本發(fā)明涉及魚(yú)用疫苗和海洋生物安全防范。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具備生物學(xué)屏障的遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)突變株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
為了實(shí)現(xiàn)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的養(yǎng)殖魚(yú)類病害日益嚴(yán)重的發(fā)展趨勢(shì)，世界糧農(nóng)組織結(jié)合發(fā)達(dá)國(guó)家漁業(yè)發(fā)展的成功經(jīng)驗(yàn)(OrmondeP.Fisheriesresources：trendsinproduction，utilizationandtrade.In：NomuraI(ed.).TheStateofWorldFisheryandAgriculture2002.Rome：FAOInformationDivision，2002，p3～p45)，倡導(dǎo)“系統(tǒng)管理途徑”(Systemmanagementapproaches，SMA)養(yǎng)殖模式預(yù)防各種病害的發(fā)生。這一措施中的一個(gè)主要內(nèi)容就是提倡以疫苗接種為代表的各種免疫防治技術(shù)的應(yīng)用。這些措施的采用將大大減少化學(xué)藥物的使用，既避免了對(duì)環(huán)境的污染，又增加了水產(chǎn)品的消費(fèi)安全性。作為符合環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的經(jīng)濟(jì)有效的疾病控制策略和手段，接種疫苗在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范中正成為世界各國(guó)研究和開(kāi)發(fā)的主要前沿和應(yīng)用領(lǐng)域。目前，接種疫苗因其安全性、可靠性和持久性，已成為世界范圍內(nèi)防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害發(fā)生及暴發(fā)的主要手段。疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)、抗病周期長(zhǎng)、可終身免疫、效果顯著和防治主動(dòng)的特點(diǎn)。以病原菌細(xì)胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗(Killvaccine)為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護(hù)力)的技術(shù)應(yīng)用缺陷，對(duì)于需要免疫成千上萬(wàn)數(shù)量的魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)極為不便，給藥成本往往不能被水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所承受。而且，對(duì)于病害發(fā)生嚴(yán)重的魚(yú)苗和幼魚(yú)則無(wú)法實(shí)施注射給藥，同時(shí)，對(duì)許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無(wú)效。這一切都給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來(lái)了阻礙。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)要求病害防治技術(shù)必須經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用實(shí)施方便。因此，疫苗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)除高效價(jià)的技術(shù)要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養(yǎng)殖業(yè)的承受能力。減(弱)毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價(jià)高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開(kāi)發(fā)廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護(hù)性)的新技術(shù)優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)前國(guó)際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。愛(ài)德華氏菌屬是導(dǎo)致養(yǎng)殖魚(yú)類細(xì)菌性疾病的一類常見(jiàn)的病原體，具體分為遲鈍(緩)愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)，鯰魚(yú)愛(ài)德華氏菌(E.ictaluri)和保科愛(ài)德華氏菌(E.hoshinae)。由它們引起的魚(yú)類出血性敗血癥統(tǒng)稱為愛(ài)德華氏菌病(edwardsiellosis)。該病傳播面積廣，無(wú)明顯季節(jié)性，感染率及死亡率高，危害的種類多，有鯉魚(yú)，羅非魚(yú)，鰻鱺，鯔魚(yú)，鮭魚(yú)，鱒魚(yú)，鲆鰈等大多數(shù)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚(yú)種。此外，遲鈍愛(ài)德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥(niǎo)類、哺乳類。值得注意的是，遲鈍愛(ài)德華氏菌還是一種重要的人畜共患病原菌，它是愛(ài)德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前，我國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類愛(ài)德華氏菌病病害比較嚴(yán)重的病原主要為遲鈍愛(ài)德華氏菌。美國(guó)專利有利用利福平篩選得到野生毒株的自然減毒突變體作為減毒活疫苗的報(bào)道(EvansJJ，Klesius，PHandShoemakerCA.ModifiedliveEdwardsiellatardavaccineforaquaticanimals，2006，UnitedStatesPatent7067122)。目前在我國(guó)尚無(wú)該病害的有效防治措施。目前，已經(jīng)鑒定的與遲鈍愛(ài)德華氏菌毒力相關(guān)的因子包括溶血素、幾丁質(zhì)酶、鐵載體、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞黏附因子、三型分泌系統(tǒng)(TTSS)及六型分泌系統(tǒng)(T6SS)(Edwardsiellatarda-Virulencemechanismsofanemerginggastroenteritispathogen，MicrobesandInfection，2012，14：26-34.)