案中，可將錯(cuò)誤校正和檢測(cè)編碼至亞單位中。實(shí)現(xiàn)錯(cuò)誤檢測(cè)和校正的總體思路是將一定的冗余度(即，一些額外數(shù)據(jù))添加到信息中，其接收器可用于檢查所傳遞的信息的一致性，并復(fù)原被確定為錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)。錯(cuò)誤檢測(cè)與校正方案可以是系統(tǒng)的或非系統(tǒng)的：在系統(tǒng)性方案中，發(fā)射器發(fā)送原始數(shù)據(jù)，并附加固定數(shù)目的校驗(yàn)位(或奇偶校驗(yàn)數(shù)據(jù))，該校驗(yàn)位來源于一些確定性算法獲得的數(shù)據(jù)位。如果只需要錯(cuò)誤檢測(cè)，則接收器可簡(jiǎn)單地將相同的算法應(yīng)用于所接收的數(shù)據(jù)位并且將其輸出與所接收的校驗(yàn)位進(jìn)行比較；如果數(shù)值不匹配，則在傳輸過程中的某一點(diǎn)發(fā)生了錯(cuò)誤。在使用非系統(tǒng)性代碼的系統(tǒng)中，原始信息被轉(zhuǎn)化為具有至少與原始信息一樣多的位元的編碼信息。錯(cuò)誤檢測(cè)與校正方案包括重復(fù)代碼、奇偶校驗(yàn)位、校驗(yàn)和、循環(huán)冗余校驗(yàn)(CRC)、密碼雜湊函數(shù)、錯(cuò)誤校正碼、自動(dòng)重復(fù)請(qǐng)求、混合ARQ、錯(cuò)誤校正代碼、卷積碼、分組碼如漢明碼、多維奇偶校驗(yàn)碼、Reed-Solomon碼、渦輪碼和低密度奇偶校驗(yàn)碼(LDPC)。在一些實(shí)施方案中，如果未添加聚合物，則每一輪的鏈被阻止進(jìn)一步添加。如果每一輪使用不同的突出端進(jìn)行互補(bǔ)添加，則這可用DNA作為聚合物單位來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的方法(包括本文所述的方法)進(jìn)行測(cè)序來讀取表位/條碼以及所連接的細(xì)胞起源特征。對(duì)于靶蛋白而言，假設(shè)每100bp讀取代表ESB-COB對(duì)的測(cè)序方法靈敏度如下。感興趣的分子的蛋白質(zhì)拷貝數(shù)為100至100,000。假設(shè)想要讀取具有以下大體分布的100種蛋白質(zhì)：測(cè)試1蛋白質(zhì)測(cè)試1讀取測(cè)試2蛋白質(zhì)測(cè)試2讀取100個(gè)拷貝202x103202x103500個(gè)拷貝201x104201x1041000個(gè)拷貝202x104202x10410000個(gè)拷貝202x105404x105100000個(gè)拷貝202x1060在測(cè)試1中，需要能夠讀取2,232,000個(gè)序列/細(xì)胞，以訪問細(xì)胞中所有100種蛋白質(zhì)。采用可以進(jìn)行2x109次讀取的測(cè)序技術(shù)如IlluminaHiSeq2000，這意味著該方法可在約1000個(gè)細(xì)胞中讀取100種蛋白質(zhì)。然而，如果通過完全避免它們或通過標(biāo)準(zhǔn)化(幾種方法可對(duì)此有效)對(duì)它們的表示進(jìn)行“加帽”來限制高拷貝數(shù)蛋白質(zhì)，則我們可以增加可訪問的細(xì)胞數(shù)。假定因此進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并將100,000個(gè)拷貝限制至10,000個(gè)拷貝的限制(測(cè)試2)，則讀取的總數(shù)是432,000。即，可讀取約5000個(gè)細(xì)胞中的100種蛋白質(zhì)。對(duì)于mRNA，數(shù)目是不同的，因?yàn)镽NA通常表達(dá)得較低。感興趣的分子的RNA拷貝數(shù)為5至1000(基于Lewin必需基因數(shù))；不計(jì)數(shù)特化mRNA的高蛋白質(zhì)產(chǎn)生如肌動(dòng)蛋白或Ig。因此，假設(shè)想要讀取具有以下大體分布的100種mRNA：測(cè)試1mRNA測(cè)試1讀取5個(gè)拷貝6030050個(gè)拷貝201000100個(gè)拷貝1010001000個(gè)拷貝1010000在測(cè)試1中，需要能夠讀取12,300個(gè)序列/細(xì)胞以訪問細(xì)胞中所有100種mRNA。采用可以進(jìn)行2x109次讀取的測(cè)序技術(shù)如IlluminaHiSeq2000，這意味著該方法可讀取約162,000個(gè)細(xì)胞中的100種mRNA。這等同于高參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)運(yùn)行。具有相同分布的200種mRNA可以線性轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩s80,000個(gè)細(xì)胞上讀取。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，增加讀取數(shù)將增加細(xì)胞數(shù)和可獲得的參數(shù)(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。本文所述的任何實(shí)施方案可用于檢測(cè)多個(gè)靶分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含用于分析靶分子的UBA的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于多路復(fù)用分析的UBA群體。群體中的每個(gè)UBA對(duì)靶分子是特異性的。隨后使用ESB-COB對(duì)來檢測(cè)靶分子與UBA的結(jié)合。每個(gè)ESB-COB對(duì)包含可與特定靶分子和本文所述的起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特標(biāo)記物代碼。在一些實(shí)施方案中，如下所述的ESB-COB的檢測(cè)本質(zhì)上是數(shù)字化的，因?yàn)槊看斡?jì)數(shù)一個(gè)分子。當(dāng)用熒光讀取代碼時(shí)，信號(hào)高，并且斑點(diǎn)存在或不存在，因此是數(shù)字化檢測(cè)。使用數(shù)字化檢測(cè)，而非用于量化信號(hào)的模擬熒光信號(hào)，導(dǎo)致更精確的量化。因此本文所述的方法允許多路復(fù)用達(dá)到超過當(dāng)前可能的水平，以得到更精確的量化和可能更高的靈敏度。生物分子樣品本發(fā)明的UBA和ESB/COB系統(tǒng)可用于檢測(cè)任何生物分子樣品中的靶分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，該樣品可包含任何數(shù)量的物質(zhì)，包括但不限于：生物樣品如細(xì)胞(包括原代細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞系)、細(xì)胞裂解物或提取物、組織和組織提取物；體液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴、膽汁、腦脊液、間隙液、房水或玻璃體液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液和精液、滲出液、溢泌物(例如，從膿腫或任何其他感染或炎癥部位獲得的流體)或從幾乎任何生物體的關(guān)節(jié)(例如，正常關(guān)節(jié)或受諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎等疾病影響的關(guān)節(jié))獲得的流體，哺乳動(dòng)物樣品是優(yōu)選的，并且人類樣品是特別優(yōu)選的；環(huán)境樣品(包括但不限于空氣樣品、農(nóng)業(yè)樣品、水樣品和土壤樣品)；生物戰(zhàn)劑樣品；研究樣品，包括細(xì)胞外液、來自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞外上清液、細(xì)菌內(nèi)的包涵體、細(xì)胞區(qū)室、細(xì)胞周質(zhì)、線粒體區(qū)室等。生物分子樣品可間接地來源于生物標(biāo)本。例如，當(dāng)感興趣的靶分子是蛋白激酶時(shí)，本發(fā)明的生物分子樣品可以是含有從細(xì)胞裂解物分離的蛋白質(zhì)的樣品。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的生物分子樣品是通過使生物標(biāo)本經(jīng)過分級(jí)分離例如大小分級(jí)分離或膜分級(jí)分離而產(chǎn)生的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的，并且在至少一些這樣的技術(shù)中使用的試劑盒是可購(gòu)買到的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)通常采用一種或多種以下方法：離析(maceration)和細(xì)胞裂解，包括物理、化學(xué)和酶方法；離心；按分子量的分離，如大小排阻色譜法和制備電泳；選擇性沉淀，例如，鹽溶和鹽析程序；各種色譜法；等等。關(guān)于蛋白質(zhì)純化技術(shù)的詳細(xì)描述和相關(guān)方案尤其可見于Marchak等人,StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborPress(1996)；EssentialsfromCells:ALaboratoryManual,D.Spector和R.Goldman,編,ColdSpringHarborPress(2003)；R.Simpson,ProteinsandProteomics:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(2003)；和D.Liebler,IntroductiontoProteomics,HumanaPress(2002)。也可以使用可商購(gòu)的試劑盒，例如但不限于，可購(gòu)自CALBIOCHEM.RTM.,LaJolla,Calif的ProteoExtract.TM.