用于高效乳酸生產(chǎn)的材料和方法本申請是申請日2006年8月10日、標(biāo)題為“用于高效乳酸生產(chǎn)的材料和方法”申請?zhí)?00610109332.9的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2005年8月10日提交的美國臨時(shí)申請系列號第60/706,887號、2006年1月24日提交的系列第60/761,576號、以及2006年5月11日提交的系列號第60/799,619號的權(quán)益。政府支持本發(fā)明是在政府的支持下完成的，其由能源部資金支持，批準(zhǔn)號為USDOE-DEFG02-96ER20222；以及由能源部聯(lián)合美國農(nóng)業(yè)部資金支持，批準(zhǔn)號為USDA&DOEBiomassRDIDEFG36-04GO14019。本發(fā)明還得到來自美國農(nóng)業(yè)部的政府支持，批準(zhǔn)號為01-35504-10669和00-52104-9704。政府對本發(fā)明具有一些權(quán)利。

背景技術(shù)：
乳酸通常用作用于保存、增加風(fēng)味和酸味的食品添加劑。乳酸還用于制造可生物降解塑料，即聚乳酸(PLA)。PLA作為石油基產(chǎn)品的可更新替代品的應(yīng)用迅速擴(kuò)大(Agrawal,2003)。PLA的物理性能和生物降解速率可通過調(diào)整手性底物(D-乳酸和L-乳酸)的比率加以控制(Narayananetal.,2004)。估計(jì)每年全球乳酸市場超過100,000噸，并且有望在接下來的幾年內(nèi)隨著新的PLA設(shè)備投入運(yùn)行會(huì)有顯著增長。例如，對可生物降解的溶劑乳酸乙酯(一種乳酸衍生物)的需求有望在近年內(nèi)有顯著增長。據(jù)估計(jì)，乳酸酯有可能代替美國每年使用的380萬噸溶劑的80%。這種溶劑無毒并且具有許多有益的應(yīng)用，包括用于電子制造、油漆和涂料、紡織品、清潔劑和脫脂劑、粘合劑、印刷、以及脫墨。生產(chǎn)乳酸時(shí)，人們常常優(yōu)選發(fā)酵方法而非化學(xué)合成，因?yàn)槠涞玫降氖荄和L異構(gòu)體的混合物。微生物發(fā)酵的產(chǎn)物依賴于所使用的有機(jī)體。微生物發(fā)酵可產(chǎn)生兩種異構(gòu)體的混合物或者立體專一形式的光學(xué)純?nèi)樗?。希望的產(chǎn)物的立體專一性依賴于其計(jì)劃的用途。采用乳酸桿菌(Lactobacilli)的細(xì)菌發(fā)酵通常用于乳酸的工業(yè)生產(chǎn)，但是這些發(fā)酵很少產(chǎn)生光學(xué)純產(chǎn)物。另外，這些細(xì)菌需要復(fù)雜營養(yǎng)的性質(zhì)要求將相當(dāng)大量的補(bǔ)充營養(yǎng)素添加到生長培養(yǎng)基，增加了額外費(fèi)用并且使純化更加困難。此外，用于生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵方法效率嚴(yán)重不足，必須加以改進(jìn)以確保上述預(yù)期市場擴(kuò)張的經(jīng)濟(jì)可行性。盡管描述過重組釀酒酵母菌(Saccharmycescerevisiae)菌株含有來自乳酸桿菌或者牛源(bovineorigins)乳酸脫氫酶(ldh)基因(PatentWO99/14335andAdachietal.,1998)，但是酵母菌不能生產(chǎn)可觀水平的乳酸。雖然能夠生產(chǎn)達(dá)2-4%(w/v)的乳酸，但是這些菌株顯示出較差的生產(chǎn)能力并且相當(dāng)一部分葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇。絲狀真菌米根霉(Rhizopusoryzae)(也稱作少根霉(R.arrhizus))也用于乳酸的工業(yè)生產(chǎn)。米根霉能夠在化學(xué)成分確知的培養(yǎng)基(chemicallydefinedmedium)中將葡萄糖有氧地(aerobically)轉(zhuǎn)化為大量的光學(xué)純L-(+)-乳酸。之所以持續(xù)研究通過根霉的乳酸生產(chǎn)，主要是因?yàn)樵诨旧L培養(yǎng)基中容易進(jìn)行產(chǎn)物純化以及真菌利用復(fù)合碳水化合物和戊糖的能力(美國專利第4,963,486號)。這使得可利用真菌將低價(jià)值的農(nóng)業(yè)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸。遺憾的是，通過對根霉和其它真菌的遺傳修飾來改變?nèi)樗嵘a(chǎn)的能力比較有限?；诖竽c桿菌K-12的生物催化劑已經(jīng)被改造用于D-(-)-乳酸(鹽)(lactate)生產(chǎn)，但是不能將復(fù)合或基本培養(yǎng)基中10%的葡萄糖或蔗糖發(fā)酵完全(Changetal.,1999;Dienetal.,2001;Zhouetal.,2003;ZhuandShimizu2004)。人們開發(fā)了一種大腸桿菌生物催化劑，即SZ63(pLOI3501)，其通過在質(zhì)粒上功能化地表達(dá)來自大腸桿菌B的cscR’cscA’cscKB’基因而用于蔗糖發(fā)酵(Shuklaetal.2004)。盡管能夠有效地發(fā)酵5%的葡萄糖或蔗糖，但是這種生物催化劑不能徹底代謝更高的糖濃度并且為了質(zhì)粒的維持需要連續(xù)進(jìn)行抗生素選擇。由大腸桿菌菌株B衍生的其他生物催化劑，如KO11(保藏編號：ATCC55124)，具有天生的發(fā)酵蔗糖的能力(Moniruzzamanetal.,1997)。同菌株SZ63一樣，這種生物催化劑不能完全地代謝更高糖濃度并且為了質(zhì)粒的維持需要連續(xù)進(jìn)行抗生素選擇。因此，為了減少與大量生產(chǎn)型化學(xué)品的基于生物生產(chǎn)相關(guān)的費(fèi)用，對于具有增加發(fā)酵速度、產(chǎn)物效價(jià)和產(chǎn)率的改進(jìn)的乳酸生物催化劑仍然存在需求(Arntzenetal.,1999;Chotanietal.,2000;Dattaetal.,1995;HofvendahlandHahn-Hagerdal,2000;andOharaetal.,2001)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本主題發(fā)明提供了在乳酸生產(chǎn)中非常有用的新型微生物。另外，本主題發(fā)明還提供了新型構(gòu)建體，用于轉(zhuǎn)化大量寄主生物中的任何一種，優(yōu)選大腸桿菌，使該寄主生物在可發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)和(或)抑制一些基因，從而產(chǎn)生乳酸。因此，本主題發(fā)明的材料和方法可用來提高寄主生物中的乳酸生產(chǎn)，從而增加用于食品和工業(yè)應(yīng)用中的乳酸供應(yīng)。在一些具體實(shí)施方式中，構(gòu)建了產(chǎn)乙醇(ethanologenic)的大腸桿菌(本文中也稱為大腸桿菌E.coli)KO11的衍生物用于D-(-)-乳酸(鹽)(lactate)的生產(chǎn)。在本發(fā)明的另外的具體實(shí)施方式中，E.coli根據(jù)本主題發(fā)明進(jìn)行改造，用于L-(+)-乳酸(鹽)的生產(chǎn)。根據(jù)本主題發(fā)明，通過去掉編碼競爭途徑的基因接著通過基于生長選擇發(fā)酵葡萄糖和(或)蔗糖的性能改善的突變體，可以制得基于E.coliKO11的新型生物催化劑。本發(fā)明改造的微生物優(yōu)選含有利用蔗糖的天然基因。本發(fā)明的一些改造的E.coli菌株可發(fā)酵10%的葡萄糖或蔗糖，而生產(chǎn)超過1摩爾D-(-)-乳酸鹽/l的發(fā)酵液，根據(jù)發(fā)酵液的不同，基于代謝的糖的產(chǎn)率在約88%到約95%的范圍內(nèi)。本發(fā)明的其他改造的E.coli菌株可發(fā)酵葡萄糖或蔗糖而生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽。本發(fā)明其他的優(yōu)點(diǎn)根據(jù)隨后的描述將變得顯而易見。附圖說明圖1A-1F用圖示闡明了本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式與菌株SZ63相比之間活性的差異。圖2A-2D圖解闡明了發(fā)酵條件下在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中通過本發(fā)明各種具體實(shí)施方式的乳酸生產(chǎn)進(jìn)程(圖2A：10%葡萄糖(NBS，SZ132)；+和-1mM甜菜堿；圖2B：10%蔗糖(NBS，SZ132)；+和-1mM甜菜堿；圖2C：SZ186NBS10%葡萄糖；+和-1mM甜菜堿；圖2D：SZ186NBS10%蔗糖；+和-1mM甜菜堿；SZ186是改進(jìn)的菌株，更純凈的產(chǎn)物，更高的產(chǎn)率。)。圖3A-3B圖解闡明了通過本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式的乳酸生產(chǎn)過程中甜菜堿增加耐酸性和耐糖性的能力(圖3A：甜菜堿增強(qiáng)乳酸鹽耐性；圖3B：甜菜堿增強(qiáng)葡萄糖耐性；甜菜堿增加耐酸性和耐糖性)。圖4A-4B圖解闡明了本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式適應(yīng)無機(jī)培養(yǎng)液(mineralmedia)的能力(圖4A：細(xì)胞生長(OD550nm)；圖4B：生產(chǎn)的乳酸鹽。SZ186對無機(jī)(鹽)培養(yǎng)基的適應(yīng)，得到菌株SZ194。)。圖5A-5G圖解闡明了通過本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式在各種發(fā)酵條件下乳酸生產(chǎn)的進(jìn)程(圖5A：SZ194在含10%葡萄糖的NBS(1mM甜菜堿)中的發(fā)酵；SZ194比SZ186快；圖5B：LB10%葡萄糖(SZ194)；圖5C：LB10%葡萄糖(SZ194)。pH7.5和pH8.0優(yōu)于pH6.5和pH6.0。圖5D：SZ194NBS葡萄糖10-14%(乳酸鹽)；圖5E：SZ194NBS葡萄糖10-14%(OD)；高于10%糖，培養(yǎng)物較慢地復(fù)制(takeoff)。圖5F：分批(大腸桿菌SZ194NBS12%葡萄糖)；圖5G：補(bǔ)料分批(大腸桿菌SZ194NBS12%葡萄糖)；補(bǔ)料分批有助于改進(jìn)速率，72-96h后培養(yǎng)液中>1M乳酸鹽)。圖6圖解闡明了SZ132在10%蔗糖(pH7.0)中用于改善生長以及乳酸鹽生產(chǎn)的代謝演化。將菌株SZ132在含有10%(w/v)蔗糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以富集那些在沒有甜菜堿時(shí)生長和乳酸鹽生產(chǎn)改善的自然突變體?？寺◇wSZ136從最后的轉(zhuǎn)移中分離出來。圖6A示出了細(xì)胞量(cellmass)。圖6B示出了總有機(jī)酸(堿消耗)。圖7圖解闡明了SZ186在10%葡萄糖(pH7.0)中用于改善生長和乳酸鹽生產(chǎn)的代謝演化。將菌株SZ186在含有10%(w/v)葡萄糖和1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以富集生長和乳酸鹽生產(chǎn)改善的自然突變體。一種克隆，SZ136，從最后的轉(zhuǎn)移中分離出來。圖7A示出了細(xì)胞量。圖7B示出了總有機(jī)酸(保持pH的堿消耗)。圖8圖解闡明了通過SZ194以分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵方式生產(chǎn)乳酸鹽的比較。發(fā)酵在含有1mM甜菜堿(pH7.5)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行。圖8A示出了含有12%(w/v)葡萄糖的簡單分批發(fā)酵；圖8B示出了補(bǔ)料分批發(fā)酵。通用符號：□，細(xì)胞質(zhì)量；●，總有機(jī)酸(保持pH的堿消耗)；○，葡萄糖。圖9A-9B示出了E.coli中乳酸鹽生產(chǎn)的天然途徑。圖9A為二羥基丙酮-P節(jié)點(diǎn)。圖9B為丙酮醛支路。縮寫詞：DHAP，磷酸二羥丙酮；Gly3P，3-磷酸甘油醛。圖10A-10F示出了通過重組E.coli將12%(w/v)的葡萄糖(NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基+1mM甜菜堿)發(fā)酵為乳酸鹽的過程。圖10A示出了通過D-(-)-乳酸鹽菌株的有機(jī)酸生產(chǎn)。圖10B示出了D-(-)-乳酸鹽菌株的生長。圖10A和10B的符號：Δ，SZ194；○，TG112(10%w/v葡萄糖)；◇，TG113；□，TG114。圖10C示出了mgsA缺失對通過L-(+)-乳酸鹽菌株(10%葡萄糖+1mM甜菜堿)有機(jī)酸生產(chǎn)的影響。圖10D示出了mgsA缺失對L-(+)-乳酸鹽菌株(10%葡萄糖)生長的影響。圖10C和10D的符號：●，TG102(mgsA+，10%w/v葡萄糖，不含甜菜堿)；○，TG103(mgsA+，10%w/v葡萄糖，不含甜菜堿)；■，TG105(mgsA缺失，1mM甜菜堿)；*，TG103(mgsA+，1mM甜菜堿)。圖10E示出了通過L-(+)-乳酸鹽菌株的有機(jī)酸生產(chǎn)。圖10F示出了L-(+)-乳酸鹽菌株的生長。圖10E和10F的符號：■，TG105；▲，TG106；●，TG107；◆(□)，TG108。圖11A-11B示出了用于改善D-(-)-乳酸鹽生產(chǎn)和生長的代謝演化。