石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，同時公開了該石菖蒲多糖的制備方法，其方法如下：以石菖蒲為原料，經(jīng)含脫脂、水提醇沉、離子交換和透析工序制備獲得石菖蒲多糖。該制備方法簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明中的石菖蒲多糖經(jīng)哺乳動物細胞和秀麗線蟲疾病模型試驗證實，能夠顯著緩解過氧化氫對神經(jīng)細胞的氧化脅迫毒性，增強抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量并抑制細胞凋亡，還能夠抑制β-淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性，表明其具有良好的神經(jīng)保護作用。
【專利說明】石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于健康食品/保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]隨著全球人口老齡化趨勢的加劇，以特定神經(jīng)細胞和組織逐漸衰退乃至死亡為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康和生活質(zhì)量的重大疾病，引起了國際生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛和深入關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有復(fù)雜的病理過程，大量研究表明其受氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集等因素的影響。比如，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到氧化脅迫時，其內(nèi)源性活性氧自由基水平增加，將促使細胞內(nèi)氧化還原代謝失衡，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低并損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，引起細胞損傷和凋亡。此外，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異常聚集形成的產(chǎn)物也會誘發(fā)氧化、炎癥等多種脅迫反應(yīng)，由此導(dǎo)致神經(jīng)元的慢性和持續(xù)性損傷、壞死而產(chǎn)生神經(jīng)病變癥狀。因此，通過緩解氧化脅迫和抑制疾病蛋白質(zhì)異常聚集是研究神經(jīng)保護作用的重要策略。
[0003]我國具有豐富的中藥材資源，為神經(jīng)保護方面的防治研究提供了龐大的藥用和保健資源庫。石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，性溫味辛苦，歸心胃經(jīng)，具有開竅豁痰、化濕開胃、醒神益智、理氣活血、散風(fēng)祛濕等功效，是用于治療癲病、癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶的傳統(tǒng)中藥之一，具有顯著的藥用保健價值。現(xiàn)代研究表明，中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和神經(jīng)保護等廣泛的藥理活性和功能，在保健品領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)和應(yīng)用潛力。然而，目前對石菖蒲多糖活性功能的研究開發(fā)尚較少，缺乏其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的相關(guān)研究。因此，積極開發(fā)具有神經(jīng)保護作用的中藥多糖將對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重大的意義，也將為多糖和中藥產(chǎn)品的深入開發(fā)應(yīng)用做出貢獻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品(也稱為健康食品或功能食品)中的應(yīng)用。
[0005]其中所述的神經(jīng)保護作用是指對以氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治作用。
[0006]本發(fā)明中所述的石菖蒲多糖可通過以下方法制備獲得:以石菖蒲為原料，經(jīng)含脫月旨、水提醇沉、離子交換和透析工序制備獲得石菖蒲多糖，所獲石菖蒲多糖具有神經(jīng)保護作用，能制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品。
[0007]在石菖蒲多糖的制備過程中，各工序的具體參數(shù)如下:
[0008]脫脂時，采用乙醇為脫脂溶劑，石菖蒲和乙醇的質(zhì)量體積比為l:2g/mL?l:20g/mL，溫度為50?90°C，時間為I?IOh ;水提時，石菖蒲和水的質(zhì)量體積比為l:2g/mL?l:20g/mL，提取溫度為50?100°C，水提取時間為I?IOh ;醇沉?xí)r，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的體積比為3:1?5:1。[0009]離子交換時，將醇沉物溶解后進行陰離子交換，依次采用水和洗脫液洗脫，洗脫液經(jīng)透析后再通過濃縮和干燥處理，獲得石菖蒲多糖。
[0010]所述的陰離子交換的材料優(yōu)選為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹脂；透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD。
[0011]陰離子交換時，洗脫液優(yōu)選為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸。
[0012]本發(fā)明所述石菖蒲首選其藥用部位根或根莖。
