本發(fā)明涉及基于對芥子醇的顯著酶特異性的具有優(yōu)異的丁香苷合成活性的重組糖基轉移酶UGT72E3/2基因，基于用參與類苯基丙烷生物合成途徑的F5H、HCT和CHS基因和作為用于正調節(jié)參與木質素生物合成途徑的基因的轉錄因子的Myb58基因的代謝工程，用于產(chǎn)生具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，以及涉及通過該方法獲得的植物。

背景技術：
從通過類苯基丙烷合成途徑產(chǎn)生的作為構成木質素的組分的芥子醇(s型木質素單體(monolignol))中，通過糖基轉移酶(UDP-葡萄糖轉移酶)產(chǎn)生作為s型木質素單體糖苷的丁香苷。在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有約100種糖基轉移酶，已報道，其通過形成包括植物激素和次級代謝產(chǎn)物的多種化合物的糖苷，調節(jié)細胞活性和這些化合物在液泡中的儲存。它們之中，報道過UGT72E2和UGT72E3作為糖基轉移酶負責首先將木質素單體如松柏醇和芥子醇特異性地轉化為木質素單體糖苷。特別是，作為生成丁香苷所需的芥子醇特異性糖基轉移酶，UGT72E3對芥子醇具有很好的底物特異性，但其糖基轉移酶活性很低，使其應用受到很大限制。因此，在丁香苷(其是藥學上功能性次級代謝產(chǎn)物)大量生產(chǎn)和應用前，發(fā)展有利于在植物中有效生成丁香苷的新的糖基轉移酶仍然是首要解決的問題。此外，為了通過類苯基丙烷合成途徑在植物中有效生成丁香苷,還需要具有使作為以微量存在于植物細胞中的丁香苷前體的芥子醇的含量增加的代謝工程技術，以及對芥子醇具有底物特異性的強糖基轉移酶活性。特別是，將刺五加苷B(丁香苷)歸類為來自植物的代表性適應原，其 是來自刺五加(E.senticosus)的藥用成分，針對應激具有良好的心理和身體的適應效果。適應原是表示增強活體響應各種應激的非特異性抗性而不引起副作用的植物次級代謝產(chǎn)物的術語。近期，據(jù)報道，分離出的純態(tài)的丁香苷對成為現(xiàn)代城市中生活的人的嚴重問題的糖尿病和抑郁癥表現(xiàn)出良好效果，并因此其應用較以往更加廣泛。然而，由于刺五加的種植范圍受到限制，且因此藥用成分根據(jù)種植區(qū)域有巨大的變化，因此難以具有用于商業(yè)用途的丁香苷的生產(chǎn)所需的刺五加的穩(wěn)定供應。從而需要基于使用生物工程技術調節(jié)植物代謝途徑來發(fā)展用于穩(wěn)定生產(chǎn)植物次級代謝產(chǎn)物如高價值產(chǎn)品丁香苷的技術。同時，韓國專利申請公開號2004-0004764公開了“包含具有肝臟保護活性的刺五加提取物或其丁醇可溶性部分和具有抗氧化和肝臟保護活性的丁香苷的丁醇餾分以及丁香脂素-雙-O-β-D-吡喃葡糖苷衍生物”。此外，韓國專利申請公開號1998-0072707公開了“具有肝功能保護活性的丁香苷的藥物組合物”。然而，之前從未記載本發(fā)明所公開的用于產(chǎn)生具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法以及由所述方法獲得的植物。本發(fā)明的詳細說明待解決的技術問題本發(fā)明是鑒于前述需求而設計，并用于產(chǎn)生具有提高的糖基轉移活性同時保持高水平的底物特異性的新的重組糖基轉移酶。通過UGT72E2和UGT72E3基因的結構域交換(domainswapping)產(chǎn)生重組基因UGT72E2/3和UGT72E3/2。用花浸漬法產(chǎn)生了超表達每個UGT72E家族的轉基因擬南芥。此外，作為丁香苷合成效率的定量分析結果，證實了新產(chǎn)生的重組糖基轉移酶UGT72E3/2表現(xiàn)出比野生型UGT72E2和UGT72E3顯著提高的丁香苷合成。此外，為了通過調節(jié)植物代謝途徑提高丁香苷的產(chǎn)生，產(chǎn)生了超表達F5H和HCT基因(其調節(jié)用于在類苯基丙烷合成途徑中調節(jié)底物流的重要步驟)的每個擬南芥轉基因植物、缺少CHS基因功能的轉基因植物， 以及超表達作為木質素合成途徑的正調節(jié)轉錄因子的Myb58的轉基因植物。作為在將前述的轉基因植物與超表達重組糖基轉移酶UGT72E3/2的轉基因植物雜交后，丁香苷合成效率的定量分析結果，已發(fā)現(xiàn)，來自同時超表達UGT72E3/2、F5H和Myb58蛋白的新產(chǎn)生的轉基因植物的丁香苷生成量相比僅超表達UGT72E3/2蛋白的情況提高了10倍或以上，因此完成了本發(fā)明。解決問題的技術手段為了解決上述問題，本發(fā)明提供了重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQIDNO:2構成。本發(fā)明還提供了編碼UGT72E3/2蛋白的基因。本發(fā)明還提供了包含編碼UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體。本發(fā)明還提供了用重組載體轉化的宿主細胞。本發(fā)明還提供了相比野生型提高植物中丁香苷合成的方法，包括用重組載體轉化植物細胞，以超表達UGT72E3/2基因。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體和包含編碼F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體、包含編碼F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體，以及包含編碼Myb58或Myb63蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型在植物中具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體和敲除編碼CHS(查爾酮合酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基 因植物的方法，其中用包含編碼UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括使超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和超表達F5H蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2和F5H蛋白的轉基因植物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括使同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物和超表達Myb58或Myb63蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白、F5H蛋白和Myb58或Myb63蛋白的轉基因植物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括使超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和其中敲除編碼CHS蛋白的基因的植物雜交，并選擇超表達UGT72E3/2但抑制CHS蛋白表達的轉基因植物。