將含有10%或12%(w/v)葡萄糖和1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的E.coli菌株TG112每24或48小時(shí)進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以選擇生長、抗性和乳酸鹽生產(chǎn)改善的自然突變體。將一個(gè)克隆TG113從TG112轉(zhuǎn)移第28號(第29天)分離作為中間體，并且將另一種克隆體TG114在第81天從最后的培養(yǎng)物中分離出來。為清晰起見，示出了每4次24小時(shí)轉(zhuǎn)移和每隔48小時(shí)轉(zhuǎn)移的曲線圖。作為比較還包括了親代SZ194。圖11A示出了根據(jù)為保持pH值為7的堿消耗而計(jì)算出的總有機(jī)酸(mM)。圖11B示出了細(xì)胞量(g/L)。符號：▲，SZ194，12%(w/v)葡萄糖；○，TG112，10%(w/v)葡萄糖，1:100稀釋，24小時(shí)轉(zhuǎn)移；●，TG112，12%(w/v)葡萄糖，1:100稀釋，24小時(shí)轉(zhuǎn)移；□，TG113，12%(w/v)葡萄糖，1:350稀釋，24小時(shí)轉(zhuǎn)移；以及◆(□)，TG113，12%(w/v)葡萄糖，1:100稀釋，48小時(shí)轉(zhuǎn)移。圖12A-C示出了pLOI4417的產(chǎn)生。pLOI4417通過在pLOI4411上進(jìn)行PCR而生成，一引物在frdA的3’端退火、向上游延伸，另一引物在frdC內(nèi)部退火、向下游延伸(圖12A)。將得到的4263bpPCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DpnI處理以消化天然pLOI4411質(zhì)粒(圖12B)。消化的PCR產(chǎn)物隨后進(jìn)行自身連接，以產(chǎn)生新的質(zhì)粒pLOI4417(圖12C)。序列說明SEQIDNO:1是用于frdBC缺失的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:2是用于frdBC缺失的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:3是用于adhE缺失的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:4是用于adhE缺失的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:5是用于celY缺失的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:6是用于celY缺失的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:7是用于mgsA缺失的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:8是用于mgsA缺失的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:9是用于FRT-cat-sacB擴(kuò)增的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:10是用于FRT-cat-sacB擴(kuò)增的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:11是用于帶有5’NheI位點(diǎn)的cat-sacB擴(kuò)增的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:12是用于帶有5’NheI位點(diǎn)的cat-sacB擴(kuò)增的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:13是用于克隆frdABCD的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:14是用于克隆frdABCD的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:15是用于克隆ackA的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:16是用于克隆ackA的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:17是用于克隆lacZ-cynX的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:18是用于克隆lacZ-cynX的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:19是用于克隆mgsA的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:20是用于克隆mgsA的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:21是用于克隆focA-pflB的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:22是用于克隆focA-pflB的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:23是用于克隆adhE的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:24是用于克隆adhE的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:25是用于缺失frdBC的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:26是用于缺失frdBC的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:27是用于缺失ackA的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:28是用于缺失ackA的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:29是帶有5’NheI位點(diǎn)的lacZ反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:30是帶有5’NheI位點(diǎn)的cynX反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:31是用于缺失mgsA的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:32是用于缺失mgsA的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:33是用于缺失focA-pflB的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:34是用于缺失focA-pflB的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:35是用于缺失adhE的有義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:36是用于缺失adhE的反義引物的核苷酸序列。SEQIDNO:37-46描述了其中FRTscar被去除的遺傳區(qū)的部分序列。以粗體示出了該基因的5’和3’區(qū)的部分序列，斜體用于標(biāo)明FRTscar，并且下劃線區(qū)在菌株TG128中被去除。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供的新型微生物當(dāng)在多種發(fā)酵條件中生長時(shí)均能夠生產(chǎn)乳酸。本發(fā)明還提供了用于改造這樣的微生物的方法以及利用本發(fā)明的新型微生物有效地和穩(wěn)定地生產(chǎn)乳酸的方法，以便可從相對低廉的初級產(chǎn)品諸如葡萄糖或蔗糖提供高產(chǎn)率的乳酸。本申請中的術(shù)語“乳酸(lacticacid)”指的是游離酸形式或者鹽形式的2-羥基丙酸。乳酸的鹽形式稱作“乳酸鹽(lactate)”，不管中和劑是碳酸鈣還是氫氧化銨。本文所提到的乳酸可指乳酸兩種立體異構(gòu)形式中任何一種(L-(+)-乳酸或D-(-)-乳酸)。術(shù)語乳酸鹽可指乳酸鹽兩種立體異構(gòu)形式中任何一種(L-(+)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸鹽)。本發(fā)明提供了生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽的單一立體異構(gòu)體的微生物。根據(jù)本發(fā)明的一些方面生產(chǎn)的乳酸立體異構(gòu)體或乳酸鹽立體異構(gòu)體是“手性純”的。術(shù)語“手性純(chirallypure)”表示沒有可檢測到的乳酸或乳酸鹽的一種立體異構(gòu)形式與另一種立體異構(gòu)形式之間的污染(特定的立體異構(gòu)體的手性純度(chirallypurity)至少高于(或者高于或等于)99.9%)。本文披露的已將丙酮醛途徑(mgsA)缺失或失活的遺傳修飾微生物能夠生產(chǎn)“手性純”的D-(-)-乳酸或L-(+)-乳酸。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，利用本發(fā)明改造的微生物生產(chǎn)L-(+)-乳酸。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方式中，利用本發(fā)明改造的微生物生產(chǎn)D-(-)-乳酸。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明利用大腸桿菌(或E.Coli)作為生物催化劑，用于提高葡萄糖和/或蔗糖向乳酸的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，微生物的代謝可通過引入并表達(dá)多種基因進(jìn)行改性。根據(jù)本主題發(fā)明，可將多種新型質(zhì)粒引入E.Coli，以使轉(zhuǎn)化的(transformed)微生物可在多種發(fā)酵條件下生產(chǎn)大量的乳酸。優(yōu)選將本發(fā)明的重組E.Coli進(jìn)行改性，以便當(dāng)在包含葡萄糖和/或蔗糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，可穩(wěn)定地以高產(chǎn)率生產(chǎn)乳酸。含有本主題發(fā)明的質(zhì)粒的E.Coli寄主由美國61604伊利諾斯州皮奧里亞市大學(xué)街1815N美國農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection，1815N.UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604U.S.A.)保藏。入藏登記號和保藏日期如下：已將本主題培養(yǎng)物在如下條件下保藏，該條件確保在本專利申請未決期間由專利和商標(biāo)局根據(jù)37CFR1.14和35USC122確定的人被授權(quán)可以獲得這些培養(yǎng)物。在本主題申請的優(yōu)先權(quán)文本或其分案提交的國家中，按照國外專利法的要求可以獲得這些保藏物。但是，應(yīng)該理解，保藏物的可獲得性不構(gòu)成在由政府行為授予的專利權(quán)部分失效時(shí)對實(shí)施本主題發(fā)明的許可。而且，將該主題培養(yǎng)保藏物按照布達(dá)佩斯微生物保藏條約的規(guī)定進(jìn)行儲(chǔ)存并且對于公眾是可以獲得的，即，將它們在所有必要的管理下進(jìn)行儲(chǔ)存，使其保持存活并且不被污染，持續(xù)時(shí)間為最近一次要求提供保藏物的樣品后至少5年期間，并且在任何情況下，持續(xù)時(shí)間為在保藏日期之后的至少30(三十)年或任何可以提出披露培養(yǎng)物的專利的可實(shí)施期。如果由于保藏條件在需要時(shí)保藏處不能提供樣品，保藏人則有義務(wù)替換保藏物。公眾對本主題培養(yǎng)保藏物可獲得性的所有限制在披露它們的專利授權(quán)后將不能取消的去除。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式提供了一種E.ColiB菌株(“SZ132”；保藏編號NRRLB-30861)，其被改造以在多種培養(yǎng)基中提高細(xì)胞生長和乳酸鹽生產(chǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，可將SZ132菌株通過下面的步驟進(jìn)行構(gòu)建以生產(chǎn)D-乳酸鹽(乳酸)：(a)通過將用于纖維二糖利用的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(保藏編號ATCC68564)casAB基因整合到lacY的終止密碼子后以及將編碼內(nèi)切葡聚糖酶的菊歐文氏菌(保藏編號為ATCC55124)celY基因整合將到frdA基因中，可從E.ColiKO11構(gòu)建菌株LY52(Ohtaetal.,1991;Moniruzzamanetal.,1997;ZhouandIngram,1999)；(b)依次將E.ColiK-12(菌株W3110)的一些突變轉(zhuǎn)導(dǎo)入LY52，其用于構(gòu)建菌株SZ63(Zhouetal.,2003)；(c)通過從菌株SZ31(菌株W3110)ΔfocA-pflB缺失的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)而去除用于乙醇生產(chǎn)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因；(d)通過從菌株TC20adhE突變的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)使天然E.Coli醇脫氫酶生產(chǎn)失活(Zhouetal.,2003)；(e)利用從菌株SZ61(菌株W3110)的突變?nèi)コ宜峒っ?acetatekinase)(ackA)(Zhouetal.,2003)；(f)通過FLP重組酶去除用于選擇的抗生素基因(Zhouetal.,2003)；以及(g)在步驟(f)的抗生素基因去除過程中，去除casAB的內(nèi)部片段(或在去除抗生素基因步驟之后去除casAB基因的內(nèi)部片段)。