低分子量和極低分子量肝素獲取工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明指的是涵蓋肝素-苯索氯胺鹽中肝素鈉鹽化、有機介質解聚和形成堿性金屬鹽或堿土鹽的鹽化階段的低分子量(HBPM)和極低分子量(HMBPM)肝素制備工藝。也可以指通過本發(fā)明中所述工藝獲取的產(chǎn)物。
【專利說明】低分子量和極低分子量肝素獲取工藝
[0001] 發(fā)明目的
[0002] 本發(fā)明指的是低分子量（HBPM)和極低分子量（HMBPM)肝素制備工藝。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 肝素是一種由糖醛酸（L-艾杜糖醛苷或D-葡萄糖醛酸）和D-氨基葡萄糖交替組 成的黏多糖硫酸脂。L-艾杜糖醛苷可以是2-0-硫酸化的，D-氨基葡萄糖可以為N-硫酸 化和/或6-0-硫酸化的，小范圍內也可以是N-乙?；?-0-硫酸化的（《肝素寡糖主要 成分量化和映射》LinhardtRJ,RiceKG,KimYSetal.BiochemJ1988;254:781-787)。 肝素優(yōu)先作為鈉鹽而使用，但也可以作為其他堿性金屬鹽或堿土鹽而使用，并且主要作為 抗血栓和抗凝血藥物而應用（《主要動靜脈血栓栓塞抗凝治療》TranHAM,GinsbergJS。 《基本原則和臨床實踐》ColmanRW，MarderVJ,ClowesAW,GeorgeJN，GoldhaberSZ(Ed)， LippincottWilliams和Wilkins;2006:1673-1688)。
[0005] 根據(jù)分子量，肝素可分為普通肝素（HNF)、低分子量肝素（HBPM)和極低分子量肝 素（HMBPM)。HBPM和HMBPM通過HNF原分子的解聚獲得。
[0006] 如在其他類型肝素中出現(xiàn)的一樣，HBPM的抗血栓作用需要抗凝血酶III(ATIII)。 通過特定的糖胺序列，肝素與抗凝血酶相連，形成HBPM-ATIII-Xa因子三元復合物。該抑制 作用也稱為抗血栓作用。相反的，在抗凝血作用中，凝血酶中和需要HBPM-ATIII-IIa因子 三元復合物的形成，為此，至少需要18種糖類。
[0007] HBPM中肝素鈉的改進很大程度上是因為與抗凝血作用相比，抗血栓作用中ATIII 的活性較強。
[0008] 另一方面，在普通肝素以及通過解聚方法獲得的多種HBPM或HMBPM(酶、亞硝酸、 0消除等）中，存在能夠讓我們通過具體的雙糖單位成分量化法確定多糖量的方法，即結 合到N-磺基-3-0-磺基-D-葡糖胺（ANS，3S)中的D-葡糖醛酸（G)。該方法可獲得肝素 結構中雙糖占比與多糖成分間的比例關系，即確定相關肝素的抗FXa活性（低分子量肝素： 二維核磁共振光譜結構分化。GuerriniM，GuglieriS，NaggiA，SasisekharamR和Torri G。血栓與止血學術研討會2007;33:478-487)。
[0009] 在現(xiàn)有技術中已經(jīng)記錄了多種HBPM制備方法。在EP01955436專利文件中描述了 通過涵蓋肝素-苯索氯胺鹽中肝素鹽鹽化、肝素-芐索氯銨鹽鹽化、肝素芐酯鈉鹽提純和獲 取、芐索氯銨鹽中肝素鈉鹽化、有機介質中的強堿解聚、芐酯皂化以及產(chǎn)物提純（若有需要 的話）階段的工藝獲取HBPM的過程。在本發(fā)明中生成相應的季銨鹽肝素來取代需要事先 形成的肝素芐酯中間體，季銨鹽肝素提取物可作為基體。本發(fā)明中所描述的工藝是最簡單 的，可省略制備肝素芐酯中間體的步驟，既節(jié)省費用也節(jié)約了生產(chǎn)時間。
[0010] EP1070503專利文件描述了具備以下特性的低分子量肝素獲取工藝，平均分子量： 2000-4000D，抗FXa活性：10〇-15〇n/mg，抗Flla活性小于或等于l〇n/mg。通過以非水性 介質為基體的芐索肝素處理獲得HBPM的具體步驟為：肝素-苯索氯胺鹽中肝素鈉鹽化、以 有機介質為基礎的初級解聚、芐酯鈉鹽鹽化、初級解聚后獲得的中間體芐酯鈉鹽形成、以有 機介質為基礎的二級解聚、芐酯鈉鹽鹽化和最后的提純。
[0011] 除非所形成的鹽是苯索肝素鹽，否則在ES2003197專利文件中也將描述此前 EP1070503專利文件中所建議的相同工藝。本工藝所使用的基體為TritonB-氫氧化四烴 銨，在文件中講述到可使用任何氫氧化四烴銨化物，但沒有教授如何在本工藝中影響基體 并且解釋在使用任何氫氧化四烴銨時，該物質不是具有決定性的元素。