本發(fā)明還提供了通過上述每種方法產(chǎn)生的相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物及其種子。本發(fā)明又提供了用于提高植物中丁香苷合成的組合物，其包含作為有效成分的重組載體，所述重組載體包含由編碼UGT72E3/2蛋白的核苷酸序列SEQIDNO:1組成的基因。本發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明，提供了在各種植物中有效且大量生成丁香苷的新方法，丁香苷來自于植物且具有廣泛的應用，如報道所言，對治療成為現(xiàn)代城市中生活的人的嚴重問題的糖尿病和抑郁癥表現(xiàn)出良好效果，通過該方法可在各種植物中有效且大規(guī)模生產(chǎn)藥學上非常有用的丁香苷，基于作為丁香苷前體的芥子醇的充足生產(chǎn)和使用重組糖基轉移酶UGT72E3/2利用代謝工程通過調節(jié)編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因和參與植物中類苯基丙烷合成途徑的F5H、CHS和Myb58基因提高糖基轉移活性，所述丁香苷具有協(xié)同效應。因此，期望的是使關于作為食品或藥品 具有高價值的農用生物材料的工業(yè)得到發(fā)展。附圖說明圖1示出擬南芥糖基轉移酶UGT72E2和UGT72E3的一級和二級結構的對比。圖2示出來自擬南芥或葡萄的糖基轉移酶UGT72B1(A)和VvGT1(B)、來自擬南芥的糖基轉移酶UGT72E2和UGT72E3以及本發(fā)明產(chǎn)生的重組糖基轉移酶UGT72E2/3和UGT72E3/2(C)的三級結構的對比。圖3示出(A)用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉化體的重組載體，(B)轉入該轉化體的基因的表達水平，以及(C)在轉化的葉中針對紫外射線的反應性。圖4示出了野生型擬南芥和轉化體的葉中松柏苷和丁香苷的生成的定量HPLC分析，所述轉化體表達4種糖基轉移酶基因中的每一種，即UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2((C)中各層析譜的峰：1、松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；2、芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)；3、松柏醇；以及4、芥子醇)。圖5示出了野生型擬南芥和轉化體的根中松柏苷和丁香苷的生成的定量HPLC分析，所述轉化體表達4種糖基轉移酶基因中的每一種，即UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2((C)中各層析譜的峰：1、松柏醇4-O-葡糖苷(1、松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；2、芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)；3、松柏醇；以及4、芥子醇)。圖6示出重組糖基轉移酶UGT72E3/2的核苷酸序列和氨基酸序列。圖7示出了從超表達糖基轉移酶UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2中每個的擬南芥轉化體或野生型的葉中制備的蛋白提取物中存在的糖基轉移酶的活性的對比結果，其中通過測定向轉基因的葉的蛋白提取物中加入松柏醇或芥子醇60分鐘后產(chǎn)生的松柏苷和丁香苷，來間接測量各轉化體的蛋白提取物中存在的糖基轉移酶的活性。(A)松柏苷的生成量和(B)丁香苷的生成量。圖8示出了用于合成丁香苷的類苯基丙烷合成途徑以及用于本發(fā)明 的基因的調節(jié)位點。圖9示出了基于RT-PCR測定超表達HCT、F5H和Myb58三者的擬南芥中各基因的表達量的結果。使用肌動蛋白2基因作為對照組。圖10示出包括野生型在內的轉化體的葉中生成的(A)松柏苷和(B)丁香苷的定量HPLC分析，用于確定糖基轉移酶UGT72E3/2與類苯基丙烷合成途徑的HCT、F5H和CHS基因之間的協(xié)同效應，所述轉化體表達基因的各種組合。(C)中各層析譜的峰1：代表松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；峰2代表芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)。圖11示出包括野生型在內的轉化體的根中生成的(A)松柏苷和(B)丁香苷的定量HPLC分析，用于確定糖基轉移酶UGT72E3/2與類苯基丙烷合成途徑的HCT、F5H和CHS基因之間的協(xié)同效應，所述轉化體表達基因的各種組合。(C)中各層析譜的峰1：代表松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；峰2代表芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)。圖12為定量HPLC分析的圖，其示出了轉化體的葉中生成的(A)松柏苷和(B)丁香苷的劇增，其是基于下述的協(xié)同效應所致：糖基轉移酶UGT72E3/2、類苯基丙烷合成途徑中的F5H基因以及作為用于正調節(jié)參與木質素合成途徑的基因的轉錄因子的Myb58基因的聚合(pyramiding)。(C)中各層析譜的峰1：代表松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；峰2代表芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)。