。此外，黏附至宿主細(xì)胞表面對(duì)于遲鈍愛(ài)德華氏菌感染具有重要貢獻(xiàn)，而其黏附由菌毛介導(dǎo)，表現(xiàn)為甘露糖不敏感或敏感型的血細(xì)胞凝集。近期完成的遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202全基因組測(cè)序工作為其毒力因子的鑒定提供了基因水平的研究基礎(chǔ)(GenomesequenceoftheversatilefishpathogenEdwardsiellatardaprovidesinsightsintoitsadaptationtobroadhostrangesandintracellularniches.PLoSONE2009，4(10)：e7646)。在對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202基因組注釋中發(fā)現(xiàn)，雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Twin-argininetranslocation，Tat)對(duì)33個(gè)假定的Tat系統(tǒng)底物以及他們的共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分泌具有重要作用。而愛(ài)德華氏菌屬的Tat系統(tǒng)在其生理適應(yīng)能力及毒力方面的作用還有待鑒定。目前在世界范圍內(nèi)還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出針對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌的疫苗，只有關(guān)于滅活的遲鈍愛(ài)德華氏菌以及亞單位疫苗的相關(guān)報(bào)道(DevelopmentofaneffectiveE.tardavaccineforculturedturbot(Scophthalmusmaxlmus)，F(xiàn)ish&ShellfishImmunology.2008，25：208-212)。而相關(guān)研究揭示esrB突變株作為針對(duì)愛(ài)德華氏菌病的減毒活疫苗的潛在應(yīng)用價(jià)值(AliveattenuatedEdwardsiellatardavaccine，CN200710015285.6；Constructionandcharacterizationofalive，attenuatedesrBmutantofEdwardsiellatardaanditspotentialasavaccineagainstthehaemorrhagicsepticaemiainturbot，Scophthamusmaxlmus(L.)，F(xiàn)ish&ShellfishImmunology，2007，23：521-530)。此外，研究亦發(fā)現(xiàn)遲鈍愛(ài)德華氏菌天然弱毒株ATCCl5947和E22，以及一株利福平抗性突變株TX5RM可作為減毒活疫苗候選株，通過(guò)口服、浸泡或注射給藥方式對(duì)牙鲆可以提供有效的免疫保護(hù)(AnalysisofthevaccinepotentialofanaturalavirulentEdwardsiellatardaisolate.Vaccine，2010，28：2716-2721；TheefficacyoffiveavirulentEdwardsiellatardastrainsinalivevaccineagainstEdwardsiellosisinJapaneseflounder，Paralichthysolivaceus.Fish&ShellfishImmunology，2010，29：687-693；IsolationandanalysisofthevaccinepotentialofanattenuatedEdwardsiellatardastrain.Vaccine，2010，28：6344-6350)。U.S.Pat.No.6,019,981展示了目前商業(yè)化的帶有標(biāo)記的抵抗鯰魚(yú)愛(ài)德華氏菌的疫苗(ModifiedliveEdwardsiellaictaluriagainstentericsepticemiainchannelcatfish.U.S.Pat.No.6,019,981，2000)。然而，這些疫苗會(huì)存在毒力回復(fù)突變的可能，而且上述疫苗都沒(méi)有考慮到環(huán)境和生物安全性。我們之前已經(jīng)在遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株的基礎(chǔ)上利用無(wú)標(biāo)記基因缺失突變的策略，構(gòu)建了兩株減毒活疫苗(遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株的無(wú)標(biāo)記基因缺失減毒突變株、相關(guān)制劑及其應(yīng)用，CN201010541646.2，2010；一種遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株的無(wú)標(biāo)記基因缺失減毒突變株、相關(guān)制劑及其應(yīng)用，ZL200910052707.6，2009)，它們都缺失了芳香族氨基酸合成酶AroC。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)可能是它們的減毒效果過(guò)于顯著致使其在宿主體內(nèi)很快被清除而不能產(chǎn)生更長(zhǎng)期的保護(hù)效果。在減毒活疫苗以及其他微生物轉(zhuǎn)基因(geneticallymodifiedorganisms，GMO)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用過(guò)程中，為了防止微生物逃逸至自然環(huán)境中需要開(kāi)發(fā)生物學(xué)屏障(Biologicalcontainment)。Molin等的發(fā)明(MolinS.R.，AnderssonP.K.，GerdesK.A.S.，KlemmP..Biologicalcontainment，1995，U.S.Pat.5,670,370；MolinS.R.，AnderssonP.K.，GerdesK.A.S.，KlemmP..Biologicalcontainment，1995，U.S.Pat.5,702,916)利用可控復(fù)制子基因ParB來(lái)提供生物學(xué)屏障。此外其他類型的毒素-抗毒素系統(tǒng)，例如裂解蛋白E，亦可用于生物學(xué)屏障的構(gòu)建(Guanetal.2011，Iron-regulatedlysisofrecombinantEscherichiacoliinhostreleasesprotectiveantigenandconfersbiologicalcontainment，InfectImmun，2011，79：2608-2618)。而上述生物限制系統(tǒng)均采用了復(fù)雜的調(diào)控回路，使得自殺元件的特異性和效率難以控制，同時(shí)使得自殺回路的突變率提升。