[0013]本發(fā)明提供的石菖蒲多糖具有神經(jīng)保護作用，主要表現(xiàn)在能夠在哺乳動物細胞和整體動物水平上緩解由氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)的異常聚集引發(fā)的神經(jīng)毒性，因此可用于防治與氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0015](I)本發(fā)明的制備方法周期短、試劑消耗少，工藝簡單，穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0016](2)本發(fā)明制備的石菖蒲多糖在細胞和動物水平上對氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集誘發(fā)的神經(jīng)毒性均具有抑制作用，表明其可應(yīng)用于具有神經(jīng)保護功效的保健食品中，從而為中藥現(xiàn)代化和多糖產(chǎn)品深入應(yīng)用提供了新方向，也可為延緩衰老和防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病做出貢獻。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面通過【具體實施方式】及藥效學(xué)研究結(jié)果對本發(fā)明作進一步說明。
[0018]圖1為實施例4中石菖蒲多糖抑制H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細胞氧化毒性的數(shù)據(jù)表征圖，表征0.5mg/mL和lmg/mL的石菖蒲多糖緩解H2O2對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的氧化毒性，其中*表示P〈0.05 ；
[0019]圖2表示實施例5中石菖蒲多糖提高SH-SY5Y細胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA積累的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖2A表征lmg/mL石菖蒲多糖提高SH-SY5Y細胞內(nèi)SOD的活性，圖2B表征lmg/mL石菖蒲多糖降低MDA的含量，其中*表示p〈0.05 ；
[0020]圖3表示實施例6中石菖蒲多糖抑制H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡的數(shù)據(jù)表征圖，表征石菖蒲多糖抑制H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞的凋亡，其中*表示p〈0.05 ；
[0021]圖4表示實施例7中石菖蒲多糖抑制轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CL2355體內(nèi)β-淀粉樣蛋白聚集神經(jīng)毒性的數(shù)據(jù)表征圖，表征lmg/mL和2mg/mL的石菖蒲多糖改善β_淀粉樣蛋白聚集介導(dǎo)的CL2355秀麗線蟲神經(jīng)元趨化功能損傷，其中*表示ρ〈0.05。
【具體實施方式】
[0022]下面列舉一部分具體實施例對本發(fā)明進行說明，有必要在此指出的是以下具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]實施例1
[0024]本實例提供的是一種石菖蒲多糖，其通過以下方法制備獲得:將石菖蒲根莖粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C加熱攪拌回流3h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在95°C下加熱攪拌提取3h，收集水提物。60°C減壓濃縮，離心除去殘留藥渣和不溶性雜質(zhì)，得到澄清的濃縮提取液。將4倍體積的乙醇加入上述提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經(jīng)過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過DEAE-sepharose陰離子交換葡聚糖凝膠柱，依次采用水和1.0mol/LNaCl溶液洗脫，收集1.0mol/L NaCl溶液的洗脫液，采用3.5kD透析袋進行透析，透析截流液經(jīng)過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得石菖蒲多糖。
[0025]實施例2
[0026]本實例提供的是一種石菖蒲酸性多糖，其通過以下方法制備獲得:將石菖蒲根莖粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，80°C加熱攪拌回流3h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加熱攪拌提取3h，收集水提物。55°C減壓濃縮，離心除去殘留藥渣和不溶性雜質(zhì)，得到澄清的濃縮提取液。將4倍體積的乙醇加入上述提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經(jīng)過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過DEAE-s印hadex A-25陰離子交換纖維素柱，依次采用水和2.0mol/L KCl溶液洗脫，收集2.0mol/L KCl溶液的洗脫液，采用3.5kD透析袋進行透析，透析截流液經(jīng)過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得石菖蒲多糖。
[0027]實施例3