圖13示出了HPLC分析結果的圖，其表明，基于糖基轉移酶UGT72E3/2、類苯基丙烷合成途徑中的F5H基因以及作為用于正調節(jié)參與木質素合成途徑的基因的轉錄因子的Myb58基因的累積的協(xié)同效應，對轉化體的根沒有明顯影響。(C)中各層析譜的峰1：代表松柏醇4-O-葡糖苷(松柏苷)；峰2代表芥子醇4-O-葡糖苷(丁香苷)。圖14示出了通過RT-PCT所測定的，在超表達UGT72E3/2、F5H和Myb58基因的轉基因擬南芥、超表達UGT72E3/2和F5H基因的轉基因擬南芥以及野生型擬南芥中參與類苯基丙烷合成途徑的各種基因的表達量的圖。使用肌動蛋白2基因作為對照組。實施本發(fā)明的最佳方式為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQIDNO:2組成。在本發(fā)明的重組糖基轉移酶蛋白的范圍內，包括了具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白以及該蛋白的功能等同物。術語“功能等同物”是指由于氨基酸的添加、替換或缺失，與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％且甚至更優(yōu)選至少95％序列同源性的蛋白，并且其表現(xiàn)出與SEQIDNO:2所示的蛋白實質上相同的生理活性。術語“實質上相同的生理活性”意指丁香苷合成的提高。本發(fā)明還包括重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的“片段”、“衍生物”和“類似物”。本文使用的術語“片段”、“衍生物”和“類似物”指與本發(fā)明的重組糖基轉移酶UGT72E3/2多肽具有實質上相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的衍生物和類似物可以是以下的任意一種：(1)其中一個或多個保守型或非保守型氨基酸殘基(優(yōu)選保守型氨基酸殘基)被替換(被替換的氨基酸殘基可以被遺傳密碼編碼或未編碼)的多肽，(2)在一個或多個氨基酸上具有取代基的多肽，(3)衍生自與其他化合物(即能夠提高多肽的半衰期的化合物；例如聚乙二醇)結合的成熟多肽的多肽，以及(4)衍生自與另外的氨基酸殘基(例如前導序列、分泌序列、用于純化多肽的序列、蛋白原序列或融合蛋白)結合的前述多肽的多肽。本文定義的片段、衍生物和類似物對于本領域技術人員而言是熟知的。編碼SEQIDNO:2所示的成熟多肽的多核苷酸，包括僅編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的序列和各種附加的編碼序列；以及編碼成熟多肽的序列(以及任意附加的編碼序列)和非編碼序列。術語“編碼多肽的多核苷酸”意指編碼多肽的多核苷酸，或者另外包含編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及編碼與本發(fā)明所述的序列相同的氨基酸序列的多核苷酸變體或含有其片段、類似物或衍生物的多肽。多核苷酸變體可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的變體。核苷酸變體包括取代變體、 缺失變體和插入變體。如在相關領域中所熟知的，等位基因變體是多核苷酸的替代物，并且其可以含有多核苷酸的一個或多個取代、缺失或插入。然而，變體編碼的多核苷酸中沒有產(chǎn)生實質的功能性變化。本發(fā)明還提供了編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因。從源自擬南芥的UGT72E3和UGT72E2基因通過使用結構域交換法制備編碼本發(fā)明的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因。在本發(fā)明中，為了具有提高的丁香苷生成率,由UGT72E2和UGT72E3基因通過使用結構域交換法制備重組基因UGT72E2/3和UGT72E3/2，以產(chǎn)生如UGT72E2一樣具有高糖基轉移酶活性同時如UGT72E3一樣保持對芥子醇的底物特異性的新的重組糖基轉移酶。首先確定來自擬南芥的約100種糖基轉移酶的糖基轉移酶UGT72E進化支的酶特性，已報道該進化支具有將糖轉移到芥子醇(即丁香苷的前體)或結構相似的松柏醇的能力。UGT72E進化支還具有類似于普通糖基轉移酶的結構特性，并且已報道氨基末端結構域具有底物識別位點，羧基末端結構域具有用于將被UDP激活的糖轉移至底物的酶促激活區(qū)域，以及羧基末端上的PSPG(植物次級產(chǎn)物糖基轉移酶)對于來自植物的糖基轉移酶的活性特別重要。UGT72E進化支包括具有相似核苷酸的糖基轉移酶UGT72E1、UGT72E2和UGT72E3。在本發(fā)明中，UGT72E2和UGT72E3的每個均分為包括編號1至編號344的氨基酸的氨基片段和包括從編號345至編號481的氨基酸的羧基片段。氨基片段包括用于決定底物識別特異性的區(qū)域，羧基末端包括PSPG基序，其對于糖基轉移酶的活性很重要。為了在植物中有效生成丁香苷，底物特異性比糖基轉移酶的活性更重要。因此，將大的氨基片段制備成包括全長的3/4，同時將羧基片段制備成包括PSPG基序的小片段，而不是具有精確的對切。結果，通過將UGT72E3的包括氨基末端上的編號1至編號344的氨基酸的氨基片段連接于UGT72E2的包括編號345至羧基末端上的編號481的氨基酸的羧基片段，產(chǎn)生了本發(fā)明的重組UGT72E3/2基因。本發(fā)明的基因可以是編碼重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的DNA或RNA。cDNA、基因組DNA和人工合成的DNA包括在DNA中。DNA可以是單鏈或雙鏈的。DNA可以是編碼序列或非編碼序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明的基因可含有核苷酸序列SEQIDNO:1。此外，該核苷酸序列的同源物也在本發(fā)明的范圍內。具體而言，上述基因可包含與核苷酸序列SEQIDNO:1具有優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少90％，且最優(yōu)選至少95％同源性的核苷酸序列。某個多核苷酸的“序列同源性％”是通過比較最佳排列的兩條序列的可比較區(qū)而確定的。