用于體內(nèi)核酸遞送的聚(乙烯基酯)聚合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及膜活性的聚(乙烯基酯)聚合物，和用于體內(nèi)遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸至細(xì)胞的組合物。將RNAi多核苷酸與所述聚(乙烯基酯)聚合物偶聯(lián)，并且所述聚合物經(jīng)可逆修飾以能夠進(jìn)行體內(nèi)靶向遞送。所述聚(乙烯基酯)的膜活性將所述RNAi多核苷酸從所述細(xì)胞外移動至所述細(xì)胞內(nèi)?？赡嫘揎椞峁┥響?yīng)答性。
【專利說明】用于體內(nèi)核酸遞送的聚(乙烯基酯)聚合物
【背景技術(shù)】
[0001]將多核苷酸和其它基本不能穿透細(xì)胞膜的化合物遞送到活細(xì)胞受到細(xì)胞復(fù)雜膜系統(tǒng)的高度限制。反義、RNAi和基因治療中使用的藥物是相對高親水性的聚合物，且通常帶較高負(fù)電荷。這些物理特征均阻止其直接擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜。出于該原因，多核苷酸遞送的主要障礙是將多核苷酸遞送穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。
[0002]一種已經(jīng)用于體內(nèi)遞送小核酸的方法是使所述核酸與小靶向分子或脂質(zhì)或固醇結(jié)合。雖然已在這些偶聯(lián)物中觀察到一些遞送和活性，但是就實(shí)際應(yīng)用而言，這些方法需要的核酸劑量非常大。
[0003]已開發(fā)多種 轉(zhuǎn)染試劑，其能實(shí)現(xiàn)在體外將多核苷酸相當(dāng)有效地遞送至細(xì)胞。然而，采用這些相同轉(zhuǎn)染試劑在體內(nèi)遞送多核苷酸很復(fù)雜，并且由于體內(nèi)毒性、血清相互作用和弱靶向而變得無效。體外作用良好的轉(zhuǎn)染試劑，陽離子聚合物和脂質(zhì)，通常形成大的靜電顆粒并使細(xì)胞膜失穩(wěn)。體外轉(zhuǎn)染試劑的正電荷有助于通過電荷之間(靜電)的相互作用與核酸結(jié)合，因此形成核酸/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。正電荷也有利于載劑與細(xì)胞非特異性結(jié)合以及膜融合、去穩(wěn)定化或破壞。膜的去穩(wěn)定化有利于遞送基本不能滲透細(xì)胞膜的多核苷酸穿過細(xì)胞膜。雖然這些特性有利于核酸體外轉(zhuǎn)移，但它們會造成體內(nèi)毒性和靶向失效。陽離子電荷導(dǎo)致與血清組分相互作用，這造成多核苷酸轉(zhuǎn)染試劑相互作用的不穩(wěn)定和較低的生物利用度和靶向。在體外能夠有效的轉(zhuǎn)染試劑的膜活性在體內(nèi)常導(dǎo)致毒性。
[0004]就體內(nèi)遞送而言，所述載劑(核酸和相關(guān)聯(lián)的遞送劑)應(yīng)較小，直徑小于lOOnm，且優(yōu)選低于50nm。甚至更小的復(fù)合物(小于20nm或小于IOnm)會更加有用。大于IOOnm的遞送載劑在體內(nèi)很難到達(dá)血管細(xì)胞之外的細(xì)胞。由靜電相互作用形成的復(fù)合物在暴露于生理鹽濃度或血清組分時(shí)傾向于聚集或瓦解。此外，體內(nèi)遞送載劑上的陽離子電荷導(dǎo)致不良血清相互作用并因此導(dǎo)致生物利用度差。有趣的是，高的負(fù)電荷還可通過干擾靶向所需的相互作用來抑制體內(nèi)遞送。因此，體內(nèi)分布和靶向需要接近中性的載劑。若不細(xì)致調(diào)控，膜的破壞或失穩(wěn)活性在體內(nèi)利用時(shí)有毒。采用核酸遞送平衡載劑毒性在體外比在體內(nèi)更容易實(shí)現(xiàn)。
[0005]Rozema等在美國專利公開20040162260示范了一種通過將伯胺可逆轉(zhuǎn)化成羧基基團(tuán)對(2-丙酸-3-甲基馬來酸酐的β羧基和Y羧基)來可逆調(diào)節(jié)膜活化多胺的膜干擾活性的方法。Rozema等(Bioconjugate Chem.2003，14，51-57)報(bào)道了 β羧基不變現(xiàn)完全明顯的負(fù)電荷且其自身不能抑制膜活性。經(jīng)報(bào)道，就有效膜活性抑制而言，添加Y羧基基團(tuán)是必需的。然而，因?yàn)樗鲚d劑帶有較高負(fù)電荷，且核酸和經(jīng)修飾的聚合物都具有高負(fù)電荷密度，所以就體內(nèi)遞送而言，該系統(tǒng)無效。
[0006]通過用中性親水靶向基團(tuán)(半乳糖)和位阻穩(wěn)定基團(tuán)(PEG)替代2-丙酸-3-甲基馬來酸酐的Y羧基，Rozema等能夠保留全部水溶性和膜活性的可逆抑制，同時(shí)加入有效的的體內(nèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞靶向(美國專利公開20080152661)。
