硫酸軟骨素的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生化藥劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種硫酸軟骨素的提取方法。硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟：（1）軟骨和純水混合；（2）加入堿性蛋白酶酶解反應(yīng)；（3）加入角蛋白酶酶解反應(yīng)；（4）過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，沉降；（5）將沉降液離心，取沉淀烘干，得到硫酸軟骨素。本發(fā)明的有益效果在于，采用本發(fā)明的方法對硫酸軟骨素進行提取，相對于鹽法提取、堿法提取，簡化了生產(chǎn)的工藝流程，相對于當(dāng)前酶法提取多采用胰蛋白酶，大大縮短了工藝周期，提高了提取收率，簡化了生產(chǎn)的工藝流程。
【專利說明】硫酸軟骨素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化藥劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及硫酸軟骨素的提取方法。
[0002]【背景技術(shù)】
硫酸軟骨素是軟骨素的硫酸酯，是一種酸性粘多糖，廣泛存在于動物的器官軟骨中，通常由哺乳動物的軟骨、臍帶、血管壁等組織中提取得到，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮等有機溶劑。它可以清除體內(nèi)血液中的脂質(zhì)和脂蛋白，用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗死、動脈粥樣硬化等，能有效促進細胞代謝，還具有緩和的抗凝血作用、抗炎效果，加速傷口愈合及抗腫瘤等。目前酸性硫酸軟骨素的提取方法主要有降解法和非降解法，非降解法僅用于非蛋白多糖的黏多糖一透明質(zhì)酸，而降解法適用于包括透明質(zhì)酸在內(nèi)的所有酸性黏多糖，硫酸軟骨素的提取采用降解法，降解法又包括堿提取法和蛋白酶提取法兩種，根據(jù)這些性質(zhì)，硫酸軟骨素的提取方法有很多，歸納起來，主要有以下幾種:
(I)中性鹽法
先用10%的氯化鈣提取，氯仿-戊醇(I:4)除去蛋白質(zhì)，2倍量乙醇沉淀，最后以LlO試劑精制，而以透析法 除雜質(zhì)、氯化六氨合鈷純化，或一磷鎢酸純化，均可使工藝簡化，以30%氯化鉀或30%氯化鉀加1%碳酸鉀提取，高嶺土吸附除去雜蛋白，可提高產(chǎn)品收率。
[0003]該方法提取的產(chǎn)品顏色較白，各項指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，也不會造成環(huán)境污染，但是產(chǎn)率較低，造成原材料的大量浪費，對經(jīng)濟效益有一定的影響。
[0004](2)堿提取法
濃堿提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量1.5倍左右的15%的氫氧化鈉溶液，室溫下浸提12-16h，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-5，雙層紗布過濾，留下濾液，將濾液調(diào)節(jié)pH到8左右，按骨質(zhì)量的4%加入胰蛋白酶，于50°C左右的水解水解6h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6，升高溫度到90°C左右，加入活性炭進行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇進行沉淀分層4h，所得沉淀為硫酸軟骨素，在60°C下干燥即得最終產(chǎn)品。
[0005]稀堿提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量6倍左右的2%的氫氧化鈉溶液，60°C下浸提24h，分兩次進行，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-5，雙層紗布過濾，留下濾液，將濾液調(diào)節(jié)PH到8左右，按骨質(zhì)量的4%加入胰蛋白酶，于50°C左右的水解7h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5-7，升高溫度到80-90°C，加入活性炭進行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇和1.4%的氯化鈉溶液進行沉淀分層6h，所得沉淀再次加入1.5%的氯化鈉溶液和3倍體積的無水乙醇進行沉淀，所得即為硫酸軟骨素，然后在60°C左右的溫度下干燥即得最終產(chǎn)品。
[0006]稀堿稀鹽提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入均為骨質(zhì)量6倍的0.5%的氫氧化鈉和2%的氯化鈉混合溶液，室溫下進行浸提30h，分兩次進行，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8左右，加入骨質(zhì)量4%的胰蛋白酶進行水解，水解后升溫90°C左右，加入骨質(zhì)量1%的滑石粉，過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇進行沉淀，過濾后再加入1.5%的氯化鈉溶液進行沉淀過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇再次進行沉淀過濾，所得沉淀物于60°C下干燥得最終產(chǎn)品O[0007]稀堿濃鹽提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量5倍左右的0.2%的氫氧化鈉溶液和20%的氯化鈉溶液,pH為13，室溫下浸提30h，分兩次進行,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7，升溫80-90°C，加入骨質(zhì)量4%的滑石粉，將鹽解液調(diào)節(jié)pH至2_3，過濾lh，將濾液加入1.5倍體積的水進行稀釋，同時調(diào)節(jié)pH到6，加入1.5倍體積的無水乙醇沉淀12h，將沉淀物加入1.5%的氯化鈉溶液中進行沉淀過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60°C下干燥即得最終產(chǎn)品。