本發(fā)明的相關(guān)具體實(shí)施方式還涉及到轉(zhuǎn)化菌株SZ132以去除所有外源基因。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，通過利用線性DNA的同源重組將產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB和菊歐文氏菌(Erwiniachrysanthemi)celY基因從菌株SZ132缺失；然后利用FLP重組酶消除在菌株SZ132的構(gòu)建過程中所用的抗生素基因。所得菌株SZ186(保藏編號NRRLB-30862)只含有天然E.Coli基因。本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方式提供了E.ColiB菌株(“TG103”)，其被改造以在多種培養(yǎng)基中提高細(xì)胞生長和乳酸的L異構(gòu)體的生產(chǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，TG103菌株可通過下面的步驟進(jìn)行構(gòu)建：(a)利用本文所述的方法改造菌株SZ186；(b)將菌株SZ186進(jìn)行系列培養(yǎng)，以選擇生長和/或乳酸生產(chǎn)提高的菌株，其中所選菌株為菌株SZ194；(c)將異源L-乳酸基因和卡那霉素標(biāo)記物整合到SZ194的天然ldhA(D-乳酸脫氫酶)基因中并去除編碼區(qū)的中心部分以產(chǎn)生TG101；(d)通過FLP重組酶去除抗生素基因，以產(chǎn)生TG102；以及(e)將菌株TG102進(jìn)行若干天(如從約7到21天，優(yōu)選13天)的系列轉(zhuǎn)移，其中對每天預(yù)先接種培養(yǎng)物的培養(yǎng)液(broth)進(jìn)行1:100稀釋，并且選擇那些能顯示出生長提高和/或L-乳酸生產(chǎn)增加的菌株，其中所選菌株為TG103。根據(jù)本主題發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，加快的生長和增加的乳酸生產(chǎn)是聯(lián)系的。對于能改善生長和乳酸生產(chǎn)的菌株的共選擇過程稱為“代謝演化(Metabolicevolution)”。本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式還提供使本申請?zhí)峁┑倪z傳修飾微生物中的一些基因失活或缺失。在本發(fā)明的一方面，去除基因是為了使期望的活性失活。缺失能提供最大的穩(wěn)定性，因?yàn)闆]有發(fā)生可逆突變而導(dǎo)致功能恢復(fù)的機(jī)會(huì)?？蛇x地，可以通過插入能夠破壞基因功能和/或表達(dá)的核酸序列而使基因失活(例如，P1轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他本領(lǐng)域已知的方法)。本文討論的一種或多種特殊多核苷酸序列的失活或缺失也可稱為“改性(modification)”。用于將特異性基因引入到寄主微生物中的載體可以是任何載體，只要它能夠在寄主微生物中進(jìn)行復(fù)制。本發(fā)明的載體可在所選寄主細(xì)胞中作為克隆載體或表達(dá)載體進(jìn)行操作。許多載體為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所通曉，選用合適的載體和寄主細(xì)胞只是選擇的問題。例如，載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、病毒、或其混合物，如在Maniatisetal.,1989、Ausubeletal.,1995、Miller,J.H.,1992、SambrookandRussell,2001中描述的那些載體。而且，本發(fā)明的載體可以是非融合載體或融合載體。在每個(gè)具體載體中，可選擇不同部位用于插入感興趣的核苷酸序列。這些部位通常通過切開它們的限制性內(nèi)切酶或核酸內(nèi)切酶指定。載體可用匹配基因末端序列的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化并且該序列可以被連接。通常連接通過利用諸如T4DNA連接酶的連接酶實(shí)現(xiàn)。選擇用來將所選核苷酸片段插入載體以形成重組載體的特殊位點(diǎn)由多種因素決定。這些因素包括要表達(dá)的多肽的大小和結(jié)構(gòu)、預(yù)期多肽對由寄主細(xì)胞組分的酶的降解及其蛋白質(zhì)污染的敏感性、諸如起始和終止密碼子的部位的表達(dá)特性、以及由本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的其他因素。這些因素沒有一個(gè)單獨(dú)能夠完全控制特殊多肽的插入位點(diǎn)的選擇。確切地說，所選擇的部位反映了這些因素的平衡，并且對特定蛋白質(zhì)來說，并非所有部位同樣有效?？墒褂枚喾N載體-寄主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)施本發(fā)明。細(xì)菌菌株如E.Coli在本發(fā)明的實(shí)施中用來生產(chǎn)乳酸特別有用。但是，這里描述的新發(fā)明可通過對各種乳酸生產(chǎn)方案適合的多種寄主應(yīng)用。寄主菌株可以是細(xì)菌、真菌、或酵母菌來源的。選擇寄主菌株可考慮的因素包括底物范圍(substraterange)、抗性、糖耐性、鹽耐性、溫度耐性、pH耐性以及乳酸鹽耐性。確定最合適的寄主-載體系統(tǒng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。用于染色體缺失、整合、以及可去除抗生素抗性基因的方法以前曾描述過(Causeyetal.,2004;DatsenkoandWanner,2000;Martinez-Moralesetal.,1999;Zhouetal.,2003)。這些已知方法中的任何一個(gè)或其組合可用來實(shí)施本發(fā)明。由于用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子將存在于寄主微生物中(例如，產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB或菊歐文氏菌celY基因)，所以當(dāng)對于基因特異性的啟動(dòng)子在寄主細(xì)胞中起作用，即可采用該啟動(dòng)子?？蛇x地，還可以將外源啟動(dòng)子連接到編碼該基因的DNA，以便在該啟動(dòng)子的控制下獲得表達(dá)。當(dāng)將埃希氏菌(Escherichiabacterium)用作寄主時(shí)，lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、amyE啟動(dòng)子、spac啟動(dòng)子等等均可作為這樣的啟動(dòng)子使用。而且，還有可能利用含有如pUC19等啟動(dòng)子的表達(dá)載體，并將編碼例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB(K.oxytocacasAB)的DNA片段插入該載體中，以使該片段可在該啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)。用于染色體DNA的制備、PCR、質(zhì)粒DNA的制備、DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成等的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常用方法。這些方法在例如Sambrook,J.etal.(1989)等中描述過。乳酸可通過如上所述的用轉(zhuǎn)化的微生物將葡萄糖和/或蔗糖轉(zhuǎn)化成乳酸并收集生成的乳酸來生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)轉(zhuǎn)化的微生物在無機(jī)鹽培養(yǎng)基(如NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，生產(chǎn)的乳酸的水平可高于0.5M。本發(fā)明的載體可自發(fā)地復(fù)制或整合到寄主的基因組中。整合常常通過同源重組(例如，精氨酸可選擇性標(biāo)記物整合到染色體精氨酸基因中)或者在與載體上任何基因都不相關(guān)的染色體部位發(fā)生?？赏ㄟ^單一或者雙重跨接過程(singleordoublecross-overevent)進(jìn)行整合。還有可能在同一個(gè)構(gòu)建的微生物中存在任何數(shù)目的這些整合和復(fù)制類型。在一些具體實(shí)施方式中，將本發(fā)明改造的微生物的培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行約0.5到240小時(shí)。培養(yǎng)期間，培養(yǎng)溫度優(yōu)選控制在約25℃到45℃，pH值優(yōu)選控制在5-8。無機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣或其類似物可用來調(diào)節(jié)pH。通過轉(zhuǎn)化屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌以表達(dá)表達(dá)一些在乳酸生產(chǎn)中有用的酶可以獲得本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌是大腸桿菌。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方式中，可用于本發(fā)明的細(xì)菌包括但不限于：氧化葡糖桿菌、淺井氏葡糖桿菌、德爾馬瓦無色桿菌、粘無色桿菌、乳無色桿菌、根癌土壤桿菌、放射形土壤桿菌、糞產(chǎn)堿菌、檸檬節(jié)桿菌、腫大地桿菌(Arthrobactertumescens)、石蠟節(jié)桿菌、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、氧化節(jié)桿菌、天牛金桿菌、印度固氮菌、產(chǎn)氨棒桿菌、離胺酸生產(chǎn)菌(divaricatum)、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、球狀短桿菌(Brevibacteriumglobosum)、暗褐短桿菌(Brevibacteriumfuscum)、酮戊二酸短桿菌、微黃短桿菌(Brevibacteriumhelcolum)、極小短小桿菌、需土金桿菌、玫瑰色短桿菌、Brevibacteriumimmariophilium、擴(kuò)展短桿菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌(Brevibacteriumprotopharmiae)、嗜乙酰棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、美棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌、醋谷棒桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、解淀粉歐文氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、草生歐文氏菌、菊歐文氏菌、外來穩(wěn)桿菌、染色假桿菌、橙色黃桿菌(Flavobacteriumaurantinum)、萊茵黃桿菌、塞沃尼假桿菌、短穩(wěn)桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、微球菌sp.CCM825(Micrococcussp.CCM825)、摩氏摩根氏菌、紅串紅球菌、粗糙諾卡氏菌、Planococcuseucinatus、雷氏普羅威登斯菌、謝氏丙酸桿菌、產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonassynxantha)、產(chǎn)氮假單胞菌、熒光假單胞菌、卵狀假單胞菌、施氏假單胞菌、食酸叢毛單胞菌(Pseudomonasacidovolans)、霉味假單胞菌、睪丸酮叢毛單胞菌、銅綠假單胞菌、紅串紅球菌、紫紅紅球菌、紅球菌sp.ATCC15592(Rhodococcussp.ATCC15592)、紅球菌sp.ATCC19070(Rhodococcussp.ATCC19070)、脲芽孢八疊球菌、金黃色葡萄球菌、梅氏弧菌(Vibriometschnikovii)、干酪弧菌(Vibriotyrogenes)、馬杜拉馬杜拉放線菌、紫產(chǎn)色鏈霉菌、Kitasatosporiaparulosa、天藍(lán)色鏈霉菌、淺黃鏈霉菌(Streptomycesflavelus)、淺灰鏈霉菌、淺青紫鏈霉菌、橄欖鏈霉菌、田無鏈霉菌、弗吉尼亞鏈霉菌、抗生鏈霉菌、可可鏈霉菌、淡紫灰鏈霉菌、綠色產(chǎn)色鏈霉菌、殺鮭氣單胞菌、短小芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、解硫胺素芽孢桿菌、弗氏埃希氏菌、嗜氨微桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、薛氏沙門氏菌(Salmonellaschottmulleri)、柑橘黃單胞菌等等。