親水性聚合物顆粒及其制備方法
【專利摘要】形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。
【專利說(shuō)明】親水性聚合物顆粒及其制備方法
[0001] 本專利申請(qǐng)要求于2012年2月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/597, 053的利益， 所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。
[0002] 本專利申請(qǐng)要求于2012年10月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/719, 045的利益， 所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。
[0003] 本專利申請(qǐng)要求于2〇12年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/731,87 3的利益， 所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 總的來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)內(nèi)容涉及親水性聚合物顆粒，并且涉及用于制備并使用此類親 水性聚合物顆粒的方法。

【背景技術(shù)】
[0005] 聚合物顆粒越來(lái)越多地用作分離技術(shù)中的組分，并且?guī)椭鷻z測(cè)化學(xué)和生物系統(tǒng)兩 者中的分析物。例如，聚合物顆粒已用于色譜技術(shù)中以從溶液中分離靶分子。在另一個(gè)例 子中，具有磁性涂層的聚合物顆粒用于磁性分離技術(shù)中。最近以來(lái)，聚合物顆粒已用于增強(qiáng) ELISA型技術(shù)并且可用于捕獲多核苷酸。
[0006] 然而，此類分離和分析技術(shù)己具有由于顆粒大小中的變異的缺點(diǎn)。顆粒大小中的 大變異導(dǎo)致顆粒重量中的變異，以及可用于與靶分析物相互作用的反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)目中的變 異。對(duì)于磁性分離技術(shù)，大小中的變異可導(dǎo)致低效率分離。對(duì)于色譜技術(shù)和多種多核苷酸 捕獲技術(shù)，大小中的變異可導(dǎo)致可用于與多核苷酸相互作用的位點(diǎn)數(shù)目中的變異，導(dǎo)致捕 獲或分離效率中的變異。
[0007]像這樣，改善的聚合物顆粒和用于制造此類聚合物顆粒的方法將是期望的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在第一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性 保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物 顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。
[0009]在第二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使具有疏水性 保護(hù)基團(tuán)的丙烯酰胺單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合 物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒。
[0010]在第三個(gè)方面，形成顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中，使可自由基聚 合單體的多個(gè)聚體單元與具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的二丙烯酰胺交聯(lián)劑聚合，由此形成包括多 個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括去除至少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基 團(tuán)。
[0011] 一在第四個(gè)方面，形成顆粒的方法包括使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè) 聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒；從聚合物顆粒中去除至 少一部分所述多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒；并且使寡核苷酸與親水性顆粒結(jié)合。
[0012] 在第五個(gè)方面，多個(gè)顆粒包括至少100, 000個(gè)顆粒。多個(gè)顆粒中的至少一個(gè)顆粒 包括水凝膠。多個(gè)顆粒具有不超過(guò)100微米的平均粒度和不超過(guò)5%的變異系數(shù)。
[0013] 在第六個(gè)方面，系統(tǒng)包括孔陣列?？钻嚵械闹辽僖粋€(gè)孔與ISFET傳感器可操作地 連接。該系統(tǒng)還包括具有不超過(guò)5%的變異系數(shù)的多個(gè)水凝膠顆粒。多個(gè)水凝膠顆粒中的 至少一個(gè)水凝膠顆粒設(shè)置在孔陣列的孔中。
[0014] 在第七個(gè)方面，多個(gè)顆粒通過(guò)包括下述的方法形成：在水性懸浮液內(nèi)的分散相中， 使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括多個(gè)疏水性保護(hù) 基團(tuán)的聚合物顆粒，并且包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。
[0015] 在第八個(gè)方面，組合物包括丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的水性混合物，該丙烯酰胺單 體包括疏水性保護(hù)基團(tuán)，單體和交聯(lián)劑以在15:1至1:2范圍內(nèi)的單體：交聯(lián)劑的質(zhì)量比包 括。
[0016] 在第九個(gè)方面，測(cè)序多核苷酸的方法包括提供包括孔陣列的裝置。至少一個(gè)孔與 ISFET可操作地連接，并且包括通過(guò)上述方面的方法形成的顆粒。該顆粒附著至多核苷酸。 該方法還包括將包括預(yù)定類型的核苷酸的溶液施加于裝置，并且觀測(cè)對(duì)施加溶液的離子應(yīng) 答。
[0017] 在第十個(gè)方面，用于核苷酸摻入的方法包括提供通過(guò)上述方面的方法形成的顆 粒。該顆粒附著至包括與引物雜交的模板核酸的核酸雙鏈體。該雙鏈體與聚合酶結(jié)合。該 方法還包括使顆粒與一種或多種核苷酸接觸，并且使用聚合酶將至少一種核苷酸摻入引物 的末端上。
[0018] 在第十一個(gè)方面，形成顆粒的方法包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散 相，在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括 多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒，并且將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為水凝膠顆粒。
[0019] 在第十二個(gè)方面，形成顆粒的方法包括提供在水性懸浮液中的種子顆粒，該種子 顆粒包含疏水性聚合物，并且包括促進(jìn)種子顆粒在水性懸浮液中形成分散相。該方法還包 括在分散相中使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體的多個(gè)聚體單元聚合，由此形成包括具 有多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性聚合物的聚合物顆粒。聚合物顆粒包括疏水性聚合物。該 方法還包括從親水性聚合物中切割多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)，并且從聚合物顆粒中提取疏水性 聚合物，形成水凝膠顆粒。
[0020] 在第十三個(gè)方面，顆粒包括由羥烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。 二丙烯酰胺包括羥基。當(dāng)暴露于水時(shí)，顆粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 通過(guò)參考附圖，本公開(kāi)內(nèi)容可得到更好理解，并且它的眾多特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員變得顯而易見(jiàn)。
[0022] 圖1包括用于制造示例性聚合物顆粒的示例性流程的舉例說(shuō)明。
[0023] 圖2包括利用聚合物顆粒的示例性測(cè)序方法的舉例說(shuō)明。