部分蛋白質(zhì)組提取試劑盒(PartialProteomeExtractionKits)(P-PEK)和ProteoExtract.TM.完整蛋白質(zhì)組提取試劑盒(CompleteProteomeExtractionKits)(C-PEK)。技術(shù)人員將會(huì)理解，供本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒使用的非核酸分析物可以很容易地獲得，而無需使用此類純化技術(shù)和商品化試劑盒進(jìn)行過多的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的生物分子樣品可以是天然的例如未經(jīng)過操作或處理，或是經(jīng)處理的，其可包括任何數(shù)量的處理，包括暴露于候選藥劑(包括藥物)、遺傳工程(例如，基因的添加或缺失)等。生物分子樣品還可包括環(huán)境樣品，如含有細(xì)菌或其他生物體如硅藻、溝鞭藻類、藻類的樣品，尤其例如在某些?；蜿懟鶚悠分?。COB的檢測(cè)COB/ESB復(fù)合物通過本領(lǐng)域中可用的、能夠檢測(cè)給定COB/ESB復(fù)合物上的特定序列或信號(hào)的任何手段來檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，可擴(kuò)增關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行擴(kuò)增。在一些情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息?？梢允褂玫腜CR技術(shù)的實(shí)例包括但不限于定量PCR、定量熒光PCR(QF-PCR)、多重?zé)晒釶CR(MF-PCR)、實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)、單細(xì)胞PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、原位聚合酶群落PCR、原位滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、橋式PCR、picotiterPCR和乳液PCR。其他合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、自動(dòng)維持序列復(fù)制、靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)。本文可使用的其他擴(kuò)增方法包括美國(guó)專利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的那些方法。在任何實(shí)施方案中，關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息的擴(kuò)增可在珠上進(jìn)行。在本文的任何實(shí)施方案中，可從單細(xì)胞獲得靶核酸。在本文的任何實(shí)施方案中，在擴(kuò)增步驟(例如，PCR)之前，可對(duì)關(guān)于UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的信息進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，對(duì)UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合進(jìn)行量化。核酸量化方法是本領(lǐng)域已知的并且包括但不限于氣相色譜法、超臨界流體色譜法、液相色譜法(包括分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、大小排阻色譜法、薄層色譜法和親和色譜法)、電泳(包括毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管電色譜法、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法、等速電泳、瞬時(shí)等速電泳和毛細(xì)管凝膠電泳)、比較基因組雜交(CGH)、微陣列、珠陣列和高通量基因分型，如使用分子倒置探針(MIP)。UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的量化可用于確定基因/等位基因拷貝數(shù)、基因或外顯子水平的表達(dá)、甲基化狀態(tài)分析，或檢測(cè)新型轉(zhuǎn)錄物，以便診斷病癥如胎兒異?；虬┌Y。在一些實(shí)施方案中，對(duì)UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合進(jìn)行測(cè)序?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的經(jīng)典Sanger測(cè)序法來實(shí)現(xiàn)測(cè)序。測(cè)序還可使用高通量系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，其中一些系統(tǒng)允許在測(cè)序的核苷酸引入增長(zhǎng)中的鏈時(shí)或之后立即對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，即，實(shí)時(shí)或基本上實(shí)時(shí)地檢測(cè)序列。在一些情況下，高通量測(cè)序產(chǎn)生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000次序列讀取/小時(shí)；其中每次讀取為至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150個(gè)堿基/讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過Illumina的HiSeq2000機(jī)器獲得的技術(shù)。該機(jī)器使用通過合成化學(xué)進(jìn)行的基于可逆終止子的測(cè)序。該機(jī)器在八天內(nèi)可進(jìn)行2千億次DNA讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過ABISolidSystem獲得的技術(shù)。該遺傳分析平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)與珠連接的克隆擴(kuò)增的DNA片段的大規(guī)模并行測(cè)序。該測(cè)序方法基于與染料標(biāo)記的寡核苷酸的相繼連接。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過IonTorrentPersonalGenomeMachine(PMG)獲得的技術(shù)。PGM在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)可以進(jìn)行1千萬次讀取。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過HelicosBioSciencesCorporation(Cambridge,Massachusetts)獲得的技術(shù)，如單分子合成測(cè)序(SMSS)法。SMSS是獨(dú)一無二的，因?yàn)槠湓试S在最多達(dá)24小時(shí)內(nèi)對(duì)整個(gè)人類基因組進(jìn)行測(cè)序。最后，SMSS在公開號(hào)為20060024711、20060024678、20060012793、20060012784和20050100932的美國(guó)申請(qǐng)中有部分描述。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序涉及使用可通過454Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)獲得的技術(shù)，如PicoTiterPlate裝置，該裝置包括光纖板，該光纖板傳輸將由該儀器中的CCD照相機(jī)記錄的、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。光纖的這種使用允許在4.5小時(shí)內(nèi)檢測(cè)最少2千萬個(gè)堿基對(duì)。先采用珠擴(kuò)增而后進(jìn)行光纖檢測(cè)的方法在Marguiles,M.等人,"Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypricolitrereactors",Nature,doi:10.1038/nature03959以及公開號(hào)為20020012930、20030058629、20030100102、20030148344、20040248161、20050079510、20050124022和20060078909的美國(guó)申請(qǐng)中有所描述。在一些實(shí)施方案中，使用克隆單分子序列(ClonalSingleMoleculeArray)(Solexa,Inc.)或利用可逆終止子化學(xué)的合成測(cè)序(SBS)來進(jìn)行高通量測(cè)序。在美國(guó)專利6,969,488、6,897,023、6,833,246、6,787,308和公開號(hào)為20040106110、20030064398、20030022207的美國(guó)申請(qǐng)和Constans,A.,TheScientist2003,17(13):36中對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行了部分描述。在一些實(shí)施方案中，高通量測(cè)序可使用AnyDot.chips(Genovoxx,Germany)進(jìn)行。特別是，AnyDot-chips允許將核苷酸熒光信號(hào)檢測(cè)增強(qiáng)10-50倍。