[0007]我們在此描述新型膜活化聚合物，以及用所述聚合物制備的組合物，其用于在體內(nèi)將核酸遞送至細(xì)胞。這些新型聚合物具有優(yōu)于前述那些的改進(jìn)的治療潛力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于兩性陽離子聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，所述兩性陽離子聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物特別適合用于在體內(nèi)遞送多核苷酸至細(xì)胞。本發(fā)明的兩性陽離子聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物包含多種含胺乙烯基酯單體和多種第一疏水性乙烯基酯單體。所述含胺單體包含伯胺側(cè)基。所述疏水性單體包含具有2~20個(gè)碳原子的疏水性側(cè)基，所述疏水性側(cè)基選自下組:烴基、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、芳香基和芳基。所述聚合物還可包含多種第二含胺乙烯基酯單體或多種第二疏水性乙烯基酯單體。第二含胺乙烯基酯單體包含胺側(cè)基，所述胺側(cè)基選自下組:伯胺、仲胺、叔胺、季胺、經(jīng)保護(hù)的胺、氮雜環(huán)、醛亞胺、酰肼、腙和咪唑。本發(fā)明的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物除了是兩性的以外，還具有膜活化性。優(yōu)選的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物包含含伯胺單體和丁酰乙烯基酯單體。本發(fā)明的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物可由兩種、三種或四種不同單體合成。所述單體可選自下組:經(jīng)保護(hù)的乙烯基胺酯(amine vinyl ester)、咪唑乙烯基酯、烷基乙烯基酷、烯基乙烯基酷、炔基乙烯基酷、芳香族乙烯基酷和芳基乙烯基酷。經(jīng)保護(hù)的乙烯基胺酷單體包括，但不限于:含有叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)的胺的乙烯基酯。經(jīng)保護(hù)的伯胺單體用烷基乙烯基酯單體共聚合。然后，在聚合反應(yīng)之后去除所述胺保護(hù)基團(tuán)以形成水溶性、兩親性的無規(guī)共聚物。脂族疏水性基團(tuán)可以是線性、分支或環(huán)狀的，并且可包含一種或多種雜原子取代。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合來合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述RAFT聚合反應(yīng)采用丙二酸N，N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDP-DTC)進(jìn)行。采用RAFT聚合，并可任選地分餾，可使聚合物的多分散性小于1.5,或更優(yōu)選地小于1.4或1.3。
[0010]就體內(nèi)遞送 多核苷酸至細(xì)胞而言，所述兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物經(jīng)可逆修飾?？赡嫘揎棸ㄊ谷绫疚亩x的多種掩蔽劑通過多個(gè)可逆生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵結(jié)合聚合物伯胺?？赡娴纳韺W(xué)不穩(wěn)定性共價(jià)鍵可選自下組:pH不穩(wěn)定性鍵和酶可切割鍵。如本文所用，可逆修飾指在連接所述掩蔽劑和所述聚合物的生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵被切割后，聚合物伯胺恢復(fù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過掩蔽劑的可逆結(jié)合來修飾多于50%、多于60%、多于70%、多于80%或多于90%的聚合物伯胺。掩蔽劑可選自下組:位阻穩(wěn)定劑和靶向基團(tuán)。所述掩蔽劑改善體內(nèi)生物分散性或所述聚合物的靶向或聚合物-多核苷酸偶聯(lián)物。掩蔽劑可抑制所述聚合物與血清成分或非靶細(xì)胞的非特異性相互作用。掩蔽劑可降低所述聚合物或聚合物-多核苷酸偶聯(lián)物的聚集。包含靶向基團(tuán)的掩蔽劑通過將所述偶聯(lián)系統(tǒng)靶向至細(xì)胞表面受體來增強(qiáng)細(xì)胞特異性靶向或細(xì)胞內(nèi)化?？稍谒鼍酆衔锱c多核苷酸偶聯(lián)之前或之后使所述掩蔽劑與所述聚合物偶聯(lián)。
[0011]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，多核苷酸通過第二生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵與本發(fā)明的聚合物連接。一種或多種多核苷酸可通過所述第二生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵連接所述聚合物。第一不穩(wěn)定鍵(連接掩蔽劑和聚合物的不穩(wěn)定鍵)和第二不穩(wěn)定鍵(連接多核苷酸和聚合物的不穩(wěn)定鍵)可在相同或相似的條件下被切割，或者其可在不同的條件下被切割，即，其可以是正交不穩(wěn)定鍵。所述多核苷酸可選自下組:DNA、RNA、阻斷性多核苷酸、寡核苷酸、RNA干擾多核苷酸、siRNA、微小RNA、mRNA和shRNA。第二生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵可選自下組:pH不穩(wěn)定鍵、酶可切割鍵、二硫鍵和核酸酯鍵。