[0008]以上四種工藝路線，制得的硫酸軟骨素含量和氨含量都符合原料藥的要求，但是這4種路線都存在如下的缺陷:采用稀堿溫和條件下制備的樣品溶液混濁，且時間長，污染嚴(yán)重基原因在于該條件下軟骨的膠原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性鹽和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去，最主要的是這些工藝的生產(chǎn)周期都太長，極大的限制了工廠的生產(chǎn)效益和經(jīng)濟效益。
[0009](3)酶提取法
稀堿-酶解提取法，鄒開朗等提出稀堿與酶解相結(jié)合法生產(chǎn)硫酸軟骨素，先將軟骨在80°C水煮4-6h，然后按原料(干質(zhì)量)與2%氫氧化鈉的比例為1:6的量加入氫氧化鈉溶液，室溫提取1.5h然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到6左右，雙層紗布過濾，取濾液，合并2次濾液，并測量體積待用，濾液調(diào)節(jié)PH到8，按濾液與胰酶100:0.4的比例加入胰酶，于50°C左右水解Ih后，再按100:0.4的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，45°C下水解1.5h后過濾后加入高嶺土和活性炭吸附，該工藝用氯仿反萃取的方法純化硫酸軟骨素，與其它的方法相比較，縮短了一半工藝流程，同時提高了純度和提取率，又減輕了堿法提取所帶來的環(huán)境污染。
[0010]還有采用濃堿-復(fù)合酸酶解提取的方法，該方法的實驗流程與稀堿酶解法基本相同，只是在堿解這一步增加了堿的嘗試，該方法提高了產(chǎn)品的純度和收率，降低了生產(chǎn)成本。
[0011]復(fù)合酶解提取法，該方法質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品顏色潔白，生產(chǎn)周期短。上述的方法其缺點是，在生產(chǎn)過程中引用了濃堿，酸，該方法中酸堿醇的消耗量都較大，反應(yīng)條件比較強烈，而且成本也較高。
[0012]酶解-樹脂提取法，該方法的優(yōu)點是酶水解或稀堿水解與樹脂交換技術(shù)相結(jié)合，保證了硫酸軟骨素分子不降解，解決了成品純度的問題，該方法簡便，收率高，但是該方法的成本也較高，而且耗時較長。
[0013]從上述的方法來看，目前國內(nèi)外常用堿提與胰酶酶解相結(jié)合的方法來提取硫酸軟骨素，但此提取工藝中，胰蛋白酶的酶解反應(yīng)至少需要5h，這是主要的限速環(huán)節(jié)，將該工藝用于規(guī)模化生產(chǎn)，不僅生產(chǎn)周期長，而且產(chǎn)品成本高。
[0014]因此需要針對上述的方法進行改進，尋找一種不僅易于規(guī)?；a(chǎn)，而且生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品成本低的硫酸軟骨素的提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種易于規(guī)?；a(chǎn)、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品成本低的硫酸軟骨素的提取方法。
[0016]本發(fā)明的硫酸軟骨素的提取方法是通過下述的技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟:(1)軟骨和純水以1:0.5-1:2的比例混合；
(2)按照占軟骨重量0.40-0.60%的比例加入堿性蛋白酶，于50-60°C，ρΗ9.0-10.0條件下酶解反應(yīng)1.5-2.5h ；
(3)按照占軟骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60°C，ρΗΙΟ.0-11.0條件下酶解反應(yīng)2.5-3.5h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到60-70%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0017]優(yōu)選的，上述的步驟(1)中，軟骨與純水的比例為:1:1。
[0018]上述的步驟(2)中，堿性蛋白酶占軟骨的重的0.5%，酶解反應(yīng)的條件是:于55°C，pH9.5的條件下酶解反應(yīng)2h。
[0019]上述的步驟(3)中，角蛋白酶占軟骨重的0.5%，于55°C，pH10.5的條件下酶解反應(yīng)3h。
[0020]上述的步驟(5)中，將沉降液離心的條件是,在6000rpm的轉(zhuǎn)速下,離心5min。
[0021]傳統(tǒng)酶提取方法是采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶相結(jié)合，共同作用于軟骨，提取硫酸軟骨素；本發(fā)明所提供的一種硫酸軟骨素提取方法，用角蛋白酶取代胰蛋白酶進行酶解，對比結(jié)果顯示在達到相同效果的前提下，角蛋白酶所需的酶解時間更短，該新提取方法不但能夠明顯縮短提取時間，還可以簡化提取工藝，降低生產(chǎn)成本，更適合工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0023]實施例1