[0012] 同時，通過對現(xiàn)有技術的了解，在該行業(yè)中具備較大的興趣開發(fā)HBPM和HMBPM制 備的有效工藝，該工藝可獲得最大的ATIII糖胺序列，并且省略掉肝素-芐索氯銨鹽鹽化、 芐索氯銨鹽中肝素鈉鹽化以及芐酯皂化階段。
[0013] 發(fā)明描沐
[0014]
【發(fā)明者】已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個高收益和高選擇性的HBPM和HMBPM獲取新工藝，從而獲得 最具選擇性的制備過程。此外，與其他熟知的工藝相比，所發(fā)明的工藝是最簡單的。發(fā)明人 員已經(jīng)證實在通過0消除機制進行的HBPM和HMBPM半合成工藝中，苯索肝素鹽解聚提取 物的專門作用為強堿作用，可以阻止ATIII活性糖胺的保留，因為在其結構中糖胺呈現(xiàn)為 三硫酸單糖，與含有較低硫化度單糖的其他分子破裂結構相比，更能阻礙活性糖胺的保留。
[0015] 工藝的特點是第一階段為鹽化（即一種鹽轉化為另一種鹽的反應）、使用磷基或 胍基進行的解聚以及最終的鹽化。
[0016] 因此，發(fā)明的第一階段指的是涵蓋以下階段的發(fā)明成分獲取工藝：
[0017]a)苯索肝素鹽中堿性金屬肝素鈉或堿土肝素鈉的鹽化
[0018] b)添加磷基或胍基的有機介質解聚；以及
[0019]c)形成堿性金屬鹽或堿土鹽的鹽化
[0020] 圖片描沐
[0021] 以一組發(fā)明樣例（但不僅限于此）的圖片、插圖描述本文件。
[0022] 圖1 :使用TritonB解聚的樣本4中所述產(chǎn)物的13C-1HHSQC光譜異頭信號區(qū)域 (H1-C1關系）展現(xiàn)，在氘化水（D20)中記錄為298K。在光譜中我們可以觀察到組成糖胺的 5個單糖的相關5個關系峰值。ANSred、還原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-0硫酸化的 L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、來自ANS、3S和ANS-(G) 的D-葡糖醛酸、來自D-葡糖醛酸環(huán)的N-磺基-D-葡糖胺。畫圈突顯G-(ANS，3S)單元的 H1-C1關系峰值，因為這是最具糖胺特點的信號，并且可視為參考以便在多個樣本中確定該 信號出現(xiàn)的數(shù)量。
[0023] 圖2:使用BEMP解聚的樣本4中所述產(chǎn)物的13C-1HHSQC光譜異頭信號區(qū)域 (H1-C1關系）展現(xiàn)，在氘化水（D20)中記錄為298K。在光譜中我們可以觀察到組成糖胺的 5個單糖的相關5個關系峰值。ANSred、還原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-0硫酸化的 L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、來自ANS、3S和ANS-(G) 的D-葡糖醛酸、來自D-葡糖醛酸環(huán)的N-磺基-D-葡糖胺。畫圈突顯G-(ANS，3S)單元的 H1-C1關系峰值，因為這是最具糖胺特點的信號，并且可視為參考以便在多個樣本中確定該 信號出現(xiàn)的數(shù)量。
[0024] 發(fā)明詳沐
[0025] 在本發(fā)明中，"磷基或胍基"術語指的是強親核性中性基團，如 Pl-t-Bu，P2-t-Bu，t-BuP4 和BEMP(2-叔-丁基亞氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全 氫-1，3, 2-二吖磷英）和TTMG(2-叔-丁基-1，1，3, 3-四甲基胍），非介子溶劑中的強堿 (MeCNpKaBEMP= 27. 6,DMSOpKat-BuP4H+ = 32)。
[0026] 如上所述，發(fā)明的第一方面指的是涵蓋以下階段的HMBPM和/或HBPM成分獲取工 乙：
[0027]a)苯索肝素鹽中堿性金屬肝素鈉或堿土肝素鈉的鹽化
[0028] b)添加磷基或胍基的有機介質解聚；以及
[0029]c)形成堿性金屬鹽或堿土鹽的鹽化
[0030] 最終產(chǎn)物需要在階段b)和階段c)中進行凈化時，需添加有機和/或無機過氧化 物。
[0031] 階段a)中的堿性金屬肝素鹽或堿土肝素鹽最好是堿性金屬普通肝素鹽或堿土普 通肝素鹽。
[0032] 所使用的過氧化物最好是過氧化氫。其他有機過氧化物范例為：過氧化甲乙酮、過 氧化苯甲酰、過氧化丙酮。無機過氧化物范例為含有（〇2)_2和IA及IIA組金屬物的復合 物。