而基于芳香族氨基酸合成酶(如AroA、AroC、AroD)、嘧啶合成酶(ThyA)、嘌呤合成酶(PurA和PurE)、天冬氨酸-b-半醛合成酶(Asd)等突變所形成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的生物學(xué)屏障則會(huì)產(chǎn)生基礎(chǔ)代謝方面的顯著影響。因此開(kāi)發(fā)一種安全有效、回復(fù)突變率低、對(duì)菌株自身基礎(chǔ)代謝影響甚微的生物學(xué)屏障就成為亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種以遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株為出發(fā)菌株，利用無(wú)標(biāo)記基因缺失突變策略構(gòu)建的具有生物學(xué)屏障、回復(fù)突變率低的突變株。該突變株具有海洋生物學(xué)屏障機(jī)制，即在低鹽環(huán)境(如魚(yú)體中)中能穩(wěn)定存在，而在高鹽環(huán)境下(如海水環(huán)境中)不穩(wěn)定并且死亡，易被海水環(huán)境清除，可以防止減毒活疫苗株在自然海水環(huán)境中的逸散，提高了減毒活疫苗株的環(huán)境和生物安全性。本發(fā)明實(shí)施例采用了遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株EIB202，該毒株從我國(guó)黃海海域養(yǎng)殖漁場(chǎng)內(nèi)爆發(fā)的愛(ài)德華氏菌病的病魚(yú)體內(nèi)分離得到，是一株強(qiáng)毒性的遲鈍愛(ài)德華氏菌菌株(EdwardsiellatardaEIB202，肖婧凡等，“IsolationandidentificationoffishpathogenEdwardsiellatardafrommaricultureinChina”，《AquacultureResearch》Vol.40，2009)，并且于2008年5月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC-M208068。具體地說(shuō)：本發(fā)明包括以下內(nèi)容：一種遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株，其特征在于其tatABCD基因失活因而不表達(dá)TatABCD蛋白。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株的tatABCD基因被缺失。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株是保藏號(hào)為CCTCCM2011338的遲鈍愛(ài)德華氏菌EIBAV11092701。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株還缺失了遲鈍愛(ài)德華氏菌內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株的特征還在于其eseBCD和escA基因失活因而不表達(dá)EseBCD和EscA蛋白，并且不含遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株的內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株的eseBCD和escA基因被缺失。實(shí)施方式之一中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株是保藏號(hào)為CCTCCM2011339的遲鈍愛(ài)德華氏菌EIBAV11092801。一種免疫組合物，包含本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株作為免疫原性組分。實(shí)施方式之一中，所述免疫組合物中所述遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株的濃度為103-109CFU/ml。本發(fā)明遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株用于制造抗魚(yú)類愛(ài)德華氏菌病的藥物的應(yīng)用。用本發(fā)明遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株防治魚(yú)類愛(ài)德華氏菌病的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于：1.提供了具備生物學(xué)屏障的遲鈍愛(ài)德華氏菌無(wú)標(biāo)記突變株，提高了在該系統(tǒng)基礎(chǔ)上所構(gòu)建的減毒株的生物安全性，防止其在海水環(huán)境中的逸散。2.本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華菌株減毒株相對(duì)于野生毒株毒力顯著降低，同時(shí)能提供有效的免疫保護(hù)，能夠有效地保護(hù)魚(yú)類免受愛(ài)德華氏菌毒株導(dǎo)致的遲鈍愛(ài)德華氏菌病的侵害，免疫效果顯著，對(duì)于所免疫的魚(yú)體具有非常好的遲鈍愛(ài)德華氏菌病的防治效果；3.本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華菌減毒株不攜帶任何抗生素抗性標(biāo)記、內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202和其它標(biāo)記，對(duì)環(huán)境不存在傳播抗生素抗性的潛在危險(xiǎn)；無(wú)任何外源性基因片段，毒力相關(guān)基因大片段缺失，毒力不可回復(fù)，在海水環(huán)境中很容易由于海水的高鹽度而被清除，極大消除向環(huán)境傳播大量毒性病原體的可能性，具有技術(shù)上的環(huán)境和產(chǎn)品生物安全性，有實(shí)際的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值；4.本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華菌減毒株遺傳背景清楚，易于區(qū)分疫苗株與野生株，便于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，提高疫苗的環(huán)境生物安全性和可控性；附圖說(shuō)明圖1：實(shí)施例中，OverlapPCR技術(shù)制備tatABCD缺失片段F1F2的圖解。圖2：實(shí)施例中，兩次同源重組構(gòu)建tatABCD基因缺失突變株的圖解。圖3：實(shí)施例中，利用cat基因(氯霉素抗性基因)和自殺質(zhì)粒篩選無(wú)內(nèi)源性質(zhì)粒方案的圖解。圖4A-C：遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株EIB202與tatABCD缺失株EIBAV11092701在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)狀況。