通過使根據(jù)本發(fā)明制備的含有轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物接觸蔗糖和(或)葡萄糖，可在反應(yīng)混合物中生產(chǎn)乳酸。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方式中，將細(xì)胞從轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物中分離并收集；將經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞進(jìn)行丙酮處理或冷凍干燥；從這些轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞或者處理過的細(xì)胞中制備無細(xì)胞(cellfree)提取物；從這樣的無細(xì)胞提取物中分離諸如膜片段的片段；或可通過固定轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞、處理過的細(xì)胞、無細(xì)胞提取物和片段產(chǎn)生固定物質(zhì)，其中任何一種獨(dú)立接觸或聯(lián)合接觸蔗糖和(或)葡萄糖可以生產(chǎn)乳酸。微生物可包括一種微生物，或可用作兩種或多種微生物的任意混合物。發(fā)酵參數(shù)依賴于用于產(chǎn)生重組酶的寄主微生物的類型。生長培養(yǎng)基可以是基本/合成(defined)或完全/復(fù)合培養(yǎng)基。可發(fā)酵碳源可包括己糖和戊糖、淀粉、纖維素、木聚糖、低聚糖及其組合。根據(jù)本主題發(fā)明可以使用的一種形式的生長培養(yǎng)基包括改性的由MillerJ.H.(1992)描述的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(每升具有10gDifco胰胨、5gDifco酵母提取物以及5g氯化鈉)。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方式中，本發(fā)明構(gòu)建的菌株的培養(yǎng)物可以在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(如由Causeyetal.,2004描述的)并補(bǔ)充了2%到20%的糖(w/v)或5%或者10%的糖(葡萄糖或蔗糖)。該微生物可在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基里面或上面生長。NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括、主要組成為、或包含以下組分(每升)：3.5gKH2PO4；5.0gK2HPO4；3.5g(NH4)2HPO4；0.25gMgSO4·7H2O；15mgCaCl2·2H2O；0.5mg硫胺；以及1mL的痕量金屬成分(stock)、葡萄糖(例如，平皿中2%或培養(yǎng)液中3%)和1.5%的瓊脂(用于平皿)。將痕量金屬成分在0.1MHCl中制備，并且包括、主要組成為或包含(每升)：1.6gFeCl3；0.2gCoCl2·6H2O；0.1gCuCl2；0.2gZnCl2·4H2O；0.2gNaMoO4；0.05gH3BO3。當(dāng)需要進(jìn)行pH控制時(shí)，可將4-嗎啉代丙烷磺酸(0.1M，pH7.1)加入到液體和固體培養(yǎng)基(過濾除菌)(并且可選地包括在用于10升發(fā)酵的培養(yǎng)基中)。基本培養(yǎng)基也可通過將琥珀酸鹽(1g/升)用作碳(不可發(fā)酵基質(zhì))的唯一來源進(jìn)行制備并可在需要時(shí)作為補(bǔ)充成分加入葡萄糖-基本培養(yǎng)基中。在一些具體實(shí)施方式中，當(dāng)菌株構(gòu)建需要時(shí)還可包括抗生素。生長和乳酸鹽的生產(chǎn)可用常規(guī)分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)或連續(xù)發(fā)酵來進(jìn)行。在一些具體實(shí)施方式中，在減氧或缺氧條件下進(jìn)行發(fā)酵對于一些寄主是理想的。在另外的具體實(shí)施方式中，乳酸鹽生產(chǎn)可在有氧條件下進(jìn)行；并且，可選地使用氣提式或類似的發(fā)酵罐。發(fā)酵的pH值應(yīng)足夠高以允許通過寄主的生長和乳酸鹽生產(chǎn)。調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH可利用中和劑如碳酸鈣或氫氧化鈣來進(jìn)行?？蛇x地，可以在發(fā)酵期間，利用諸如膜技術(shù)、電滲析、溶劑萃取以及吸收樹脂的方法持續(xù)移出乳酸。任何上述發(fā)酵方法的選擇和結(jié)合很大程度上依賴于寄主菌株和優(yōu)選的下游過程。本主題發(fā)明的各種非限制性具體實(shí)施方式包括：1.一種遺傳修飾的E.Coli菌株，包括對E.Coli菌株KO11(ATCC55124)進(jìn)行以下遺傳修飾：a)在lacY的終止密碼子之后插入產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB基因；b)將菊歐文氏菌celY基因整合到frdA基因中；c)使focA-運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌pdc-adhB-pflB失活或缺失；d)使天然E.Coli醇脫氫酶基因失活或缺失；以及e)使乙酸激酶(ackA)基因失活或缺失；2.根據(jù)具體實(shí)施方式1的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株還包括失活或缺失的抗生素抗性基因；3.根據(jù)具體實(shí)施方式1的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB基因和菊歐文氏菌celY基因插入后在所述遺傳修飾的E.Coli菌株中失活或缺失；4.根據(jù)具體實(shí)施方式2的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB基因和菊歐文氏菌celY基因插入后在所述遺傳修飾的E.Coli菌株中失活或缺失；5.根據(jù)具體實(shí)施方式2的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是代謝演化的；6.根據(jù)具體實(shí)施方式1或具體實(shí)施方式3的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是代謝演化的；7.根據(jù)具體實(shí)施方式4的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是代謝演化的；8.根據(jù)具體實(shí)施方式1、2、3、4、5、6或7的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述抗生素基因利用FLP重組酶進(jìn)行缺失；9.根據(jù)具體實(shí)施方式7的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是SZ186；10.根據(jù)具體實(shí)施方式5的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是SZ132；11.根據(jù)具體實(shí)施方式1、2、3、4或5的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中在所述遺傳修飾的E.Coli菌株中失活或缺失所述菌株的mgsA基因；12.一種遺傳修飾的E.Coli菌株，包括已將mgsA基因失活或缺失的E.Coli菌株SZ194(NRRLB30863)；13.根據(jù)具體實(shí)施方式12的遺傳修飾E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是代謝演化的；14.根據(jù)具體實(shí)施方式13的遺傳修飾E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是TG112、TG113或TG114；15.根據(jù)具體實(shí)施方式11或12的遺傳修飾E.Coli菌株，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株還包括失活或缺失的天然ldhA基因和重組插入的編碼L-特異性乳酸脫氫酶的異源基因；16.根據(jù)具體實(shí)施方式15的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述異源L-特異性乳酸脫氫酶基因是ldhL基因(例如，從乳酸片球菌獲得的ldhL基因)；17.根據(jù)具體實(shí)施方式15或具體實(shí)施方式16的遺傳修飾的E.Coli菌株，其中所述菌株是代謝演化的；18.一種遺傳修飾的E.Coli菌株，選自TG112、TG113或TG114、SZ194、SZ132、SZ186或TG103;19.一種培養(yǎng)或培育遺傳修飾的E.Coli菌株的方法，包括將一種或多種根據(jù)具體實(shí)施方式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一個(gè)的遺傳修飾的E.Coli菌株接種培養(yǎng)基，以及培養(yǎng)或培育所述遺傳修飾的E.Coli菌株；20.一種生產(chǎn)D-(-)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸的方法，包括在允許D-(-)-乳酸生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)一種或多種根據(jù)具體實(shí)施方式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一個(gè)的遺傳修飾的E.Coli菌株，以及可選地中和D-(-)-乳酸以形成D-(-)-乳酸鹽；21.根據(jù)具體實(shí)施方式20的方法，其中所述一種或多種遺傳修飾的E.Coli菌株選自TG112、TG113、TG114或SZ194；22.一種生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽或L-(+)-乳酸的方法，包括在允許L-(+)-乳酸生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)一種或多種根據(jù)具體實(shí)施方式15、16或17中任一個(gè)的遺傳修飾的E.Coli菌株，以及可選地中和L-(+)-乳酸以形成L-(+)-乳酸鹽；23.根據(jù)具體實(shí)施方式22的方法，其中所述一種或多種遺傳修飾的E.Coli菌株是TG103、TG105、TG106、TG107或TG108；24.根據(jù)具體實(shí)施方式19、20、21、22或23的任一個(gè)的方法，其中所述遺傳修飾的E.Coli菌株是在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的；25.根據(jù)具體實(shí)施方式24的方法，其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括2%到20%(w/v)的糖；26.根據(jù)具體實(shí)施方式25的方法，其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基含有2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%(w/v)的糖；27.根據(jù)具體實(shí)施方式25或26的方法，其中該糖是葡萄糖或蔗糖或葡萄糖和蔗糖的組合；28.根據(jù)具體實(shí)施方式20的方法，其中如具體實(shí)施方式11所述的遺傳修飾的E.Coli菌株是在允許生產(chǎn)手性純D-(-)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的；29.根據(jù)具體實(shí)施方式22的方法，其中如具體實(shí)施方式15、16或17所述的遺傳修飾的E.Coli菌株是在允許生產(chǎn)手性純L-(+)-乳酸鹽或L-(+)-乳酸的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的；30.根據(jù)具體實(shí)施方式21的方法，其中所述方法生產(chǎn)手性純D-(-)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸；31.根據(jù)具體實(shí)施方式23的方法，其中所述方法生產(chǎn)手性純L-(+)-乳酸鹽或L-(+)-乳酸；32.根據(jù)具體實(shí)施方式28、29、30或31的方法，進(jìn)一步包括純化手性純?nèi)樗猁}(L-(+)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸鹽)的步驟；33.根據(jù)具體實(shí)施方式20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一個(gè)的方法，其中生產(chǎn)的乳酸鹽(例如，L-(+)-乳酸鹽或D-(-)-乳酸鹽)的濃度為至少0.5M；34.根據(jù)具體實(shí)施方式33的方法，其中培養(yǎng)基是化學(xué)成分確知(人工合成)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基如NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基；35.