[0028]本實例提供的是一種石菖蒲酸性多糖，其通過以下方法制備獲得:將石菖蒲根莖粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，85°C加熱攪拌回流3h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:15 (g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取4h，收集水提物。50°C減壓濃縮，離心除去殘留藥渣和不溶性雜質(zhì)，得到澄清的濃縮提取液。將5倍體積的乙醇加入上述提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經(jīng)過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過D900型陰離子交換樹脂，依次采用水和1.0mol/L氯化銨溶液洗脫，收集1.0mol/L氯化銨溶液的洗脫液，采用2.5kD透析袋進行透析，透析截流液經(jīng)過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得石菖蒲多糖。
[0029]實施例4
[0030]H2O2是一種氧化性很強的神經(jīng)毒性物質(zhì)，可誘導(dǎo)強烈急性的細胞氧化損傷，而抑制其對細胞的氧化損傷能夠有效緩解神經(jīng)毒性。將實施例1制得的石菖蒲多糖，按照0.25mg/mL、0.5mg/mL和lmg/mL濃度加入以100 μ mol/L H2O2造模的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中。對照組采用H2O2造模處理，但多糖溶液用細胞完全培養(yǎng)基代替。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后棄上清，加入DMSO后振搖15min，測定細胞在570nm處的吸光值。細胞存活率為多糖組吸收值與對照組吸光值的比值。細胞活力值以mean±SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0031]圖1顯示，H2O2在100 μ mol/L時能夠顯著降低細胞活力，而石菖蒲多糖在0.5mg/mL和lmg/mL濃度時均能夠顯著降低H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞毒性，表明其具有良好的體外抗氧化和神經(jīng)保護作用。
[0032]實施例5
[0033]將實施例1中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL濃度加入到以100 μ mol/L H2O2造模的SH-SY5Y細胞中，對照組僅采用H2O2造模處理。在37°C下孵育24h，收集細胞后裂解，取上清測定細胞內(nèi)總蛋白量。取50mmol/L PBS(pH7.4)、130mmol/L甲硫氨酸溶液、0.75mmol/L NBT溶液、20 μ mol/L核黃素溶液和100 μ mol/L EDTA-Na2溶液各150 μ 1，混勻后加入0.75ml細胞裂解液，在80yE/(m2s)的光照強度下反應(yīng)20min。對照組同上處理，用等體積的PBS代替細胞裂解液?？瞻捉M與對照組同樣處理，但避光反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后，在560nm處測定各組的吸光值。超氧化物歧化酶SOD活力計算公式如下:SOD活力(U/mgprotein) = [2 X (Acontrol - A
polysaccharide) I ^control ^-blank^ ]/Cp0 式^中，Ap0]_ySaccharide、Acontrol 和 Ablank
分別表示多糖組、對照組和空白組的吸光值，Cp表示蛋白質(zhì)濃度。SOD活力以mean±SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0034]結(jié)果如圖2A顯示，100 μ mol/L H2O2能夠顯著降低細胞內(nèi)SOD活性，而石菖蒲多糖在lmg/mL濃度時能夠提高SOD活性。
[0035]將實施例1中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL濃度加入到以100 μ mol/L H2O2造模的SH-SY5Y細胞中，對照組僅采用H2O2造模處理。在37°C下孵育24h后，收集細胞后裂解，取上清測定細胞內(nèi)總蛋白量。取0.6ml 5%三氯乙酸溶液、0.4ml 0.67%TBA溶液和0.6mL細胞裂解液，混勻后置于100°C反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后迅速置于冰上冷卻，離心后取上清，在450nm、532nm和600nm處測定吸光值。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量計算公式為:MDA含量(nM/mg protein) = {[6.45X (A532 -A600)] - 0.56XA45J/Cp。式中，A450、A532 和 A600 分別表示各組在450nm、532nm和600nm處的吸光值,Cp表示蛋白質(zhì)濃度。MDA含量以mean 土 SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0036]結(jié)果如圖2B 顯示，100 μ mol/L H2O2能夠顯著增加細胞內(nèi)MDA含量，而lmg/mL石菖蒲多糖能夠降低MDA含量。上述結(jié)果顯示石菖蒲多糖能夠改善由于氧化應(yīng)激造成的細胞內(nèi)抗氧化酶活性降低和脂質(zhì)氧化損傷程度，進一步表明其具有良好的抗氧化和神經(jīng)保護作用。
[0037]實施例6
[0038]大量研究表明，細胞凋亡是氧化脅迫、蛋白質(zhì)聚集毒性損傷神經(jīng)元的重要途徑。例如，活性氧自由基可以激活細胞凋亡，進而破壞細胞組成并擾亂其正常生理功能，引起神經(jīng)細胞損傷。反之，抑制細胞凋亡將有助于緩解氧化脅迫等損傷。將實施例2中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL濃度加入到以lOOymol/L H2O2造模的SH-SY5Y細胞中，對照組僅采用H2O2造模處理。在371:下孵育2411后，收集細胞加入50(^1^ PBS懸浮細胞，加入5 μ LAnnexin V-FITC溶液混勻，再加入5 μ L碘化丙啶溶液，室溫下避光反應(yīng)約IOmin后于流式細胞儀上進行檢測，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488nm和530nm。凋亡率以mean±SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0039]采用Annexin V/PI雙染法可以檢測細胞凋亡狀態(tài)，在Annexin V/PI雙染的流式細胞散點圖中，左上象限為細胞碎片(FITC-/PI+)，左下象限為正常細胞(FITC-/P1-)，右上象限為凋亡晚期和壞死細胞(FITC+/PI+)，右下象限為凋亡早期細胞(FITC+/P1-)。圖3顯示，100 μ mol/L H2O2能夠顯著誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡，而lmg/mL石菖蒲多糖能夠有效抑制細胞凋亡程度，表明其能夠緩解H2O2對神經(jīng)的氧化損傷，具有神經(jīng)保護作用。