在這點上，可比較區(qū)的一部分多核苷酸與參照序列(無任何添加或缺失)相比，相對于所述兩條序列的最佳比對，可含添加或缺失(即缺口)。本發(fā)明還涉及與和上述核苷酸序列SEQIDNO:1具有至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％序列同源性的序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所述，“嚴格條件”意指：(1)在低離子強度和高溫下的雜交和洗滌，如0.2xSSC，0.1％SDS，60℃；(2)存在變性劑如50％(v/v)甲酰胺、0.1％牛血清/0.1％Ficoll以及42℃下的雜交；或(3)僅在同源性為至少80％、優(yōu)選至少90％、且更優(yōu)選至少95％的兩條序列之間發(fā)生的雜交。此外，由可雜交的核苷酸編碼的多肽的生物學功能和活性與SEQIDNO:2所示的成熟多肽的生物學功能和活性相同。本發(fā)明還提供了包含編碼前述重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體。術語“重組體”是指能夠復制異源核苷酸，或能夠表達所述核苷酸或肽、異源肽或由異源核苷酸編碼的蛋白的細胞。重組細胞可以以有義或反義的形式表達在天然狀態(tài)的細胞中未發(fā)現(xiàn)的基因或基因片段。此外，重組細胞可表達天然狀態(tài)下存在的基因，只要通過人工手段將所述基因修飾或重轉入細胞即可。本發(fā)明的重組植物表達載體可以用作允許外來基因在植物中瞬時表達的瞬時表達載體，并且還用作允許外來基因在植物中永久表達的植物 表達載體。可用于本發(fā)明的二元載體可以是包含T-DNA的RB(右邊界)和LB(左邊界)的任意二元載體，在與根瘤農桿菌(A.tumefaciens)的Ti質粒一起存在時，其可以轉化植物。優(yōu)選的是使用相關領域技術人員常用的pBI101(目錄編號:6018-1,Clontech,USA)、pBIN19(基因庫保藏號U09365)、pBI121、pCAMBIA等。本文使用的術語“載體”是指遞送至細胞的DNA片段和核苷酸分子。載體能夠復制DNA并能在宿主細胞中獨立復制。術語“遞送系統(tǒng)”和“載體”通?？山惶媸褂?。術語“表達載體”是指包含所需編碼序列和在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的其他適當核苷酸序列的重組DNA分子。可用于真核細胞中的啟動子、增強子、終止信號和多聚腺苷酸化信號是本領域熟知的。植物表達載體的優(yōu)選實例是Ti-質粒載體，當所述Ti-質粒載體存在于合適的宿主中(如根瘤農桿菌)時該載體可以將自身的一部分(即所謂的T區(qū))轉入植物細胞。其他類型的Ti-質粒載體(參見EP0116718B1)目前用于將雜交基因轉移到可以產(chǎn)生新植物的原生質體，這是通過適當?shù)貙⒅参锛毎螂s交DNA插入至植物基因組而實現(xiàn)的。Ti-質粒載體的特別優(yōu)選形式是EP0120516B1和US專利4940838中公開的所謂二元載體?？捎糜趯⒈景l(fā)明的基因導入宿主植物的其他載體可選自雙鏈植物病毒(例如CaMV)、單鏈植物病毒以及源自雙粒病毒等的病毒載體(例如非完整植物病毒載體)。特別是，在植物宿主不能被適當?shù)霓D化時，使用所述載體是有利的。表達載體可含有至少一個選擇標記。所述選擇標記是具有能通過普通化學方法選擇靶基因的特性的核苷酸序列。實例包括可用于區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞的所有基因。具體實例包括：除草劑(如草甘膦和膦絲菌素(phosphinotricine))抗性基因；抗生素(如卡那霉素、氨芐青霉素、G418、博萊霉素、潮霉素和氯霉素)抗性基因，但不限于此。對于本發(fā)明一個實施方案的植物表達載體而言，啟動子可以是CaMV 35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、MAS和組蛋白啟動子中的任意一個，但不限于此。術語“啟動子”是指結合RNA聚合酶以啟動其轉錄的DNA分子且其對應于結構基因上游的DNA區(qū)域。術語“植物啟動子”是指可啟動植物細胞內轉錄的啟動子。術語“組成型啟動子”是指在大部分環(huán)境條件和生長狀態(tài)或細胞分化狀態(tài)下都有活性的啟動子。因為可采用多種機制在不同階段選擇轉化體，所以本發(fā)明優(yōu)選組成型啟動子。因此，本發(fā)明并不限制選擇組成型啟動子的可能性。在本發(fā)明的上述重組載體中，可以使用任意種類的典型終止子。實例包括胭脂堿合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmylA終止子、菜豆堿終止子以及根瘤農桿菌Optopine基因的終止子等，但不限于此。本發(fā)明還提供了用前述重組載體轉化的宿主細胞。當用本發(fā)明的載體轉化真核細胞時，可以用作宿主細胞的有酵母(釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae))、昆蟲細胞、人的細胞(例如CHO(中國地鼠卵巢細胞)的細胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細胞系)、植物細胞等。宿主細胞優(yōu)選為植物細胞。對于向宿主細胞遞送本發(fā)明的載體的方法，可以通過微注射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質體介導的轉染法、DEAE-葡聚糖處理法或基因轟擊法將載體導入宿主細胞。本發(fā)明還提供了相比野生型提高植物中丁香苷合成的方法，包括用超表達UGT72E3/2基因的重組載體轉化植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的方法，UGT72E3/2基因可以由核苷酸序列SEQIDNO:1組成，但不限于此。