專利名稱：含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含可降解亞胺鍵的低分子量PEI衍生物核酸物質(zhì)的載體、其制備方法、在核酸藥物(DNA和RNA)輸送中的應用和復合物。
背景技術：
基因治療，是將外源性基因物質(zhì)(DNA或RNA)導入細胞，促進或者抑制特定蛋白的表達，或者取代、修復有問題的基因，從而達到疾病治療的目的?；蛑委熢谄浒l(fā)展過程中遇到了一系列技術瓶頸，其中最重要的瓶頸之一是基因物質(zhì)安全有效的體內(nèi)輸送。目前常用的基因輸送載體可以分為病毒載體及非病毒載體。病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但由于病毒的變異會引起潛在的致病危險，并且病毒表面成分會引起人體免疫反應，同時病毒載體的制備和純化困難且擔載基因量小。而以為代表的非病毒基因載體具有基因擔載密度和擔載量大、制備簡單，便于化學修飾等優(yōu)勢。因此，非病毒基因載體被認為是更理想的基因物質(zhì)輸送載體。但是載體也存在著化學毒性大的缺點，例如聚乙烯亞胺是目前研究最為廣泛的非病毒載體，分支狀分子量為25kDa的PEI轉(zhuǎn)染效率最高，但是PEI25kDa同時因其烷基骨架無法降解而導致細胞累計毒性較大。多數(shù)的國內(nèi)外專家將其研究集中在可降解的PEI衍生物。猶他大學的Sung Wan Kim 等人在緩控釋雜志(Journal of Controlled Release2005,103:209-219)發(fā)表“Polyethylenimine with acid-labile linkages as abiodegradable gene carrier”(用酸降解連接劑聚PEI作為基因載體)的文章,該文章采用戊二醛作為連接劑與低分子量PEI (1800Da)交聯(lián)，生成特征性的含有亞胺鍵連接的可降解聚乙烯亞胺類，該類的結(jié)構(gòu)特點是:與基因形成的復合物被細胞攝取后，凝聚基因的在細胞內(nèi)的內(nèi)吞體和溶酶體的酸性條件下，與低分子量PEI直接相連的亞胺鍵斷開，生成無細胞毒性的低分量PEI ，但是含亞胺鍵的聚合結(jié)構(gòu)不能保證這一攜帶核酸進入細胞之前足夠穩(wěn)定，其轉(zhuǎn)染活性也一般(與PEI25KDa對照)。Jin 等人申請一項題為 “Polycationic gene carriers formed of endogenousamino group-bearing monomers”(內(nèi)源性氨基基團的單體形成聚陽離子基因載體)的PCT專利(W02009/100645A1)，該專利中采用人體內(nèi)源性專職凝聚基因的小分子單體精胺分別與1，4_ 丁二醇二氯甲酸酯、1，4_ 丁二酰氯和乙二醛等三個連接劑，縮合得到分別含有氨酯鍵、酰胺鍵和亞胺鍵等聚精胺陽離子，這些表現(xiàn)出良好的核酸輸送能力，而且，聚合物通過生物響應性降解能夠回歸到精胺內(nèi)源性單體的初始狀態(tài)，具體的特征是良好的生物相容性，但該技術的缺陷在于:含有氨酯鍵、酰胺鍵的降解速率比較慢，導致核酸物質(zhì)無法及時從內(nèi)涵體里逃逸，影響核酸輸送效率；含有亞胺鍵的降解速率比較快，但是載體的不穩(wěn)定性致使其輸送的核酸物質(zhì)尚未到達胞質(zhì)，便從胞外釋放出來，轉(zhuǎn)染效率大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體、其制備方法、在核酸藥物(DNA和RNA)輸送中的應用和復合物。本發(fā)明制備的是具有高效、低毒、可降解為起始狀態(tài)小分子的基因物質(zhì)輸送載體，可以用于基因物質(zhì)(DNA和RNA)的輸送。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體(PPI)，其結(jié)構(gòu)式為:
權利要求
1.一種含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為:
2.根據(jù)權利要求1所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體，其特征在于，所述核酸物質(zhì)的載體的基本構(gòu)建單元為低分子量聚乙烯亞胺ΡΕΙ，所述低分子量PEI為重均分子量Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI。
3.根據(jù)權利要求2所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體，其特征在于，所述低分子量 PEI 的分子量為:Mw=800Da/Mn=600Da 或 Mw=1300Da/Mn=1200Da 或 Mw=2000Da/Mn=1800Da ;其中，Mw為重均分子量，Mn為數(shù)均分子量。
4.一種根據(jù)權利要求1所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將低分子量PEI與咪唑二醛按摩爾比為1:1-3.5的比例加入到溶劑中，得到反應體系; (2)攪拌、搖動或震蕩反應體系，使之發(fā)生縮合反應，即得所述含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體。
5.根據(jù)權利要求4所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述低分子量PEI為Mw在2000Da以下的任一低分子量的PEI。
6.根據(jù)權利要求5所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述低分子量PEI的分子量為:Mw=800Da/Mn=600Da或Mw=1300Da/Mn=1200Da或Mw=2000Da/Mn=1800Da ;其中，Mw為重均分子量，Mn為數(shù)均分子量。
7.根據(jù)權利要求4所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，還包括以下分離純化的步驟:將所述含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體用超純水溶解后，置于活化后的透析袋中透析；透析結(jié)束后，用微孔濾膜過濾，最后預凍、凍干。
8.根據(jù)權利要求7所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量為7k 20k。
9.根據(jù)權利要求7所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述透析的時間為12 48小時。
10.根據(jù)權利要求7所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述微孔濾膜的孔徑為0.22 0.45 μ m。
11.根據(jù)權利要求4所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的溶劑選自無水乙醇或氯仿。
12.一種根據(jù)權利要求1所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體在核酸藥物輸送中的應用。
13.一種復合物，其特征在于，所述復合物是按照如下方法制備得到的:將權利要求1所述的含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的溶液加入到核酸溶液中，混合均勻，室溫下孵育，即得。
14.根據(jù)權利要求13所述的復合物，其特征在于，所述核酸為DNA或RNA，其特征為DNA疫苗、siRNA 和 microRNA。
15.根據(jù)權利要求13所述 的復合物，其特征在于，所述孵育的時間為20 120分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體，其結(jié)構(gòu)式為其中，x為1～20,y為1～20，n為1～20。本發(fā)明還公開了該含可降解亞胺鍵的核酸物質(zhì)的載體的制備方法、在核酸藥物輸送中的應用和復合物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備的含有亞胺鍵結(jié)構(gòu)的可降解低分子量PEI衍生物核酸物質(zhì)的載體結(jié)構(gòu)簡單、易于合成，在不同的細胞株中均表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染活性，同時具有較低的細胞毒性，是一種高效、低毒的基因輸送載體。
文檔編號C08G73/04GK103243122SQ20131011623
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權日2013年4月3日
發(fā)明者袁偉恩, 金拓, 吳飛, 蘇靖, 呂楠, 陳順 申請人:上海交通大學