圖5A-C：遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株EIB202及tatABCD缺失株EIBAV11092701在不同溫度(A.28℃；B.16℃；C.10℃)和不同鹽濃度的可培養(yǎng)狀況檢測(cè)。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施方式之一提供了一種遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株，其tatABCD基因失活因而不表達(dá)TatABCD蛋白。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，遲鈍愛(ài)德華氏菌的Tat系統(tǒng)缺損時(shí)，例如TatABCD蛋白缺失時(shí)，變得對(duì)鹽度敏感，具體表現(xiàn)為隨鹽濃度升高而出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，基于此形成了本發(fā)明的海洋環(huán)境生物學(xué)屏障。本發(fā)明的海洋環(huán)境生物學(xué)屏障表現(xiàn)為，突變株或基于該突變株的疫苗在魚(yú)類體內(nèi)低鹽度條件下正常生長(zhǎng)和繁殖，而在海水高鹽度環(huán)境下則生長(zhǎng)抑制，迅速衰敗和消亡，由此避免了基因逃逸等生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明在實(shí)施例中例舉了以基因缺失方式來(lái)使tatABCD基因失活，即制造了tatABCD基因缺失突變的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還可以用其它基因滅活技術(shù)，例如誘變、反義核酸和RNA干擾技術(shù)等，造成tatABCD基因缺失或Tat系統(tǒng)缺損，從而達(dá)到與本申請(qǐng)實(shí)施例所示相同或相當(dāng)?shù)男Ч?。作為?shí)施例之一，本發(fā)明提供了一種含有tatABCD基因缺失突變的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株，命名為EIBAV11092701，于2011年9月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)CCTCCM2011338。實(shí)施方式之一，本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華氏菌tatABCD基因缺失突變株不含內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒突變株，其tatABCD基因失活因而不表達(dá)TatABCD蛋白，其eseBCD和escA基因失活因而不表達(dá)EseBCD和EscA蛋白，并且不含遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株的內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，遲鈍愛(ài)德華氏菌的TTSS系統(tǒng)缺損例如EseBCD和EscA蛋白缺失且不含遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株的內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202時(shí)，其毒力顯著降低，但具有顯著的免疫保護(hù)作用，因此是適宜的減毒疫苗株原料。本發(fā)明在實(shí)施例中例舉了以基因缺失方式來(lái)使eseBCD和escA基因失活，即制造了eseBCD和escA基因缺失突變的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還可以用其它基因滅活技術(shù)，例如誘變、反義核酸和RNA干擾技術(shù)等等，造成EseBCD和EscA蛋白缺失或TTSS系統(tǒng)缺損，從而達(dá)到與本申請(qǐng)實(shí)施例所示相同或相當(dāng)?shù)男Ч?。作為?shí)施例之一，本發(fā)明提供了一種含有tatABCD，eseBCD和escA基因缺失突變并且不含遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株的內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202的遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒突變株，命名為EIBAV11092801，于2011年9月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)CCTCCM2011339。本發(fā)明的突變株可按照遲鈍愛(ài)德華氏菌常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)基可選用LB培養(yǎng)基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，可以補(bǔ)加NaCl至0.5％。本發(fā)明實(shí)施例之一選用了胰蛋白胨。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種免疫組合物，其中包含本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株作為免疫原性組分，優(yōu)選本發(fā)明的減毒突變株。本發(fā)明的免疫組合物還可以包含各種適宜的載體和免疫佐劑。所述載體例如水和生理鹽水。本發(fā)明實(shí)施例之一采用0.9％(9g/L)NaCl濃度的生理鹽水作為載體。所述免疫組合物的pH以生理pH，尤其是目標(biāo)魚(yú)類的體內(nèi)生理pH為宜，例如pH6-8，pH7-7.2。本發(fā)明免疫組合物的形式之一是即用組合物，其中作為免疫原性組分的本發(fā)明減毒突變株的濃度可以采用常規(guī)技術(shù)手段試驗(yàn)確定，也可參照本領(lǐng)域?qū)嵺`經(jīng)驗(yàn)來(lái)試驗(yàn)確定。例如，本發(fā)明的免疫組合物中，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒突變株濃度的數(shù)量級(jí)為103-109CFU/ml，或者103、104、105、106、107、108或109CFU/ml，或者以上所述任意兩兩構(gòu)成的區(qū)間，例如103-108CFU/ml。在一例浸泡液型組合物中，減毒突變株濃度的數(shù)量級(jí)為106-108CFU/ml。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種防治魚(yú)類愛(ài)德華氏菌病的方法，采用本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒突變株來(lái)免疫魚(yú)類?？梢詫⒈景l(fā)明的減毒突變株作為疫苗使用，也可以將其配置和合適的免疫組合物使用。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常規(guī)免疫方式均適用于本發(fā)明，例如注射和浸泡。