根據(jù)具體實(shí)施方式20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34的方法，其中乳酸(L-(+)-乳酸或D-(-)-乳酸)的產(chǎn)率為至少或高于(或者高于或等于)90%；36.根據(jù)具體實(shí)施方式35的方法，其中該產(chǎn)率為至少90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、或99%；37.根據(jù)具體實(shí)施方式29、30、31、32、33、34、35或36的方法，其中沒有可檢測的乳酸或乳酸鹽的一種立體異構(gòu)形式與另一種立體異構(gòu)形式的污染(例如，特異性的立體異構(gòu)體的手性純度為至少、高于(或者高于或等于)99.9%)；或38.一種組合物，包括一種或多種根據(jù)具體實(shí)施方式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一個(gè)的遺傳修飾的E.Coli菌株以及培養(yǎng)基。以下是闡述用于實(shí)施本發(fā)明的方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制性的。除非另有說明，所有百分?jǐn)?shù)均以重量計(jì)并且所有的溶劑混合物的比例均以體積計(jì)。實(shí)施例1E.Coli菌株SZ132和SZ186的制備與分析本實(shí)施例中使用的E.Coli菌株列在表1中。菌株SZ63是E.ColiK-12的衍生物(ATCC27325)。KO11(ATCC55124)是E.ColiB(ATCC11303)的衍生物，其含有整合到pflB基因中的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇生產(chǎn)基因。培養(yǎng)物在改性Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)液(每升：10gDifco胰胨；5gDifco酵母提取物；5g氯化鈉)或者在補(bǔ)充了5%或10%的糖(葡萄糖或蔗糖)的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中、于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。菌株構(gòu)建時(shí)需包括抗生素。質(zhì)粒構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)方法。染色體缺失、整合以及可去除抗生素抗性基因的方法之前已描述過了。菌株E.ColiDH5a和S17-1用作用于質(zhì)粒構(gòu)建的寄主。菌株NC3用作中間寄主以將在從K-12菌株到B菌株的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中與限制性內(nèi)切酶有關(guān)的問題減到最少(Dienetal.,2001)。種子培養(yǎng)物如之前由Shuklaetal.(2004)和Zhouetal.,(2003)描述過的方法制備，并用來接種小發(fā)酵容器(350mL工作體積，35℃，150rpm攪拌)。通過自動(dòng)加入6N的KOH將培養(yǎng)液保持在pH7.0。標(biāo)繪的數(shù)據(jù)代表2次或更多次重復(fù)的平均值。對于3次或更多次發(fā)酵的平均值還將表示平均值標(biāo)準(zhǔn)差的長條包括在內(nèi)。乳酸鹽的最大體積生產(chǎn)率從每個(gè)圖表的最陡區(qū)進(jìn)行估計(jì)。在種子培養(yǎng)物的生長過程中或發(fā)酵液中不包括抗生素。通過在550nm測量光密度(在1.0OD550nm處，330g干細(xì)胞wt/l)估計(jì)細(xì)胞量(cellmass)?？傆袡C(jī)酸產(chǎn)量(主要是乳酸鹽)通過堿(KOH)消耗進(jìn)行測量。酸性產(chǎn)物在發(fā)酵結(jié)束時(shí)通過高性能液相色譜進(jìn)行分析。乙醇通過氣相色譜檢測。菌株SZ132的構(gòu)建菌株LY52由KO11通過將用于纖維二糖利用的產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB基因(Moniruzzamanetal.1997)整合到lacY的終止密碼子之后以及將編碼內(nèi)切葡聚糖酶的菊歐文氏菌celY基因(ZhouandIngram,1999)整合到frdA基因中進(jìn)行構(gòu)建。將之前描述的用于構(gòu)建用于乳酸鹽生產(chǎn)的SZ63(Zhouetal.,2003)的E.ColiK-12(菌株W3110)中的突變連續(xù)地轉(zhuǎn)導(dǎo)入LY52中。通過從SZ31的ΔfocA-pflB的缺失的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)消除了用于乙醇生產(chǎn)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因。天然E.Coli醇脫氫酶通過從TC20的adhE突變的P1轉(zhuǎn)導(dǎo)失活。利用SZ61中的突變?nèi)コ宜峒っ?ackA)。用于選擇的抗生素基因通過FLP重組酶去除(Zhouetal.,2003)。用FLP重組酶去除抗生素基因的過程中，也缺失了casAB的內(nèi)部片段。casAB和啟動(dòng)子的序列分析表明存在與FLP重組酶識別位點(diǎn)非常相似的DNA區(qū)，推測可能是造成這種缺失的原因。通過用1%的接種物連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)而使所得菌株適應(yīng)基本培養(yǎng)基。在這些轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞生長和乳酸鹽生產(chǎn)得到了改善。來自最后一次轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上劃線用于克隆的分離。一個(gè)克隆被選出并命名為SZ132。菌株SZ186的構(gòu)建構(gòu)建SZ132的進(jìn)一步衍生物，其中去除所有外源基因。利用線性DNA通過同源重組去除產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB和菊歐文氏菌celY基因。使用FLP重組酶來消除在構(gòu)建過程中使用的抗生素基因。所得菌株SZ186只含有天然E.Coli基因。乳酸生產(chǎn)的分析在E.ColiK-12和E.ColiB的衍生物中構(gòu)建類似遺傳突變，分別產(chǎn)生SZ63(Zhouetal.,2003)和SZ132。在細(xì)胞生長和乳酸鹽(D異構(gòu)體)生產(chǎn)方面，SZ132優(yōu)于SZ63(參見圖1A)。在豐富培養(yǎng)基中，SZ132在48h內(nèi)完成10%葡萄糖的發(fā)酵，產(chǎn)生超過1mol乳酸鹽/l發(fā)酵液，為以前對基于E.ColiK-12的菌株報(bào)道的兩倍。用SZ63和10%葡萄糖的發(fā)酵在72h后停止，在120h之后只產(chǎn)生840mmol乳酸鹽/l發(fā)酵液。在豐富培養(yǎng)基中，SZ132d的乳酸鹽產(chǎn)率(95%)高于K-12菌株SZ63的乳酸鹽產(chǎn)率(88%)。SZ132的最大體積生產(chǎn)率為75mmol/lh，比SZ63高76%(表2)。在含有5%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，SZ132的細(xì)胞產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率為SZ63的兩倍(參見圖1B)。菌株SZ132在36h內(nèi)完成5%葡萄糖的發(fā)酵，少于SZ63所需的時(shí)間的1/4。在這些條件下，用NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵的細(xì)胞產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率僅為用豐富培養(yǎng)基及10%葡萄糖的25-35%。在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，菌株SZ132和SZ63在144h內(nèi)均不能完成10%葡萄糖的發(fā)酵(參見圖1C)?；诖x的糖，兩種菌株的乳酸鹽產(chǎn)率都超過90%。利用含有10%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基，SZ132的細(xì)胞產(chǎn)率(0.83g/l)、乳酸鹽生產(chǎn)(700mmol/l的發(fā)酵液)、以及體積生產(chǎn)率(11.2mmol乳酸鹽/lh)比SZ63大約高兩倍。利用NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基和10%葡萄糖，SZ132的體積生產(chǎn)率低于在豐富培養(yǎng)基中觀察到的體積生產(chǎn)率的20%。在豐富培養(yǎng)基和NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，蔗糖發(fā)酵比葡萄糖慢。以前的研究表明，在豐富培養(yǎng)基中SZ63(pLOI3501)需要36h來完成5%蔗糖的發(fā)酵，但在這種培養(yǎng)基中不能完成10%蔗糖的發(fā)酵。在豐富培養(yǎng)基中SZ132在120h內(nèi)完成10%蔗糖的發(fā)酵并產(chǎn)生超過1mol乳酸鹽/l發(fā)酵液(參見圖1D)，幾乎是以前報(bào)道的含有(harboring)蔗糖質(zhì)粒的SZ63的兩倍。SZ132在含有10%蔗糖(9.3mmol/l)的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的體積生產(chǎn)率為在含有蔗糖的豐富培養(yǎng)基中觀察到的體積生產(chǎn)率的1/3，低于在含有10%葡萄糖的豐富培養(yǎng)基中觀察到的體積生產(chǎn)率的1/8(表2)。盡管在72h內(nèi)、在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中將5%蔗糖發(fā)酵完全(參見圖1E)，但是在這種培養(yǎng)基中即使利延長孵育時(shí)間也不能充分代謝10%蔗糖?；诖x的糖，在兩種培養(yǎng)基中蔗糖的產(chǎn)率在從86%到93%的范圍內(nèi)變動(dòng)。這些結(jié)果表明，高水平的有機(jī)酸可通過E.ColiB的改性菌株從葡萄糖和(或)蔗糖進(jìn)行生產(chǎn)。估計(jì)豐富培養(yǎng)基(LB)中的最大體積生產(chǎn)率為75mmol乳酸鹽/lh，比NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基高3倍以上。存在許多用于改進(jìn)的機(jī)會(huì)。在復(fù)合培養(yǎng)基中，完成10%蔗糖代謝所需的孵育時(shí)間比10%葡萄糖長3倍，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中則更長。有必要在不增加昂貴的復(fù)合營養(yǎng)成分的情況縮短發(fā)酵時(shí)間。確定增加生長和生產(chǎn)率的組分可顯著減少發(fā)酵相關(guān)的費(fèi)用，而且還提供減少乳酸鹽純化和廢物處理相關(guān)的費(fèi)用的機(jī)會(huì)。圖2-5圖解闡述了在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，通過本發(fā)明的各種具體實(shí)施方式，即SZ132、SZ186以及SZ194(保藏號NRRLB-30863)，于NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中在各種發(fā)酵條件下進(jìn)行乳酸(D異構(gòu)體)生產(chǎn)的進(jìn)程。實(shí)施例2E.Coli菌株SZ194的制備菌株SZ194的制備中使用的菌株和質(zhì)粒列在表3中。將培養(yǎng)物在37℃、改性Luria培養(yǎng)液(每升：10gDifco胰胨，5gDifco酵母提取物，5g氯化鈉)(Miller,J.H.1992AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria.ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)或補(bǔ)充了1mM甜菜堿和2%-14%(w/v)糖(葡萄糖或蔗糖)的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Causey,T.B.etal.,2004,“EngineeringEscherichiacoliforefficiientconversionofglucosetopyruvate,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2235-2240)中進(jìn)行培育。如果需要，氨芐青霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)也用于菌株構(gòu)建。采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增、酶消化、純化以及質(zhì)粒構(gòu)建(Milleretal.,1992;SambrookandRussell,2001)。染色體基因缺失和整合的方法之前已經(jīng)描述過(Causeyetal.,2004;DatsenkoandWanner,2000;Martinez-Moralesetal.,1999；Zhouetal.，2003a)。