[0033]階段c)后獲得的產(chǎn)物需要進行凈化處理。最好通過濃度為5-20% (p/v)，pH值 為6-7. 5,氯化鈉濃度為3-15% (p/v)的水溶液，并且使用甲醇沉淀法進行提純。通過濃度 為7. 5-12. 5% (p/v)，pH值為6. 5-7. 25,氯化鈉濃度為5-10% (p/v)的水溶液，使用甲醇 沉淀法進行產(chǎn)物稀釋。
[0034] 使用有機溶劑進行解聚，有機溶劑最好為二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿，二甲基甲酰 胺和/或甲酰胺。在20-40°C溫度環(huán)境下所使用的有機溶劑優(yōu)先考慮二氯甲烷。
[0035] 至少連續(xù)添加2次堿性物進行階段b)的解聚。最好連續(xù)添加3次。
[0036] 重量比例：苯索肝素鹽和每個添加物基體之間的體積比為1:0. 5和1:0. 05,最好 為 1:0.3 和 1:0.1。
[0037] 重量比例：苯索肝素鹽和過氧化氫之間的體積比為1:1和1:0. 01，最好為1:0. 2 和 1:0.05〇
[0038] 使用醋酸鈉醇類溶液中反應介質沉降方法進行階段c)的鹽化，最好在10% (p/v) 醋酸鈉甲醇溶液中進行。
[0039] 本發(fā)明的第二階段為通過含有大比例糖胺和較大的抗血栓活性的發(fā)明工藝所獲 得的產(chǎn)物。
[0040] 范例
[0041] 接下來所示具體范例用于說明本發(fā)明的屬性。這些范例僅用于解釋性說明，不限 制本發(fā)明的描述內容。
[0042]范例1
[0043] 100g的肝素鈉稀釋在725ml的水中，在該溶液中添加880ml的苯扎氯銨/50 %p/ v水。過濾產(chǎn)物、使用水進行清洗并且冷凍干燥。可獲得233g苯索肝素鹽。
[0044] 將在上一階段獲得的10g苯索肝素鹽稀釋在30ml的二氯甲烷中，并且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加BEMP(2-叔-丁基亞氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全 氫-1,3, 2-二吖磷英）：
[0045] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0046] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0047] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0048] 在溶液中添加1ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此后在60ml的 醋酸鈉甲醇（10%P/V)溶液中進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗。所獲 得的產(chǎn)物在5ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，并且使用 125ml的甲醇溶劑進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35°C的溫度 下在真空爐中進行干燥。獲得3. 39g產(chǎn)物。
[0049] 將2g解聚產(chǎn)物在14. 5ml的水中稀釋，在所獲得的溶液中添加17. 6ml的苯扎氯 銨/50%p/v水。過濾產(chǎn)物、使用水進行清洗并且冷凍干燥。所獲得的4. 84g產(chǎn)物稀釋在 14. 5ml的二氯甲烷中，并且加熱到35°C。在該溶液中添加0. 83ml的BEMP并且在35°C下維 持16小時的反應活性。16小時后在26ml的醋酸鈉甲醇（10%p/v)溶液中進行沉淀。通 過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗。所獲得的產(chǎn)物在5ml的水中進行稀釋、中和、添加 氯化鈉，直至達到10%P/V的濃度，并且使用50ml的甲醇溶劑進行沉淀。
[0050] 通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35°C的溫度下在真空爐中進行干 燥。
[0051] 獲得1. 32g產(chǎn)物（52. 1 %收益）。所獲得的產(chǎn)物特點如下所示：
[0052]-介質分子量：2903Da.