[0024]在不同附圖中的相同參考符號(hào)的使用指示相似或相同項(xiàng)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 在示例性實(shí)施方式中，形成聚合物顆粒的方法包括在水性懸浮液內(nèi)的分散相中， 使具有由疏水性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的親水性官能團(tuán)的單體的多個(gè)聚體單元聚合。聚合形成包括 多個(gè)疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚合物顆粒。該方法還包括將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆粒，例如 水凝膠顆粒。在一個(gè)例子中，單體包括親水性可自由基聚合單體，例如親水性基于乙烯基的 單體，特別是丙烯酰胺。單體是包括由疏水性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的親水性官能團(tuán)的親水性單體。 例如，疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括甲硅烷基官能團(tuán)或其衍生物。聚合還可包括在交聯(lián)劑的存在 下聚合，所述交聯(lián)劑例如乙烯基交聯(lián)劑，包括示例性二丙烯酰胺交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可以是具有 疏水性保護(hù)基團(tuán)的受保護(hù)的交聯(lián)劑。在一個(gè)例子中，將聚合物顆粒轉(zhuǎn)換為親水性顆?？砂?括從聚合物顆粒中去除疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分。特別地，疏水性保護(hù)基團(tuán)可以是酸 可切割的保護(hù)基團(tuán)，并且去除疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括從聚合物顆粒中酸切割疏水性保護(hù)基 團(tuán)。
[0026] 通過(guò)此類方法制備的示例性聚合物顆?？删哂衅谕拇笮』蜃儺愊禂?shù)。特別地， 聚合物顆粒可以是親水的。例如，聚合物顆?？砂ㄋz顆粒。此外，聚合物顆?？删哂?不超過(guò)100 μ m，例如不超過(guò)30 μ m、不超過(guò)3 μ m、或不超過(guò)2 μ m的平均粒度。聚合物顆?？?具有不超過(guò)15%，例如不超過(guò)5%的變異系數(shù)。
[0027] 特別地，此類顆?？捎糜诓东@靶分析物例如多核苷酸。在一個(gè)例子中，聚合物顆粒 可用于使用涉及光檢測(cè)的測(cè)序方法或涉及離子檢測(cè)的測(cè)序方法來(lái)測(cè)序多核苷酸。
[0028] 在特定實(shí)施方式中，分散相在水性懸浮液內(nèi)形成。分散相優(yōu)選是疏水的。在一個(gè) 例子中，分散相由于促進(jìn)種子顆粒例如疏水性種子顆粒而形成，以獲得分散相。促進(jìn)有利于 種子顆粒中疏水性組分的吸收。
[0029] 具有可去除的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體更喜歡分散相。單體在分散相內(nèi)聚合。任選 地，交聯(lián)劑與在分散相內(nèi)的單體聚合。在其中分散相由種子顆粒例如疏水性種子顆粒形成 的一個(gè)例子中，可去除與種子顆粒結(jié)合的聚合物。例如，種子顆粒的聚合物可使用溶劑溶 解，并且可從聚合物顆粒中提取。
[0030] 疏水性保護(hù)基團(tuán)可例如通過(guò)從聚合物顆粒中切割疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分 而去除。因此，形成親水性顆粒例如水凝膠顆粒。
[0031] 在一個(gè)例子中，可活化所得的親水性顆粒，以有利于與靶分析物例如多核苷酸的 綴合。例如，切割疏水性保護(hù)基團(tuán)可在親水性顆粒上留下親水性官能團(tuán)，例如羥基、氨基、硫 醇基或其組合。在特定例子中，羥基可通過(guò)將羥基轉(zhuǎn)換為磺酸酯基團(tuán)或氯得到活化?；撬?酯官能團(tuán)或氯可使用親核取代進(jìn)行取代或替換。特別地，具有親核末端基團(tuán)例如胺或硫醇 基的寡核苷酸可通過(guò)磺酸酯基團(tuán)或氯的親核取代而附著至親水性顆粒。此類顆?？商貏e用 于捕獲在測(cè)序技術(shù)中使用的多核苷酸。
[0032] 在另一個(gè)例子中，磺酸化顆粒還可與單官能或多官能單親核試劑或多親核試劑反 應(yīng)，所述親核試劑可形成與顆粒的附著，同時(shí)維持關(guān)于包含親電基團(tuán)例如馬來(lái)酰亞胺的寡 核苷酸的親核活性。另外，殘留親核活性可通過(guò)附著至包含多親電基團(tuán)的試劑而轉(zhuǎn)換為親 電活性，所述多親電基團(tuán)隨后附著至包含親核基團(tuán)的寡核苷酸。
[0033] 其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過(guò)程中使用包含在羧酸上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單 體。羧酸基團(tuán)的脫保護(hù)使得可獲得羧酸基團(tuán)，所述羧酸基團(tuán)還可與具有親核基團(tuán)例如胺的 寡核苷酸反應(yīng)或促使寡核苷酸附著。
[0034] 其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過(guò)程中使用包含在胺上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體。 胺基的脫保護(hù)使得可獲得親核基團(tuán)，所述親核基團(tuán)還可用胺反應(yīng)性雙官能雙親電試劑修 飾，所述修飾獲得在附著至聚合物顆粒后的單官能親電基團(tuán)。此類親電基團(tuán)可與具有親核 基團(tuán)例如胺或硫醇的寡核苷酸反應(yīng)，促使通過(guò)與空親電體反應(yīng)的寡核苷酸附著。
[0035] 如圖1中所示，方法100包括提供種子顆粒102。將單體加入懸浮液中，并且優(yōu)選 位于由促進(jìn)的種子顆粒形成的分散相104中。使單體和任選的交聯(lián)劑聚合，形成聚合物顆 粒108。聚合物顆粒108可剝?nèi)シN子聚合物，形成聚合物顆粒110。去除聚合物顆粒11〇上 的疏水性保護(hù)基團(tuán)，形成親水性顆粒112?？苫罨H水性顆粒112,形成綴合顆粒114。 [0036] 種子顆粒102可包括種子聚合物。在一個(gè)例子中，種子聚合物是疏水的。特別地， 種子聚合物可包括苯乙烯類聚合物、丙烯酸類聚合物、丙烯酰胺、另一種疏水的乙烯基聚合 物，或其任何組合。在一個(gè)例子中，種子顆粒102是單分散的，例如具有不超過(guò)20%的變異 系數(shù)。變異系數(shù)（CV)定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值乘以1〇〇,其中"平均值"是平均粒子直徑， 并且標(biāo)準(zhǔn)偏差是粒度的標(biāo)準(zhǔn)偏差。作為另外一種選擇，"平均值"可以是z-平均值或模式粒 徑。依照通常實(shí)踐，CV在主模式即主峰上進(jìn)行計(jì)算，從而排除與聚集體相關(guān)的小峰。因此， 低于或高于模式大小的一些顆?？稍谟?jì)算中不計(jì)算，所述計(jì)算可例如基于可檢測(cè)顆粒的總 粒子數(shù)的約 9〇%。此類CV測(cè)定可在CPS圓盤(pán)式離心機(jī)上執(zhí)行。特別地，種子顆粒102群 體可具有不超過(guò)10%，例如不超過(guò)5. 0%、不超過(guò)3. 5%、不超過(guò)3%、不超過(guò)2. 5%、不超過(guò) 2%、或甚至不超過(guò)1.0%的變異系數(shù)。此外，種子顆粒1〇2可具有不超過(guò)〇.6μπ!的初始粒 度。例如，初始粒度可以是不超過(guò)0· 45 μ m,例如不超過(guò)0· 35 μ m、或甚至不超過(guò)〇. 15 μ m。 作為另外一種選擇，具有至少3 μ m，例如至少5 μ m、至少10 μ m、至少20 μ m、或至少50 μ m 的初始粒度的更大種子顆粒可用于形成更大的聚合物顆粒。在一個(gè)例子中，初始粒度可以 是不超過(guò)100 u m。
[0037]種子顆粒1〇2可在水性懸浮液內(nèi)得到促進(jìn)，形成促進(jìn)的分散相104。特別地，促進(jìn) 種子顆粒包括使溶劑和促進(jìn)劑與種子顆粒一起在水性懸浮液內(nèi)混合，形成分散相。促進(jìn)的 種子顆粒更容易吸收疏水性組分。溶劑可以是與水混溶的。例如，溶劑可包括醛或酮，例如 甲醛、丙酮、甲基乙基酮、 二異丙基酮、二甲基甲酰胺或其組合；醚溶劑例如四氫呋喃、二甲 醚或其組合；酯溶劑；雜環(huán)溶劑例如吡啶、二噁烷、四氫糠醇、N-甲基-2-吡咯烷酮或其組 合；或其組合。在一個(gè)例子中，溶劑可包括酮例如丙酮。在另一個(gè)例子中，溶劑可包括醚溶 劑例如四氫呋喃。在另外的例子中，溶劑可包括雜環(huán)溶劑例如吡啶。
[0038]促進(jìn)劑或促進(jìn)試劑可以是疏水的，并且具有低水溶性例如在25Γ下不超過(guò) 0.01g/l的水溶性。例如，促進(jìn)劑可包括二辛酰過(guò)氧化物、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸正丁 酯、十二醇、分子量低于20kD的聚苯乙烯或其組合。在一個(gè)例子中，二辛酰過(guò)氧化物還可表 現(xiàn)為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。促進(jìn)劑還可以是低分子量聚苯乙烯，其例如使用低單體/引發(fā)劑 比率在分開(kāi)的聚合步驟中，或在種子聚合過(guò)程中添加鏈轉(zhuǎn)移試劑而制備。促進(jìn)劑一般在高 壓勻化器中乳化。