AnyDot.chips及其使用方法在國(guó)際公開申請(qǐng)?zhí)朩O02/088382、WO03/020968、WO03/031947、WO2005/044836、PCT/EP05/05657、PCT/EP05/05655和德國(guó)專利申請(qǐng)DE10149786、DE10214395、DE10356837、DE102004009704、DE102004025696、DE102004025746、DE102004025694、DE102004025695、DE102004025744、DE102004025745和DE102005012301中有部分描述。其他高通量測(cè)序系統(tǒng)包括在Venter,J.等人,Science,2001年2月16日、Adams,M.等人,Science,2000年3月24日和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月以及公開號(hào)為20030044781和2006/0078937的美國(guó)申請(qǐng)中公開的系統(tǒng)?？傮w上這樣的系統(tǒng)涉及通過經(jīng)由在核酸分子上測(cè)定的聚合反應(yīng)暫時(shí)添加堿基而對(duì)具有多個(gè)堿基的靶核酸分子進(jìn)行測(cè)序，即實(shí)時(shí)跟蹤待測(cè)序的模板核酸分子上核酸聚合酶的活性。而后可通過確定在堿基添加順序的每一步中哪個(gè)堿基正在經(jīng)由核酸聚合酶的催化活性而并入靶核酸的增長(zhǎng)互補(bǔ)鏈中來推斷序列。在適合沿著靶核酸分子移動(dòng)并在活性位點(diǎn)處延伸寡核苷酸引物的位置上提供靶核酸分子復(fù)合物上的聚合酶。在接近活性位點(diǎn)處提供多種標(biāo)記類型的核苷酸類似物，其中每個(gè)可區(qū)分類型的核苷酸類似物與靶核酸序列中的不同核苷酸互補(bǔ)。通過使用聚合酶將核苷酸類似物添加到核酸鏈的活性位點(diǎn)處，來延伸增長(zhǎng)的核酸鏈，其中添加的核苷酸類似物與活性位點(diǎn)處的靶核酸的核苷酸互補(bǔ)。對(duì)作為聚合步驟的結(jié)果而添加到寡核苷酸引物上的核苷酸類似物進(jìn)行鑒定。重復(fù)進(jìn)行提供標(biāo)記的核苷酸類似物、使增長(zhǎng)的核酸鏈聚合和鑒定添加的核苷酸類似物的步驟，以使得核酸鏈進(jìn)一步延伸并且確定靶核酸的序列。在一些實(shí)施方案中，UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合的序列分析可包括通過連接方案(簡(jiǎn)并連接)進(jìn)行的四色測(cè)序，其包括將錨引物與四個(gè)位置之一雜交。而后進(jìn)行將引物錨定至用熒光染料標(biāo)記的簡(jiǎn)并九聚體群體的酶連接反應(yīng)。在任何給定的循環(huán)中，所使用的九聚體群體的結(jié)構(gòu)為使得其位置之一的身份與連接至該九聚體的熒光團(tuán)的身份相關(guān)。在連接酶鑒別該探查的位置的互補(bǔ)性的情況下，熒光信號(hào)允許堿基身份的推斷。進(jìn)行連接和四色成像之后，剝離錨引物：九聚體復(fù)合物，并開始新的循環(huán)。進(jìn)行連接后對(duì)序列信息進(jìn)行成像的方法是本領(lǐng)域已知的。可通過檢測(cè)和/或量化感興趣的組裝檢測(cè)復(fù)合物的存在的任何方法來檢測(cè)和/或量化一個(gè)或多個(gè)UBA、ESB、COB、UBA/ESB復(fù)合物、UBA/ESB/COB復(fù)合物、COB/ESB復(fù)合物和/或其組合復(fù)合物。此類方法可包括放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、免疫組織化學(xué)、利用或不利用共聚焦顯微鏡檢查的免疫熒光組織化學(xué)、拉曼光譜法、X射線放射自顯影、X射線放射顯影、發(fā)光光譜法、反相測(cè)定、均相酶免疫測(cè)定和相關(guān)的非酶技術(shù)、Western印跡法、全細(xì)胞染色、免疫電子顯微鏡術(shù)、核酸擴(kuò)增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜法、膜片鉗、二維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多重蛋白質(zhì)測(cè)定、無標(biāo)記的細(xì)胞測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)等。美國(guó)專利4,568,649描述了采用閃爍計(jì)數(shù)的配體檢測(cè)系統(tǒng)。這些技術(shù)對(duì)于修飾的蛋白質(zhì)參數(shù)是尤其有用的。可使用熒光或其他標(biāo)記的報(bào)道分子來獲得蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞決定簇的細(xì)胞讀出值。顯微鏡方法對(duì)于測(cè)定形態(tài)學(xué)方面的參數(shù)是有用的。流式細(xì)胞術(shù)方法對(duì)于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)參數(shù)是有用的。當(dāng)在本發(fā)明的方法和組合物中使用熒光標(biāo)記的組分時(shí)，公認(rèn)不同類型的熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(例如，細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cytometric)測(cè)量裝置系統(tǒng))可用于實(shí)施本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)或?qū)Ｓ糜诟咄亢Y選的系統(tǒng)，例如96孔或更大的微量滴定板，例如Lakowicz,J.R.，PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,NewYork:PlenumPress(1983)；Herman,B.,Resonanceenergytransfermicroscopy,in:FluorescenceMicroscopyofLivingCellsinCulture,PartB,MethodsinCellBiology,vol.30,編Taylor,D.L.&Wang,Y.-L.,SanDiego:AcademicPress(1989),pp.219-243；Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistry,MenloPark:Benjamin/CummingsPublishingCol,Inc.(1978),pp.296-361。當(dāng)COB/ESB復(fù)合物是熒光標(biāo)記的時(shí)，可對(duì)適當(dāng)激發(fā)源的合適的考慮因素進(jìn)行研究?？赡艿募ぐl(fā)源可包括但不限于弧光燈、氙燈、激光、發(fā)光二級(jí)管或其一些組合。適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)源與適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(例如倒置熒光顯微鏡、表面熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡)結(jié)合使用。優(yōu)選地，使用可允許以足夠的空間分辨率進(jìn)行檢測(cè)的顯微鏡來確定COB/ESB復(fù)合物上斑點(diǎn)的順序。如果例如，COB/ESB復(fù)合物用三種不同的顏色Alexa488、Cy3和Alexa647(分別標(biāo)記為1、2和3)標(biāo)記。顏色1、2和3各自在不同的通道中獲得，并且將可看作成排斑點(diǎn)的第一和第二寄存器(register)向上移動(dòng)幾個(gè)像素以便能夠單獨(dú)地顯示每個(gè)寄存器。用于檢測(cè)可在本發(fā)明的方法中使用的多種顏色的方法的實(shí)例在美國(guó)專利號(hào)7,473,767、美國(guó)專利公開號(hào)2007/0166708、美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/645,270和PCT申請(qǐng)?zhí)朥S06/049274中有所描述，其通過引用整體并入本文?？墒褂脽晒庥?jì)測(cè)量樣品中的熒光。還可使用檢測(cè)熒光的其他方法，例如，量子點(diǎn)方法(參見，例如，Goldman等人,J.Am.Chem.Soc.(2002)124:6378-82；Pathak等人,J.Am.Chem.Soc.(2001)123:4103-4；和Remade等人,Proc.Natl.Sci.USA(2000)18:553-8，各自通過引用明確地引入本文)以及共聚焦顯微鏡檢查。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ACS細(xì)胞分選儀(例如，F(xiàn)ACSVantageTM,LSRII或CantoCellSorter,BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,Calif.)用于根據(jù)存在或不存在COB/ESB復(fù)合物來分選和收集細(xì)胞。通過賦予含有陽性細(xì)胞的小滴電磁電荷，可將該細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。而后可在無菌收集容器中收獲陽性選擇的細(xì)胞。這些細(xì)胞分選程序在例如FACSVantageTM.培訓(xùn)手冊(cè)中有詳細(xì)描述，具體參見第3-11至3-28以及10-1至10-17節(jié)，關(guān)于上述儀器的內(nèi)容，其通過引用整體并入本文。在另一實(shí)施方案中，可基于COB/ESB復(fù)合物的存在與否采用細(xì)胞的磁分離來分選陽性細(xì)胞。在這類分離技術(shù)中，將要進(jìn)行陽性選擇的細(xì)胞首先與包含可回收顆粒(例如，磁響應(yīng)性顆粒)的COB/ESB復(fù)合物接觸。而后可例如利用磁場(chǎng)將該細(xì)胞與非陽性或未標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行物理分離。當(dāng)使用磁響應(yīng)性顆粒時(shí)，可利用磁場(chǎng)將陽性細(xì)胞或標(biāo)記的細(xì)胞保留在容器中，同時(shí)去除陰性細(xì)胞。