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，描述一種組合物，所述組合物包括:兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其與a) —種或多種靶向基團(tuán)和或位阻穩(wěn)定劑通過可逆生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵共價(jià)連接；和b) —種或多種多核苷酸通過正交第二生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵共價(jià)連接。給予哺乳動物藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑內(nèi)的所述多核苷酸-聚合物偶聯(lián)物。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，描述了用于將膜可穿透性分子遞送至細(xì)胞并在所述細(xì)胞內(nèi)釋放所述分子的聚合物偶聯(lián)系統(tǒng)。所述聚合物偶聯(lián)系統(tǒng)包含與本發(fā)明的經(jīng)可逆修飾的聚(乙烯基酯)可逆連接的膜可穿透性分子。優(yōu)選的膜可穿透分子包括多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸包括RNA干擾多核苷酸。優(yōu)選的RNA干擾多核苷酸包括siRNA或miRNA。給予哺乳動物藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑內(nèi)的所述聚合物或多核苷酸-聚合物偶聯(lián)物。 [0013]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的特點(diǎn)是用于體內(nèi)遞送RNA干擾多核苷酸至肝臟細(xì)胞的組合物，所述組合物包括:兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其與一種或多種靶向基團(tuán)和/或位阻穩(wěn)定劑通過可逆生理學(xué)不穩(wěn)定共價(jià)鍵共價(jià)連接，并且與和多核苷酸靶向基團(tuán)偶聯(lián)的RNA干擾多核苷酸(多核苷酸偶聯(lián)物)共價(jià)連接。優(yōu)選的多核苷酸靶向基團(tuán)是含有至少20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)。另一個(gè)優(yōu)選的多核苷酸靶向基團(tuán)是三價(jià)半乳糖胺。分別合成所述聚(乙烯基酯)和所述多核苷酸-偶聯(lián)物，并且可在分開的容器或單個(gè)容器中提供。在該組合物中，所述多核苷酸不與所述聚合物偶聯(lián)。給予哺乳動物藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑內(nèi)的經(jīng)修飾的聚合物和多核苷酸-偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和RNAi多核苷酸偶聯(lián)物在給予所述哺乳動物前可在溶液中合并。在另一實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可在單獨(dú)的溶液中共給予所述哺乳動物。在另一實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可依次給予所述哺乳動物。對于依次給予，所述遞送聚合物可在給予所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物之前給予?；蛘撸瑢τ谝来谓o予，所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可在給予所述遞送聚合物之前給予。
[0014]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物適合用于體外遞送多核苷酸至哺乳動物細(xì)胞。就體外細(xì)胞遞送而言，所述兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物可如上所述經(jīng)可逆修飾，或不經(jīng)可逆修飾使用。其還可與脂質(zhì)或其它聚合物結(jié)合。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1.顯示不同兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物的結(jié)構(gòu)的示意圖，其中:
[0016]N是具有-NH2形式的伯胺，
[0017]N’是具有-NR5H' -NR5R6或-NR5R6R7形式(其中R5、R6和R7獨(dú)立地選自-CH3和-CH2-CH3)的仲胺、叔胺或季胺，或者N'可以是氮雜環(huán)、醛亞胺、酰肼、腙或咪唑，
[0018]Y和Y’是接頭基團(tuán)，
[0019]R和R’是獨(dú)立地具有2-20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)，
[0020]Rl、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫(-H)和甲基(-CH3)，
[0021]m和P是大于零(O)的整數(shù)，
[0022]η和q是大于或等于零(O)的整數(shù)，且
[0023](m+n) / (p+q)的比是 1-9。