[0039]水性懸浮液還可包括表面活性劑。表面活性劑可以是離子表面活性劑、兩性表面 活性1劑、或非離子表面活性劑。離子表面活性劑可以是陰離子表面活性劑。在另一個(gè)例子 中，離子表面活性劑可以是陽(yáng)離子表面活性劑。示例性陰離子表面活性劑包括硫酸鹽表面 活性劑、磺酸鹽表面活性劑、磷酸鹽表面活性劑、羧酸鹽表面活性劑或其任何組合。示例性 硫酸鹽表面活性劑包括烷基硫酸鹽，例如月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉， (SDS))，或其組合；烷基醚硫酸鹽，例如月桂基聚醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉或其任何 組合；或其任何組合。示例性磺酸鹽表面活性劑包括烷基磺酸鹽例如十二烷基磺酸鈉；多 庫(kù)酯鈉例如磺基琥珀酸鈉二辛酯；烷基芐基磺酸鹽；或其任何組合。示例性磷酸鹽表面活 性劑包括烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽或其任何組合。示例性羧酸表面活性劑包括烷 基羧酸鹽，例如脂肪酸鹽或硬脂酸鈉；月桂酰肌氨酸鈉；膽汁酸鹽例如脫氧膽酸鈉；或其任 何組合。
[0040] 示例性陽(yáng)離子表面活性劑包括伯胺、仲胺或叔胺，季銨表面活性劑或其任何組合。 示例性季銨表面活性劑包括烷基三甲銨鹽例如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)或十六烷基 三甲基氯化銨（CTAC);西吡氯銨（CPC);聚乙氧基化牛油胺（Ρ0ΕΑ);苯扎氯銨（BAC);芐索 氯銨（BZT) ;5_溴-5-硝基-1，3-二噁烷；雙十八烷基二甲基氯化銨；雙十八烷基二甲基溴 化銨（D0DAB);或其任何組合。
[0041] 示例性兩性表面活性劑包括具有磺酸鹽、羧酸鹽或磷酸鹽陰離子的伯胺、仲胺或 叔胺，或季銨陽(yáng)離子。示例性磺酸鹽兩性表面活性劑包括（3-[(3-膽酰胺丙基）二甲基氨 基]-1-丙磺酸鹽）；磺基甜菜堿（sultaine)例如椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿；或其任何 組合。示例性羧酸兩性表面活性劑包括氨基酸、亞氨酸、甜菜堿例如椰油酰胺丙基甜菜堿或 其任何組合。示例性磷酸鹽兩性表面活性劑包括卵磷脂。在進(jìn)一步的例子中，表面活性劑 可以是非離子表面活性劑例如基于聚乙二醇的表面活性劑。
[0042]回到圖1，加入懸浮液中的單體優(yōu)選天然位于由促進(jìn)的種子顆粒形成的分散相 104中。交聯(lián)劑例如疏水性交聯(lián)劑也可加入水性懸浮液中，并且可優(yōu)先位于分散相中。在 一個(gè)例子中，交聯(lián)劑具有不超過(guò)10g/l的水溶性。此外，致孔劑（porogen)可加入水性懸 浮液中，并且可優(yōu)先位于分散相中。在進(jìn)一步的例子中，分散相可包括丙烯酸亞磷醜胺 (acrydite)寡核苷酸，例如離子交換的丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸。如圖1中所示，使單體和 任選的交聯(lián)劑聚合以形成聚合物顆粒108。
[0043] 單體可以是可自由基聚合的單體例如基于乙烯基的單體。特別地，單體可包括與 疏水性保護(hù)基團(tuán)偶聯(lián)的親水性單體。在一個(gè)例子中，親水性單體可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯 酯、甲基丙烯酸羥烷基酯或其任何組合。在特定例子中，親水性單體是丙烯酰胺，例如包括 羥基、氨基、羧基或其組合的丙烯酰胺。在一個(gè)例子中，親水性單體是氨基烷基丙烯酰胺、由 胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺（下文所示的C)、丙烯酰基哌嗪（下文所示的D)，或 其組合。在另一個(gè)例子中，丙烯酰胺可以是羥烷基丙烯酰胺，例如羥乙基丙烯酰胺。特別地， 羥烷基丙烯酰胺可包括N-三（羥甲基）甲基）丙烯酰胺（下文所示的A)、N-(羥甲基）丙 烯酰胺（下文所示的B)，或其組合。在進(jìn)一步的例子中，可使用單體的混合物，例如羥烷基 丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物，或丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物。 在一個(gè)例子中，胺官能化的丙烯酰胺可以在100:1至1:1的范圍（例如100:1至2:1的范 圍、50:1至 3:1的范圍、50:1至5:1的范圍、或甚至印：丨至⑴：丨的范圍）內(nèi)的羥烷基丙烯 酰胺：胺官能化的丙烯酰胺或丙烯酰：胺官能化的丙烯酰胺的比率包括。
[0044] Q ' H Q B 人一她 H v^\ r\ /T^ H
[0045] 在特定例子中，親水性單體包括羥基或包括胺。疏水性保護(hù)基團(tuán)例如通過(guò)與羥基 或胺基鍵合來(lái)屏蔽單體的親水性。當(dāng)與羥基鍵合時(shí)，此類保護(hù)基團(tuán)在本文中被稱為羥基保 護(hù)基團(tuán)或氫氧基保護(hù)基團(tuán)。特別地，疏水性保護(hù)基團(tuán)可例如通過(guò)切割例如酸切割去除。疏 水性基團(tuán)可選擇為在酸性條件下切割，所述切割不導(dǎo)致潛在聚合物或其一部分的水解。例 如，對(duì)于低于6的pH值，當(dāng)丙烯酰胺聚合物存在時(shí)，疏水性保護(hù)基團(tuán)在比丙烯酰胺的酰胺部 分水解的pH高的pH下切割。對(duì)于高于9的pH值，疏水性保護(hù)基團(tuán)在比丙烯酰胺的酰胺部 分水解的pH低的pH下切割。
[0046] 示例性疏水性保護(hù)基團(tuán)包括有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基 醚官能團(tuán)。甲硅烷基醚官能團(tuán)可源自鹵代甲硅烷基化合物，例如通式RiSiOg (R3) (?)的 化合物，其中&是鹵素，例如氯，并且R2、R3和獨(dú)立地選自氫，烷基例如甲基、乙基、丙基、 丁基、芳基、甲硅烷基、其醚衍生物或其任何組合。示例性甲硅烷基醚官能團(tuán)源自叔丁基二 甲基氯娃焼、三甲基氯娃燒、二乙基氯娃燒、二丙基氯娃燒、二丁基氯娃燒、一苯基甲基氯娃 烷、氯（二甲基）苯基硅烷，或其組合。在特定例子中，受保護(hù)單體包括N-(2_((叔丁基二甲 基甲娃焼基）氧基）乙基）丙稀醜胺或tBDMS-HEAM、N-(2 -((二乙基甲娃燒基）氧基）乙 基）丙烯酰胺或TES-HEAM或其組合。在另一個(gè)例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)可包括有機(jī)部分。 示例性有機(jī)部分可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其組合。在一個(gè)例 子中，此類有機(jī)部分可以是與胺官能團(tuán)例如胺官能化的丙烯酰胺或其共聚物的胺官能團(tuán)結(jié) 合的疏水性保護(hù)基團(tuán)。
[0047] 受保護(hù)單體可以相對(duì)于初始種子聚合物作為在100:1至1:2的范圍（例如50:1 至1:1的范圍、45:1至2:1的范圍、30:1至5:1的范圍、或甚至2〇:1至8:1的范圍）內(nèi)的 重量比（受保護(hù)單體：種子聚合物）表示的量包括。作為另外一種選擇，單體可以在 10:1 至1:2的范圍，例如5:1至1:2的范圍，或甚至在2:1至1:2的范圍內(nèi)的量包括。
[0048] 分散相還可包括交聯(lián)劑。在一個(gè)例子中，交聯(lián)劑以在15:1至1:2的范圍（例如 10:1至1:1的范圍、6:1至1:1的范圍、或甚至4:1至1:1的范圍）內(nèi)的受保護(hù)單體與交 聯(lián)劑的質(zhì)量比包括。交聯(lián)劑可具有低水溶性（例如小于Wg/ 1)，導(dǎo)致對(duì)于分散相的優(yōu)先。 特別地，交聯(lián)劑可以是二乙烯基交聯(lián)劑。例如，二乙烯基交聯(lián)劑可包括二丙烯酰胺，例如 Ν，Ν'-(乙烷-1,2-二基）雙（2-羥乙基）丙烯酰胺、N，N，-(2-羥丙烷-1,3-二基）二丙 烯酰胺或其組合。在另一個(gè)例子中，二乙烯基交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基 苯、六亞甲基雙丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯、其受保護(hù)的衍生物，或其組合。在 進(jìn)一步的例子中，交聯(lián)劑可由疏水性保護(hù)基團(tuán)例如羥基保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。特別地，疏水 性保護(hù)基團(tuán)可以是有機(jī)金屬部分。例如，有機(jī)金屬部分可形成甲硅烷基醚官能團(tuán)。