這些以及相似的分離程序在例如BaxterImmunotherapyIsolex培訓(xùn)手冊(cè)中有所描述，其整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，將一種或多種細(xì)胞包含在96孔板或其他可商購(gòu)的多孔板的孔中。在備選的實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物或細(xì)胞在細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量裝置中?？捎糜诒景l(fā)明的其他多孔板包括但不限于384孔板和1536孔板。用于容納反應(yīng)混合物或細(xì)胞并可用于本發(fā)明的其他容器對(duì)于技術(shù)人員將是顯而易見的。在一些實(shí)施方案中，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)量COB/ESB復(fù)合物的豐度。已用特定元件標(biāo)記的UBA與COB/ESB復(fù)合物結(jié)合。當(dāng)將細(xì)胞引入ICP中時(shí)，其被霧化和電離。測(cè)定包括COB/ESB復(fù)合物在內(nèi)的細(xì)胞的元件組分。與COB/ESB復(fù)合物上的標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的信號(hào)的存在和強(qiáng)度指示該細(xì)胞上COB/ESB復(fù)合物的豐度(Tanner等人,SpectrochimicaActaPartB:AtomicSpectroscopy,(2007),62(3):188-195.)。在一些實(shí)施方案中，“流式細(xì)胞儀”是一種微流體裝置，其中在設(shè)計(jì)為引導(dǎo)細(xì)胞在幾組平行的多通道中通過檢測(cè)裝置的通道中進(jìn)行細(xì)胞測(cè)量或細(xì)胞內(nèi)含物的一些測(cè)量。參見美國(guó)專利7,378,280、7,294,503、7,294,298和6,830,936。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞或其內(nèi)含物的某些部分經(jīng)超聲包裹在液體的單獨(dú)小滴內(nèi)，并利用設(shè)計(jì)為測(cè)定每個(gè)單獨(dú)小滴的特征和這些小滴內(nèi)的材料的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行探查。靈活的硬件和軟件使儀器適應(yīng)于多種應(yīng)用。軟件程序模塊允許方法的構(gòu)建、修改和運(yùn)行。系統(tǒng)診斷模塊允許儀器校準(zhǔn)、正確連接和馬達(dá)運(yùn)行。定制工具、實(shí)驗(yàn)室器具和液體、顆粒、細(xì)胞和生物體傳輸模式允許進(jìn)行不同應(yīng)用。數(shù)據(jù)庫(kù)允許方法和參數(shù)的儲(chǔ)存。機(jī)撲(robotic)接口和計(jì)算機(jī)接口允許儀器之間的通信。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括液體處理組件的使用。液體處理系統(tǒng)可包括包含任意數(shù)量的組件的機(jī)撲系統(tǒng)。此外，本文概述的任何或所有步驟可以是自動(dòng)化的；因此，例如，該系統(tǒng)可以是完全或部分自動(dòng)化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，存在眾多可以使用的組件，包括但不限于一個(gè)或多個(gè)機(jī)撲臂；用于微孔板定位的平板處理器(handler)；取下或更換非交叉污染板上的孔蓋的自動(dòng)化蓋或帽處理器；用于利用一次性吸頭進(jìn)行樣品分布的吸頭組裝件；用于樣品分布的可洗吸頭組裝件；96孔加載塊；冷卻試劑架；微量滴定板移液管位置(任選地冷卻的)；平板和吸頭的堆積塔；以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。完全機(jī)撲或微流體系統(tǒng)包括自動(dòng)化的液體、顆粒、細(xì)胞和生物體處理，包括高通量移液以進(jìn)行篩選應(yīng)用的所有步驟。這包括液體、顆粒、細(xì)胞和生物體操作，如抽吸、分配、混合、稀釋、洗滌、精確體積轉(zhuǎn)移；回收和丟棄移液吸頭；以及重復(fù)吸移相同體積以從單次樣品抽吸中進(jìn)行多次遞送。這些操作是無交叉污染的液體、顆粒、細(xì)胞和生物體轉(zhuǎn)移。該儀器進(jìn)行微孔板樣品通向過濾器、膜和/或子板、高密度轉(zhuǎn)移器、全板系列稀釋和高容量操作的自動(dòng)化重復(fù)。在一些實(shí)施方案中，使用化學(xué)衍生的顆粒、板、盒、管、磁性顆粒或?qū)y(cè)定組分具有特異性的其他固相基質(zhì)。微孔板、管或任何固相基質(zhì)的結(jié)合表面包括非極性表面、高極性表面、促進(jìn)共價(jià)結(jié)合的經(jīng)修飾的葡聚糖涂層、抗體涂層、結(jié)合融合蛋白或肽的親和介質(zhì)、表面固定的蛋白質(zhì)如重組蛋白A或G、核苷酸樹脂或涂層，并且其他親和基質(zhì)在本發(fā)明中也是有用的。在一些實(shí)施方案中，將用于多孔板、多通管、支持器、盒、微型管、超聲懸浮和包裹、深孔板、微量離心管、冷凍管、方孔板、過濾器、芯片、微通道芯片、微流體芯片、光纖、珠和其他固相基質(zhì)的平臺(tái)或具有多種體積的平臺(tái)安裝在可升級(jí)的模塊平臺(tái)上以提供額外的容量。該模塊平臺(tái)包括變速軌道振蕩器，和用于源樣品、樣品和試劑稀釋的多位置工作臺(tái)、測(cè)定板、樣品和試劑儲(chǔ)存器、移液吸頭和活性洗滌站。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用讀板器。在一些實(shí)施方案中，熱循環(huán)儀和溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于穩(wěn)定熱交換器的溫度，如提供孵育樣品從0℃至100℃的精確溫度控制的控制組塊或平臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，可與單個(gè)或多個(gè)磁探頭、親和探頭或移液管互換的移液管頭(單通道或多通道)機(jī)撲地操作液體、顆粒、細(xì)胞和生物體。多孔或多管磁力分離器或平臺(tái)以單樣品或多樣品形式操作液體、顆粒、細(xì)胞和生物體。在一些實(shí)施方案中，儀器將包括檢測(cè)器，該檢測(cè)器根據(jù)標(biāo)記物和試驗(yàn)可以是多種不同的檢測(cè)器。在一些實(shí)施方案中，有用的檢測(cè)器包括具有多熒光通道的顯微鏡；讀板器，以提供具有單和雙波長(zhǎng)端點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)能力、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、發(fā)光、猝滅、雙光子激發(fā)和強(qiáng)度再分配的熒光、紫外線和可見光分光光度檢測(cè)；捕獲數(shù)據(jù)和圖像并將其轉(zhuǎn)換為可定量格式的CCD相機(jī)；以及計(jì)算機(jī)工作站。在一些實(shí)施方案中，機(jī)撲裝置包括與存儲(chǔ)器和一組輸入/輸出設(shè)備(例如，鍵盤、鼠標(biāo)、監(jiān)視器、打印機(jī)等)通過總線進(jìn)行通信的中央處理器。此外，如下所述，這可補(bǔ)充或替代用于本發(fā)明多路復(fù)用裝置的CPU。中央處理器、存儲(chǔ)器、輸入/輸出設(shè)備與總線之間的一般交互是本領(lǐng)域已知的。因此，根據(jù)將要運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)，將多種不同的流程存儲(chǔ)在CPU存儲(chǔ)器中。這些機(jī)撲流體處理系統(tǒng)可利用任何數(shù)量的不同試劑，包括緩沖液、試劑、樣品、洗滌液、測(cè)定組分如標(biāo)記物探針等。靶分子檢測(cè)的應(yīng)用本發(fā)明的組合物和方法可用于診斷、預(yù)后、治療、患者分層、藥物開發(fā)、治療選擇和篩選目的。本發(fā)明提供了采用本發(fā)明的方法可從單一生物分子樣品同時(shí)分析許多不同靶分子的優(yōu)點(diǎn)。這允許例如對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)種診斷試驗(yàn)。本發(fā)明的組合物和方法可用于蛋白質(zhì)組學(xué)。本文所述的方法通常將提供對(duì)于該應(yīng)用非常理想的快速應(yīng)答。本文所述的方法和組合物可在尋找可用于診斷和預(yù)后以及用作健康和疾病指標(biāo)的生物標(biāo)志物的過程中使用。本文所述的方法和組合物可用于篩選藥物，例如，藥物開發(fā)、治療選擇、治療效果的確定和/或鑒定用于藥物開發(fā)的靶標(biāo)。在涉及藥物的篩選試驗(yàn)中檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的能力是非常重要的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是體內(nèi)的最終基因產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法和組合物將同時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)和基因兩者的表達(dá)，這將提供最多的關(guān)于正在進(jìn)行的特定篩選的信息。本發(fā)明的組合物和方法可用于基因表達(dá)分析。本文所述的方法區(qū)分核苷酸序列。靶核苷酸序列之間的差異可以是例如單核酸堿基差異、核酸缺失、核酸插入或重排。還可以檢測(cè)這類涉及一個(gè)以上堿基的序列差異。在一些實(shí)施方案中，UBA，例如，寡核苷酸探針，具有基本相同的長(zhǎng)度，使得它們?cè)诨鞠嗨频碾s交條件下與靶核苷酸序列雜交。