專利名稱：殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H₂O₂檢測熒光生物傳感器中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H2O2檢測熒光生物傳感器中的應(yīng)用，屬于高分子材料的制備與改性領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖由于其來源豐富，價格低廉，易于化學(xué)修飾，可與酶結(jié)合，具有良好的成膜性、生物相容性、生物可降解性、滲透性、親水性、機(jī)械強(qiáng)度等優(yōu)異性能，在生物傳感器用功能膜材料中具有重要的應(yīng)用價值。環(huán)糊精具有獨(dú)特的內(nèi)疏水、外親水的空腔結(jié)構(gòu)，是熒光生物傳感器檢測的重要載體。將具有光化學(xué)探針性能的有機(jī)小分子在環(huán)糊精的疏水性空腔內(nèi)進(jìn)行包絡(luò)，可使探針分子在水溶液中實(shí)現(xiàn)均勻分散，而且環(huán)糊精與適宜尺寸的熒光探針的匹配可增加熒光發(fā)射速度常數(shù)，減少分子移動自由度，避免去活碰撞，保持適宜的微環(huán)境，并保護(hù)激發(fā)態(tài)不與大體積水分子和猝滅劑接觸，可顯著增強(qiáng)熒光探針的熒光強(qiáng)度，更有利于對客體分子的檢測。將殼聚糖固載環(huán)糊精超分子主體應(yīng)用于熒光傳感器，可將殼聚糖的易成膜、易功能修飾性能以及良好的生物化學(xué)性能與環(huán)糊精空腔良好的超分子包絡(luò)作用相結(jié)合，發(fā)揮各自優(yōu)勢，制備出性能優(yōu)異的熒光生物傳感器。已有文獻(xiàn)報道了在殼聚糖2-NH2固載環(huán)糊精后，利用環(huán)糊精的疏水性空腔包結(jié)熒光探針用于傳感器檢測。但對于需要通過組合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光檢測的傳感器響應(yīng)模式來說，上述殼聚糖2-NH2固載環(huán)糊精衍生物的檢測效果將大大降低。如對目前食品、保健品中使用較多的添加劑H2O2在進(jìn)行檢測時，需要利用過氧化氫酶與熒光探針的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)檢測，通過H2O2在過氧化氫酶的催化作用下，分解產(chǎn)生的.0Η進(jìn)一步氧化一定的熒光探針，從而使其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化而實(shí)現(xiàn)檢測。過氧化氫酶容易失活，為了提高其穩(wěn)定性，需要將其固定在傳感器敏感膜中。但當(dāng)殼聚糖氨基上固載體積較大的環(huán)糊精大環(huán)化合物時，將產(chǎn)生較大的位阻，影響在殼聚糖氨基上酶的固定，影響酶與待測物的反應(yīng)，從而影響檢測效果。因此，目前有關(guān)殼聚糖固載環(huán)糊精應(yīng)用于需要通過組合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光檢測的傳感器未見報道。在殼聚糖的6-0Η定位取代環(huán)糊精，同時保留其2-ΝΗ2，可制得性能優(yōu)異的殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物。對具有此結(jié)構(gòu)的衍生物，可利用殼聚糖骨架上的2-ΝΗ2固定生物酶，利用環(huán)糊精的疏水性空腔包結(jié)、穩(wěn)定、增敏熒光探針，將催化分解與熒光響應(yīng)在同一功能分子上實(shí)現(xiàn)，顯著提高響應(yīng)效果及測試穩(wěn)定性。但目前文獻(xiàn)所報道的固載方法均存在一定的缺陷，環(huán)糊精的固載效率不高，均小于50 μ mol.g—1。環(huán)糊精固載率較低時，固載的疏水性空腔難以包埋足夠的熒光探針，導(dǎo)致熒光響應(yīng)性能變差。專利CN201110441171.4提出了一種通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備具有高固載率的殼聚
糖6-0H定位固載環(huán)糊精衍生物的制備方法。該方法的反應(yīng)方程式為:
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 具體制備步驟為: 第一步:殼聚糖2-NH2保護(hù)衍生物的制備 1)稱取1份殼聚糖溶于30 400份的質(zhì)量濃度為0.1% 10%的醋酸的水溶液中； 2)將1 10份鄰苯二甲酸酐溶于30 400份有機(jī)化合物A中后滴加到1)得到的反應(yīng)體系中，在O 80°C下攪拌反應(yīng)0.5 8小時；然后加入溶劑B使產(chǎn)生的殼聚糖衍生物沉淀析出，用有機(jī)溶劑C洗滌2次以上以除去多余鄰苯二甲酸酐化合物，然后50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐保護(hù)的殼聚糖衍生物a ； 有機(jī)化合物A為乙醇、乙醚、苯或DMF ； 有機(jī)溶劑B為甲醇、丙酮或乙腈； 有機(jī)溶劑C為乙醇、乙醚或苯； 第二步:殼聚糖2-NH2保護(hù)，6-OH對甲苯磺酰酯化衍生物的制備將1份第一步得到的鄰苯二甲酸酐化殼聚糖衍生物a溶解在20-400份的有機(jī)溶劑D中，向其中加入10 100份的對甲苯磺酰氯的有機(jī)溶液E，1 