一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法
【專利摘要】一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，涉及從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備低分子量、低蛋白質(zhì)含量的透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明采用透明質(zhì)酸發(fā)酵液為原料，經(jīng)過乙醇沉淀、脫水、沉淀物復(fù)溶、復(fù)溶液加熱、活性炭吸附、堿性條件下水解得到寡聚透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明制備的寡聚透明質(zhì)酸鈉分子量在10000道爾頓以下，分布集中，蛋白質(zhì)含量為0，提取收益率在95％以上。本發(fā)明操作簡單，成本較低，尤其適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，尤其是從透明質(zhì)酸 發(fā)酵液中制備低分子量、分子量分布集中且低蛋白質(zhì)含量的寡聚透明質(zhì)酸。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA)是一種在人體內(nèi)廣泛存在的生物大分子，其重 復(fù)的二糖基本結(jié)構(gòu)單元是由β-1，4-糖苷鍵和β-1，3-糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡萄糖 和葡萄糖醛酸。透明質(zhì)酸在人體內(nèi)一般以較低分子量存在，主要集中在10kDa至50kDa范 圍，主要在生理環(huán)境中起到組織潤滑，免疫調(diào)節(jié)等作用，在醫(yī)學(xué)上已廣泛應(yīng)用于防止術(shù)后粘 連，填充劑和外用藥物等。目前發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸在體內(nèi)的生物活性受到其相對分子量的影 響。低分子量透明質(zhì)酸和寡糖透明質(zhì)酸有高分子沒有的生物活性，如促進血管生成，促進傷 口愈合等作用，特別的在某些腫瘤部位，透明質(zhì)酸會大量富集，一方面在抑制腫瘤細胞的耐 藥性并參與免疫調(diào)節(jié)，另一方面由于其潤滑作用可以使腫瘤快速擴散。由于低分子量透明 質(zhì)酸在人體有諸多作用，而且保持了優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，關(guān)于低分子量透明 質(zhì)酸的藥物載體在研究受到了極大地關(guān)注。
[0003] 現(xiàn)有降解高分子透明質(zhì)酸的方法主要有化學(xué)法，物理法和酶解法。酶解法價格昂 貴，工藝復(fù)雜，且無法回收透明質(zhì)酸酶，需要除去蛋白和內(nèi)毒素，因此不適合大規(guī)模的工業(yè) 生產(chǎn)。物理法其降解力度有限，難以得到分子量在10000道爾頓以下的寡聚透明質(zhì)酸。化 學(xué)法主要包括水解法和氧化法，氧化法常采用的氧化劑為次氯酸鈉和過氧化氫，但往往會 產(chǎn)生氧化劑殘留。水解法分為酸解法和堿解法，酸解法一般采用濃鹽酸水解，平均分子量降 至10000以下時，分子量分布較寬。所有上述方法都是采用成品透明質(zhì)酸或鹽做為原料通 過講解得到寡聚透明質(zhì)酸或鹽，雖然國內(nèi)外研究比較深入，但存在的缺點有：1)利用成品 透明質(zhì)酸或鹽作為原料成本較高；2)降解得到的寡聚透明質(zhì)酸還需進一步分離純化，難以 提高，相比從發(fā)酵液中直接制備寡聚透明質(zhì)酸增加了提取成本，并且難以提高提取率。
[0004] 本發(fā)明通過將從發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸的工藝和堿水解結(jié)合的方法，將發(fā)酵液 中的透明質(zhì)酸降解為分子量在10000道爾頓以下且分布集中的寡聚透明質(zhì)酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種利用透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚 透明質(zhì)酸的方法，該工藝操作簡便、高效、費用低廉、成品得率高、分子量分布集中、易于工 業(yè)化。
[0006] 本發(fā)明的一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，包括：
[0007] (1)乙醇沉淀：向透明質(zhì)酸發(fā)酵液中加入濃度為95%的乙醇，充分攪拌，得到透明 質(zhì)酸鈉絲狀沉淀物；
[0008] (2)脫水：取出透明質(zhì)酸鈉絲狀沉淀物，用濃度為95%的乙醇洗滌沉淀3次后脫 水；
[0009] (3)復(fù)溶：將已經(jīng)脫水的透明質(zhì)酸用與初始發(fā)酵液等體積的蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓?br> [0010] (4)過濾：將復(fù)溶液加熱至80?90°C，過濾得到濾液；
[0011] (5)去除雜質(zhì)：在濾液中加入1 %?5 %的活性炭，在40?50°C下攪拌1?3h，加 入1%?5%的硅藻土，攪勻過濾得到清液；
[0012] (6)水解：將清液在pH值為10?14,溫度為80?100°C下水解2?6h，得到寡聚 透明質(zhì)酸；
[0013] (7)除菌過濾：在1. 5MPa以下，將上述得到的寡聚透明質(zhì)酸經(jīng)過0. 22 μ m的微孔 過濾器過濾得到成品寡聚透明質(zhì)酸。