示例性 甲硅烷基醚官能團(tuán)可源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅 烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯（二甲基）苯基硅烷，或其組合。示例性受保護(hù)的 二丙烯酰胺交聯(lián)劑包括Ν, Ν'-(乙烷-I,2-二基）雙（N-(2_((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧 基）乙基）丙烯酰胺、N，N' -(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）丙烷-1,3-二基） 二丙烯酰胺、N，Ν' -（乙烷-1，2-二基）雙（N-(2-((三乙基甲硅烷基）氧基）乙基）丙烯 酰胺、Ν，Ν'-(Ν-(2-((三乙基甲硅烷基）氧基）丙烷-l， 3_二基）二丙烯酰胺、甲硅烷基保 護(hù)的Ν-[2-(丙烯酰氨基）-1，2_二羥乙基]丙烯酰胺例如Ν，Ν'（2,3_雙（（三乙基甲硅烷 基）氧基）丁烷-1,4-二基）二丙烯酰胺，或其組合。在另一個(gè)例子中，保護(hù)基團(tuán)可包括烷 氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其組合。特別地，包括羥基的交聯(lián)劑可由保 護(hù)基團(tuán)例如上文與受保護(hù)單體相關(guān)描述的保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。
[0049]另外，使具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的親水性單體聚合可包括在致孔劑的存在下聚合。 示例性致孔劑包括芳香族致孔劑。在一個(gè)例子中，芳香族致孔劑包括苯、甲苯、二甲苯、均三 甲苯、乙酸苯乙酯、己二酸二乙酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯酯、乙酸丁酯，或其組合。 致孔劑通常具有15-20的溶解度參數(shù)。在另一個(gè)例子中，致孔劑是烷醇致孔劑例如十二醇。 致孔劑可以相對(duì)于在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)的有機(jī)相在1重量％至99重量％的范圍（例如30重量％ 至 9〇重量％的范圍或甚至50重量％至85重量％的范圍）內(nèi)的量包括。
[0050] 單體選自以其無(wú)保護(hù)形式產(chǎn)生水凝膠的一組單體，使得寡核苷酸和聚合酶可在使 用過(guò)程中到達(dá)其靶。
[0051] 親水性丙烯酰胺和尤其是二丙烯酰胺難以在這樣的溶劑中溶解，所述溶劑與水不 混溶并且同時(shí)溶解疏水性種子聚合物。關(guān)于單體和交聯(lián)劑兩者的保護(hù)基團(tuán)可這樣選擇，使 得單體在疏水相中的溶解度足夠大，以實(shí)現(xiàn)足夠大的濃度以進(jìn)行聚合。同時(shí)，保護(hù)基團(tuán)可以 不大得使得聚合由于立體阻礙而無(wú)法進(jìn)行。脫保護(hù)可在不水解聚合物的條件下進(jìn)行。
[0052] 任選地，可包括聚合引發(fā)劑。示例性聚合引發(fā)劑可通過(guò)自由基生成而引發(fā)聚合。示 例性聚合引發(fā)劑包括偶氮引發(fā)劑例如油溶性偶氮引發(fā)劑。另一種引發(fā)劑可包括過(guò)硫酸銨。 進(jìn)一步的示例性引發(fā)劑可包括四甲基乙二胺。在一個(gè)例子中，聚合引發(fā)劑可以基于分散相 重量0.001重量％至3重量％的量包括。
[0053] 在聚合后，聚合物顆粒108可剝?nèi)シN子聚合物，形成仍具有疏水性保護(hù)基團(tuán)的聚 合物顆粒110。例如，種子聚合物可使用溶劑提取，所述溶劑例如醛或酮例如丙酮、甲基乙基 酮、二異丙基酮、乙酸丁酯、環(huán)己酮、二甲基甲酰胺或其組合；鄰苯二甲酸酯溶劑例如鄰苯二 甲酸正丁酯；醚溶劑例如四氫呋喃、二異丙醚、甲基叔丁醚、二甲醚、二乙醚或其組合；酯溶 劑例如乙酸乙酯、乙酸丁酯或其組合；雜環(huán)溶劑例如吡啶、二噁烷、四氫糠醇或其組合；鹵 代溶劑例如二氯甲烷、氯仿或其組合。作為另外一種選擇，種子聚合物可在聚合物顆粒轉(zhuǎn)換 為親水性顆粒后進(jìn)行提取。例如，種子聚合物可在使顆粒聚合物脫保護(hù)，例如去除聚合物上 起因于受保護(hù)單體的甲硅烷基后進(jìn)行提取。
[0054] 如圖1中所示，一旦提取種子聚合物，聚合物顆粒110就可通過(guò)去除疏水性保護(hù)基 團(tuán)的至少一部分而轉(zhuǎn)換為親水性聚合物顆粒。例如，疏水性保護(hù)基團(tuán)可從聚合物顆粒中酸 切割。特別地，此類去除可從聚合物顆粒中去除基本上所有疏水性保護(hù)基團(tuán)，例如去除至少 80%的疏水性保護(hù)基團(tuán)，或甚至至少90%的疏水性保護(hù)基團(tuán)。
[0055] 在一個(gè)例子中，疏水性保護(hù)基團(tuán)通過(guò)添加酸例如有機(jī)酸進(jìn)行酸切割。特別地，有機(jī) 酸可具有在3. 0至5. 5的范圍內(nèi)的PKa。例如，有機(jī)酸可包括乙酸、乳酸、檸檬酸或其任何組 合。作為另外一種選擇，可使用無(wú)機(jī)酸。
[0056] -旦去除疏水性保護(hù)基團(tuán)的至少一部分，就形成親水性顆粒112。親水性顆粒112 可以是水凝膠顆粒。水凝膠是可吸收其重量至少20%的水，例如其重量至少45 %、至少 65%、至少85%、至少100%、至少300%、至少1〇〇〇%、至少1500%或甚至至少2000%的水 的聚合物。
[0057] 可活化親水性聚合物112,以有利于與靶分析物例如多核苷酸的綴合。例如，可增 強(qiáng)在親水性顆粒112上的官能團(tuán)，以允許與靶分析物或分析物受體的結(jié)合。在特定例子中， 親水性聚合物的官能團(tuán)可用能夠?qū)⒂H水性聚合物官能團(tuán)轉(zhuǎn)換為反應(yīng)部分的試劑進(jìn)行修飾， 所述反應(yīng)部分可經(jīng)歷親核或親電取代。例如，親水性顆粒112上的羥基可通過(guò)將羥基的至 少一部分替換為磺酸酯基團(tuán)或氯進(jìn)行活化。示例性磺酸酯基團(tuán)可源自三氟乙基磺酰氯、甲 磺酰氯、對(duì)甲苯磺酰氯或4-氟苯橫酰氯（fosyl chloride)、或其任何組合。橫酸酯可作用 于允許親核體替換磺酸酯?；撬狨ミ€可與釋放的氯反應(yīng)，以提供可在過(guò)程中用于綴合顆粒 的氯化基團(tuán)。在另一個(gè)例子中，可活化在親水性聚合物112上的胺基。
[0058] 例如，祀分析物或分散物受體可通過(guò)由橫酸酯基團(tuán)的親核取代而與親水性聚合物 結(jié)合。在特定例子中，由親核體例如胺或硫醇封端的靶分析物受體可經(jīng)歷親核取代，以替換 親水性聚合物112的表面上的磺酸酯基團(tuán)。由于活化，可形成綴合顆粒114。
[0059] 在另一個(gè)例子中，磺酸化顆粒還可與單官能或多官能單親核試劑或多親核試劑反 應(yīng)，所述親核試劑可形成與顆粒的附著，同時(shí)維持對(duì)包含親電基團(tuán)例如馬來(lái)酰亞胺的寡核 苷酸的親核活性。另外，殘留親核活性可通過(guò)附著至包含多親電基團(tuán)的試劑而轉(zhuǎn)換為親電 活性，所述多親電基團(tuán)隨后附著至包含親核基團(tuán)的寡核苷酸。
[0060] 在另一個(gè)例子中，含有官能團(tuán)的單體可在聚合過(guò)程中添加。單體可包括例如含有 羧酸、酯、鹵素或其他胺反應(yīng)基團(tuán)的丙烯酰胺。酯基團(tuán)可在與胺寡核苷酸反應(yīng)前水解。
[0061] 其他綴合技術(shù)包括在顆粒合成過(guò)程中使用包含在胺上的疏水性保護(hù)基團(tuán)的單體。 胺基的脫保護(hù)使得可獲得親核基團(tuán)，所述親核基團(tuán)還可用胺反應(yīng)性雙官能雙親電試劑修 飾，所述修飾獲得在附著至聚合物顆粒后的單官能親電基團(tuán)。此類親電基團(tuán)可與具有親核 基團(tuán)例如胺或硫醇的寡核苷酸反應(yīng)，促使通過(guò)與空親電體反應(yīng)的寡核苷酸附著。
[0062]如果顆粒112由氨基和羥基丙烯酰胺的組合制備，則水凝膠顆粒的脫保護(hù)導(dǎo)致親 核氨基和中性羥基的組合。氨基可由二官能雙親電部分例如二異氰酸酯或雙-NHS酯進(jìn)行 修飾，導(dǎo)致與親核體反應(yīng)的親水性顆粒。示例性雙-NHS酯包括雙琥珀酰亞胺C2-C12烷基 酯，例如雙琥珀酰亞胺辛二酸酯或雙琥珀酰亞胺戊二酸酯。