構(gòu)建質(zhì)粒pLOI3924以有利于casAB基因的缺失，可通過利用ORFmers(Sigma-Genosis,TheWoodlands,TX)克隆lacY和lacA基因以及在lacY的羧基端的NdeI位點(diǎn)和lacAN終端的ATG之間插入來自pLOI2511的FRT-kan-FRT盒(SmaI消化)而實(shí)現(xiàn)。來自這個(gè)質(zhì)粒的擴(kuò)增片段(對于lacY正向(forward)ORFmer；對于lacA反向ORFmer)用于染色體整合，去除casAB基因。在表4中描述了用于其他基因缺失的雜種引物(Hybridprimer)及包含的序列，這些序列對應(yīng)于靶標(biāo)基因的開始或結(jié)束的約45個(gè)堿基對以及對應(yīng)于FRT側(cè)面的卡那霉素盒的DNA序列的20個(gè)堿基對。除非另有說明，所有發(fā)酵(pH7.0)中均使用含有1mM甜菜堿和10%糖(葡萄糖或蔗糖)的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Causeyetal.,2004)。種子培養(yǎng)物如前所述(Zhouetal.,2003)進(jìn)行制備并用于接種500ml發(fā)酵容器(350mL工作體積，35℃，150rpm攪拌)至33mgcdwl-1的初始密度。如有指明，再加入甜菜堿(1mM)。通過自動(dòng)加入6NKOH而保持培養(yǎng)液的pH。在補(bǔ)料分批發(fā)酵(6%+3%+3%)中使用的總的12%(w/v)葡萄糖如下：308ml的NBS培養(yǎng)基含有21g的葡萄糖。在24h和48h之后，將21ml50%的葡萄糖緩慢加入到每個(gè)容器中。將來自有pH調(diào)控的發(fā)酵的細(xì)胞在不同時(shí)間(24或48h)進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以利于通過基于生長的選擇的代謝演化。將連續(xù)轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)物以33mgcdwl-1的初始密度進(jìn)行接種。選擇結(jié)束時(shí)分離的克隆則賦予新的菌株名稱。利用Bausch&LombSpectronic70分光光度計(jì)在550nm處檢測光密度而估計(jì)細(xì)胞量。通過用于pH維持的堿(KOH)消耗估計(jì)總的有機(jī)酸產(chǎn)量(主要是乳酸鹽)。通過高性能液相色譜在發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析酸性產(chǎn)物和手性純度(Zhouetal.,2003a)。標(biāo)繪的數(shù)據(jù)表示2次或更多次重復(fù)的平均值。對于3次或更多次發(fā)酵的平均值還將表示標(biāo)準(zhǔn)差的長條包括在內(nèi)。乳酸生產(chǎn)的分析甜菜堿(一種保護(hù)性調(diào)滲劑(osmolyte))對由SZ132在含有高糖濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長和乳酸鹽生產(chǎn)非常有益，可能是由于參與(partitioninginto)諸如谷氨酸鹽和海藻糖等天然調(diào)滲劑的生物合成的碳不足(Purvisetal.,2005)。SZ132的連續(xù)轉(zhuǎn)移在含有10%蔗糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行，以選擇在缺乏甜菜堿的情況下具有等價(jià)性能的菌株(圖6A和6B)。用于菌株SZ132生長的能量產(chǎn)生依賴于利用乳酸鹽作為NADH氧化主要途徑的糖酵解代謝流(flux)，提供基于生長的選擇。在連續(xù)轉(zhuǎn)移的過程中，生長和酸產(chǎn)量(堿消耗)穩(wěn)定提高。在最后的轉(zhuǎn)移中，不添加甜菜堿即可使10%蔗糖發(fā)酵完全。從這種培養(yǎng)物中分離出一種克隆并命名為菌株SZ136。這個(gè)菌株在96小時(shí)后產(chǎn)生母體SZ132兩倍的細(xì)胞產(chǎn)率和3倍的更高效價(jià)的乳酸鹽(圖6)。然而，SZ136還產(chǎn)生比SZ132更高濃度的琥珀酸鹽和乙醇(表5)，降低了乳酸鹽產(chǎn)率(基于代謝的糖)。a含有10%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH7.0)，除非另有說明。如有指明，則再加入1mM甜菜堿。b產(chǎn)率是基于代謝的糖，假定每摩爾己糖有2摩爾乳酸鹽的最大理論產(chǎn)率(等重量轉(zhuǎn)化)。對SZ132在10%(w/v)蔗糖上的生長改善看來伴隨一些突變，這些突變能夠改善生長，但由于副產(chǎn)物途徑也部分恢復(fù)了突變基因的功能。菌株SZ132中的延胡索酸鹽還原酶的突變表征得較差，最初作為一種Tn5缺失而獲得(Ohtaetal.,1991)，隨后在frdA和frdB之間插入celY(Zhouetal.,2005)。通過插入帶側(cè)翼FRT位點(diǎn)的抗生素標(biāo)記而破壞醇脫氫酶基因。然后使用翻轉(zhuǎn)酶(flippase)去除抗生素基因，只留下FRT區(qū)。進(jìn)一步缺失產(chǎn)生SZ162的frdBC和adhE的編碼區(qū)，消除了兩種副產(chǎn)物，而且由于糖利用不完全降低了生長和最終乳酸鹽效價(jià)(表5)。在這個(gè)菌株中還進(jìn)行其他的缺失以消除之前整合的用于纖維素利用的外源基因(Zhouetal.,2005)：來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的casAB(纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)和來自菊歐文氏菌的celY(內(nèi)切葡聚糖酶)。在有或沒有甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，所得菌株SZ186產(chǎn)生可忽略濃度的副產(chǎn)物，但不能完全利用10%的糖(圖7A；表5)。然而，SZ162和SZ186基于代謝糖的產(chǎn)率都很高(96%-99%)。SZ136中能夠消除副產(chǎn)物途徑(SZ186)的缺失也將細(xì)胞產(chǎn)率降低了幾乎一半，對碳參與生物合成造成了不良影響。使用代謝演化來共選擇(co-select)在1mM甜菜堿和10%葡萄糖存在時(shí)生長和發(fā)酵性能改善的SZ186衍生物(圖7A和7B)。細(xì)胞產(chǎn)率和有機(jī)酸生產(chǎn)在最初幾輪選擇的過程中同時(shí)增加。從最后富集中分離出單個(gè)克隆體并命名為SZ194。菌株SZ194比SZ186生長更快并且達(dá)到更高的細(xì)胞產(chǎn)率。由SZ194在部分發(fā)酵中生產(chǎn)的乳酸鹽濃度高達(dá)900mM，始終高于SZ186的乳酸鹽濃度(表5)。兩種菌株從葡萄糖生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)率都接近理論產(chǎn)率并且副產(chǎn)物最少。但是，利用兩種菌株，pH7.0時(shí)，即使在延長孵育時(shí)間糖仍不被利用。pH7.0時(shí)，由10%(w/v)葡萄糖生產(chǎn)的800-900mM乳酸鹽大大超過了pH7.0時(shí)抑制生長所需的最大乳酸鹽濃度并且還可能會(huì)抑制進(jìn)一步的葡萄糖代謝。人們探索了可能引起SZ194對10%(w/v)糖不完全發(fā)酵的兩個(gè)因素：未知的營養(yǎng)缺陷和乳酸鹽耐受性。用pH7.0的Luria發(fā)酵液(豐富培養(yǎng)基)代替含有1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基對乳酸鹽產(chǎn)率(表5)或乳酸鹽生產(chǎn)(表6)幾乎沒有影響。乳酸鹽毒性通過比較pH對發(fā)酵的影響進(jìn)行檢測(表5)。弱有機(jī)酸如乳酸鹽的毒性部分與共軛中性形式的解偶聯(lián)作用有關(guān)(Warneckeetal.,2005)，解偶聯(lián)作用又與pH反相關(guān)。發(fā)酵也觀察到了相似的趨勢。在Luria液體培養(yǎng)基中，最終乳酸鹽效價(jià)在pH6.5時(shí)最低而在pH7.5和pH8.0時(shí)最高。pH的變化對細(xì)胞產(chǎn)率影響較小。在pH7.5時(shí)，利用Luria液體培養(yǎng)基在72h內(nèi)將10%(w/v)的葡萄糖發(fā)酵完全。a為含有10%葡萄糖和1mM甜菜堿的NBS無機(jī)鹽(培養(yǎng)基)(pH7.0)，除非另有說明。b生產(chǎn)率最高的24h周期的平均值pH增加的好處在含有1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中得到確認(rèn)(圖8；表5)。在pH7.5時(shí)，可將10%和12%(w/v)的葡萄糖發(fā)酵完全，產(chǎn)生超過1mol乳酸鹽L-1并且只有痕量副產(chǎn)物(圖3A)?；诩尤氚l(fā)酵液中的總糖量，每g葡萄糖產(chǎn)生0.95g乳酸鹽產(chǎn)物的產(chǎn)率代表95%的最大理論產(chǎn)率。加入更高濃度的糖不會(huì)進(jìn)一步增加乳酸鹽的最終效價(jià)。在補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)過程中觀察到相似的最終效價(jià)(圖8B)且再加入糖時(shí)不會(huì)進(jìn)一步增加。接近1.0-1.2M的最終乳酸鹽效價(jià)似乎代表pH7.5時(shí)通過SZ194進(jìn)行的糖代謝的上限(表5)。人們注意到pH7.5(發(fā)酵的最佳pH)非常接近報(bào)道的E.Coli細(xì)胞質(zhì)的pH(Axeetal.,1995;Warneckeetal.,2005)，這一事實(shí)非常有趣。盡管在E.Coli中還沒有確定有乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，但是若干研究已提供了它們存在于E.Coli和乳酸菌中的證據(jù)(Axeetal.,1995;Konings,2002;Poolman,2002)。推測這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是乳酸鹽/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能會(huì)增加效率的活性伴隨外部pH的增加。根據(jù)“能量循環(huán)模式”(Michelsetal.,1979)，代謝終產(chǎn)物如乳酸鹽的載體媒介流出物可導(dǎo)致跨膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度產(chǎn)生并有助于ATP生成。估計(jì)乳酸菌中的乳酸鹽流出物貢獻(xiàn)30%的總細(xì)胞能量(vanMarisetal.,2004a)。由于E.ColiSZ194和乳酸菌以相似途徑代謝葡萄糖，所以E.Coli有可能通過E.Coli乳酸鹽流出物來產(chǎn)生額外的ATP。對由SZ194生產(chǎn)的乳酸鹽的手性純度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)比95%的D-乳酸鹽更高。盡管較好，但是這種手性純度低于母體菌株SZ132(99.5%的D-乳酸鹽)(Zhouetal.,2005)。這種手征不純性的來源還不清楚。根據(jù)本主題發(fā)明，超過1M的乳酸鹽效價(jià)可通過pH7.5時(shí)E.ColiSZ194在補(bǔ)充了1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行生產(chǎn)。這種培養(yǎng)基中SZ194的乳酸生產(chǎn)率和細(xì)胞產(chǎn)率相當(dāng)于Luria培養(yǎng)基(表6)。菌株SZ194的110gL-1的最終乳酸鹽效價(jià)和產(chǎn)率(0.95g乳酸鹽g葡萄糖-1)不亞于諸如瑞士乳桿菌(L.helveticus)(Kyla-Nikkilaetal.,2000)和保加利亞乳桿菌(L.delbrueckii)(Demircietal.,1992)的乳酸菌，并且在豐富培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基中超過以前改造的生物催化劑的性能(Dienetal.,2001;Porroetal.,1999;Saitohetal.,2005;vanMarisetal.,2004b)。實(shí)施例3材料與方法菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基以及生長條件本研究中利用的E.Coli菌株、質(zhì)粒和引物列在表7中。菌株SZ194從E.ColiB(ATCC11303)的衍生物預(yù)先構(gòu)建并作為用于構(gòu)建的起始點(diǎn)(參見實(shí)施例2和Zhouetal.,2006)。在菌株構(gòu)建過程中，有氧條件下(aerobically)培養(yǎng)物在30°C、37°C、或39°C含有2%(w/v)葡萄糖或阿拉伯糖的Luria培養(yǎng)液(每升：10gDifco胰胨，5gDifco酵母提取物以及5g氯化鈉)(Miller1992)中培養(yǎng)。需要時(shí)加入氨芐青霉素(50mg/L)、四環(huán)素(12.5或6.25mg/L)或卡那霉素(25或50mg/L)。為了進(jìn)行發(fā)酵測試，37℃沒有抗生素的條件下、將菌株在補(bǔ)充了1mM甜菜堿和2-12%(w/v)葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Causeyetal.,2004)中進(jìn)行培養(yǎng)。在缺少pH控制(平皿、試管、搖瓶)的條件下，將MOPS緩沖液(100mM，pH7.4)加到固體和液體培養(yǎng)基中。