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體和包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO: 4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體、包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體，以及包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的Myb58蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體、包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體，以及包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:8組成的Myb63蛋白的基因的重組載體轉化植物。本發(fā)明還提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物，其中用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體、敲除編碼由氨基酸序列SEQIDNO:10組成的CHS(查爾酮合酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物。在本發(fā)明中，為了向超表達重組糖基轉移酶UGT72E3/2的轉化體高效供應作為丁香苷的底物的芥子醇，利用了丁香苷合成途徑中的每個步驟和工作酶。具體而言，為了提高向類苯基丙烷合成途徑引入香豆酰輔酶A，超表達HCT(羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶)基因，并降低轉化為松柏醇的松柏醛的量，并且為了促進向芥子醇的轉化，超表達F5H(阿魏酸5-羥化酶)基因。此外，為了降低從丁香苷合成途徑到類黃酮途徑損失的香豆酰輔酶A的量，使用了缺少CHS(查爾酮合酶)基因功能的突變體。為敲除CHS基因，可以使用沉默載體，但不限于此。本文所述的術語“敲除”是指從核苷酸序列中修飾或除去特定基因，以阻止所述特定基因的表達，并且其一般是指下調或完全抑制基因表達 的現(xiàn)象。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷合成的轉基因植物的方法，包括：(a)用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物，以及(b)由步驟(a)的轉基因植物細胞再生植株。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括：(a)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物；(b)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達F5H蛋白的轉基因植物；(c)使步驟(a)的超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和步驟(b)的超表達F5H蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的方法，包括：(a)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物；(b)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達F5H蛋白的轉基因植物；(c)使步驟(a)的超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和步驟(b)的超表達F5H蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物；(d)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的Myb58蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達Myb58蛋白的轉基因植物；(e)使步驟(c)的同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物和步驟(d)的超表達Myb58蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白、F5H蛋白和Myb58蛋白的轉基因植物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括：(a)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物；(b)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:4組成的F5H(阿魏酸5-羥化酶)蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達F5H蛋白的轉基因植物；(c)使步驟(a)的超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和步驟(b)的超表達F5H蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物；(d)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:8組成的Myb63蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達Myb63蛋白的轉基因植物；(e)使步驟(c)的同時超表達UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的轉基因植物和步驟(d)的超表達Myb63蛋白的轉基因植物雜交，并選擇同時超表達UGT72E3/2蛋白、F5H蛋白和Myb63蛋白的轉基因植物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物的方法，包括：(a)通過用包含編碼由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的重組糖基轉移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重組載體轉化植物，產(chǎn)生超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物；(b)產(chǎn)生其中敲除編碼由氨基酸序列SEQIDNO:10組成的CHS(查爾酮合酶)蛋白的基因的植物；以及(c)使步驟(a)的超表達UGT72E3/2蛋白的轉基因植物和步驟(b)的敲除CHS蛋白編碼基因的植物雜交，并選擇超表達UGT72E3/2蛋白和抑制CHS蛋白表達的轉基因植物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的方法，植物優(yōu)選在葉或根處或最優(yōu)選在葉中呈現(xiàn)提高的丁香苷合成，但并不限于此。