因此，本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)傳染病、遺傳病和癌癥。其在環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)學(xué)以及食品科學(xué)中也是有用的?？稍诤怂嵘线M(jìn)行的遺傳分析的實(shí)例包括例如SNP檢測(cè)、STR檢測(cè)、RNA表達(dá)分析、啟動(dòng)子甲基化、基因表達(dá)、病毒檢測(cè)、病毒亞型分型和抗藥性。本方法可用于分析獲自或來源于患者的生物分子樣品，以便確定樣品中是否存在患病細(xì)胞類型，疾病的階段，患者的預(yù)后，患者響應(yīng)于特定治療的能力，或?qū)颊叩淖罴阎委?。本方法還可用于鑒定特定疾病的生物標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法用于病癥的診斷。如本文所用的術(shù)語病癥的“診斷”包括預(yù)測(cè)或診斷病癥、確定病癥易感性、監(jiān)測(cè)病癥的治療、診斷疾病的治療反應(yīng)以及病癥的預(yù)后、病癥進(jìn)展和對(duì)病癥特定治療的響應(yīng)。例如，可根據(jù)本文所述的任何方法來測(cè)定血液樣品，以確定樣品中疾病標(biāo)志物或惡性細(xì)胞類型的存在和/或量，從而對(duì)疾病或癌癥進(jìn)行診斷或分期。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法和組合物用于病癥的診斷和預(yù)后。許多免疫性、增生性和惡性疾病和病癥特別適合于本文所述的方法。免疫性疾病和病癥包括變應(yīng)性疾病和病癥、免疫功能紊亂和自身免疫疾病和病況。變應(yīng)性疾病和病癥包括但不限于變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎和食物變態(tài)反應(yīng)。免疫缺陷包括但不限于重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、嗜酸細(xì)胞增多綜合征、慢性肉芽腫病、I型和II型白細(xì)胞粘附缺陷、高IgE綜合征、ChediakHigashi、中性白細(xì)胞增多癥、中性白細(xì)胞減少癥、發(fā)育不全、丙種球蛋白缺乏血癥、高IgM綜合征、迪喬治/腭-心-面綜合征以及干擾素γ-TH1途徑缺陷。自身免疫和免疫調(diào)節(jié)異常疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、系統(tǒng)性硬化癥、甲狀腺腫和淋巴瘤性甲狀腺腫(橋本甲狀腺炎、淋巴細(xì)胞性甲狀腺腫)、斑禿、自身免疫性心肌炎、硬化萎縮苔蘚、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、萎縮性胃炎、重癥肌無力、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和炎性腸病、同種異體移植物排斥和對(duì)傳染性微生物或環(huán)境抗原的變態(tài)反應(yīng)引起的組織破壞?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)估的增生性疾病和病癥包括但不限于新生兒血管瘤病；繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化；慢性進(jìn)行性骨髓退行性疾?。欢喟l(fā)性神經(jīng)纖維瘤??；節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)瘤病；瘢痕疙瘩形成；骨佩吉特病；纖維性囊腫病(例如，乳房或子宮纖維性囊腫病)；結(jié)節(jié)?。籔eronies和Duputren纖維化、硬化、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)估的惡性疾病和病癥包括惡性血液病和實(shí)體瘤。當(dāng)樣品是血液樣品時(shí)，惡性血液病尤其適合于本發(fā)明的方法，因?yàn)檫@類惡性病涉及到血液承載的細(xì)胞的變化。這類惡性病包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非B細(xì)胞淋巴瘤和其他淋巴瘤、急性或慢性白血病、紅細(xì)胞增多癥、血小板增多癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常疾病、骨髓增生性疾病、骨髓纖維化、非典型免疫淋巴增生和漿細(xì)胞疾病。可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)估的漿細(xì)胞疾病包括多發(fā)性骨髓瘤、淀粉樣變性和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥。實(shí)體瘤的實(shí)例包括但不限于結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腦瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、膀胱腫瘤、黑素瘤、肝癌、骨肉瘤和其他骨癌、睪丸癌和卵巢癌、頭頸腫瘤和宮頸腫瘤。遺傳疾病也可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。這可通過針對(duì)染色體和基因畸變或針對(duì)遺傳疾病的產(chǎn)前和產(chǎn)后篩查來進(jìn)行?？蓹z測(cè)的遺傳疾病的實(shí)例包括：21-羥化酶缺乏癥、囊性纖維化、脆性X綜合征、特納綜合征、迪謝納肌營(yíng)養(yǎng)不良、唐氏綜合癥或其他三體性、心臟病、單基因病、HLA分型、苯丙酮尿癥、鐮狀細(xì)胞性貧血、泰-薩克斯病(Tay-SachsDisease)、地中海貧血、克萊恩費(fèi)爾特綜合征、亨廷頓病、自身免疫性疾病、脂沉積癥、肥胖缺陷、血友病、先天性代謝缺陷和糖尿病。本文所述的方法可用于通過分別確定樣品中細(xì)菌或病毒的標(biāo)志物的存在和/或量來診斷病原體感染，例如，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的感染。許多傳染病可通過本發(fā)明的方法來檢測(cè)。通常，這些是由細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌傳染原引起的。還可利用本發(fā)明來確定各種傳染原對(duì)藥物的抗性?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測(cè)的細(xì)菌傳染原包括大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬(KlESBiella)、假單胞菌屬、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、結(jié)核分支桿菌、鳥型細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumaviumintracellulare)、耶爾森氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、巴斯德氏菌屬、布魯氏菌屬、梭菌屬、百日咳博代氏菌、擬桿菌屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、B-溶血性鏈球菌、棒桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、支原體屬、脲原體屬、衣原體屬、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌、糞腸球菌、普通變形菌、奇異變形菌、幽門螺桿菌、徹白密螺旋體、伯氏疏螺旋體、回歸熱疏螺旋體、立克次體病原體、諾卡氏菌屬和放線菌屬(Acitnomycetes)?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測(cè)的真菌傳染原包括新型隱球菌、皮炎芽生菌、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、白色念珠菌、煙曲霉(Aspergillusfumigautus)、藻菌目(根霉屬)、申克孢子絲菌、著色真菌病和馬杜拉分支菌病。可通過本發(fā)明檢測(cè)的病毒傳染原包括人免疫缺陷病毒、人T細(xì)胞淋巴細(xì)胞病毒(humanT-celllymphocytotrophicvirus)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人乳頭瘤病毒、正黏病毒、副黏病毒、腺病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒、布尼病毒(bunyaviruses)、嵌沙樣病毒(arenaviruses)、風(fēng)疹病毒和呼腸病毒?？赏ㄟ^本發(fā)明檢測(cè)的寄生蟲傳染原包括惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、盤尾絲蟲(Onchovervavolvulus)、利什曼原蟲屬、錐體蟲屬的種、血吸蟲屬的種、溶組織內(nèi)阿米巴、隱孢子蟲屬、賈第蟲屬的種、滴蟲屬的種、結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balatidiumcoli)、班氏吳策線蟲屬、弓形蟲屬的種、蠕形住腸蟯蟲、人蛔蟲、鞭形鞭蟲、麥地那龍線蟲(Dracunculusmedinesis)、吸蟲類、闊節(jié)裂頭絳蟲、絳蟲屬的種、卡氏肺囊蟲和美洲板口線蟲(Necatoramericanis)。本發(fā)明還可用于檢測(cè)傳染原的抗藥性。例如，抗萬古霉素糞腸球菌、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌、抗青霉素肺炎鏈球菌、多重耐藥性結(jié)核分枝桿菌和抗AZT人類免疫缺陷病毒都可利用本發(fā)明進(jìn)行鑒定。因此，使用本發(fā)明的組合物和方法檢測(cè)的靶分子可以是患者標(biāo)志物(如癌癥標(biāo)志物)或由外來物引起的感染的標(biāo)志物如細(xì)菌或病毒標(biāo)志物。