[0024]圖2.顯示不同二肽掩蔽劑結(jié)構(gòu)的示意圖。【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明涉及用于遞送生物活性物質(zhì)(例如核酸、肽和蛋白質(zhì))的兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物及其偶聯(lián)系統(tǒng)。將核酸和其它基本不能穿透細(xì)胞膜的化合物遞送到活細(xì)胞受到細(xì)胞復(fù)雜膜系統(tǒng)的限制。就體內(nèi)遞送而言，所述兩親性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物經(jīng)掩蔽劑通過生理學(xué)不穩(wěn)定連接共價(jià)結(jié)合來可逆修飾。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式(I)的膜活性聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物:
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其具有如下結(jié)構(gòu):
2.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，(m+n)/(p+q)的比是L 5 ~4。
3.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，所述聚合物的多分散性低于1.5。
4.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，Y是-(CH2)a-,其中a是2、3或4。
5.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，Y是-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O
6.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，R是-(CH2)k-CH3，其中 k 是 1、2、3、4 或 6。
7.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，η是零。
8.如權(quán)利要求7所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，q是零。
9.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，RUR2、R3和R4各自是氫。
10.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于:Y是-(CH2)4-R是-(CH2)2-CH3 Rl和R3各自是氫，并且η和P各自是零。
11.如權(quán)利要求10所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，m/p的比是1.3~.2.3。
12.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于:
Y是 _ (CH2) 2-
R 是-(CH2) 2-CH3
Rl和R3各自是氫，并且
η和P各自是零。
13.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于:
Y是 _ (CH2) 2-
R 是-(CH2) 3-CH3
Rl和R3各自是氫，并且
η和P各自是零。
14.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，所述聚合物與RNA干擾多核苷酸偶聯(lián)。
15.如權(quán)利要求1所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，大于50%的N通過與雙取代的馬來酸酐掩蔽劑、二肽-酰胺基芐基-碳酸酯掩蔽劑或雙取代的馬來酸酐掩蔽劑和二肽-酰胺基芐基-碳酸酯掩蔽劑的組合反應(yīng)來可逆修飾。
16.一種用于抑制體內(nèi)基因表達(dá)的組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體內(nèi)的如權(quán)利要求16所述的聚(丙烯酸酯)無規(guī)共聚物和RNA干擾多核苷酸。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述RNA干擾多核苷酸與所述聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物共價(jià)連接。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述RNA干擾多核苷酸與含有至少20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)偶聯(lián)。
19.一種聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其具有如下結(jié)構(gòu):
20.如權(quán)利要求19所述的聚(乙烯基酯)無規(guī)共聚物，其特征在于，所述m/p的比是.1.5-4。
【文檔編號】C08L33/06GK104024328SQ201280041442
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月26日
【發(fā)明者】D·H·維基菲爾德, N·羅西, D·謝赫 申請人:箭頭研究公司