本發(fā)明的方法包括用本發(fā)明的重組載體轉化植物細胞的步驟，并且可以由根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefiaciens)介導所述轉化。此外，本發(fā)明的方法包括由轉基因植物細胞再生轉基因植株的步驟。對于由轉基因植物細胞再生轉基因植株的方法，可以使用相關領域熟知的方法。需要將轉基因植物細胞再生為整個植株。對于各種物種的通過愈合組織或原生質體的培養(yǎng)再生為成熟植株的技術是相關領域中熟知的(HandbookofPlantCellCulture(植物細胞培養(yǎng)手冊),Vol.1-5,1983-1989Momillan,N.Y.)。本發(fā)明中所用的Myb58基因是用于正調節(jié)參與類苯基丙烷生物合成途徑的基因的轉錄因子，預期已知具有相似功能的Myb63也預期在丁香苷合成的過程中具有協(xié)同效應。本發(fā)明還提供了通過上述每種方法產(chǎn)生的相比野生型具有提高的丁香苷生成的轉基因植物及其種子。對于本發(fā)明的一個實施方案的植物而言，所述植物可優(yōu)選為雙子葉植物，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草、茄子、辣椒、番茄、牛蒡、茼蒿、生菜、氣球花、菠菜、甜菜、山藥、芹菜、胡蘿卜、水芹菜、水香菜、中國白菜、甘藍、蘿卜(Raphanussativusfor.raphnistroidesMAK)、西瓜、東方甜瓜(orientalmelon)、黃瓜、西葫蘆、絲瓜、草莓、大豆、綠豆、蕓豆或甜豌豆。最優(yōu)選地，其可以是擬南芥，但并不限于此。本發(fā)明還提供了用于提高植物中丁香苷合成的組合物，其包含作為有效成分的重組載體，所述重組載體包含由SEQIDNO:1組成的編碼UGT72E3/2蛋白的基因。所述組合物包含作為有效成分的重組載體，所述重組載體包含由SEQIDNO:1組成的編碼UGT72E3/2蛋白的基因，并 且根據(jù)用所述重組載體轉化植物，可以提高植物中丁香苷的合成。下面，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明。然而，很顯然以下給出的實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，本發(fā)明并決不限于以下實施例。本發(fā)明所使用的基因和核苷酸序列的信息本發(fā)明所使用的基因和核苷酸序列的信息如下表1所述。[表1]基因名稱核苷酸序列編號氨基酸序列編號UGT72E3/212F5H34Myb5856Myb6378CHS910HCT1112實施例1.擬南芥糖基轉移酶UGT72E2和UGT72E3的一級結構和二級結構為了研發(fā)用于于植物中產(chǎn)生具有各種藥物應用的丁香苷的新的糖基轉移酶，通過使用SWISS-MODEL工作空間(圖1)，對具有非常優(yōu)異的糖基轉移酶效率但對丁香苷的前體松柏醇的底物特異性不佳的UGT72E2與對芥子醇具有非常優(yōu)異的底物特異性但糖基轉移酶效率低的UGT72E3蛋白之間進行一級結構與二級結構的對比。作為產(chǎn)生具有兩種酶的所有優(yōu)勢的新的重組糖基轉移酶的結構域交換的預備步驟，標記對糖基轉移酶活性很重要的含有PSPG基序的羧基末端與用于決定底物特異性的氨基末端的一級結構和二級結構的差異以及發(fā)生結構域交換的區(qū)域。實施例2.擬南芥糖基轉移酶UGT72E2和UGT72E3和新產(chǎn)生的重組糖基轉移酶UGT72E2/3和UGT72E3/2的三級結構從分別來自擬南芥和葡萄的糖基轉移酶UGT72B1和VvGT1(其三級結構已研究透徹)可見，糖基轉移酶一般具有用于決定底物特異性的區(qū)域(即糖受體)和用于決定糖基轉移酶活性的區(qū)域(即糖供體)，兩者在氨基末端結構域和羧基末端結構域之間的邊界的深且窄的缺口(gap)處彼此相鄰(圖2A和2B)。通過使用SWISS-MODEL工作空間，獲得UGT72E2、 UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2的預期三級結構(圖2C)。認為決定底物特異性的區(qū)域和決定糖基轉移酶活性的區(qū)域附近的結構變化，與糖基轉移酶UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2之間的底物特異性和糖基轉移酶活性的差異有關。實施例3.用于轉化體生產(chǎn)的重組載體、轉移到轉化體的基因的表達水平以及轉化體響應UV射線的表型本發(fā)明的發(fā)明人探討了，在擬南芥的100種糖基轉移酶中，糖基轉移酶UGT72E進化支的酶特征，已報道其具有將糖轉為作為丁香苷的前體的芥子醇或結構相似的松柏醇的能力。UGT72E進化支也具有與常見糖基轉移酶相似的結構特征。氨基末端結構域具有用于底物識別的區(qū)域，羧基末端具有用于將被UDP激活的糖轉化為底物的酶激活區(qū)域。特別是，據(jù)報道，羧基末端的PSPG(植物次級產(chǎn)物糖基轉移酶)基序對于來自植物的糖基轉移酶的活性很重要。UGT72E進化支包括具有相似核苷酸序列的糖基轉移酶UGT72E1、UGT72E2和UGT72E3。在本發(fā)明中，UGT72E2和UGT72E3的每個均分為包括編號1至編號344的氨基酸的氨基片段和包括從編號345至編號481的氨基酸的羧基片段。氨基片段包括用于決定底物識別特異性的區(qū)域，羧基末端包括對于糖基轉移酶的活性很重要的PSPG基序。為了在植物中有效生成丁香苷，底物特異性比糖基轉移酶的活性更重要。因此，，將大的氨基片段制備成包括全長的3/4，同時將羧基片段制備成包括PSPG基序的小片段，而不是具有精確的對切。通過將UGT72E2的包括氨基末端上的編號1至編號344的氨基酸的氨基片段與UGT72E3的包括編號345至羧基末端上的編號481的氨基酸的羧基片段連接，制備本發(fā)明所使用的重組UGT72E2/3基因。通過將UGT72E3的包括氨基末端上的編號1至編號344的氨基酸的氨基片段與UGT72E2的包括編號345至羧基末端上的編號481的氨基酸的羧基片段連接，制備重組UGT72E3/2基因。