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨0.5%的比例加入堿性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應(yīng)2h ；
(3)按照與軟骨0.5%的比例加入角蛋白酶，55°C，ρΗΙΟ.5條件下酶解反應(yīng)3h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0024]實施例1中，得到的硫酸軟骨素分析結(jié)果如下:
得到的硫酸軟骨素0.665mg/ml，收率13.3%，白色絮狀，易從容器壁刮下；
對比例I
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨1%的比例加入堿性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應(yīng)3h ；
(3)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(4)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0025]對比例2
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨1%的比例加入角蛋白酶，55°C，ρΗΙΟ.5條件下酶解反應(yīng)3h ；
(3)過濾，取濾液， 向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；(4)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60 V烘干，得到硫酸軟骨素。
[0026]對比例I中，產(chǎn)品的純度為0.273mg/ml，收率為5.5% ；
對比例2中，產(chǎn)品的純度為0.308 mg/ml，粗品收率為6.2%。
[0027]對比例3
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨0.5%的比例加入堿性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應(yīng)2h ；
(3)按照與軟骨0.5%的比例加入胰蛋白酶，55°C，pH7.0條件下酶解反應(yīng)3h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0028]對比例3中，產(chǎn)品的純度為0.417 mg/ml，粗品收率為8.3%。
[0029]對比例4
A:軟骨和純水以1:1的比例混合；
按照與軟骨0.45%的比例加入堿性蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應(yīng)2h ；
按照與軟骨0.45%的比例加入胰蛋白酶，55°C，pH7.0條件下酶解反應(yīng)3h ；
過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih ；
將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0030]B:軟骨和純水以1:1的比例混合；
按照與軟骨0.45%的比例加入堿性蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應(yīng)2h ；
按照與軟骨0.45%的比例加入角蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應(yīng)3h ；
過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih ；
將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
[0031]1.A、B兩者的沉降效果對比:
【權(quán)利要求】
1.硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟: (1)軟骨和純水以1:0.5-1:2的重量比例混合； (2)按照占軟骨重量0.40-0.60%的比例加入堿性蛋白酶，于50-60°C，ρΗ9.0-10.0條件下酶解反應(yīng)1.5-2.5h ； (3)按照占軟骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60°C，ρΗΙΟ.0-11.0條件下酶解反應(yīng)2.5-3.5h ；(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到60-70%，沉降Ih； (5)將步驟(4)中的沉降液離心，取沉淀，60°C烘干，得到硫酸軟骨素。
2.如權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特征在于，所述的步驟(1)中，軟骨與純水的重量比例為:1:1。
3.如權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，堿性蛋白酶占軟骨的重量的0.5%，酶解反應(yīng)的條件是:于55°C，pH9.5的條件下酶解反應(yīng)2h。
4.如權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，角蛋白酶占軟骨重的0.5%，于55°C，ρΗΙΟ.5的條件下酶解反應(yīng)3h。
5.如權(quán)利要求1 所述的硫酸軟骨素提取方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，將沉降液離心的條件是，在6000rpm的轉(zhuǎn)速下,離心5min。
【文檔編號】C08B37/08GK103641935SQ201310620429
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】楊雨, 趙穎娟, 宋迪, 薛秀梅 申請人:濟南天天香有限公司