60分鐘滴完，然后在-10 80°C下反應(yīng)0.5 8小時，抽濾，得淺黃色固體，用有機(jī)溶劑F洗去未反應(yīng)的對甲苯磺酰氯，在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖衍生物b ； 有機(jī)溶劑D為DMF，DMSO或DMAc ； 有機(jī)溶液E中的溶劑為三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO ;有機(jī)溶液E中對甲苯磺酰氯的質(zhì)量濃度為2% 40% ; 有機(jī)溶劑F為三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮； 第三步:殼聚糖2-NH2保護(hù)，6-0H疊氮化衍生物的制備 稱取1份第二步得到的殼聚糖衍生物b溶于10 60份的有機(jī)溶劑G中，O 80°C下攪拌使之溶解，加入1 10份的疊氮化鈉，在20 100°C條件下攪拌反應(yīng)1 8小時，反應(yīng)結(jié)束后，使用50 300份水沉淀，用水洗滌析出物，最后依次用有機(jī)溶劑H和水洗滌2次以上，抽濾后50 100°C真空干燥得到殼聚糖的疊氮化衍生物c ； 有機(jī)溶劑G為DMF、DMSO或DMAc ； 有機(jī)溶劑H為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或四氫呋喃； 第四步:環(huán)糊精單對甲苯磺?；苌锏闹苽? 1)稱取1份環(huán)糊精，加入3 20份質(zhì)量濃度為0.2% 5%的堿I的水溶液中，在-10 50°C下攪拌使β -環(huán)糊精完全溶解； 2)將0.5 5份對甲苯磺酰氯溶解于1 10份的有機(jī)溶劑J中，用恒壓滴液漏斗在5 30分鐘內(nèi)滴加到1)得到的反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)0.5 6小時后，加入氯化銨調(diào)節(jié)溶液的PH值到7 9，有大量的白色物質(zhì)析出；用去離子水和有機(jī)溶劑J分別清洗抽濾2次以上，然后將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的對甲苯磺?；苌飀 ； 堿I為NaOH、KOH或氨水； 有機(jī)溶劑J為三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO ； 第五步:環(huán)糊精單炔基化衍生物的制備 將I份第四步得到的對甲苯磺?；苌飀和1 10份炔丙胺或炔丙醇分散在10 150份的水和有機(jī)溶劑K的混合物中，在20 80°C、N2保護(hù)下，攪拌反應(yīng)12 48小時后，加入沉淀劑L，析出沉淀，過濾，用水、有機(jī)溶劑K洗滌2次以上后，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的單炔基化衍生物e ； 有機(jī) 溶劑K為乙醇、丙醇、DMF或DMSO ； 水和有機(jī)溶劑K的混合物中水與有機(jī)溶劑O的質(zhì)量比為1: 9 9:1 ; 沉淀劑L為乙腈、丙酮、四氫呋喃或N-甲基吡咯烷酮； 第六步:點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備殼聚糖2-NH2保護(hù)，6-0H定位固載化環(huán)糊精衍生物 1)稱取I份第三步得到的殼聚糖的疊氮化衍生物c，溶解于I 30份的有機(jī)溶劑M中； 2)稱取0.01 0.1份CuSO4.5H20分散于I 10份有機(jī)溶劑N中，加入0.01 0.1份抗壞血酸鈉及0.01 0.5份水,增進(jìn)溶解； 3)將I)得到的溶液和2)得到的溶液進(jìn)行混合； 4)稱取I 5份第五步得到的環(huán)糊精的單炔基化衍生物e加入3)得到的混合溶液中，在O 80°C下攪拌反應(yīng)0.5 8小時，停止反應(yīng)，加入沉淀劑O后，用水洗滌2次以上，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f ； 有機(jī)溶劑M為DMSO、DMF或DMAc ； 有機(jī)溶劑N為乙醇、丙醇、DMF或DMSO ； 沉淀劑O為乙腈、丙酮、四氫呋喃或N-甲基吡咯燒酮； 第七步:2-NH2的脫保護(hù)反應(yīng)及殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的獲得將I份第六步得到的鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f浸泡在20 200份的水合肼溶液中(其中H2NNH2與H2O的摩爾比為1: 0.5 1: 3)，20 60°C下加熱攪拌反應(yīng)12 36小時，用有機(jī)溶劑P沉淀后，用有機(jī)溶劑Q洗滌兩次后在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g ； 有機(jī)溶劑P為甲醇、丙酮或乙腈； 有機(jī)溶劑Q為乙醇、乙醚或苯。