在本發(fā)明中，構建二元載體，使得從擬南芥分離出的UGT72E2和 UGT72E3與本發(fā)明新產(chǎn)生的重組的UGT72E2/3和UGT72E3/2基因的編碼區(qū)受CaMV35S啟動子和超級啟動子控制。將所得載體并入根瘤農桿菌EHA105中，然后使用植物內方法(inplantamethod)用細菌轉化擬南芥(圖3)。由于轉化體的表現(xiàn)型受引入的轉基因表達水平的顯著影響，因此基于RT-PCR，測定了在具有潮霉素抗性的擬南芥轉化體之中，由來自擬南芥的轉移酶基因UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2的穩(wěn)定引入所產(chǎn)生的表達量。為了特異性擴增所引入的基因，使用UGT72E基因特異性正向引物(5’GGTTGGAGCTCGACGTTGGAAAGCGTC3’；SEQIDNO:13)和對載體的3’UTR區(qū)有特異性的反向引物(5’TTAAAGCAGGGCATGCCTGC3’；SEQIDNO:14)的組合。為修正相對RNA量，使用總在恒定水平表達的來自擬南芥的肌動蛋白1基因，作為參照基因。在已測定的每個基因的15種轉化體中，最終鑒定出具有UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2的相似表達的轉化體系(圖3B)。根據(jù)葉中糖基轉移酶的活化的芥子醇向丁香苷的轉化，降低了葉中吸收UV射線的芥子酯(sinapylester)的生成。如此，當具有提高的糖基轉移酶活性的轉化體的葉暴露于UV射線時，大部分UV射線被葉綠素吸收，從而呈現(xiàn)很強的紅色。當芥子酯的生成正常發(fā)生在葉中時，被葉綠素吸收的UV射線的量降低，呈現(xiàn)很弱的紅色(圖3C)。實施例4.轉化體的葉中松柏苷和丁香苷生成的定量HPLC分析被子植物的葉中由類苯基丙烷合成途徑的活化產(chǎn)生的木質素單體主要作為松柏醇存在，其通過糖基轉移酶轉化為松柏苷。由于酶的作用，極小部分的松柏醇被轉化為作為丁香苷前體的芥子醇，并且由于酶活性低，被糖基轉移酶引起的向丁香苷的轉化率非常低。大部分芥子醇轉化為芥子酯，其具有通過吸收UV射線保護葉的活性。因此，對松柏醇具有高底物特異性的UGT72E2基因的表達提高了松柏苷的生成，對芥子醇具有高底物特異性的UGT72E3的超表達相對提高了丁香苷的生成(圖4A 和4B)。重組基因UGT72E3/2的超表達相比UGT72E3基因的超表達表現(xiàn)出植物中丁香苷的生成增加48.7％的效果(圖4B和4C)。實施例5.轉化體的根中松柏苷和丁香苷生成的定量HPLC分析與不斷暴露于光的葉不同，植物的根一旦暴露于光便顯示出參與基于信號轉導機制的類苯基丙烷合成途徑的各種基因的增強表達。結果，提高了包括大量松柏醇和芥子醇的木質素單體的合成。盡管松柏苷和丁香苷的生成(其在相同條件下栽培的野生型植株的葉中很難檢測到)明顯增加，但丁香苷的生成率仍很低，即僅是松柏苷的25％。此外，盡管在超表達具有高糖基轉移酶活性且對松柏醇具有強底物特異性的UGT72E2的轉化體的根中，松柏苷的生成增加了兩倍以上，但丁香苷生成卻沒有大的變化(圖5B和5C)。在超表達具有弱糖基轉移酶活性且對芥子醇具有強底物特異性的UGT72E3基因的轉化體的根中，松柏苷和丁香苷的生成與野生型幾乎在相同水平。然而，重組基因UGT72E3/2的超表達相比UGT72E3基因的超表達呈現(xiàn)出根中生成的丁香苷增加11.7％的效果(圖5B和5C)。實施例6.糖基轉移酶UGT72E3/2的核苷酸序列和氨基酸序列圖6示出了新的重組糖基轉移酶UGT72E3/2基因的核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的蛋白的氨基酸序列，其相比常規(guī)已知的糖基轉移酶UGT72E3顯示出糖基轉移酶活性提高了48.7％以上，同時保持對芥子醇的底物特異性。實施例7.從野生型和超表達糖基轉移酶UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2中的每個的轉基因擬南芥的葉中制備的蛋白提取物中存在的糖基轉移酶的活性的對比被子植物的葉中由類苯基丙烷合成途徑的激活而生成的大部分木質素單體作為松柏醇存在，并且其轉化為松柏苷，同時僅有極小部分通過F5H(阿魏酸5-羥化酶)、COMT(咖啡酸3-O-甲基轉移酶)和CAD的連續(xù)酶作用轉化為作為丁香苷前體的芥子醇。因此，作為底物的芥子醇的供應是決定丁香苷生成和糖基轉移酶活性的重要因素。為了比較糖基轉移酶的活性，將1mM松柏醇或芥子醇和5mMUDP-葡萄糖作為底物加入到從野生型和超表達糖基轉移酶UGT72E2、UGT72E3、UGT72E2/3和UGT72E3/2中的每個的轉基因擬南芥的葉中制備的蛋白提取物中。然后，使反應于22℃下發(fā)生60分鐘。之后，將甲醇(2x體積)加入反應溶液中，以結束反應，并通過使用HPLC，通過HPLC對反應前和反應后生成的松柏苷和丁香苷進行定量。如前面在體內條件下所證明的，重組糖基轉移酶UGT72E3/2對芥子醇具有高底物特異性和高糖基轉移酶活性。特別是，根據(jù)底物的添加，UGT72E3/2比其他糖基轉移酶呈現(xiàn)更好的丁香苷生成速度(圖7)。以上結果證明，也能夠基于代謝工程手段通過使用向超表達UGT72E3/2的轉化體中增加芥子醇供應的方法，在植物中以高效率生成丁香苷。實施例8.類苯基丙烷合成途徑和用于丁香苷合成的基因調節(jié)位點為了使用代謝工程手段向超表達重組糖基轉移酶UGT72E3/2有效供應作為丁香苷底物的芥子醇，利用了類苯基丙烷合成途徑的每個步驟和工作酶。具體而言，為了降低從丁香苷合成途徑到類黃酮途徑損失的香豆酰輔酶A的量，使用了缺少CHS(查爾酮合酶)基因的突變體。此外，為了提高向類苯基丙烷合成途徑引入香豆酰輔酶A，超表達HCT(羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶)基因，并降低松柏醛轉化為松柏醇的量，并且為了促進向芥子醇的轉化，采用了超表達F5H(阿魏酸5-羥化酶)基因的策略(圖8)。實施例9.超表達作為調控類苯基丙烷合成途徑的基因的HCT、F5H和Myb58的轉基因擬南芥的生產(chǎn)以及各基因的表達量的測定構建二元載體，使得擬南芥的HCT、F5H和Myb58的編碼區(qū)受超級啟動子調控。在向根瘤農桿菌EHA105引入載體后，通過植物內方法使用前述細菌進行擬南芥的轉化。