[0063]其他活化化學(xué)包括摻入多步以轉(zhuǎn)化特定官能團(tuán)，以容納特定所需連接。例如，磺酸 酯修飾的輕基可通過(guò)幾種方法轉(zhuǎn)化成親核基團(tuán)。在一個(gè)例子中，橫酸酯與疊氮化物陰離子 的反應(yīng)獲得疊氮化物取代的親水聚合物。疊氮化物可經(jīng)由"CLICK"化學(xué)直接用于與乙炔取 代的生物分子綴合，所述"CLICK"化學(xué)可伴隨或不伴隨銅催化進(jìn)行。任選地，疊氮化物可通 過(guò)例如與氫的催化還原或與有機(jī)膦的還原而轉(zhuǎn)化為胺。所得的胺隨后可用多種試劑轉(zhuǎn)化為 親電基團(tuán)，所述多種試劑例如二異氰酸酯、雙NHS酯、三聚氯氰或其組合。在一個(gè)例子中，使 用二異氰酸酯獲得在聚合物和接頭之間的脲連接，所述脲連接導(dǎo)致能夠與氨基取代的生物 分子反應(yīng)的殘留異氰酸酯基團(tuán)，以獲得在接頭和生物分子之間的脲連接。在另一個(gè)例子中， 使用雙NHS酯獲得在聚合物和接頭之間的酰胺連接，和能夠與氨基取代的生物分子反應(yīng)的 殘留的NHS酯基團(tuán)，以獲得在接頭和生物分子之間的酰胺連接。在進(jìn)一步的例子中，使用三 聚氯氰（cyanuric chloride)獲得在聚合物和接頭之間的氨基-三嗪連接，和兩個(gè)殘留的 氯-三嗪基團(tuán)，其中之一能夠與氨基取代的生物分子反應(yīng)，以獲得在接頭和生物分子之間 的氨基-三嗪連接。其他親核基團(tuán)可經(jīng)由磺酸酯活化摻入顆粒內(nèi)。例如，磺酸化的顆粒與 硫代苯甲酸陰離子的反應(yīng)和后續(xù)硫代苯甲酸酯的水解將硫醇摻入顆粒內(nèi)，所述顆?？呻S后 與馬來(lái)酰亞胺取代的生物分子反應(yīng)，以獲得與生物分子的硫代-琥珀酰亞胺連接。硫醇還 可與溴-乙?；磻?yīng)。
[0064] 作為另外一種選擇，丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸可在聚合過(guò)程中用于摻入寡核苷 酸。示例性丙烯酸亞磷酰胺寡核苷酸可包括離子交換的寡核苷酸。
[0065] 使用與在生物分子上的親核部分偶聯(lián)的在基底上的親電部分、或與在生物分子上 的親電連接偶聯(lián)的在基底上的親核連接基團(tuán)，可在難熔性（refractory)基底或聚合基底 上產(chǎn)生生物分子的共價(jià)連接。由于大多數(shù)常見(jiàn)目的生物分子的親水性性質(zhì)，對(duì)于這些偶聯(lián) 選擇的溶劑是水或含一些水溶性有機(jī)溶劑的水，以便將生物分子分散到基底上。特別地，由 于其聚陰離子性質(zhì)，多核苷酸一般在水系統(tǒng)中與基底偶聯(lián)。因?yàn)樗ㄟ^(guò)使親電體水解為失 活部分用于綴合而與親核體競(jìng)爭(zhēng)親電體，所以水性系統(tǒng)一般導(dǎo)致偶聯(lián)產(chǎn)物的低得率，其中 得率基于該偶聯(lián)對(duì)的親電部分。當(dāng)期望反應(yīng)的對(duì)的親電部分的高得率時(shí)，需要高濃度的親 核體以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)并減輕水解，導(dǎo)致親核體的無(wú)效使用。在多核酸的情況下，磷酸鹽的金屬抗 衡離子可替換為親脂抗衡離子，以便幫助生物分子溶解于極性、非反應(yīng)性、非水性溶劑中。 這些溶劑可包括酰胺或脲，例如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、 六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N，Ν，Ν'，Ν'-四甲基脲、Ν，Ν'-二甲基-N，Ν'-三 亞甲基脲或其組合；碳酸酯；例如碳酸二甲基酯、碳酸亞丙基酯或其組合；醚例如四氫呋 喃；亞砜和砜例如二甲基亞砜、二甲基砜或其組合；受阻醇例如叔丁醇；或其組合。親脂陽(yáng) 離子可包括四烷基銨或四芳基銨陽(yáng)離子例如四甲基銨、四乙基銨、四丙基胺、四丁基銨、四 戊基銨、四己基銨、四庚基錢(qián)、四辛基胺、以及其烷基和芳基混合物，四芳基鱗陽(yáng)離子例如四 苯基鱗，四烷基紳或四芳基紳例如四苯基紳，以及三烷基锍陽(yáng)離子例如三甲基锍或其組合。 通過(guò)用親脂陽(yáng)離子交換金屬陽(yáng)離子將多核酸轉(zhuǎn)換成有機(jī)溶劑可溶性材料，可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)離子交換技術(shù)進(jìn)行。
[0066] 在另一個(gè)例子中，顆?？墒褂萌闋钜壕酆霞夹g(shù)形成，其中疏水相在親水相內(nèi)形成 分散相。上文描述的有利于疏水相的單體、交聯(lián)劑以及其他試劑和化合物趨于位于在其中 發(fā)生聚合的疏水相中。 t〇〇67] 表面活性劑例如上文描述的表面活性劑可用于親水相中，以支持乳狀液形成。當(dāng) 使用種子顆粒時(shí)，表面活性劑可以低于臨界膠束濃度的濃度使用。作為另外一種選擇，表面 活性劑可以大于臨界膠束濃度的濃度使用。乳狀液聚合通常用水溶性引發(fā)劑如過(guò)硫酸鉀或 過(guò)硫酸銨進(jìn)行。
[0068]通過(guò)將引發(fā)劑加入單體的加熱乳狀液中，顆粒成核在水相中開(kāi)始，并且形成的顆 粒通過(guò)表面活性劑得到穩(wěn)定。如果大多數(shù)顆粒在短時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生，則可產(chǎn)生單一尺寸的種 子顆粒。因?yàn)閱误w通過(guò)水相從大單體小滴擴(kuò)散到小得多的種子顆粒內(nèi)，所以顆粒大小隨后 發(fā)生增加。
[0069] 特別地，上述方法可產(chǎn)生具有期望粒度和變異系數(shù)的多個(gè)顆粒。顆粒組可包括 100, 000個(gè)顆粒，例如500, 000個(gè)顆粒、大于1百萬(wàn)個(gè)顆粒、大于丨千萬(wàn)個(gè)顆?；蛏踔林辽?1x10'多個(gè)顆粒的顆?？梢允怯H水性聚合物顆粒，例如水凝膠顆粒。在特定例子中，水凝膠 顆?？梢允潜０奉w粒，例如包括交聯(lián)的羥烷基丙烯酰胺聚合物或羥烷基（hydroalkyl) 丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物的顆粒。在另一個(gè)例子中，顆粒可以是丙烯 酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物。
[0070] 該多個(gè)顆?？删哂衅谕牧６龋绮怀^(guò)100 μ m、不超過(guò)30 μ m、或不超過(guò) 3ym的粒度。平均粒度是平均粒子直徑。例如，平均粒度可以是不超過(guò)2μηι,例如不超 過(guò)1· 5 μ m、不超過(guò)1· 1 μ m、不超過(guò)0· 8 μ m、不超過(guò)0· 6 μ m、不超過(guò)〇· 5 μ m、或甚至不超過(guò) 0. 3μηι。在特定例子中，平均粒度可在0· Ιμηι至ΙΟΟμηι的范圍內(nèi)，例如〇. ?μιη至50μπι 的范圍或〇· ?μηι至1. lum的范圍。在一些方面，上述方法提供了用于產(chǎn)生顆粒的技術(shù)優(yōu) 點(diǎn)，所述顆粒具有在5μηι至ΙΟΟμηι的范圍，例如20 μ m至ΙΟΟμηι的范圍或30 μ m至70μηι 的范圍內(nèi)的粒度。在其他方面，上述方法提供了用于產(chǎn)生具有不超過(guò)1. Ιμηι的粒度的顆粒 的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)種子更大時(shí)，可形成更大的顆粒。顆粒的大小可基于種子顆粒的大小進(jìn)行 調(diào)整。使用本發(fā)明的方法，聚合物顆粒的大小比使用其他方法時(shí)更不依賴于表面活性劑選 擇和濃度。
[0071] 此外，多個(gè)顆粒是單分散的，并且可具有期望的低變異系數(shù)，例如不超過(guò)20 %的變 異系數(shù)。如上，變異系數(shù)（CV)定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值乘以100,其中"平均值"是平均 粒子直徑，并且標(biāo)準(zhǔn)偏差是粒度中的標(biāo)準(zhǔn)偏差。作為另外一種選擇，"平均值"可以是Ζ-平 均值或模式粒徑。依照通常實(shí)踐，CV在主模式即主峰上進(jìn)行計(jì)算，從而排除與聚集體相關(guān) 的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些顆?？稍谟?jì)算中不計(jì)算，所述計(jì)算可例如基于可 檢測(cè)顆粒的總粒子數(shù)的約90%。此類CV測(cè)定可在CPS圓盤(pán)式離心機(jī)或庫(kù)爾特粒度儀上執(zhí) 行。例如，多個(gè)顆粒的變異系數(shù)（CV)可以是不超過(guò)15%，例如不超過(guò)10%、不超過(guò)5%、不 超過(guò)4. 5%、不超過(guò)4. 0%、不超過(guò)3. 5%、或甚至不超過(guò)3. 0%。此類CV可無(wú)需過(guò)濾或其他 尺寸排阻技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0072] 特別地，為了維持珠大小的低變異，在聚合過(guò)程中應(yīng)避免小滴的合并。該避免在水 包油乳狀液中比油包水乳狀液中更容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)楦菀资蛊渲兴沁B續(xù)相的系統(tǒng)穩(wěn)定。 然而，親水性單體不優(yōu)先位于油相中。
[0073] 在進(jìn)一步的例子中，在水中的親水性聚合物顆?？梢允遣怀^(guò)50重量％聚合物， 例如不超過(guò)30重量％聚合物、不超過(guò)20重量％聚合物、不超過(guò)10重量％聚合物、不超過(guò)5 重量％聚合物、或甚至不超過(guò)2重量％聚合物。