由于UBA/ESB/COB的定量性質(zhì)，本發(fā)明的組合物和方法可用于量化其豐度指示生物學(xué)狀態(tài)或疾病狀況的靶分子，例如，由于疾病狀態(tài)而被上調(diào)或下調(diào)的血液標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于細(xì)胞因子檢測(cè)。本文所述方法的低靈敏度將有助于例如作為病癥生物標(biāo)志物的細(xì)胞因子的早期檢測(cè)，諸如癌癥等疾病的診斷或預(yù)后，以及亞臨床狀況的鑒定。試劑盒本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種組分的試劑盒。試劑盒可包含，例如，一個(gè)或多個(gè)UBA、一個(gè)或多個(gè)ESB和/或一個(gè)或多個(gè)APS。試劑盒可用于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何目的，包括以上所述的目的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了可用于延伸和選擇性固定COB、UBA、ESB和/或其組合的試劑盒。該試劑盒可包含固定用基底和一種或多種結(jié)合配偶體以促進(jìn)COB、UBA、ESB和/或其組合的延伸和固定。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體可包含可用于以適當(dāng)?shù)牧ρ由霤OB、UBA、ESB和/或其組合的部分。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體可促進(jìn)COB、UBA、ESB和/或其組合向表面上的固定或選擇性固定。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，試劑盒可包含能夠延伸COB、UBA、ESB和/或其組合的裝置。試劑盒可包含如本文所述的COB、APS、UBA、ESB和/或其組合的群體。試劑盒可包含用一種或多種用于標(biāo)記APS的組分預(yù)標(biāo)記的APS或未標(biāo)記的APS。此外，在試劑盒中提供的ESB和/或APS可具有或可不具有預(yù)連接的UBA。在一個(gè)實(shí)施方案中，在試劑盒中提供不與ESB和/或APS連接的UBA。試劑盒可包含其他試劑如連接體寡聚體和橋接寡聚體。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可將UBA分至不同的預(yù)混合物中。試劑盒還可包括其他試劑，例如，用于進(jìn)行雜交反應(yīng)的緩沖液、連接體、限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶I。試劑盒還將包括使用該試劑盒的組分和/或制備和/或使用APS、COB、UBA和/或ESB的說明書。實(shí)施例預(yù)見性實(shí)施例1–寡核苷酸的制備可根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成寡核苷酸。例如，可在394ADNA合成儀(AppliedBiosystemsDivision,Perkin-ElmerCorp.,FosterCity,Calif.)上合成寡核苷酸。寡核苷酸在55℃下過夜脫保護(hù)后，通過乙醇沉淀來純化。用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸的引物特異性部分通過在10%丙烯酰胺/7M尿素凝膠上的聚丙烯酰胺凝膠電泳來純化。電泳后通過對(duì)發(fā)光屏進(jìn)行紫外線投影而將寡核苷酸進(jìn)行可視化，并且將其從凝膠上切離(AppliedBiosystemsInc.,1992)。然后將其在64℃下于TNE(即Tris-鈉EDTA)緩沖液(含有500mMNaCl和5mMEDTA的100mMTris/HClpH8.0)中洗脫過夜，并按照生產(chǎn)商的說明書用SepPak柱(MilliporeCorp,Milford,Mass.)從洗出液中回收。將寡核苷酸重懸于100μlTE(即含有1mMEDTA的10mMTri-HClpH8.0)中。這些原始寡核苷酸溶液的典型濃度為約1μg/μl或大約74pm/μl。作為連接反應(yīng)的前提，將寡核苷酸用T4多核苷酸激酶在5’端進(jìn)行磷酸化。將相當(dāng)于200pm的寡核苷酸小份與10μl10x激酶緩沖液(500mMTris/HClpH8.0，100mMMgCl2)、10μl10mMATP、20UT4激酶和足量的水-ME混合得到100μl的終體積。磷酸化在37℃下進(jìn)行30分鐘，隨后在85℃下孵育10分鐘以滅活T4酶。將寡核苷酸溶液調(diào)整至合適的濃度。將經(jīng)激酶處理的寡核苷酸溶液在水中稀釋4倍以得到1000fm/μl的濃度。通過將相當(dāng)于200pm的體積的寡核苷酸與足量的水混合以得到400μl的終體積來制備寡核苷酸溶液。這對(duì)每個(gè)寡核苷酸產(chǎn)生了1000fm/μl的溶液。將經(jīng)激酶處理和未經(jīng)激酶處理的寡核苷酸的小份(20μl)冷凍以待后續(xù)使用。用于點(diǎn)擊化學(xué)的寡核苷酸合成和純化的一般方法如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述合成寡核苷酸。簡(jiǎn)言之，從LinkTechnologiesandAppliedBiosystems購(gòu)得標(biāo)準(zhǔn)DNA亞磷酰胺、固體載體和其他試劑。在AppliedBiosystems394自動(dòng)化DNA/RNA合成儀上使用酸催化的脫三苯甲基、偶聯(lián)、加帽和碘氧化的標(biāo)準(zhǔn)0.2或1.0微摩爾亞磷酰胺循環(huán)來合成寡核苷酸。在使用前即時(shí)將所有β-氰乙基亞磷酰胺單體溶解在無水乙腈中得到0.1M的溶液。正常A、G、C和T單體的偶聯(lián)時(shí)間是35秒，而反向亞酰胺(amidites)的偶聯(lián)時(shí)間是180秒。炔烴亞磷酰胺單體(圖2中的2c，El-Sagheer等人,PNAS,108:28,11338-11343,2011)和其他非標(biāo)準(zhǔn)單體偶聯(lián)360秒。通過在室溫下暴露于濃縮氨水溶液60分鐘，而后在密封管中于55℃加熱5小時(shí)，將寡核苷酸從固體載體上切下并脫保護(hù)。使用XBridgeTMBEH300PrepC1810μM10x250mm柱(Waters)，在Gilson系統(tǒng)上通過反相HPLC純化寡核苷酸，其中乙酸銨中乙腈的梯度(0%至50%緩沖液B，30分鐘，流速4mL/min)，緩沖液A：0.1M乙酸銨，pH7.0，緩沖液B：0.1M乙酸銨，pH7.0，含有50%乙腈。通過在305nm或295nm處的紫外吸收來監(jiān)測(cè)洗脫。在HPLC純化后，使用NAP-10柱將寡核苷酸脫鹽并通過凝膠電泳進(jìn)行分析。i)3′-炔烴寡核苷酸的合成3’-炔烴寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，使用3′-炔丙基胸苷亞磷酰胺單體2c，并通過使用A、G、C和T的3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)脫氧核苷-5′-亞磷酰胺(反向亞磷酰胺，LinkTechnologies)以5′至3′方向組裝所需序列，或通過根據(jù)El-Sagheer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(35):15329-15334.)所述將5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-炔丙基-5-甲基-脫氧胞苷連接至固體載體(33μmol/g負(fù)載，AM聚苯乙烯，AppliedBiosystems)，從而合成3′-炔烴寡核苷酸。將樹脂裝入扭轉(zhuǎn)柱(GlenResearch)中，而后用來通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺寡核苷酸合成以3′至5′方向組裝所需序列。然后如上所述將寡核苷酸切下、脫保護(hù)和純化。ii)5′-疊氮寡核苷酸的合成5’-疊氮寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，如一般方法(上述)所述，以0.2或1.0μmol的規(guī)模(三苯甲基脫離)，由正常的5’-HO-dC、5′-HO-dT(或由5′-碘代-dT，使用可從GlenResearch購(gòu)得的5′-碘代dT單體)組裝寡核苷酸。為了將5′-羥基轉(zhuǎn)換為5′-碘代，用0.5M的DMF中的甲基三苯氧基碘化鏻溶液(1.0mL)處理連接至合成柱的受保護(hù)的寡聚體，該溶液在室溫下經(jīng)由兩個(gè)1mL的注射器定期過柱15分鐘。而后用無水DMF洗柱數(shù)次。為了將5′-碘代(dT或dC)轉(zhuǎn)換為5′-疊氮基(dT或dC)，將疊氮鈉(50mg)在無水DMF(1mL)中懸浮，在70℃下加熱10分鐘，而后冷卻，并將上清液吸入1mL注射器中，反復(fù)過柱，而后置于室溫過夜(或55℃下5小時(shí))。然后用DMF和乙腈洗柱，并通過通入氬氣流進(jìn)行干燥。如上所述，將得到的5′-疊氮寡核苷酸從固體載體上切下、脫保護(hù)并純化。iii)3′-炔烴-5′-疊氮寡核苷酸的合成3’-炔烴-5’疊氮寡核苷酸的合成如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011)所述進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將聚苯乙烯固體載體上的5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-炔丙基-5-甲基脫氧胞苷裝入扭轉(zhuǎn)柱(GlenResearch)中，并用來利用5′端的5′-碘代dT、5′-HO-dT或5′-HO-dC以3′至5′方向組裝所需序列(標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺寡核苷酸合成)。然后使用以上對(duì)于5′-疊氮寡核苷酸的合成所述的條件將5′-羥基或碘代基團(tuán)轉(zhuǎn)換為疊氮化物。