[0053]-抗FXa活性：193UI/mg.
[0054]-抗Flla活性：9. 3UI/mg.
[0055]范例2
[0056] 將50g的肝素鈉稀釋在365ml的水中，在該溶液中添加221g的苯扎氯銨/50%p/ v水。
[0057] 過濾產(chǎn)物、使用水進行清洗并且冷凍干燥。可獲得128. 18g苯索肝素鹽。
[0058] 將在上一階段獲得的5g苯索肝素鹽稀釋在15ml的二氯甲烷中，并且加熱到35°C。 在該溶液中按3次份額添加BEMP:
[0059]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0060]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0061]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0062] 在溶液中添加0.50ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此后在30ml 的醋酸鈉甲醇（10%P/V)溶液中進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗。所 獲得的產(chǎn)物在2. 5ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，并且使 用75ml的甲醇溶劑進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35°C的溫度 下在真空爐中進行干燥。獲得1. 40g產(chǎn)物。
[0063] 將1.40g解聚產(chǎn)物在10ml的水中稀釋，在所獲得的溶液中添加6. 18g的苯扎氯銨 /50%p/v水。過濾產(chǎn)物、使用水進行清洗并且冷凍干燥。所獲得的3. 40g苯索肝素鹽稀釋 在10ml的二氯甲烷中，并且加熱到35°C。在該溶液中按三次份額添加BEMP:
[0064] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0065]-0.58ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0066] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0067] 在溶液中添加0.34ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此后在20ml 的醋酸鈉甲醇（10%p/v)溶液中進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗。將 所獲得的產(chǎn)物在1. 7ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，并且 使用50ml的甲醇溶劑進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35°C的 溫度下在真空爐中進行干燥。獲得〇.85g產(chǎn)物（43.6%收益）。所獲得的產(chǎn)物特點如下所 示：
[0068]-介質分子量：2787Da.
[0069] -抗FXa活性：121. 5n/mg.
[0070] -抗Flla活性：8. 2n/mg.
[0071]范例3
[0072] 將在范例2中獲得的0.50g產(chǎn)物稀釋在5ml的水中，進行中和，添加氯化鈉，直至 濃度達到10%P/V，并且使用6ml甲醇溶劑進行沉淀。通過離心方式篩出沉淀物，使用甲醇 清洗并且在35°C的溫度下在真空爐中進行干燥。獲得0. 13g產(chǎn)物。所獲得的產(chǎn)物特點如下 所示：
[0073]-介質分子量：3, 534Da.
[0074]-抗FXa活性：125. 2n/mg.
[0075] -抗Flla活性：19. 4UI/mg.
[0076] 重復范例2所述步驟，但要使用TTMG基體，而不是BEMP基體。
[0077] 所獲得的產(chǎn)物特點如下所示：
[0078]-介質分子量：3704Da.
[0079] -抗FXa活性：118. 5n/mg.
[0080] -抗Flla活性：16. 2n/mg.