適宜的使用濃度為103-109CFU/ml，或者103、104、105、106、107、108或109CFU/ml，或者以上所述任意兩兩構(gòu)成的區(qū)間，例如103-108CFU/ml。例如，注射免疫時(shí)，減毒突變株劑量的數(shù)量級(jí)為103CFU/g(體重)，例如5×103CFU/g。又例如，浸泡免疫時(shí)，減毒突變株濃度的數(shù)量級(jí)為106-108CFU/ml。實(shí)施例之一中，采用本發(fā)明減毒突變株的浸泡時(shí)間為15-120分鐘。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是采用本發(fā)明的遲鈍愛(ài)德華氏菌突變株，尤其是減毒突變株來(lái)制造抗魚(yú)類愛(ài)德華氏菌病的藥物，例如抗愛(ài)德華氏菌的魚(yú)用疫苗。實(shí)施例為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1無(wú)標(biāo)記基因缺失減毒突變株的構(gòu)建(一)tatABCD基因缺失菌株的構(gòu)建1)PCR擴(kuò)增獲得所需基因片段如圖1所示，以遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株EIB202(保藏編號(hào)CCTCC-M208068，保藏地點(diǎn)為武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年5月1日)的基因組為模版，利用下列擴(kuò)增引物：P1：GGAAGATCTCGTCTACAGCACAGCATGGA，SEQIDNO：1P2：GCTTCAGCCAATCCGAACCCAGAGTACGCA，SEQIDNO：2P3：GGGTTCGGATTGGCTGAAGCAGGTGACTGA，SEQIDNO：3P4：ACATGCATGCATCGCTGCTGTACGCCTCTT，SEQIDNO：4tatABCD-deF：CCTGTTCAATACCGCACGGCGTTTT，SEQIDNO：5tatABCD-deR：TGCGGCCATCCATCATATCGCTCGG，SEQIDNO：6首先分別用P1和P2、P3和P4擴(kuò)增獲得OverlapPCR所需的上游片段和下游片段F1，F(xiàn)2。采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒、按照說(shuō)明書(shū)指示回收目標(biāo)片段。利用OverlapPCR技術(shù)由模板F1和F2、引物P1和P4所獲得的tatABCD缺失片段F1F2。采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。2)構(gòu)建自殺工具質(zhì)粒將pDMK載體多克隆位點(diǎn)的BglII位點(diǎn)和SphI位點(diǎn)切開(kāi)后，將目的片段F1F2與切割后的質(zhì)粒用T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜。CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化EscherichiacoliSM10λpir，在氯霉素和卡那霉素平板上篩選得到轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒載體pDMKΔtatABCD的陽(yáng)性克隆。3)接合將攜帶有pDMKΔtatABCD質(zhì)粒的SM10λpir按體積比4比1的比率與野生菌株EIB202混合離心，去除上清液，用10微升新鮮LB培養(yǎng)基重懸沉淀。將0.22微米滅菌后的親水性濾膜平整鋪放在新鮮半固體LB培養(yǎng)基上，取出全部菌懸液點(diǎn)置于親水濾膜中央。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，用0.2M的MgCl2將親水性濾膜上的菌落洗脫，涂布于卡那霉素、多粘菌素雙重抗性平板。4)兩輪篩選獲得tatABCD基因缺失突變株克隆如圖2所示，自殺質(zhì)粒pDMKΔtatABCD根據(jù)同源重組原理插入到基因組上tatABCD基因簇中。利用卡那霉素、多粘菌素雙重抗性平板篩選，及以P1/P4為引物的PCR擴(kuò)增鑒定tatABCD基因插入了缺失了tatABCD的F1F2片段而失活的克隆。接著，在10％(w/v)的蔗糖LB半固體培養(yǎng)基平板上，利用pDMK上編碼的SacB蛋白可反向篩選獲得發(fā)生第二次同源重組的菌株。以引物tatABCD-deF/R通過(guò)PCR驗(yàn)證可獲得缺失突變菌株，其中一個(gè)克隆命名為EIBAV11092701，于2011年9月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)CCTCCM2011338。(二)tatABCD基因缺失及質(zhì)粒消除菌株的構(gòu)建1)如圖3所示，利用引物catA-P1(GGAAGATCTTCTTTACCAAGCACAT，SEQIDNO：7)，catA-P2(ACATGCATGCGCTCAGGTTAAATTAAAGGG，SEQIDNO：8)，以遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株EIB202中的質(zhì)粒pEIB202為模板，擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段CAT(編碼氯霉素抗性基因片段)。并按照(一)中所描述方法，連接構(gòu)建于pDMK上，獲得質(zhì)粒pDMKCATIII。2)通過(guò)(一)中所描述接合的方法，將質(zhì)粒pDMKCATIII從SM10λpir中接合轉(zhuǎn)移至上述獲得的EIBAV11092701受體菌株中。根據(jù)同源交換原理，質(zhì)粒pDMKCATIII插入到菌株EIBAV11092701中的內(nèi)源性質(zhì)粒pEIB202中對(duì)應(yīng)片段上，于41℃培養(yǎng)24小時(shí)后重新接種至不添加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次。利用SacB篩選標(biāo)記，在10％(w/v)的蔗糖LB平板上篩選獲得SacB陰性的菌株，利用引物C6-P1(CGGCAGCTTCAATAACCA，SEQIDNO：9)，C6-P2(GGAACTCCGTAACGTCGAA，SEQIDNO：10)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒抽提驗(yàn)證確定其為質(zhì)粒消除菌株ΔtatABCDΔplas。(三)減毒疫苗株EIBAV11092801的構(gòu)建在遲鈍愛(ài)德華氏菌ΔtatABCDΔplas基礎(chǔ)上構(gòu)建定向缺失eseBCD和escA基因的突變株，利用下列擴(kuò)增引物：P5：GGAAGATCTCGCCTTTCACACGTTACAGCAAGAG，SEQIDNO：11，P6：GCTGGGCATCCGATTAGCCACCTGCTGGGA，SEQIDNO：12，P7：CAGGTGGCTAATCGGATGCCCAGCAAAAGA，SEQIDNO：13，P8：ACATGCATGCCCTGCGACTGACGCGACATGTCATT，SEQIDNO：14.TTSS-deF：CCTGTTCAATACCGCACGGCGTTTT，SEQIDNO：15，TTSS-deR：TGCGGCCATCCATCATATCGCTCGG，SEQIDNO：16。