那時，為了使通過使用潮霉素抗性選擇標記利用雜交育種和選擇方式產(chǎn)生的超表達UGT72E3/2的轉化體中具有HCT、F5H和Myb58的聚合累積(pyramidalaccumulation)，通過使用卡那 霉素(HCT和F5H)或除草劑(Myb58)抗性選擇標記制備各基因的擬南芥轉化體。由于轉化體的表型受引入的轉化基因表達水平的顯著影響，因此在已選擇的轉化體中，基于RT-PCR，測定了由穩(wěn)定引入HCT、F5H和Myb58基因所產(chǎn)生的表達量。為了特定擴增引入的基因，使用HCT基因特異性正向引物HCT-F(5'-CTGGTTACTTTGGGAATGTGATATTCAC-3'；SEQIDNO:15)、F5H基因特異性正向引物F5H-F(5'-CAGACGAGTTGAAGAATCCGACATCGAG-3'；SEQIDNO:16)和Myb58基因特異性正向引物Myb58-F(5'-CAGACGAGTTGAAGAATCCGACATCGAG-3'；SEQIDNO:17)的組合物。此外，使用了載體的對3’UTR區(qū)具有特異性的UTR-R(5’TTAAAGCAGGGCATGCCTGC3’；SEQIDNO:14)作為反向引物。為了校準RNA的相對量，使用總在恒定水平表達的擬南芥的肌動蛋白2基因作為參照基因。對每個基因檢測了10個轉化體，結果，最終獲得了具有優(yōu)良的HCT、F5H和Myb58表達的轉化體系(圖9)。同時，僅有一種CHS基因存在于擬南芥中，且當缺少該基因時，種皮顏色轉變?yōu)辄S色。基于這種表型差異，分離出純合轉化體。實施例10.轉化體的葉和根中松柏苷和丁香苷生成的定量HPLC分析通過類苯基丙烷合成途徑，被子植物產(chǎn)生以下三種木質素單體：即利用p-香豆醇產(chǎn)生的H木質素單體、利用松柏醇產(chǎn)生的G木質素單體和利用芥子醇產(chǎn)生的S木質素單體。然而，大部分木質素單體以G木質素單體的形式存在，并因此松柏醇的濃度在植物細胞中相對最高。糖基轉移酶UGT72E2的超表達使高濃度的松柏醇轉化為松柏苷。由于F5H和COMT(咖啡酸3-O-甲基轉移酶)的酶作用，使部分松柏醇轉化為芥子醇，因此植物細胞中作為丁香苷前體的芥子醇的濃度非常低。因此，為了在植物細胞中有效生成丁香苷，除了具有高效糖基轉移酶UGT72E3/2之外，還需要用于增加芥子醇的代謝工程方法。為了檢測糖基轉移酶UGT72E3/2與HCT、F5H和CHS基因之間的協(xié)同效應，進行轉化體的葉和根中生成的松柏苷和丁香苷的定量HPLC分析。具體是，產(chǎn)生了超表達調節(jié)類苯基丙烷合成途徑的重要步驟的HCT或F5H的轉化體，并使其與超表達高效糖基轉移酶UGT72E3/2的轉化體雜交。之后，在F2代分離超表達HCT和UGT72E3/2或F5H與UGT72E3/2的轉化體，并從下一代獲得純合株系。此外，為了防止作為類苯基丙烷合成途徑到類黃酮合成途徑的重要前體的p-香豆酰輔酶A的損失，使缺少負責p-香豆酰輔酶A向查爾酮轉化的CHS(查爾酮合酶)的突變體與超表達UGT72E3/2的轉化體進行雜交。在從F2代中分離出敲除CHS基因且超表達UGT72E3/2基因的株系后，從下一代確認純合株系。作為通過使用HPLC測定轉化體的葉和根中丁香苷合成效率的結果，發(fā)現(xiàn)相比僅超表達UGT72E3/2的轉化體，在超表達HCT，或超表達F5H但缺少CHS基因功能的植物的葉中丁香苷合成分別提高了17.3％、71.3％和64.6％(圖10)。然而，從植物的根來講，相比僅超表達UGT72E3/2基因的轉化體，僅具有UGT72E3/2和F5H的超表達的轉化體表現(xiàn)出略微提高的丁香苷合成(圖11)。實施例11.基于利用UGT72E3/2、F5H和Myb58基因的聚合的協(xié)同效應，轉化體的葉與根中丁香苷生成的定量HPLC分析對芥子醇具有高特異性的新的糖基轉移酶基因UGT72E3/2(其已通過酶工程方法研發(fā))和參與類苯基丙烷途徑中松柏醇向芥子醇的轉化的F5H基因的累積的超表達，表現(xiàn)出明顯提高丁香苷生成率的效果。同時，當暴露于光時，植物的根表現(xiàn)出參與基于光信號轉導機制的類苯基丙烷合成途徑的各種基因的提高的表達。結果，提高了包括大量松柏醇和芥子醇的木質素單體的合成，因此野生型植物根中丁香苷的合成量比葉高至少36倍。同時，超表達UGT72E3/2和F5H的轉化體的葉中丁香苷的生成量相比野生型的葉提高了16倍或以上。然而，相比轉化體的根中生成的丁香苷的量，其仍然低了至少4倍。與根不同，提高葉中生成的丁 香苷的優(yōu)勢在于，可在不破壞植物的情況下進行大量生產(chǎn)。因此，如暴露于光的根一樣，增加參與類苯基丙烷合成的各種基因的方法對于葉也是需要的。為了解決前述問題，在本發(fā)明中通過定量HPLC分析測定了轉化體的丁香苷生成量，丁香苷的生成基于使用糖基轉移酶UGT72E3/2基因、類苯基丙烷合成途徑的F5H基因和作為用于正調節(jié)與木質素合成途徑有關的基因的轉錄因子的Myb58基因的聚合的協(xié)同效應。為了確認使用Myb58基因的協(xié)同效應，產(chǎn)生了超表達擬南芥中作為用于正調節(jié)木質素合成途徑的特定轉錄因子的Myb58基因的轉化體。由于Myb58基因不能提高F5H基因的表達,在與超表達UGT72E3/2基因和F5H基因的轉化體雜交后,在F2代選擇超表達Myb58、UGT72E3/2和F5H三者的轉化體株系,并在下一代獲得純合株系。作為利用HPLC探討這些轉化體的葉和根中丁香苷合成效率的結果,已發(fā)現(xiàn)，在超表達UGT72E3/2、F5H和Myb58基因三者的轉化體的葉中，丁香苷的生成量相比超表達UGT72E3/2和F5H基因的轉化體提高了8倍，或者相比僅超表達UGT72E3/2基因的轉化體提高了10倍，因此表現(xiàn)出優(yōu)異的效果(圖12)?；谂c丁香苷生成有關的三種基因即UGT72E3/2、F5H和Myb58之間的協(xié)同效應，在葉中有效生成丁香苷的結果與在基因水平進行的分析結果相匹配。通過超表達Myb58并單獨地超表達不受Myb58調控的UGT72E3/2和F5H基因來增強與類苯基丙烷合成途徑有關的各種基因的表達，使得轉化體的葉中丁香苷的生成量明顯提高(圖14)。此外，結果表明，轉化體的葉中的丁香苷生成量相比根中的生成量提高了2倍或以上。因此，已確認，作為UGT72E3/2、F5H和Myb58基因超表達引起的協(xié)同效應，在根中丁香苷的生成最理想地降低大約2倍左右，同時在葉中明顯提高。因此，用上述方法獲得能夠大量生成丁香苷的轉基因植物。