[0014] 步驟（6)所述清液中透明質(zhì)酸鈉濃度為0. 1%?0.4%，進一步優(yōu)選為0. 15%? 3%。
[0015] 步驟（6)所述清液優(yōu)選通過添加 pH值調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)pH值，優(yōu)選所述pH值調(diào)節(jié)劑 為氫氧化鈉。
[0016] 步驟（6)所述水解過程中優(yōu)選溶液pH值為10. 5?13,進一步優(yōu)選為11?13。
[0017] 步驟（6)所述水解過程中溫度優(yōu)選為85?98°C，進一步優(yōu)選為90?95°C。所述 水解時間優(yōu)選為3?5h，進一步優(yōu)選為3?4h。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：（1)本發(fā)明將透明質(zhì)酸的純化工藝和寡聚透明質(zhì)酸的制備 方法結(jié)合在一起，從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備寡聚透明質(zhì)酸的操作工序，大大簡化了生產(chǎn)工 藝流程，降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；（2)水解過程中通過堿解，進行廣泛的 蛋白質(zhì)水解，能很好的去處蛋白質(zhì)；（2)本發(fā)明制備的寡聚透明質(zhì)酸分子量分布集中，收益 率在95%以上。

【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0020] 實施例1
[0021] 在10L的發(fā)酵罐中發(fā)酵得到5L透明質(zhì)酸發(fā)酵液，其中透明質(zhì)酸含量為5. 2g/L，加 入15L95%的乙醇并不斷攪拌，靜置lOmin后取出絲狀透明質(zhì)酸沉淀物，再用95%的乙醇 洗滌沉淀物3次后脫水；將沉淀物放入5L的純化水中攪拌直至完全溶解，將復(fù)溶液加熱至 85°C，裝配好抽濾瓶，在布氏漏斗中放入濾板，先用純化水潤濕濾板，然后均勻倒入料液，同 時開啟真空泵，對溶液進行抽濾；抽濾結(jié)束后，緩慢在溶液中加入60g針用活性炭，在45°C 下進行活性炭吸附2h，吸附結(jié)束后在溶液中加入60g硅藻土，在攪拌速度50rpm下混合攪 拌15min，按照上述步驟對溶液進行抽濾得到清液；用10 %的NaOH調(diào)溶液的pH至11. 4， 緩慢升溫至95°C水解3. 5h即可得到寡聚透明質(zhì)酸；最后將上述得到的寡聚透明質(zhì)酸經(jīng)過 0. 22 μ m的微孔過濾器過濾得到成品寡聚透明質(zhì)酸。
[0022] 實施例2
[0023] 在實施例中，用10%的NaOH調(diào)溶液的pH至12,緩慢升溫至90°C水解3. 5h，其他 操作同實施例1。
【權(quán)利要求】
1. 一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于將透明質(zhì)酸發(fā)酵液經(jīng) 過乙醇沉淀，過濾處理去除雜質(zhì)得到清液，在pH值為11?14,溫度為80?10(TC下水解 2?5h，得到寡聚透明質(zhì)酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于其具體步驟為： (1) 乙醇沉淀：向透明質(zhì)酸發(fā)酵液中加入濃度為95%的乙醇，充分攪拌，得到透明質(zhì)酸 鈉絲狀沉淀物； (2) 脫水：取出透明質(zhì)酸鈉絲狀沉淀物，用濃度為95%的乙醇洗滌沉淀3次后脫水； (3) 復(fù)溶：將已經(jīng)脫水的透明質(zhì)酸用與初始發(fā)酵液等體積的蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓? (4) 過濾：將復(fù)溶液加熱至80?90°C，過濾得到濾液； (5) 去除雜質(zhì)：在濾液中加入1 %?5%的活性炭，在40?50°C下攪拌1?3h，加入 1 %?5%的硅藻土，攪勻過濾得到清液； (6) 水解：將清液在pH值為10?14,溫度為80?100°C下水解2?6h，得到寡聚透明 質(zhì)酸； (7) 除菌過濾：在1. 5MPa以下，將上述得到的寡聚透明質(zhì)酸經(jīng)過0. 22 μ m的微孔過濾 器過濾得到成品寡聚透明質(zhì)酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于：步驟（6)所述清液 中透明質(zhì)酸鈉濃度為〇. 1 %?0.4%，進一步優(yōu)選為0. 15%?3%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于：步驟（6)所述清液 優(yōu)選通過添加 pH值調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)pH值，優(yōu)選所述pH值調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于：步驟（6)所述水解 過程中優(yōu)選溶液pH值為10. 5?13,進一步優(yōu)選為11?12。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備寡聚透明質(zhì)酸的方法，其特征在于：步驟（6)所述水解 過程中溫度優(yōu)選為85?98°C，進一步優(yōu)選為90?95°C。所述水解時間優(yōu)選為3?5h，進 一步優(yōu)選為4?4. 5h。
【文檔編號】C08B37/08GK104059166SQ201310092904
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月21日
【發(fā)明者】薛勇, 肖剛 申請人:上海昊海生物科技股份有限公司