首先分別用P5和P6、P7和P8擴(kuò)增獲得OverlapPCR所需的上游片段和下游片段F3，F(xiàn)4?；厥崭髌魏螅肙verlapPCR技術(shù)與引物P5和P8一起反應(yīng)獲得TTSS缺失片段F3F4。并按照(一)中所描述，連接構(gòu)建于pDMK上，獲得質(zhì)粒pDMKΔTTSS。將攜帶有pDMKΔTTSS質(zhì)粒的SM10λpir按體積比4比1的比率和遲鈍愛(ài)德華氏菌ΔtatABCDΔplas混合離心，按照(一)中所描述，利用卡那霉素、多粘菌素雙重抗性平板篩選，及以P5/P8為引物的PCR擴(kuò)增可鑒定獲得TTSS基因因插入F3F4而失活的克隆。隨后在10％蔗糖LB半固體培養(yǎng)基平板上，利用pDMK上編碼SacB可反向篩選獲得發(fā)生第二次同源重組的菌株。以引物TTSS-deF/TTSS-deR通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得的缺失突變菌株，其中一個(gè)克隆命名為EIBAV11092801。于2011年9月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)CCTCCM2011339。(四)tatABCD+回補(bǔ)株的構(gòu)建在ΔtatABCD突變株的基礎(chǔ)上，利用引物tatABCD-comF(CCGGAATTCGCTGGGTGCCGCCGGATACCAATG，SEQIDNO：17)和引物tatABCD-comR(ACGCGTCGACTCGCGGAACGGACCGTAGTAGCAAG，SEQIDNO：18)，以E.tardaEIB202(CCTCCM208068)基因組為模板擴(kuò)增含有tatABCD基因啟動(dòng)子區(qū)域及其完整開(kāi)放閱讀框的基因序列，隨后對(duì)該目的片段進(jìn)行測(cè)序分析。將此片段與回補(bǔ)質(zhì)粒pMMBK通過(guò)EcoRI和SalI雙酶切后用T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化EscherichiacoliSM10λpir，在氯霉素和卡那霉素平板上篩選得到轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒載體pMMBKtatABCD(該質(zhì)粒含tatABCD片段)的陽(yáng)性克隆。通過(guò)(一)中所描述接合的方法，將質(zhì)粒pMMBKtatABCD從SM10λpir中接合轉(zhuǎn)移至上述獲得的ΔtatABCDΔplas受體菌株中。利用卡那霉素、多粘菌素雙重抗性平板篩選，及以pMMB206-F(CCCCAGGCTTTACACTT，SEQIDNO：19)和pMMB206-R(GCTTCTGCGTTCTGATTT，SEQIDNO：20)為引物的PCR擴(kuò)增鑒定獲得的回補(bǔ)菌株，將所得回補(bǔ)株克隆命名為tatABCD+。實(shí)施例2減毒活疫苗的制備(一)培養(yǎng)基與生理鹽水配制：1)LB斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，瓊脂18g/L，pH7.5；2)種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，pH7.5；3)發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，pH6.8；4)生理鹽水：NaCl9g/L，pH7.2，121℃滅菌20分鐘。(二)疫苗組合物的制備：取一接種環(huán)保存于LB斜面培養(yǎng)基上的減毒疫苗株EIBAV11092801種子，接種于裝有100ml液體LB種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶，在28℃下振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘)。12小時(shí)后，取5ml生長(zhǎng)旺盛的菌液(OD600＝4.0左右)接種于100ml新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12小時(shí)。用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，離心收獲菌體(2000×g，15分鐘，15℃)，無(wú)菌生理鹽水稀釋成一定濃度懸液(102～109CFU/ml)，由此制得含有弱毒株EIBAV11092801作為活疫苗的免疫組合物，保藏于15℃?zhèn)溆谩?shí)施例3：遲鈍愛(ài)德華氏菌菌株EIBAV11092701的應(yīng)激及毒力檢測(cè)(一)EIBAV11092701滲透壓應(yīng)激檢測(cè)將野生株(EIB202)、tatABCD基因缺失突變株EIBAV11092701(ΔtatABCD)和回補(bǔ)株(tatABCD+)過(guò)夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)液稀釋到OD600＝1.0，然后按照1％的接種量接種至含有不同NaCl濃度(1.5％、3.0％和3.5％，百分比按g/100ml計(jì))的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定各菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)狀況來(lái)檢測(cè)EIBAV11092701滲透壓應(yīng)激能力(圖4)。結(jié)果顯示，遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株和EIBAV11092701菌株在低鹽(1.5％NaCl)條件下的生長(zhǎng)特征沒(méi)有差異，而在高鹽濃度下(3.0％和3.5％NaCl)，雖然遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株在穩(wěn)定期的菌體濃度相較于低鹽情況有所下降，但是未出現(xiàn)生長(zhǎng)延滯的現(xiàn)象；而EIBAV11092701菌株的生長(zhǎng)則出現(xiàn)明顯的延滯，生長(zhǎng)速率和最終的菌體濃度顯著下降，而且其生長(zhǎng)受抑制的程度隨著NaCl濃度的提高而增強(qiáng)?？梢?jiàn)，Tat系統(tǒng)對(duì)于遲鈍愛(ài)德華氏菌在高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)具有重要的作用。(二)EIBAV11092701在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)維持狀況上面的結(jié)果顯示EIBAV11092701在高鹽濃度下相較于遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株的菌體濃度顯著下降。為了弄清其生長(zhǎng)抑制是否是由于菌體在高鹽濃度下的裂解等不可培養(yǎng)因素所引起，進(jìn)一步檢測(cè)了野生株和突變株在不同鹽濃度下可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目。