遺傳學(xué)方法DNA純化(Qiagen)、限制性內(nèi)切核酸酶消化(NewEnglandBiolabs)、DNA擴(kuò)增(StratageneandInvitrogen)以及轉(zhuǎn)化，依照廠商方案和標(biāo)準(zhǔn)方法(Miller1992,SambrookandRussell2001)。染色體缺失和整合的方法之前已經(jīng)描述過(Causeyetal.,2004,Zhouetal.,2003,DatsenkoandWanner2000,Martinez-Moralesetal.,1999)。將含有與mgsA基因(斜體)的開始或結(jié)束的50個(gè)核苷酸以及對應(yīng)于pKD4的FRT側(cè)面的卡那霉素盒(加下劃線的)的序列的20個(gè)核苷酸同源的序列的雜交引物(表7)用于天然mgsA基因的缺失。前面構(gòu)建了質(zhì)粒pLOI2398，以便于將乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ldhL整合到E.Coli的染色體ldhA基因中(Zhouetal.,2003a)。發(fā)酵預(yù)接種物通過將菌落接種到250ml燒瓶(100ml含有2%(w/v)葡萄糖和100mMMOPS的NBS培養(yǎng)基，pH7.4)中進(jìn)行培養(yǎng)。16h(37℃，120rpm)后，將這種預(yù)接種物稀釋到含有350mlNBS培養(yǎng)液(含5-12%糖，含或不含1mM甜菜堿)的500ml發(fā)酵容器中，以提供33mgdcwL-1。24h(37℃，150rpm，控制pH在7.0)之后，利用這種培養(yǎng)物來提供33mgdcwl-1的初始接種?；钚宰畲蟮?4h期間的體積生產(chǎn)率給予報(bào)道。單位生產(chǎn)率的計(jì)算是用體積生產(chǎn)率除以24h時(shí)的細(xì)胞量所得的商數(shù)。代謝演化將來自pH控制發(fā)酵的細(xì)胞以24或48h間隔進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以有利于通過競爭性，基于生長的選擇的代謝演化。每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將接種物稀釋(1/100到1/350)入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基。從這些選擇分離出的克隆則賦予新的菌株名稱。分析細(xì)胞量利用Bausch&LombSpectronic70分光光度計(jì)在550nm測量光密度而估計(jì)?？傆袡C(jī)酸產(chǎn)量(主要是乳酸鹽)通過用于保持pH7.0的KOH消耗進(jìn)行估計(jì)。通過高性能液相色譜在發(fā)酵結(jié)束時(shí)分析酸性產(chǎn)物和手性純度。通過堿消耗估計(jì)的有機(jī)酸始終低于通過HPLC測量的乳酸鹽，可能是由于礦物的代謝。結(jié)果與討論恢復(fù)D-㈠-乳酸鹽生產(chǎn)的手性純度結(jié)果表明菌株SZ194在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中可以99%的手性純度從葡萄糖高效產(chǎn)生D-(-)-乳酸鹽(Zhouetal.,2006)。高糖濃度下，甜菜堿能夠增加乳酸鹽生產(chǎn)率(效價(jià)和速率)但也將手性純度降低到95%(表8)。E.Coli中L-(+)-乳酸鹽有若干可能的來源(圖9A)。L-(+)-乳酸鹽可從乳醛(lactaldehyde)產(chǎn)生，乳醛是鼠李糖(rhamnose)或巖藻糖分解代謝過程的中間體(Badiaetal.,1991)，而這兩種糖均不存在于我們的培養(yǎng)基中，并且作為來自糖酵解的丙酮醛支路的產(chǎn)物(圖9A和9B)。丙酮醛支路表示一個(gè)短溢出途徑(spilloverpathway)，由快速糖酵解過程中的二羥基丙酮-磷酸酯(鹽)堆積以及ATP合成時(shí)的磷酸酯(鹽)限制引起。二羥基丙酮-磷酸酯堆積和磷酸酯限制均可因高速的糖酵解代謝流(flux)而加劇。為了檢驗(yàn)這種假設(shè)，將編碼第一個(gè)承諾步驟(committedstep)(丙酮醛合成酶)的mgsA基因缺失。所得的菌株TG112產(chǎn)生手性純的D-(-)-乳酸鹽(表8和9；圖10A和10B)。與SZ194相比，這種缺失提高了了生長和初始生產(chǎn)率?；贖PLC分析的產(chǎn)率類似(表8)。對TG112的進(jìn)一步改進(jìn)通過81天生長過程中的代謝演化進(jìn)行選擇(圖11)。發(fā)酵培養(yǎng)物在含有10%(w/v)葡萄糖、12%(w/v)葡萄糖、以及12%(w/v)葡萄糖和1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)移。在第28天分離到一個(gè)克隆(TG113)并且在富集結(jié)束時(shí)分離到另一個(gè)克隆(TG114)。D-(-)-乳酸鹽生產(chǎn)率(速度、效價(jià)以及產(chǎn)率)和細(xì)胞產(chǎn)率在這個(gè)過程中得到改進(jìn)(圖10A和10B；表8和表9)。利用SZ114的發(fā)酵在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中48h內(nèi)基本上完成，終產(chǎn)率為0.98gD-(-)-乳酸鹽g-1葡萄糖。高接種物為單位生產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率提供了適度的進(jìn)一步改進(jìn)。利用這些缺失mgsA的菌株的副產(chǎn)物和手性雜質(zhì)低于檢測水平(<0.1%)。通過TG114生產(chǎn)D-(-)-乳酸鹽不亞于其他生物催化劑，并且可以利用簡單的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件提供較高生產(chǎn)率、效價(jià)、產(chǎn)率和手性純度(表10)。手性純L-㈩-乳酸鹽的生產(chǎn)為了主要生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽，用來自乳酸片球菌的編碼L-(+)-乳酸脫氫酶的ldhL基因替換編碼D-(-)-乳酸脫氫酶的天然ldhA基因，重新改造D-(-)-乳酸鹽菌株SZ194(Zhouetal.,2003a)。所得菌株TG102主要生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽，并在含有5%(w/v)葡萄糖、10%(w/v)葡萄糖以及含有1mM甜菜堿的10%(w/v)葡萄糖的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以選擇生長和生產(chǎn)率改善的菌株。24天之后，選出一個(gè)克隆并命名為TG103。盡管由于糖酵解代謝流增加而改善了乳酸鹽生產(chǎn)率(圖10C和10D；表9)，但是L-(+)-乳酸鹽被5%的D-(-)-乳酸鹽污染(表8)。由于丙酮醛支路可以生產(chǎn)兩種手性形式的乳酸鹽，所以mgsA被確定為手性雜質(zhì)的最可能的來源。缺失mgsA之后就恢復(fù)了絕對手性純度。所得菌株TG105只生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽(圖10和10D；表8)。進(jìn)一步的改進(jìn)則通過在含有10%-12%(w/v)葡萄糖和1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的連續(xù)轉(zhuǎn)移(接種稀釋度為1∶100到1:350)過程中共選擇(co-select)生長和生產(chǎn)率而實(shí)現(xiàn)。在10次和22次轉(zhuǎn)移后分別分離TG106和TG107作為中間菌株(圖10E和10F)。在99天之后分離出菌株TG108。所有菌株只以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽而副產(chǎn)物達(dá)到最低水平(表8)。雖然單位生產(chǎn)率基本保持不變，但在菌株選擇過程中12%(w/v)葡萄糖中的體積生產(chǎn)率和細(xì)胞產(chǎn)率均增加(表9)。利用較高接種物時(shí)，可以觀察到最大體積生產(chǎn)率(活性最大的24h期間)稍有增加。菌株TG108用于L-(+)-乳酸鹽生產(chǎn)可以比擬其他生物催化劑(表10)。這種菌株的效價(jià)和產(chǎn)率高于其他微生物報(bào)道的效價(jià)和產(chǎn)率。其他的優(yōu)點(diǎn)包括簡單的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基以及手性純度。結(jié)論高效價(jià)(48h內(nèi)>100gl-1)手性純的L-(+)和D-(-)-乳酸鹽(>99.9%的手性純度)可通過重組E.ColiB在補(bǔ)充了1mM甜菜堿的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中容易地進(jìn)行生產(chǎn)。消除丙酮醛支路對于去除乳酸鹽的D-(+)及L-(-)對映異構(gòu)體中的雜質(zhì)是必要的。實(shí)施例4通過去除來自TG114的所有外源DNA構(gòu)建TG128為了促進(jìn)用于乳酸鹽生產(chǎn)的重組E.Coli菌株的商業(yè)應(yīng)用，進(jìn)一步構(gòu)建了TG114的衍生物，其中去除了前面基因改造過程中在染色體中留下的所有外源DNA。去除的DNA包括含有用來去除抗生素標(biāo)記的翻轉(zhuǎn)酶(flippase)(重組酶)的FRT識別位點(diǎn)的scar區(qū)、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的DNA小片段、產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB的部分、以及菊歐文氏菌celY的部分。這些外源DNA片段被徹底去除，只留下天然染色體DNA，其中所選基因的中心區(qū)域已被去除用以提高乳酸鹽的生產(chǎn)。菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件本研究中使用的E.Coli菌株、質(zhì)粒和引物列于表11中。菌株TG114之前從E.ColiB(ATCC11303)的衍生物構(gòu)建并用作構(gòu)建的起始點(diǎn)(Grabaretal.,2006)。菌株構(gòu)建過程中，有氧條件下培養(yǎng)物在含有2%(w/v)葡萄糖和阿拉伯糖或10%蔗糖的Luria培養(yǎng)液(每升：10gDifco胰胨，5gDifco酵母提取物以及5g氯化鈉)(Miller1992)中、于30℃、37℃、或39℃進(jìn)行培養(yǎng)。如果需要，則加入氨芐青霉素(50mg/L)、金霉素(10mg/L)或氯霉素(40mg/L)。將培養(yǎng)物保持在含有補(bǔ)充了2%(w/v)葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Causeyetal.,2004)的平皿上。在缺少pH控制的條件(平皿、試管、搖瓶(shakenflasks))下將MOPS緩沖液(100mM，pH7.4)加入固體和液體培養(yǎng)基。為了進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，將菌株在37℃沒有抗生素的情況下在AM1無機(jī)鹽培養(yǎng)基(每升：2.63g(NH4)2HPO4，0.87gNH4H2PO4，0.37gMgSO4·7H2O，2.4mgFeCl3，0.3mgCoCl2·6H2O，0.15mgCuCl2，0.3mgZnCl2·4H2O，0.3mgNaMoO4，0.075mgH3BO3，0.075mgMnCl2·4H2O2，1mM甜菜堿以及120g/L葡萄糖)中進(jìn)行培育。遺傳學(xué)方法基因克隆(Invitrogen)、DNA純化(Qiagen)、限制性內(nèi)切核酸酶消化(NewEnglandBiolabs)、DNA擴(kuò)增(StratageneandInvitrogen)以及轉(zhuǎn)化，依照廠商方案和標(biāo)準(zhǔn)方法。用于染色體缺失和整合的方法之前已經(jīng)描述過(Causeyetal.,2004,Zhouetal.,2003,DatsenkoandWanner2000,Martinez-Moralesetal.,1999)。所使用質(zhì)粒和引物的說明列于表11中。質(zhì)粒構(gòu)建通過設(shè)計(jì)在E.ColiBgDNA的frdABCD操縱子‘frdAfrdBfrdC和frdD’內(nèi)部擴(kuò)增的引物、隨后連接到Invitrogen克隆載體pCR2.1-TOPO中而產(chǎn)生質(zhì)粒pLOI4411(表11)。質(zhì)粒pLOI4412、pLOI4413、pLOI4415以及pLOI4416用類似的方法進(jìn)行構(gòu)建，以便分別克隆感興趣的天然基因ackA、adhE、focA-plfB以及mgsA。利用反義引物產(chǎn)生編碼無縫基因敲除(knockout)的質(zhì)粒。設(shè)計(jì)具有5’磷酸酯基團(tuán)的反義引物以擴(kuò)增除要去除的基因區(qū)以外的整個(gè)質(zhì)粒(圖12)。例如，pLOI4417通過在pLOI4411上進(jìn)行PCR而生成，一引物在frdA的3’端退火(向上游延伸)、另一引物在frdC內(nèi)退火(向下游延伸)。所得4263bpPCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DpnI進(jìn)行處理，以消化天然pLOI4411質(zhì)粒。消化的PCR產(chǎn)物隨后進(jìn)行自身連接，以產(chǎn)生新的質(zhì)粒pLOI4417。