[0074] 在另外的例子中，聚合物顆?？删哂性试S蛋白質(zhì)和酶擴(kuò)散的孔隙率。在一個(gè)例子 中，聚合物顆?？删哂性试S具有下述大小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散的孔隙率：至少50千道爾頓，例如 至少100千道爾頓、至少200千道爾頓、至少250千道爾頓、或甚至至少350千道爾頓。 [0075] 在另一個(gè)例子中，當(dāng)綴合時(shí)，聚合物顆?？砂ㄖ辽?χ104/μ m3的多核苷酸密度， 稱為核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少105/μηι 3,例如至少106/lim3、至少5xl06/ μ m3、至少8χ106/μ m3、至少lxl〇V μ m3、或甚至至少3χ107/μ m3。在進(jìn)一步的例子中，核苷 酸密度可以是不超過(guò)1〇15/μ m3。
[0076] 此類聚合物顆?？捎糜诙喾N分離技術(shù)和分析技術(shù)中。特別地，聚合物顆?？捎糜?結(jié)合多核苷酸。此類結(jié)合多核苷酸可用于從溶液中分離多核苷酸或可用于分析技術(shù)例如測(cè) 序。在圖2中所示的具體例子中，此類聚合物顆?？稍跍y(cè)序技術(shù)過(guò)程中用作多核苷酸的載 體。例如，此類親水性顆?？晒潭ǘ嗪塑账嵊糜谑褂脽晒鉁y(cè)序技術(shù)的測(cè)序。在另一個(gè)例子 中，親水性顆?？晒潭ǘ嗪塑账岬亩鄠€(gè)拷貝用于使用離子感測(cè)技術(shù)的測(cè)序。
[0077] 一般而言，聚合物顆?？蛇M(jìn)行處理，以包括生物分子，所述生物分子包括核苷、核 苷酸、核酸（寡核苷酸和多核苷酸）、多肽、糖、多糖、脂質(zhì)或其衍生物或類似物。例如，聚合 物顆?？膳c生物分子結(jié)合或附著。生物分子的末端或任何中間部分都可與聚合物顆粒結(jié)合 或附著。聚合物顆?？墒褂眠B接化學(xué)與生物分子結(jié)合或附著。連接化學(xué)包括共價(jià)或非共價(jià) 鍵，包括離子鍵、氫鍵、親和鍵、偶極-偶極鍵、范德華鍵和疏水鍵。連接化學(xué)包括在結(jié)合配 偶體之間，例如在下述物質(zhì)之間的親和力：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和 抗體或其免疫反應(yīng)片段；抗體和半抗原；地高辛配基（digoxigen)部分和抗地高辛配基抗 體；熒光素部分和抗熒光素抗體；操縱子和阻遏子；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；類固 醇和類固醇結(jié)合蛋白；活性化合物和活性化合物受體；激素和激素受體；酶和底物；免疫球 蛋白和蛋白A ;或者寡核苷酸或多核苷酸及其相應(yīng)互補(bǔ)體。
[0078] 在一個(gè)例子中，聚合物顆?？捎糜诰哂斜砻娴南到y(tǒng)中。該系統(tǒng)包括在表面上的一 個(gè)或多個(gè)聚合物顆粒。表面可以是固體表面。表面可包括平面、凹或凸表面、或其任何組合。 表面可包括紋理或特征，包括蝕刻、空穴化或隆起。表面可缺乏任何紋理或特點(diǎn)。表面可包 括毛細(xì)管、通道、凹槽、孔或儲(chǔ)庫(kù)的內(nèi)壁。表面可以是網(wǎng)。表面可以是多孔、半多孔或非多孔 的。表面可以是濾器或凝膠。表面可包括針（例如針陣列）的頂端。表面可由例如下述材 料制備：玻璃、硼硅玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳 酸酯、聚甲基丙烯酸酯（PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)、聚二甲基硅氧烷（PDMS)、硅、鍺、 石墨、陶瓷、硅、半導(dǎo)體、高折射率電解質(zhì)、晶體、凝膠、聚合物或薄膜（例如金、銀、鋁或鉆石 的薄膜）。表面可包括具有金屬薄膜或金屬涂層的固體基底。表面是光學(xué)透明、最低限度反 射、最低限度吸收的或顯示出低熒光。
[0079] 表面可具有類似于含96、384、1536、3456或9600個(gè)孔的微量滴定板的尺度。表面 可在任何一個(gè)尺度上是約l-20cm，在任何一個(gè)尺度上是約l-l〇cm，在任何一個(gè)尺度上是約 0· 10-lcm，或在任何一個(gè)尺度上是約〇· OOlnm - lcm。表面（以及任何紋理或特點(diǎn)）可通過(guò) 納米構(gòu)造技術(shù)產(chǎn)生。
[0080] 多個(gè)聚合物顆?？稍诒砻嫔弦噪S機(jī)或有序陣列排列，或以隨機(jī)和有序陣列的組合 排列。有序陣列包括直線和六角形模式。表面可包括以隨機(jī)或有序陣列或兩者的組合排列 的多個(gè)位點(diǎn)。一個(gè)或多個(gè)聚合物顆?？晌挥谝粋€(gè)位點(diǎn)、一些位點(diǎn)或所有位點(diǎn)處。一些位點(diǎn) 可具有一個(gè)聚合物顆粒，并且其他位點(diǎn)可具有多個(gè)聚合物顆粒。至少一個(gè)位點(diǎn)可缺乏聚合 物顆粒。在陣列中，至少兩個(gè)聚合物顆?？杀舜私佑|，或在聚合物顆粒之間不具有接觸。
[0081]、如圖2中所示，多個(gè)聚合物顆粒2〇4可連同多個(gè)多核苷酸2〇2 一起置于溶液中。多 個(gè)顆粒204可被活化或以其他方式制備，以與多核苷酸2〇2結(jié)合。例如，顆粒2〇4可包括與 多個(gè)多核苷酸202的多核苷酸一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一個(gè)例子中，聚合物顆粒2〇4 可使用諸如生物素-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的技術(shù)由靶多核苷酸2〇4進(jìn)行修飾。
[0082]在特定實(shí)施方式中，對(duì)親水性顆粒和多核苷酸實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增。例 如，分散相小滴2〇6或208作為乳狀液的一部分形成，并且可包括親水性顆?；蚨嗪塑账?。 在一個(gè)例子中，多核苷酸202和親水性顆粒204以低濃度和相對(duì)于彼此的低比率提供，使得 單個(gè)多核苷酸 2〇2可能位于與單個(gè)親水性顆粒2〇4相同的分散相小滴內(nèi)。其他小滴例如小 滴208可包括單個(gè)親水性顆粒且不包括多核苷酸。每個(gè)小滴 2〇6或2〇8可包括酶、核苷酸、 鹽或足以促進(jìn)多核苷酸復(fù)制的其他組分。
[0083]在特定實(shí)施方式中，酶例如聚合酶存在于分散相小滴的親水性顆粒或水凝膠顆粒 中，與分散相小滴的親水性顆?；蛩z顆粒結(jié)合或緊密接近。在一個(gè)例子中，聚合酶存在 ^分散相小滴中，以有利于多核苷酸的復(fù)制。多種核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在 示例性實(shí)施方式中，聚合酶可包括可催化多核苷酸復(fù)制的酶、其片段或子單元。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重組聚合酶、突變型聚合酶、變體聚合酶、融合 物或以其他方式改造的聚合酶、化學(xué)修飾的聚合酶、合成分子、或其類似物、衍生物或片段。 [00 84]在一個(gè)實(shí)施方式中，聚合酶可以是任何家族A DNA聚合酶（也稱為pol I家族） 或任何家族B DNA聚合酶。在實(shí)施方式中，DNA聚合酶可以是與非重組!)嫩聚合酶相比較， 能夠以優(yōu)良的準(zhǔn)確度和得率復(fù)制多核苷酸的重組形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶 或熱穩(wěn)定聚合酶。在實(shí)施方式中，用于多核苷酸復(fù)制的條件可包括'熱啟動(dòng)'條件,例如熱 啟動(dòng)聚合酶例如Amplitaq Gold? DNA聚合酶（Applied Biosciences)或K0D熱啟動(dòng)DNA 聚合酶（EMD Biosciences)。通常，'熱啟動(dòng)，聚合酶包括熱穩(wěn)定聚合酶和一種或多種抗體， 所述抗體抑制在環(huán)境溫度下的DNA聚合酶和3' -5,外切核酸酶活性。
[0085]在實(shí)施方式中，聚合酶可以是酶例如Taq聚合酶（來(lái)自水生棲熱菌（Thermus aquaticus))、Tfi聚合酶（來(lái)自絲狀棲熱菌（Thermus filiformis))、Bst聚合酶（來(lái)自 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus))、Pfu聚合酶（來(lái)自強(qiáng)烈熾熱球菌 (Pyrococcus furiosus))、Tth聚合酶（來(lái)自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus))、Pow聚 合酶（來(lái)自沃氏熱球菌（Pyrococcus woesei))、Tli聚合酶（來(lái)自棲熱球菌（Thermococcus litoralis))'Ultima 聚合酶（來(lái)自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima))、KOD 聚合酶（來(lái) 自超好熱原始菌（Thermococcus kodakaraensis))、Pol I和II聚合酶（來(lái)自激烈火球菌 (Pyrococcus abyssi))以及Pab (來(lái)自激烈火球菌）。