2.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第二步的殼聚糖2-NH2保護(hù)，6-0H對甲苯磺酰酯化衍生物的制備，其具體制備方法為: 將1份第一步得到的鄰苯二甲酸酐化殼聚糖衍生物a溶解在20-100份的有機(jī)溶劑D中，向其中加入20 60份的對甲苯磺酰氯的有機(jī)溶液E，10 40分鐘滴完，然后在-10 80°C下反應(yīng)3 6小時，抽濾，得淺黃色固體，用有機(jī)溶劑F洗去未反應(yīng)的對甲苯磺酰氯，在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖衍生物b ； 有機(jī)溶劑D為DMF，DMSO或DMAc ； 有機(jī)溶液E中的溶劑為三氯甲烷或DMSO ;有機(jī)溶液E中對甲苯磺酰氯的質(zhì)量濃度為2% 40% ； 有機(jī)溶劑F為三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮。
3.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第三步的殼聚糖2-NH2保護(hù)，6-0H疊氮化衍生物的制備，其具體制備方法為: 稱取I份殼聚糖衍生物b溶于20 40份的有機(jī)溶劑G中，O 80°C下攪拌使之溶解，加入1 4份的疊氮化鈉，在50 90°C條件下攪拌反應(yīng)3 6小時，反應(yīng)結(jié)束后，使用50 300份水沉淀，用水洗滌析出物，最后依次用有機(jī)溶劑H和水洗滌2次以上，抽濾后50 80°C真空干燥得到殼聚糖的疊氮化衍生物c ； 有機(jī)溶劑G為DMF、DMSO或DMAc ； 有機(jī)溶劑H為乙醇、丙酮或四氫呋喃。
4.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第四步的環(huán)糊精單對甲苯磺?；苌锏闹苽?，其具體制備方法為: 1)稱取I份環(huán)糊精，加入5 12份質(zhì)量濃度為0.5% 2%的堿I的水溶液中，在-10 30°C下攪拌使β -環(huán)糊精完全溶解； 2)將I 3份對甲苯磺酰氯溶解于I 5份的有機(jī)溶劑J中，用恒壓滴液漏斗在10 20分鐘內(nèi)滴加到I)得到的反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)I 3小時后，加入氯化銨調(diào)節(jié)溶液的pH值到7 9，有大量的白色物質(zhì)析出；用去離子水和有機(jī)溶劑J分別清洗抽濾2次以上，然后將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的對甲苯磺?；苌飀 ； 堿I為NaOH或KOH ； 有機(jī)溶劑J為三氯甲烷或DMSO。
5.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第五步的環(huán)糊精單炔基化衍生物的制備，其具體制備方法為: 將I份第四步得到的對甲苯磺?；苌飀和I 5份炔丙胺或炔丙醇分散在20 70份的水和有機(jī)溶劑K的混合物中，在40 70°C、N2保護(hù)下，攪拌反應(yīng)20 30小時后，力口入沉淀劑L，析出沉淀，過濾，用水、有機(jī)溶劑K洗滌2次以上后，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的單炔基化衍生物e ； 有機(jī)溶劑K為乙醇或DMSO ； 水和有機(jī)溶劑K的混合物中水與有機(jī)溶劑O的質(zhì)量比為3: 7 7: 3 ； 沉淀劑L為乙腈或四氫呋喃。
6.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第六步的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備殼聚糖2-順2保護(hù)，6-0H定位固載化環(huán)糊精衍生物，其具體制備方法為: 1)稱取I份殼聚糖的疊氮化衍生物c，溶解于5 15份的有機(jī)溶劑M中； 2)稱取0.01 0.05份CuSO4.5Η20分散于I 10份有機(jī)溶劑N中，加入0.01 0.05份抗壞血酸鈉及0.01 0.2份水增進(jìn)溶解； 3)將I)得到的溶液和2)得到的溶液進(jìn)行混合； 4)稱取I 5份第五步得到的環(huán)糊精的單炔基化衍生物e加入3)得到的混合溶液中，在20 60°C下攪拌反應(yīng)3 6小時，停止反應(yīng)，加入沉淀劑O后，用水洗滌2次以上，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f ； 有機(jī)溶劑M為DMSO、DMF或DMAc ； 有機(jī)溶劑N為乙醇或DMSO ; 沉淀劑O為乙腈或四氫呋喃。
7.按權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第七步的2-NH2的脫保護(hù)反應(yīng)及殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的獲得，其具體制備方法為: 將第六步得到的I份鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f浸泡在30 100份的水合肼溶液中(其中H2NNH2與H2O的摩爾比為1: 0.5 1: 2)，20 40°C下加熱攪拌反應(yīng)12 20小時，用有機(jī)溶劑P沉淀后，用有機(jī)溶劑Q洗滌兩次后在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g ； 有機(jī)溶劑P為甲醇、丙酮或乙腈； 有機(jī)溶劑Q為乙醇、乙醚或苯。