利用列于表11中的引物組，以類似的方式產(chǎn)生質(zhì)粒pLOI4418、pLOI4419、pLOI4421以及pLOI4422。這些質(zhì)粒作為PCR模板，用來擴(kuò)增含有預(yù)期缺失并缺少所有異源序列的線性DNA。將這種線性DNA用來通過同源重組(雙向跨接過程，doublecross-overevent)替換FRTscar區(qū)、異源DNA、以及sacB。用這種方式就在染色體上形成了所選基因的無縫去除。從TG114去除FRTScar和異源DNA由DatsenkoandWanner(2000)的一步去除法留下的～85bpFLP識別靶標(biāo)(FRT)scar可通過兩步法去除。首先，F(xiàn)RT位點(diǎn)單獨(dú)地通過環(huán)形FRT-cat-sacB盒進(jìn)行靶向，導(dǎo)致這種盒的單跨接整合(singlecross-overintergration)到染色體上的FRTscar(FRT-cat-sacB-FRT)。含有cat-sacB-FRT盒的環(huán)形DNA構(gòu)建如下：1)利用質(zhì)粒pLOI4151作為模板進(jìn)行FRT-cat-sacB盒的PCR擴(kuò)增。被擴(kuò)增的盒包括側(cè)翼的PstI位點(diǎn)；2)用PstI消化，隨后通過自身連接以產(chǎn)生不能自動(dòng)復(fù)制的閉合環(huán)。這種環(huán)形DNA用于整合。cat基因的表達(dá)賦予氯霉素抗性，并允許直接選擇含有該整合的細(xì)胞。第二步中，sacB基因允許直接選擇細(xì)胞，其中含有sacB的DNA區(qū)已通過同源重組(雙向跨接過程)而去除。在有10%蔗糖的情況(Ausubeletal.,2005;Leeetal.,2001)下表達(dá)sacB的細(xì)胞通過多糖的胞內(nèi)生產(chǎn)而被殺滅和溶解。利用這種方法，那些DNA已通過插入而替換sacB的重組體(recombinant)可從大的種群中進(jìn)行篩選。在本實(shí)施例中，通過雙向跨接過程的線性DNA片段的整合可得到完全敲除(cleanknockout)的菌株，只含有天然DNA或伴有缺失的天然DNA，不含任何異源DNA。第二步中使用天然DNA序列或含有預(yù)期基因缺失的天然序列，以徹底去除FRTscar區(qū)和來自TG114的所有異源DNA。線性DNA片段經(jīng)電穿孔之后，將細(xì)胞在1mLSOC培養(yǎng)基中于37℃振搖孵育4小時(shí)。經(jīng)過4小時(shí)的擴(kuò)大培養(yǎng)(outgrown)后，將該細(xì)胞在50mL補(bǔ)充了10%(w/v)蔗糖的無鹽的LB(每升：10gDifco胰胨，5gDifco酵母提取物)中孵育16-20小時(shí)。然后將細(xì)胞刮涂(struckonto)到補(bǔ)充了5%蔗糖的無鹽的LB瓊脂平板上。保留FRT-cat-sacB的多數(shù)細(xì)胞在有蔗糖的情況下延長周期之后不能存活。存活且形成菌落的細(xì)胞則缺少sacB和scar區(qū)。連續(xù)使用這種方法，將存在于TG114中的全部5個(gè)FRTscar消除并恢復(fù)lac操縱子。在這個(gè)過程中使用的引物、質(zhì)粒以及菌株總結(jié)在表11中。利用兩步法的修改將整合到lacA中的casAB基因去除并用這個(gè)區(qū)域中的野生型序列加以替換。整合到frdA中的菊歐文氏菌celY片段(和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌DNA)在構(gòu)建無縫frdBC缺失體的過程中被去除。所得菌株TG128缺少FRTscar并且只含有天然DNA序列，這些序列含有在表11所示的基因中的缺失區(qū)。示出了對于TG114和TG128的基因缺失區(qū)中的初始序列的對比(表12)。天然lac操縱子的恢復(fù)TG114含有來自以前構(gòu)建體的在lacYlacA區(qū)中的異源DNA片段(來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌casAB、菊歐文氏菌celY的部分的DNA片段)(Grabaretal.,2006)。從TG120去除這些而產(chǎn)生TG122，并且在TG122隨后的衍生物中不存在。用于這種構(gòu)建的引物列在表11中。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，將來自E.ColiB從天然lacZ’到cynX的區(qū)域加以擴(kuò)增并克隆到pCR2.1-TOPO中，以產(chǎn)生pLOI3956。為了有利于重組體的選擇，如下將pLOI3956的中心區(qū)(lacZ’-lacA’)用含有cat和sacB基因的盒加以替換。以pLOI3956作為模板，使用含有NheI位點(diǎn)的反義引物來擴(kuò)增lacZ’、pCR2.1以及cynX(省去lacZ’的部分、lacY、lacA和cynX’的部分)。使用第二組含有NheI位點(diǎn)的引物擴(kuò)增來自pEL04(最初通稱pK04，Ausubeletal.,2005andLeeetal.,2001)的cat-sacB盒。在利用NheI的消化之后，將這些PCR產(chǎn)物加以連接而產(chǎn)生pLOI3957，這是含有l(wèi)acZ’-sacB-cat-cynX’的pCR2.1的衍生物。以質(zhì)粒pLOI3957作為模板，將lacZ’-sacB-cat-cynX’經(jīng)PCR擴(kuò)增并整合到具有用于氯霉素抗性的選擇性的TG120中，以產(chǎn)生TG121。利用pLOI3956作為模板，將野生型lacZ’-lacY-lacA-cynX’區(qū)經(jīng)PCR擴(kuò)增并整合到TG121中。通過在有蔗糖的生長過程中sacB功能缺乏而選擇含有l(wèi)acZYA操縱子的天然序列的整合體。將這些整合體中的一種命名為TG122。菌株TG122是TG128構(gòu)建過程中的中間菌株。發(fā)酵預(yù)接種物通過將菌落接種到250mL燒瓶(盛有100mL含有2%(w/v)葡萄糖和100mMMOPS(pH7.4)的NBS培養(yǎng)基(Causeyetal.,2004)進(jìn)行培養(yǎng)。16h(37℃，120rpm)后，將這種預(yù)接種物稀釋到盛有350mLAF1無機(jī)鹽培養(yǎng)基(12%糖)的500mL發(fā)酵容器中，以提供33mgdcw/L。24h(37℃，150rpm，pH控制在7.0)后得到的培養(yǎng)物用來提供33mgdcw/L的初始接種物，并在相同條件下孵育96h。移出樣品用于分析。分析利用Bausch&LombSpectronic70分光光度計(jì)在550nm檢測光密度而估計(jì)細(xì)胞量?？傆袡C(jī)酸產(chǎn)量(主要是乳酸鹽)通過用于保持pH7.0的KOH消耗進(jìn)行估計(jì)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)通過高性能液相色譜分析酸性產(chǎn)物和手性純度。通過堿消耗估計(jì)的有機(jī)酸始終低于通過HPLC測量的乳酸鹽，可能是由于礦物的代謝。利用TG128的葡萄糖發(fā)酵菌株TG114經(jīng)過深入的(intensive)遺傳學(xué)操作而去除FRTscar和其他外源DNA。所得微生物菌株TG128只含有天然的、野生型DNA序列和基因的無縫缺失，從而消除不需要的發(fā)酵產(chǎn)物。這種菌株的發(fā)酵性能基本上與TG114相當(dāng)，最大理論產(chǎn)率的96%-98%的乳酸鹽產(chǎn)率(表13)。通過代謝演化選擇用于乳酸鹽生產(chǎn)的耐熱突變體利用代謝演化來選擇能夠在高溫下進(jìn)行有效乳酸鹽生產(chǎn)的菌株。pH控制發(fā)酵的細(xì)胞以24h的間隔進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，以利于通過競爭性、基于生長選擇的代謝演化。每次轉(zhuǎn)移均將接種物稀釋(1/100到1/350)到預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基中。孵育溫度在生長允許的情況下，每次增加一度的一小部分(afractionofadegree)，以有利于分離出耐熱菌株。菌株TG128的發(fā)酵優(yōu)選在37°C。在連續(xù)轉(zhuǎn)移的過程中，突變體通過孵育溫度遞增而獲得。用這種方法，從TG128篩選出新的菌株，其能夠在39℃(菌株TG129)和43℃(菌株TG130)進(jìn)行有效發(fā)酵。這兩種耐熱菌株在高溫下的產(chǎn)率相當(dāng)于TG114在37℃的產(chǎn)率(表13)。利用TG128的葡萄糖發(fā)酵菌株TG114經(jīng)過深入的遺傳學(xué)操作而去除FRTscar和其他外源DNA。所得微生物菌株TG128只含有天然的、野生型DNA序列和基因的無縫缺失，從而消除不需要的發(fā)酵產(chǎn)物。這種菌株的發(fā)酵性能基本上與TG114相當(dāng)，最大理論產(chǎn)率的96%-98%的乳酸鹽產(chǎn)率(表13)。選擇用于乳酸鹽生產(chǎn)的耐熱突變體利用代謝演化來選擇能夠在高溫下進(jìn)行有效乳酸鹽生產(chǎn)的菌株。連續(xù)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中(其中溫度以一度的一小部分增加)允許TG129(其發(fā)酵優(yōu)選在39℃)和TG130(其發(fā)酵優(yōu)選在43℃)的分離。這兩種在高溫下的產(chǎn)率相當(dāng)于TG114在37℃的產(chǎn)率(表13)。a除非另有說明，NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基含有12%(w/v)葡萄糖(pH7.0)。當(dāng)有指明時(shí)，還需加入1mM甜菜堿。粗體字菌株生產(chǎn)D-(-)-乳酸鹽。下劃線的菌株生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽。b產(chǎn)率基于代謝的糖，假定每摩爾己糖有2摩爾乳酸鹽的最大理論產(chǎn)率(等重量轉(zhuǎn)化)。a無機(jī)鹽(培養(yǎng)基)NBS含有12%(w/v)葡萄糖、1mM甜菜堿、控制pH在7.0(除非另有說明)。粗體字菌株生產(chǎn)D-(-)-乳酸鹽。下劃線的菌株生產(chǎn)L-(+)-乳酸鹽。bpH控制在7.5。c5%接種物。d10%接種物。e10%葡萄糖。f產(chǎn)率最高的24h期間的平均值。a用粗體字示出的是基因的5’和3’區(qū)的部分序列，斜體是FRTscar以及下劃線的是菌株TG128中缺失的區(qū)域。b這個(gè)區(qū)還含有來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌啟動(dòng)子的部分序列以及來自菊歐文氏菌celY基因的部分序列(以下劃線的正常體示出)。c破折號表示缺失的區(qū)域a含有12%(w/v)葡萄糖、1mM甜菜堿、控制pH在7.0的無機(jī)鹽(培養(yǎng)基)(NBS)。b產(chǎn)率是基于代謝的糖，假定每摩爾己糖有2摩爾乳酸鹽的最大理論產(chǎn)率(等重量轉(zhuǎn)化)。將本文所參照或引用的所有專利、專利申請以及出版物的全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考，包括所有圖形和表格，到它們與本說明書顯而易見的內(nèi)容相一致的程度。應(yīng)當(dāng)理解本文所描述的實(shí)施例和具體實(shí)施方式只是用于說明的目的，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，建議根據(jù)其作出各種更改和變化，且這些修改和變化都包括在本申請的精神和范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)U.S.PatentNo.4,963,486U.S.PublishedPatentApplicationNo.20040005677U.S.PublishedPatentApplicationNo.20030003553U.S.PublishedPatentApplicationNo.20050112737U.S.PublishedPatentApplicationNo.20040029256WO99/14335Adachietal.(1998)“ModificationofmetabolicpathwaysofSaccharomycescerevisiaebytheexpressionoflactatedehydrogenaseanddeletionofpyruvatedecarboxylasegenesforthelacticacidfermentationatlowpHvalue”J.Ferment.Bioeng.86:284-289.Agrawal,A.K.(2003)“Advancesintheproductionofpoly(lacticacid)fibers.Areview.”J.Macromolec.Science-PolymerRev.,4:479-503.Arntzen,C.E.,Dale,B.E.(1999)Biobasedindustrialproducts,prioritiesforresearchandcommercialization,NationalAcademyPress,Washington,D.C.Ausubel，F(xiàn).M.etal.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.Ausubel,F.M.,R.Brent,R.E.Klingston,D.D.Moore,J.G.Deidman,J.A.SmithandK.Struhl(eds.)(2005)Currentprotocolsinmolecularbiology.Jo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