[0086]在實(shí)施方式中，聚合酶可以是重組形式的超好熱原始菌。在實(shí)施方式中，聚合酶可 以是K0D或K0D樣DNA聚合酶，例如K0D聚合酶（EMD Biosciences)、K0D "熱啟動(dòng)，，聚合酶 (EMD Biosciences)、K0D Xtreme熱啟動(dòng)DNA聚合酶（EMD Biosciences)、K0D XL DNA聚合酶 (EMD Biosciences)、Platinum? Taq 1)NA 聚合酶（Invitrogen)、Platimira_ Taq DNA 聚合 酶尚保真度（Invitrogen)、Platinum? Pfx(Invitrogen)、Accuprime? Pfx(Invitrogen)、 Accuprime? Taq DNA 聚合酶局保真度（Invitrogen)或 Ampl itaq DNA 聚合酶 (Applied Biosystems)。在實(shí)施方式中，聚合酶可以是含有與本文討論的聚合酶相似的突 變的DNA聚合酶。 、 _____丄 JA
[0087]在實(shí)施方式中，多核苷酸的復(fù)制可包括調(diào)節(jié)復(fù)制條件。調(diào)節(jié)可任選包括.增加或降 低聚合酶濃度；增加或降低核苷酸濃度；增加或降低陽(yáng)離子濃度；増加或降低反應(yīng)溫度 間或pH等等。調(diào)節(jié)可包括增加或降低反應(yīng)速率、增加或降低反應(yīng)產(chǎn)物得率等等。在實(shí)^ 式中，復(fù)制可在適當(dāng)緩沖劑或核苷酸（包括核苷酸類似物或生物素化的核苷酸）的存在下 進(jìn)行。
[0088]特別地，待擴(kuò)增的多核苷酸可通過(guò)聚合物顆粒捕獲。用于捕獲核酸的示例性方法 可包括：使多核苷酸與寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸附著至聚合物顆粒。在實(shí)施方式中，用 于捕獲核酸的方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸（例如捕獲寡核苷酸）的聚合物顆 粒；(b)提供單鏈多核苷酸；和 （c)使單鏈寡核苷酸與單鏈多核苷酸雜交，由此將單鏈多核 苷^捕獲至聚合物顆粒。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸（例如捕 獲寡核苷酸）附著。在實(shí)施方式中，步驟（ c)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中， 單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)（或部分互補(bǔ)）的核苷 酸序列。
[0089]在一個(gè)例子中，該:方法還包括將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)多核苷酸，并且使多個(gè)多核 苷酸的至少一部分附著至親水性顆粒，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的親水性顆粒。 作為另外一種選擇，該方法還可包括通過(guò)延伸寡核苷酸將多核苷酸擴(kuò)增成多個(gè)互補(bǔ)多核苷 酸，由此生成包括多個(gè)附著的多核苷酸的水凝膠顆粒。
[0090]、在實(shí)施方式中，用于核苷酸摻入的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行核苷酸聚合反應(yīng)，所 述多核苷酸是與附著至聚合物顆粒的寡核苷酸雜交的。在實(shí)施方式中，用于核苷酸摻入的 方法包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸（例如引物寡核苷酸）的聚合物顆粒 ；(b)提供單 鏈模板多核苷酸；（c)使單鏈寡核苷酸與單鏈模板多核苷酸雜交；和（d)在適合于聚合酶催 化至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使單鏈模板多核苷酸與聚合酶和至少 一個(gè)核苷酸接觸，由此進(jìn)行核苷酸摻入。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核 苷^、（例如捕獲寡核苷酸）附著。在實(shí)施方式中，步驟 （b)、（c)或（d)可用多個(gè)單鏈多核 苷酸進(jìn)行。在頭施方式中，單鏈募核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分 互補(bǔ)（或部分互補(bǔ)）的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含與單鏈寡核苷酸雜交的單鏈 多核苷酸，所述單鏈寡核苷酸附著至聚合物顆粒，其中至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷 酸的末端上。 '
[0091]在實(shí)施方式中，用于引物延伸的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所述多 核苷酸是與附著至聚合物顆粒的寡核苷酸雜交的。在實(shí)施方式中，用于核酸引物延伸的方 $包括：(a)提供附著至單鏈寡核苷酸（例如引物寡核苷酸）的聚合物顆粒； (b)提供單鏈 模板多核苷酸；(c)使單鏈寡核苷酸與單鏈模板多核苷酸雜交；和（d)在適合于聚合酶催化 至少一個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使單鏈模板多核苷酸與聚合酶和至少一 個(gè)核苷酸接觸，由此延伸引物。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸（例 如捕獲寡核苷酸）附著。在實(shí)施方式中，步驟（b)、（ c)或（d)可用多個(gè)單鏈多核苷酸進(jìn)行。 在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)（或部 分互補(bǔ)）的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含與單鏈寡核苷酸雜交的單鏈多核苷酸，所 述單鏈寡核苷酸附著至聚合物顆粒，其中所述單鏈寡核苷酸由一個(gè)或多個(gè)核苷酸延伸。 [0092]在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法包括：對(duì)多核苷酸進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所述多 懷紐酸雜交。在實(shí)式中，用·酸擴(kuò)漏方法包括： 丨?恩--?核?酸（例如引物雜飾）的聚合物臟；(b)提供單鏈模板多核 苷^;(。）使單鏈募核苷酸與單麵板多核苷酸雜交；( d)在適合于聚合酶將至少-個(gè)核昔 酸催化聚合鮮齡核_上的條件下，使單謝艦多核細(xì)與聚合酶輕少-種核苷酸 接觸、以便生成延伸的單鏈寡核麵。在實(shí)施方式中，該方法還包括 ：(e)從延伸的單鏈寡 核苷酸去除（嫩P使變性）單f雜板斜紐酸，使得單鏈猶箝謝親附著至聚合物顆粒； ⑴」吏剩余的單鏈寡核苷酸與第二單鏈模板多核苷酸雜交；和 （g)在適合于第二聚合酶催 化第一至少:個(gè)核苷酸聚合到單鏈寡核苷酸上的條件下，使第二單鏈模板多核苷酸與第二 聚合酶和第二至少一個(gè)核苷酸接觸，以便生成后續(xù)延伸的單鏈寡核苷酸。在實(shí)施方式中，步 驟（ e)、（1和、(g)可重復(fù)至少一次。在實(shí)施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含熱穩(wěn)定的聚 合酶。在實(shí)施方式中，適合于核苷酸聚合的條件包括在高溫下進(jìn)行核苷酸聚合步驟（例如 步驟（d)或、(g))。在實(shí)施方式中，適合于核苷酸聚合的條件包括在交替溫度（例如高溫和 相^更低的溫度）下進(jìn)、行核苷酸聚合步驟（例如步驟 （d)或（g))。在實(shí)施方式中，交替溫 度范圍為60-95°C。在實(shí)施方式中，溫度循環(huán)可以是約 1〇秒至約5分鐘、或約10分鐘、或約 15分鐘或更久。在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法可生成各自附著至多個(gè)模板多核苷酸 的一種或$種聚合物顆粒，所述多個(gè)模板多核苷酸包含與單鏈模板多核苷酸或第二單鏈模 板多核苷酸互補(bǔ)的序列。在實(shí)施方式中，聚合物顆粒各自可與多個(gè)單鏈寡核苷酸（例如捕 獲募核苷酸）附著。在實(shí)施方式中，步驟（b)、（ c)、（d)、（e)、（f)或（g)可用多個(gè)單鏈多核 苷酸進(jìn)行。在實(shí)施方式中，單鏈寡核苷酸的至少一部分包含與單鏈多核苷酸的至少一部分 互補(bǔ)（或部分互補(bǔ)）的核苷酸序列。在實(shí)施方式中，用于核酸擴(kuò)增的方法（如上所述）可 在油相（例如分散相小滴）中的水相溶液中進(jìn)行。
[0093]在PCR后，形成顆粒例如顆粒210,其可包括親水性顆粒212和多核苷酸的多個(gè)拷 貝214。雖然多核苷酸214作為在顆粒210的表面上示出，但多核苷酸214可在顆粒210內(nèi) 延伸。具有相對(duì)于水的低濃度聚合物的水凝膠和親水性顆?？砂ㄔ陬w粒 21〇內(nèi)部和各處 的多核苷酸區(qū)段，或多核苷酸可位于孔及其他開(kāi)口內(nèi)。特別地，顆粒21〇可允許酶、核苷酸、 引物和用于監(jiān)控反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散。大量多核苷酸/顆粒產(chǎn)生更佳的信號(hào)。