8.一種利用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物制備用于H2O2檢測的熒光生物傳感器檢測材料的方法，其特征是: 具體制備步驟如下: 第一步:殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針的制備 將殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物g溶于溶劑R中；其中殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物在溶液中的濃度為0.001 0.05mol/L ；向上述溶液中加入熒光探針，殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物g與熒光探針的摩爾投料比1: 0.5 1: 10 ;在30 90°C油浴中回流攪拌反應(yīng)I 8小時；反應(yīng)完畢后，用去離子水沉淀包合物，用溶劑S洗去未發(fā)生包合的熒光探針，干燥，得殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針產(chǎn)物； 溶劑R為:乙醇，丙酮，甲醇，DMF，DMSOjjC ; 熒光探針為:羅丹明B，香豆素，水楊基熒光酮，苯基熒光酮中的一種； 溶劑S為:乙二醇，乙醚 ，氯仿，乙腈； 第二步:殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針-固載過氧化氫酶的制備 將殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針溶解于水中，殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針的摩爾濃度為0.001mol/L 0.05mol/L ;將過氧化氫酶加入pH=7的0.05 0.2mol/L的PBS緩沖溶液中，配制成質(zhì)量濃度為10.0 50.0mg/mL的過氧化氫酶溶液； 稱取I份的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針溶液，按照過氧化氫酶占溶液用量為0.0005 0.01份加入過氧化氫酶溶液，在4 70攝氏度反應(yīng)0.5 10小時后，力口入0.0001 0.008份的戊二醛，在4 70攝氏度再反應(yīng)0.5 10小時后，加入10 50份的環(huán)己烷，攪拌后離心分離，抽濾，用去離子水洗滌固體產(chǎn)物，洗去未發(fā)生交聯(lián)的戊二醛，抽濾，用0.05 0.2mol/L的PBS緩沖溶液洗去未發(fā)生固定化的過氧化氫酶，制得殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包結(jié)熒光探針-固載過氧化氫酶產(chǎn)物，即為用于H2O2檢測的熒光生物傳感器檢測材料。
9.一種利用權(quán)利要求8所述的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合突光探針-固載過氧化氫酶產(chǎn)物對H2O2進(jìn)行熒光生物傳感器檢測的方法，其特征是: 首先配制不同濃度的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，將殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針-固載過氧化氫酶產(chǎn)物溶解在水中，測量各H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收峰的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對H2O2在溶液中的濃度作圖，利用兩者的線性關(guān)系，得到殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針-固載過氧化氫酶溶液對H2O2的有效檢測范圍及工作曲線；最后測量殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合熒光探針-固載過氧化氫酶水溶液在H2O2待測溶液中的最大吸收峰的熒光強(qiáng)度，對應(yīng)前面得到的工作曲線，得到待測溶液中H2O2的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H2O2檢測熒光生物傳感器中的應(yīng)用，屬于高分子材料的制備與改性領(lǐng)域。本發(fā)明以鄰苯二甲酸酐保護(hù)殼聚糖2-NH2，通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在其6-OH位置固載環(huán)糊精后，再以水合肼脫除殼聚糖2-NH2的保護(hù)，制得在水和部分有機(jī)溶劑中具有良好溶解性的，具有高固載率的殼聚糖6-OH定位固載環(huán)糊精衍生物。將通過本發(fā)明制得的殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物中的環(huán)糊精疏水性空腔中固載熒光探針，殼聚糖吡喃環(huán)的2-NH2固載過氧化氫酶后，應(yīng)用于對H2O2含量檢測用的熒光生物傳感器。本發(fā)明使殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物在以酶催化作用配合熒光檢測的熒光生物傳感器中的應(yīng)用成為可能。
文檔編號C08G81/00GK103087328SQ20131004252
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者陳煜 , 葉彥春, 李偉萍, 郭燕文 申請人:北京理工大學(xué)