將過(guò)夜培養(yǎng)的野生株(EIB202)和突變株EIBAV11092701(ΔtatABCD)分別接種至50ml含有不同鹽濃度(2.5％、3％、3.5％、4％NaCl)的人工海水中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，每隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，進(jìn)行一定的濃度梯度稀釋后取100μl樣品涂布至LB固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(圖5A)。當(dāng)平板上菌落數(shù)少于1時(shí)認(rèn)定為不可培養(yǎng)的。結(jié)果顯示，在28℃培養(yǎng)溫度條件下，在所檢測(cè)的鹽濃度范圍內(nèi)EIBAV11092701菌株均出現(xiàn)生長(zhǎng)受損的現(xiàn)象，其可培養(yǎng)菌落數(shù)目明顯低于野生株，且下降速度明顯更快。此外，EIBAV11092701菌株在所檢測(cè)的鹽濃度條件下維持時(shí)間相對(duì)野生毒株減少了3-5天?？梢?jiàn)，Tat系統(tǒng)對(duì)于遲鈍愛(ài)德華氏菌在高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)具有重要的作用。(三)EIBAV11092701在不同溫度和不同鹽度下的生長(zhǎng)維持狀況由于海水環(huán)境在不同的季節(jié)不僅在鹽濃度上有一定范圍的波動(dòng)，其水體溫度也會(huì)發(fā)生一定的改變，因此進(jìn)一步檢測(cè)了遲鈍愛(ài)德華氏菌株在上述鹽濃度范圍并且在不同溫度條件培養(yǎng)下的生長(zhǎng)狀況。分別選取了16℃和10℃，檢測(cè)了野生株和Tat突變株的生長(zhǎng)狀況(圖5B和C)。結(jié)果顯示野生株和EIBAV11092701在檢測(cè)溫度16℃和10℃下的鹽度生長(zhǎng)受限情況與28℃時(shí)的情況基本一致。然而EIBAV11092701相較于野生毒株其生長(zhǎng)受限的程度更為明顯。例如，10℃時(shí)，突變株EIBAV11092701在檢測(cè)鹽濃度范圍(2.5％、3％、3.5％、4％NaCl)下的維持時(shí)間比野生株EIB202縮短4-13天。這些結(jié)果表明Tat系統(tǒng)在高鹽應(yīng)激方面扮演重要角色，可以利用Tat缺陷株在低鹽環(huán)境(如魚(yú)體中)能夠穩(wěn)定存在而在高鹽環(huán)境(海水環(huán)境中)不能穩(wěn)定存在的鹽度限制特性構(gòu)建適用于海水環(huán)境的生物學(xué)屏障的減毒活疫苗，由此提高減毒活疫苗的環(huán)境生物安全性。(四)EIBAV11092701的致病力檢測(cè)進(jìn)一步用健康大菱鲆考察EIBAV11092701菌株的致病力，檢測(cè)指標(biāo)為半致死劑量LD50。試驗(yàn)用魚(yú)先置于潔凈水槽適應(yīng)養(yǎng)殖1周，以剔出不正常個(gè)體。在感染試驗(yàn)前，再將健康試驗(yàn)用魚(yú)養(yǎng)殖于10L感染試驗(yàn)水槽，繼續(xù)喂養(yǎng)1周，每槽養(yǎng)殖10尾(平均體長(zhǎng)11～12em，體重30g)。試驗(yàn)水槽每天使用無(wú)菌海水替換2/3體積養(yǎng)殖水，水溫16℃，上下波動(dòng)2℃。于12000g離心收集各菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物，然后用生理鹽水洗滌3次以除去殘留的培養(yǎng)基，將菌體用生理鹽水進(jìn)行重懸，同時(shí)將密度梯度調(diào)整至102、103、104、105、106、107、108和109CFU/ml，并采用平板計(jì)數(shù)的方式計(jì)算菌液中菌體的數(shù)量。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組，每組3個(gè)平行水槽，每槽10尾，實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS-222溶液(80mg/L)進(jìn)行麻醉，采用背部肌肉注射的方式進(jìn)行人工感染，每組按照101、102、103、104、105、106、107和108CFU/尾注射動(dòng)物。對(duì)照組則以同樣的方式注射同樣劑量生理鹽水。注射完成后，將感染后的試驗(yàn)動(dòng)物正常飼養(yǎng)，觀察15天內(nèi)魚(yú)體的感染情況，記錄每天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用過(guò)量的MS-222溶液(200mg/L)殺死實(shí)驗(yàn)用魚(yú)。用Reed-Muench法計(jì)算各菌株的半致死劑量(LD50)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重?fù)Q算成CFU/g體重(見(jiàn)表1)。其計(jì)算公式如下：LD50＝10[Xm-i(∑P-0.5)]其中：Xm：最大劑量的對(duì)數(shù)值i：相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差P：各組動(dòng)物死亡率，用小數(shù)表示(如死亡率為80％應(yīng)寫(xiě)成0.8)∑P：各組動(dòng)物死亡率之總和表1.遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株和突變株EIBAV11092701對(duì)大菱鲆的半致死劑量LD50菌株LD50(CFU/g)EIB2024.75×102EIBAV110927012.5×103結(jié)果顯示EIBAV11092701在以大菱鲆為動(dòng)物模型時(shí)，其毒力低于遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株EIB202，適于作為構(gòu)建減毒疫苗的出發(fā)菌株。實(shí)施例4：遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒株EIBAV11092801的致病力及免疫保護(hù)率評(píng)價(jià)(一)以大菱鲆為試驗(yàn)動(dòng)物的注射給藥毒力測(cè)試用健康大菱鲆考察EIBAV11092801菌株的致病力，檢測(cè)指標(biāo)為半致死劑量LD50。試驗(yàn)用魚(yú)先置于潔凈水槽適應(yīng)養(yǎng)殖1周，以剔出不正常個(gè)體。在感染試驗(yàn)前，再將健康試驗(yàn)用魚(yú)養(yǎng)殖于10L感染試驗(yàn)水槽，繼續(xù)喂養(yǎng)1周，每槽養(yǎng)殖10尾(平均體長(zhǎng)11～12cm，體重30g)。試驗(yàn)水槽每天使用無(wú)菌海水替換2/3體積養(yǎng)殖水，水溫16℃，上下波動(dòng)2℃。