[0094]在實(shí)施方式中，可收集來(lái)自破乳操作的聚合物顆粒并在用于測(cè)序的制劑中洗滌。 收集可通過(guò)下述進(jìn)行：使生物素部分（例如與附著至聚合物顆粒的擴(kuò)增的多核苷酸模板連 接）與抗生物素蛋白部分接觸，并且與缺乏生物素化模板的聚合物顆粒分離。可使攜帶雙 鏈模板多核苷酸的收集的聚合物顆粒變性，以獲得單鏈模板多核苷酸用于測(cè)序。變性步驟 可包括用堿例如（NaOH)、甲酰胺或吡咯烷酮處理。
[0095]在示例性實(shí)施方式中，顆粒210可用于測(cè)序裝置中。例如，測(cè)序裝置216可包括孔 218的陣列。顆粒210可置于孔218內(nèi)。
[0096]在一個(gè)例子中，引物可加入孔218中，或顆粒210可在置于孔218內(nèi)之前預(yù)暴露于 引物。特別地，顆粒210可包括結(jié)合的引物。引物和多核苷酸形成包括與引物雜交的多核 苷酸（例如模板核酸）的核酸雙鏈體。核酸雙鏈體是至少部分雙鏈的多核苷酸。酶和核苷 酸可提供給孔218,以促進(jìn)可察覺(jué)的反應(yīng)，例如核苷酸摻入。
[0097]測(cè)序可通過(guò)檢測(cè)核苷酸添加進(jìn)行。核苷酸添加可使用諸如熒光發(fā)射法或離子檢測(cè) 法的方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，一組熒光標(biāo)記的核苷酸可提供給系統(tǒng)216,并且可遷移至孔218。 激發(fā)能也可提供給孔2 is。當(dāng)核苷酸由聚合酶捕獲并加入延伸引物的末端時(shí)，核苷酸的標(biāo)記 可發(fā)熒光，從而指示加入哪種類型的核苷酸。
[0098] 在替代例子中，包括單一類型核苷酸的溶液可順序進(jìn)料。響應(yīng)核苷酸添加，在孔 218的局部環(huán)境內(nèi)的pH可改變。此類pH變化可通過(guò)離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管（ISFET)進(jìn)行 檢測(cè)。像這樣，pH變化可用于生成指示與顆粒210的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸次序的信號(hào)。 [0099] 特別地，測(cè)序系統(tǒng)可包括設(shè)置在離子傳感器例如場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET)的傳感器墊 上的孔或多個(gè)孔。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)包括裝載到孔內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)聚合物顆粒，所述孔設(shè) 置在離子傳感器（例如FET)的傳感器墊上，或包括裝載到多個(gè)孔內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)聚合物顆 粒，所述多個(gè)孔設(shè)置在離子傳感器（例如FET)的傳感器墊上。在實(shí)施方式中，F(xiàn)ET可以是 chemFET或ISFET。"chemFET"或化學(xué)場(chǎng)效應(yīng)晶體管包括充當(dāng)化學(xué)傳感器的一類場(chǎng)效應(yīng)晶 體管。chemFET具有M0SFET晶體管的類似結(jié)構(gòu)，其中在門(mén)電極上的電荷由化學(xué)過(guò)程施加。 "ISFET"或離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管可用于測(cè)量溶液中的離子濃度；當(dāng)離子濃度（例如H+)改 變時(shí)，通過(guò)晶體管的電流相應(yīng)地改變。
[0100] 在實(shí)施方式中，F(xiàn)ET可以是FET陣列。如本文使用的，"陣列"是元件例如傳感器或 孔的平面排列。陣列可以是一維或二維的。一維陣列可以是具有在第一維度中的一列（或 行）元件和在第二維度中的多個(gè)列（或行）的陣列。第一和第二維度中的列（或行）數(shù)目 可相同或不同。FET或陣列可包含10 2、103、104、105、106、10 7或更多卩已1'。
[0101] 在實(shí)施方式中，一種或多種微流體結(jié)構(gòu)可在FET傳感器陣列上方制造，以提供生 物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)的約束或限制。例如，在一個(gè)實(shí)現(xiàn)中，一種或多種微流體結(jié)構(gòu)可構(gòu)造為設(shè)置 在陣列的一種或多種傳感器上的一個(gè)或多個(gè)孔（或微孔、或反應(yīng)室、或反應(yīng)孔，因?yàn)檫@些術(shù) 語(yǔ)在本文中可互換使用），使得給定孔設(shè)置在其上的一種或多種傳感器檢測(cè)并測(cè)量給定孔 中的分析物存在、水平或濃度。在實(shí)施方式中，可存在FET傳感器和反應(yīng)孔的1:1對(duì)應(yīng)。
[0102] 回到圖2,在另一個(gè)例子中，孔陣列的孔218可以可操作地連接至測(cè)量裝置。例如， 對(duì)于熒光發(fā)射法，孔218可以可操作地偶聯(lián)至光檢測(cè)裝置。在離子檢測(cè)的情況下，孔218的 下表面可設(shè)置在離子傳感器例如場(chǎng)效應(yīng)晶體管的傳感器墊上。
[0103] 涉及經(jīng)由核苷酸摻入的離子副產(chǎn)物檢測(cè)測(cè)序的一個(gè)示例性系統(tǒng)為Ion Torrent PGM?測(cè)序儀（Life Technologies)，所述Ion Torrent PGM?測(cè)序儀是基于離子的測(cè)序 系統(tǒng)，其通過(guò)檢測(cè)作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的氫離子來(lái)測(cè)序核酸模板。通常，氫離 子作為在通過(guò)聚合酶的模板依賴性核酸合成過(guò)程中發(fā)生的核苷酸摻入的副產(chǎn)物釋放。 Ion Torrent PGM?測(cè)序儀通過(guò)檢測(cè)核苷酸摻入的氫離子副產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)核苷酸摻入。Ion Torrent PGM?測(cè)序儀可包括待測(cè)序的多個(gè)模板多核苷酸，每個(gè)模板設(shè)置在陣列中的各自測(cè) 序反應(yīng)孔內(nèi)。陣列的孔可各自與至少一種離子傳感器偶聯(lián)，所述離子傳感器可檢測(cè)作為核 苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的H+離子的釋放或溶液pH變化。離子傳感器包括與離子敏感的檢 測(cè)層偶聯(lián)的場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET)，所述離子敏感的檢測(cè)層可感測(cè)H+離子的存在或溶液pH變 化。離子傳感器可提供指示核苷酸摻入的輸出信號(hào)，所述輸出信號(hào)可表示為其量級(jí)與各自 孔或反應(yīng)室中的H+離子濃度關(guān)聯(lián)的電壓變化。不同核苷酸類型可連續(xù)流動(dòng)到反應(yīng)室內(nèi)，并 且可以由模板序列決定的次序通過(guò)聚合酶摻入延伸引物（或聚合位點(diǎn)）內(nèi)。每個(gè)核苷酸摻 入可伴隨反應(yīng)孔中H+離子的釋放，連同局限性pH的伴隨變化。H+離子的釋放可通過(guò)傳感器 的FET登記，所述傳感器產(chǎn)生指示核苷酸摻入的發(fā)生的信號(hào)。在特定核苷酸流動(dòng)過(guò)程中未 摻入的核苷酸可能不產(chǎn)生信號(hào)。來(lái)自FET的信號(hào)幅度還可與摻入延伸核酸分子內(nèi)的特定類 型核苷酸的數(shù)目關(guān)聯(lián)，由此允許分辨均聚物區(qū)域。因此，在測(cè)序儀的運(yùn)行過(guò)程中，進(jìn)入反應(yīng) 室內(nèi)的多個(gè)核苷酸流連同跨越多個(gè)孔或反應(yīng)室的摻入監(jiān)控可允許儀器同時(shí)分辨多個(gè)核酸 模板的序列。關(guān)于Ion Torrent PGM?測(cè)序儀組成、設(shè)計(jì)和操作的更多細(xì)節(jié)可例如在下述專 利申請(qǐng)中找到：美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)12/002781，目前作為美國(guó)專利
【發(fā)明者】G.豐努姆, G.莫達(dá)爾, N.許斯, A.E.莫爾特伯格, D.特蘭, J.阿斯羅德, M.T.戈克曼, S.門(mén)琴, C.福勒, L.安德魯齊, W.欣茨, D.格雷姆亞辛斯基, D.萊特, A.馬斯特羅亞尼, B.羅森布魯姆, S.坎, C.斯托拉奇克, T.索科爾斯基 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司