預(yù)見性實(shí)施例2.點(diǎn)擊化學(xué)連接將寡核苷酸APS與模板退火并保持在4℃下過夜。CuI點(diǎn)擊催化劑溶液由如Chan等人(ChanTR,HilgrafR,SharplessKB和FokinVV(2004)Polytriazolesascopper(I)-stabilizingligandsincatalysis.Org.Lett.6(17):2853-2855；2.8μmol，在0.2MNaCl中，38.0μL)所述的三羥丙基三唑配體、抗壞血酸鈉(4.0μmol，在0.2MNaCl中，8.0μL)和CuSO4·5H2O(0.4μmol，在0.2MNaCl中，4.0μL)制備。將該溶液加入到退火的寡核苷酸中，并將反應(yīng)化合物保持在0℃下1小時(shí)，然后在室溫下再保持1小時(shí)。使用NAP-25凝膠過濾柱除去試劑。預(yù)見性實(shí)施例3.珠上COB的分配混合合成在該實(shí)施例中，合成了連接至珠上的COB。采用了4種不同的方法將APS組裝至COB中：拼接(Patchwork)COB(圖6)用十種不同的CL寡核苷酸標(biāo)記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進(jìn)行六輪分配混合合成。在每一輪中，將珠分入20個(gè)不同的容器中。向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個(gè)不同的APS。給定輪次中的每個(gè)APS進(jìn)一步包含與該輪中其余APS不同的獨(dú)特的子代碼序列。在第一輪中，每個(gè)APS包含一端上的與CL寡核苷酸的退火區(qū)互補(bǔ)的退火區(qū)1以及另一端上的退火區(qū)2。添加后，寡核苷酸APS與CL寡核苷酸沿著互補(bǔ)退火區(qū)1雜交。退火區(qū)2保持單鏈并且可與后一輪加入的APS雜交。在隨后的輪次中，每個(gè)APS包含一端上的與來自前一輪的APS的可用退火區(qū)互補(bǔ)的退火區(qū)以及另一端上的附加退火區(qū)。加入的APS與前一輪加入的APS沿著互補(bǔ)退火區(qū)雜交。最后一個(gè)亞單位任選地包含用于PCR引物或測(cè)序引物雜交的第二擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS進(jìn)一步包含隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計(jì)數(shù)器，允許檢測(cè)到的COB的隨后標(biāo)準(zhǔn)化。在每一輪加入APS后，將珠合并，并將其分入20個(gè)新池(pools)中啟動(dòng)后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個(gè)具有一對(duì)輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個(gè)APS后，使用聚合酶/連接酶將珠上雜交的APS拼接在一起。任選地使用針對(duì)CL和最后一個(gè)APS亞單位上的擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)的引物，PCR擴(kuò)增COB以供測(cè)序。使用引物的特異性退火訂合(stitch)COB(圖7)用十種不同的CL寡核苷酸標(biāo)記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進(jìn)行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個(gè)不同的容器中。向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個(gè)不同的APS。給定輪次中的每個(gè)APS進(jìn)一步包含與該輪中其余APS不同的獨(dú)特的子代碼序列。還加入了退火引物。在第一輪中，退火引物具有與CL寡核苷酸互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)和與APS互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)。退火引物與二者雜交，將它們訂合在一起。在隨后的輪次中，退火引物具有與在前一輪過程中加入的APS互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)。同樣，退火引物與來自隨后輪次的APS雜交，將它們訂合在一起。退火引物的互補(bǔ)區(qū)對(duì)每一輪具有特異性，從而允許僅來自前一輪和當(dāng)前一輪的亞單位有效雜交。因此，退火引物不與更早輪次的亞單位雜交，這些亞單位不具有與當(dāng)前一輪的退火引物互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，因此阻斷了缺失特定輪次的亞單位的COB的進(jìn)一步合成。最后一個(gè)亞單位任選地包含用于PCR引物或測(cè)序引物雜交的第二擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS進(jìn)一步包含隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計(jì)數(shù)器，允許檢測(cè)到的COB的隨后標(biāo)準(zhǔn)化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個(gè)新池中啟動(dòng)后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個(gè)具有一對(duì)輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個(gè)APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實(shí)施例2所述的點(diǎn)擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對(duì)CL和最后一個(gè)APS亞單位上的擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)的引物，PCR擴(kuò)增COB以供測(cè)序。使用具有共同互補(bǔ)區(qū)的引物的退火訂合COB(圖8)用十種不同的CL寡核苷酸標(biāo)記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)、10種不同ESB序列中的一種和共同退火區(qū)。進(jìn)行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個(gè)不同的容器中。向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個(gè)不同的APS。給定輪次中的每個(gè)APS進(jìn)一步包含與該輪中其余APS不同的獨(dú)特的子代碼序列。還加入了退火引物。在第一輪中，退火引物具有與CL寡核苷酸互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補(bǔ)的第二互補(bǔ)區(qū)。退火引物與二者雜交，將它們訂合在一起。在隨后的輪次中，退火引物具有與在前一輪過程中加入的APS互補(bǔ)的第一互補(bǔ)區(qū)和與當(dāng)前一輪加入的APS互補(bǔ)的第二互補(bǔ)區(qū)。同樣，退火引物與來自隨后輪次的APS雜交，將它們訂合在一起。在退火引物的這兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)中，第一互補(bǔ)區(qū)對(duì)每一輪具有特異性，從而允許與僅來自前一輪的亞單位有效雜交。因此，退火引物不與更早輪次的亞單位雜交，這些亞單位不具有與當(dāng)前一輪的退火引物互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，因此阻斷了缺失特定輪次的亞單位的COB的進(jìn)一步合成。最后一個(gè)亞單位任選地包含用于PCR引物或測(cè)序引物雜交的第二擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS進(jìn)一步包含隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計(jì)數(shù)器，允許檢測(cè)到的COB的隨后標(biāo)準(zhǔn)化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個(gè)新池中啟動(dòng)后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個(gè)具有一對(duì)輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個(gè)APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實(shí)施例2所述的點(diǎn)擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對(duì)CL和最后一個(gè)APS亞單位上的擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)的引物，PCR擴(kuò)增COB以供測(cè)序。環(huán)狀COB(圖9)用十種不同的CL寡核苷酸標(biāo)記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有任選的第一擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)、10種不同ESB序列中的一種、六對(duì)APS特異性環(huán)狀退火區(qū)和任選的第二擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)。進(jìn)行六輪分配混合合成。在每一輪，將珠分入20個(gè)不同的容器中。向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個(gè)不同的APS。