于12000g離心收集各菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物，然后用生理鹽水洗滌3次以除去殘留的培養(yǎng)基，將菌體用生理鹽水進(jìn)行重懸，同時(shí)將密度梯度調(diào)整至103、104、105、106、107、108、109和1010CFU/ml，并采用平板計(jì)數(shù)的方式計(jì)算菌液中菌體的數(shù)量。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組，每組3個(gè)平行水槽，每槽10尾，采用背部肌肉注射的方式進(jìn)行人工感染，每組按照102、103、104、105、106、107、108和109CFU/尾注射動(dòng)物。對(duì)照組則以同樣的方式注射同樣劑量生理鹽水。注射完成后，將感染后的試驗(yàn)動(dòng)物正常飼養(yǎng)，觀察15天內(nèi)魚(yú)體的感染情況，記錄每天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算各菌株的半致死劑量(LD50)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重?fù)Q算成CFU/g體重(見(jiàn)表2)。表2.遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株和減毒株EIBAV11092801對(duì)大菱鲆的半致死劑量LD50菌株LD50(CFU/g)EIB2024.75×102EIBAV11092801高于5.0×108結(jié)果顯示EIBAV11092801的毒力顯著低于野生毒株EIB202，在所檢測(cè)的感染劑量范圍內(nèi)所引起的死亡數(shù)均未達(dá)到50％，減毒效果非常明顯。(二)以大菱鲆為試驗(yàn)動(dòng)物的注射給藥免疫保護(hù)試驗(yàn)以5×103CFU/g劑量腹腔注射免疫健康大菱鲆，試驗(yàn)所用大菱鲆隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)平行水槽，44尾/槽。將制備的減毒活疫苗采用腹腔注射方式免疫。免疫期為一個(gè)月，每天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康狀況，見(jiàn)表3。在免疫1個(gè)月后，將EIB202以1×102CFU/g劑量對(duì)免疫動(dòng)物進(jìn)行背部肌肉注射方式攻毒，連續(xù)考察3周，統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率并計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)力(表3)。其中，按下列公式計(jì)算免疫保護(hù)率：相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)％＝(對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率％)/對(duì)照組死亡率×100％。表3.遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒株EIBAV11092801的免疫保護(hù)率評(píng)價(jià)由表3的結(jié)果可知用EIBAV11092801減毒株具有較好的免疫保護(hù)力，相對(duì)免疫保護(hù)率RPS在80％以上，可以有效地抵抗遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株的感染。(三)以大菱鲆為試驗(yàn)動(dòng)物的浸泡給藥免疫保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)一步考察了EIBAV11092801減毒株以浸泡給藥方式的免疫保護(hù)效率。將試驗(yàn)大菱鲆隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)平行水槽，40尾/槽。浸泡免疫是將制備好的疫苗原液用無(wú)菌海水稀釋成106CFU/ml或108CFU/ml，放入浸泡用無(wú)菌空水槽至10L，然后將各組試驗(yàn)大菱鲆依次浸泡處理，浸泡時(shí)間控制在15-120分鐘之間。對(duì)照組不做任何處理。免疫4周后將各組免疫大菱鲆用遲鈍愛(ài)德華氏菌野生毒株活菌(背部肌肉注射感染1×102CFU/g)進(jìn)行人工感染攻毒。在3周內(nèi)觀察統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和免疫組死亡數(shù)，計(jì)算每組的免疫保護(hù)率(見(jiàn)表4)。表4.遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒株EIBAV11092801浸泡免疫的免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)從上述數(shù)據(jù)可以看出，該減毒疫苗具有良好的抗遲鈍愛(ài)德華氏菌感染防治效果，注射免疫4周后的免疫保護(hù)率高于50％，而沒(méi)有接種疫苗的大菱鲆死亡率接近100％。浸泡給藥劑量在106-108CFU/ml范圍內(nèi)表現(xiàn)十分穩(wěn)定的給藥安全性。和注射給藥效果相比，浸泡免疫表現(xiàn)出基本一致的良好免疫效果，說(shuō)明本發(fā)明疫苗可方便地通過(guò)浸泡給藥方式獲得高免疫保護(hù)率。實(shí)施例5：遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒株EIBAV11092801在不同鹽濃度下的維持狀況檢測(cè)為了檢測(cè)EIBAV11092801在不同鹽濃度下可培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，將過(guò)夜培養(yǎng)的遲鈍愛(ài)德華氏菌減毒株EIBAV11092801接種至50ml新鮮的含有不同鹽濃度(2.5％、3.5％和4％NaCl)人工海水中進(jìn)行培養(yǎng)。然后將100μl樣品涂布至LB平板培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)48小時(shí)。當(dāng)平板上長(zhǎng)出的菌落少于1個(gè)時(shí)認(rèn)定為不可培養(yǎng)的。結(jié)果表明，8-9天后，在海水環(huán)境(2.5％以上鹽濃度)中檢測(cè)不到EIBAV11092801菌落。綜上，本發(fā)明的減毒活疫苗株在養(yǎng)殖魚(yú)類模型上具有非常良好的抗遲鈍愛(ài)德華氏菌免疫保護(hù)效果，同時(shí)消除了傳統(tǒng)減毒活疫苗普遍存在的潛在環(huán)境和產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)，是一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的疫苗。以上，通過(guò)實(shí)施例示例性的講解了本發(fā)明的實(shí)施方式。很顯然，在此基礎(chǔ)上可以作出各種修改和變換，這些修改后變換明顯符合本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。