[0040]實施例7
[0041]轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CL2355是在神經(jīng)元中表達Αβ42 ( β -淀粉樣蛋白42片段，β -amyloid peptide42,A^ 42)蛋白，其聚集能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性,可導(dǎo)致秀麗線蟲對化學(xué)物質(zhì)的趨化識別能力下降，因此可以通過抑制蛋白聚集來緩解其神經(jīng)毒性。將實施例3制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL和2mg/mL濃度分別加入LI期CL2355秀麗線蟲幼蟲中，對照組加入等體積的S Medium,置于16°C培養(yǎng)36h后，于23°C再次培養(yǎng)36h。在9cm的培養(yǎng)平板中間用lmol/L甘油劃直線,在一邊半圓形區(qū)域加入1.5μ I 0.5%苯甲醒的乙醇溶液和1.5μ1 lmol/L NaN3溶液，標(biāo)記為A區(qū)。在另一半圓區(qū)域的相同位置加入1.5 μ I乙醇和1.5μ1 lmol/L NaN3溶液，標(biāo)記為B區(qū)。將CL2355秀麗線蟲轉(zhuǎn)到平板中央后于23°C孵育lh，然后分別統(tǒng)計A區(qū)和B區(qū)秀麗線蟲的數(shù)量，趨化率=(A區(qū)數(shù)目-B區(qū)數(shù)目)/秀麗線蟲總數(shù)。數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0042]圖4顯示，石菖蒲多糖在lmg/mL和2mg/mL濃度時均能夠提高轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CL2355的趨化率，說明石菖蒲多糖能夠通過抑制疾病蛋白質(zhì)異常聚集來有效的改善神經(jīng)元功能，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
[0043]經(jīng)上述哺乳動物細胞和秀麗線蟲疾病模型試驗證實，石菖蒲多糖能夠顯著緩解過氧化氫對神經(jīng)細胞的氧化脅迫毒性(見實施例4)，增強抗氧化酶活性并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量(見實施例5)，抑制神經(jīng)細胞凋亡(見實施例6)，還能夠抑制β -淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性(見實施例7)，表明其具有良好的神經(jīng)保護作用。
[0044]實施例8
[0045]將實施例1制得的石菖蒲多糖，根據(jù)需要添加適量乳清蛋白、麥芽糊精制備成為具有神經(jīng)保護功效的粉末狀態(tài)健康食品或保健食品，還可以添加其它常規(guī)輔料制成常規(guī)劑型。
[0046]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的神經(jīng)保護作用是指對以氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常聚集為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的石菖蒲多糖通過以下方法制備獲得:以石菖蒲為原料，經(jīng)含脫脂、水提醇沉、離子交換和透析工序制備獲得，所述石菖蒲多糖具有神經(jīng)保護作用，能制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:脫脂時，采用乙醇為脫脂溶劑，石菖蒲和乙醇的質(zhì)量體積比為l:2g/mL?l:20g/mL，溫度為50?90°C，時間為I?IOh ;水提時，石菖蒲和水的質(zhì)量體積比為l:2g/mL?l:20g/mL，提取溫度為50?100°C，水提取時間為I?IOh ;醇沉?xí)r，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的體積比為3:1?5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:離子交換時，將醇沉物溶解后進行陰離子交換，依次采用水和洗脫液洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析后再通過濃縮和干燥處理，即獲得石菖蒲多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述陰離子交換的材料為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:洗脫液為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的石菖蒲多糖在制備具有神經(jīng)保護作用的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述石菖蒲是指石菖蒲的藥用部位根或根莖。
【文檔編號】C08B37/00GK103609936SQ201310574725
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】馬方勵, 李海峰, 胡明華, 梁明, 馬忠華, 汪強強, 張婉婉 申請人:無限極（中國）有限公司