給定輪次中的每個(gè)APS進(jìn)一步包含與該輪中其余APS不同的獨(dú)特的子代碼序列。APS設(shè)計(jì)為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，沿著對(duì)該輪特異性的環(huán)狀退火區(qū)在每一端上與CL雜交。雜交沿著CL填充APS，而后將其連接起來。APS設(shè)計(jì)為使其不能沿著對(duì)其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接起來，這取決于連接方法。或者，用缺失的APS合成COB，缺失的APS的位置的側(cè)翼為一對(duì)環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對(duì)得到的COB進(jìn)行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS進(jìn)一步包含隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計(jì)數(shù)器，允許檢測(cè)到的COB的隨后標(biāo)準(zhǔn)化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個(gè)新池中啟動(dòng)后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個(gè)具有一對(duì)輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個(gè)APS后，使用聚合酶/連接酶或使用如實(shí)施例1所述的點(diǎn)擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對(duì)CL上的擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)的引物，PCR擴(kuò)增COB以供測(cè)序。無聚合酶的COB-ESB連接(圖10)用十種不同的CL寡核苷酸標(biāo)記氨甲基大孔聚苯乙烯(MPPS)珠，每種CL寡核苷酸具有對(duì)10種不同環(huán)狀ESB序列中的一種特異性的一對(duì)環(huán)狀退火區(qū)和六對(duì)APS特異性環(huán)狀退火區(qū)。加入所有10種環(huán)狀ESB序列以環(huán)狀幾何形狀與CL的環(huán)狀ESB特異性部分退火。環(huán)狀ESB序列設(shè)計(jì)為使得與CL的環(huán)狀ESB特異性區(qū)域的剩余部分的非特異性退火最小化。環(huán)狀ESB序列包含任選的第一擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)、ESB序列和與CL中環(huán)狀ESB特異性環(huán)狀退火區(qū)充分互補(bǔ)的一對(duì)退火區(qū)。進(jìn)行6輪分配混合合成。在每一輪中，將珠分入20個(gè)不同的容器中。向每個(gè)容器中加入不同的寡核苷酸APS，總共20個(gè)不同的APS。給定輪次中的每個(gè)APS進(jìn)一步包含與該輪其余APS不同的獨(dú)特的子代碼序列。最后一輪中的APS任選地進(jìn)一步包含第二擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)。APS設(shè)計(jì)為以環(huán)狀幾何形狀與CL雜交，沿著對(duì)該輪特異性的環(huán)狀退火區(qū)在每一端上與CL雜交。雜交沿著CL填充APS，而后將其連接起來。APS設(shè)計(jì)為使其不能沿著對(duì)其他輪次特異性的環(huán)狀退火區(qū)與CL有效地雜交。因此，如果來自特定輪次的APS缺失，則APS可能無法成功地連接起來，這取決于連接方法?；蛘?，用缺失的APS合成COB，缺失的APS的位置的側(cè)翼為一對(duì)環(huán)狀退火區(qū)。之后可相應(yīng)地對(duì)得到的COB進(jìn)行分析，并且可將其丟棄或可備選地處理重新獲得的信息。CL或者一個(gè)或多個(gè)APS進(jìn)一步包含隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)，該區(qū)充當(dāng)如上所述的分子計(jì)數(shù)器，允許檢測(cè)到的COB的隨后標(biāo)準(zhǔn)化。在每一輪加入APS和退火引物后，將珠合并，并將其分入20個(gè)新池中啟動(dòng)后一輪。如上所述在每一輪加入新的一組20個(gè)具有一對(duì)輪次特異性退火區(qū)的APS。加入6個(gè)APS后，使用如實(shí)施例2所述的點(diǎn)擊化學(xué)將珠上雜交的APS永久訂合在一起。任選地使用針對(duì)CL和最后一個(gè)APS亞單位上的擴(kuò)增引物互補(bǔ)區(qū)的引物，PCR擴(kuò)增COB以供測(cè)序。預(yù)見性實(shí)施例4.通過核酸測(cè)序的檢測(cè)由實(shí)施例3中的任意方法得到的組裝的、ESB連接的COB通過Illumina的HiSeq2000機(jī)器進(jìn)行測(cè)序。得到的序列包含10種不同ESB序列中的至少一種、隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)和來源于在6輪分配混合合成過程中添加到特定珠上的APS的6個(gè)子代碼的組合。預(yù)見性實(shí)施例5.通過肽測(cè)序的檢測(cè)(圖11)采用實(shí)施例3中的任意方法合成ESB連接的COB。得到的序列包含T7啟動(dòng)子、SP6起始位點(diǎn)、起始密碼子、ESB、COB和任選的編碼His(6)標(biāo)簽的區(qū)域(圖11)?？刹捎糜脕聿⑷隕SB的相同方法，將T7啟動(dòng)子和SP6起始位點(diǎn)并入與ESB連接的序列中?；蛘?，可將這些序列并入最后的APS中。任選地，可并入His(6)標(biāo)簽編碼區(qū)，與最后的APS或與ESB連接。采用ExpresswayTMMaxi無細(xì)胞大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)將組裝的、ESB連接的COB轉(zhuǎn)錄并翻譯成肽序列。在使用串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)序之前，采用親和色譜法和/或HPLC分離肽序列。預(yù)見性實(shí)施例6.COB在細(xì)胞表面上的分配混合合成利用COB在細(xì)胞表面上的分配混合合成來檢測(cè)和量化白細(xì)胞細(xì)胞系(HL60、JY和U937)上的細(xì)胞表面受體。使用抗體-寡核苷酸一體化偶聯(lián)試劑盒(Solulink)，將抗CD1、CD3、CD8和CD4的抗體與實(shí)施例3中所述的胺修飾的CL寡核苷酸偶聯(lián)起來。使用針對(duì)CL寡核苷酸中的序列的互補(bǔ)寡核苷酸，采用親和色譜法分離單獨(dú)標(biāo)記的抗體，并且使用質(zhì)譜法來證實(shí)每一抗體上的標(biāo)簽數(shù)。將107個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液與抗體組合在合適的條件下孵育，而后進(jìn)行6輪分配混合合成。如實(shí)施例3或?qū)嵤├?中所述檢測(cè)得到的ESB連接的COB。針對(duì)每個(gè)COB組合，對(duì)檢測(cè)到的與COB連接的ESB相關(guān)的信號(hào)進(jìn)行量化。成對(duì)繪制細(xì)胞上CD1、CD3、CD8和CD4抗原中的每一個(gè)的共表達(dá)。使用主成分分析來確定表達(dá)譜中的最強(qiáng)相關(guān)性。預(yù)見性實(shí)施例7.COB在細(xì)胞中的分配混合合成將甲醇冷卻至-20℃。采用本領(lǐng)域已知的合適的組織培養(yǎng)條件培養(yǎng)包含107個(gè)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。通過抽吸去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基。立即固定細(xì)胞并通過加入50mL冷甲醇進(jìn)行透化。使細(xì)胞在環(huán)境溫度、輕柔振蕩下孵育10分鐘。通過抽吸小心地去除甲醇。用100mL1XPBS漂洗細(xì)胞三次。細(xì)胞在室溫下用150ml在0.2%PBS中的0.1%酪蛋白溶液在輕柔振蕩下封閉1.5小時(shí)。如實(shí)施例5所述，兔抗已切割的胱天蛋白酶3、兔抗phos-p38、兔抗phos-ERK2、小鼠抗ERK2和小鼠抗β微管蛋白(克隆AA2)是CL偶聯(lián)的。細(xì)胞與CL偶聯(lián)的抗體在4℃、輕柔振蕩下孵育過夜。在室溫下用1XPBS+0.1%Tween-20洗滌細(xì)胞5次，每次5分鐘，隨后進(jìn)行6輪分配混合合成。如實(shí)施例3或?qū)嵤├?中所述檢測(cè)得到的ESB連接的COB。針對(duì)每個(gè)COB組合，對(duì)檢測(cè)到的與COB連接的ESB相關(guān)的信號(hào)進(jìn)行量化。成對(duì)繪制細(xì)胞中Phospho-p53、ERK1中每一個(gè)的共表達(dá)。使用主成分分析來確定表達(dá)譜中的最強(qiáng)相關(guān)性。雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅通過舉例的方式提供。在不偏離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)將想到眾多更改、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，在實(shí)施本發(fā)明的過程中可采用本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的各種替代方案。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，從而涵蓋這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等效方案。