[0081] 范例4.比較性范例
[0082] 在本范例中研宄的是在發(fā)明工藝中改變基體的效果。使用TritonB和BEMP分別 進行相同的實驗，以便展示在發(fā)明工藝中使用磷基的影響情況。
[0083] 將50g的肝素鈉稀釋在水中，在該溶液中添加221g的苯扎氯銨/50%p/v水。過 濾產(chǎn)物、使用水進行清洗并且冷凍干燥。可獲得128. 18g苯索肝素鹽。
[0084] 將在上一階段獲得的25g苯索肝素鹽稀釋在75ml的二氯甲烷中，并且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加TritonB:
[0085] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0086] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0087] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0088] 在溶液中添加2. 5ml的過氧化氫，接下來進行凈化以便獲得相關鈉鹽。所獲得的 產(chǎn)物進行鹽化，從而在上述條件和比例下獲得苯索肝素鹽。
[0089] 將在上一階段獲得的15. 68g苯索肝素鹽稀釋在47ml的二氯甲烷中，并且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加TritonB:
[0090] -3. 92ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0091] -3. 92ml的TritonB。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0092] -3. 92ml的TritonB?在35°C下維持8小時的反應活性。
[0093] 獲得的產(chǎn)物特點如下：
[0094] -介質分子量：2387Da.
[0095]-抗FXa活性：94n/mg.
[0096] 使用BEMP基體解聚進行相同的實驗。
[0097] 將5g苯索肝素鹽稀釋在15ml的二氯甲烷中，加熱到35°C。在該溶液中按3次份 額添加BMP:
[0098] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0099] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0100] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0101] 在溶液中添加〇. 5ml的過氧化氫，接下來進行凈化以便獲得相關鈉鹽。所獲得的 產(chǎn)物進行鹽化，從而在上述條件和比例下獲得苯索肝素鹽。
[0102] 將在上一階段獲得的3. 40g苯索肝素鹽稀釋在10ml的二氯甲烷中，并且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加BEMP:
[0103] -0.58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0104] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0105]-0.58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0106] 所獲得的產(chǎn)物特點如下：
[0107]-介質分子量：2787Da.
[0108] -抗FXa活性：121. 5n/mg.
[0109] 在該比較性范例中可以看出工藝中的磷基明顯增加了產(chǎn)物的抗FXa活性。
[0110] 樣本中可通過核磁共振（RMN)技術，使用13C-1HHSQC定量二維實驗（異核單量 子相干），根據(jù)MarcoGuerrini等人所述方法確定單糖平均含量。通過二維方法提高分辨 率，可確定一維光譜中重疊信號的數(shù)量，因而該技術最適用于研宄復合碳水化合物。這些分 子在1H-維光譜中呈現(xiàn)出較嚴重的重疊問題，這就難以確定1D中隔絕峰值的區(qū)域，進而難 以定量。
[0111] N-磺基-3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖G- (ANS，3S)中的D-葡糖醛酸單元數(shù)量呈 現(xiàn)在從天然肝素中獲取的GAG中，其數(shù)量多少直接與GAG的抗Xa活性相關，如M.Guerrini 等人所述。該糖屬于與III抗凝血酶具備相互作用的糖胺，并且僅在活躍序列中可以檢測 到。該葡糖醛酸異頭碳與直接相連的氫化物的關系信號出現(xiàn)在典型區(qū)域內，并且不會在 HSQC光譜中重疊，因此可使用其確定樣本中糖胺的比例分量。
[0112] 使用TritonB和BEMP解聚獲得的產(chǎn)物的13C-1HHSQC光譜分別在圖1和圖2中 所示，在圖片中多糖葡糖醛酸單元的相應異頭質子1H-13C的關系信號通過圓圈突顯出來。
[0113] 光譜中該信號的強度數(shù)值可使我們確定糖胺比例。
[0114] 表1?使用TritonB和BEMP的不同成分比例
[0115]
【權利要求】
1. HMBPM和/或HBPM成分獲取步驟，因為涵蓋以下階段： a) 肝素-苯索氯胺鹽中堿性金屬肝素鹽或堿土肝素鹽的鹽化； b) 通過添加磷基或胍基進行的有機介質解聚；以及 c) 形成堿性金屬鹽或堿土鹽的鹽化。
2. 根據(jù)專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為階段b)到階段c)談論的是在階段b) 獲得的過氧化氫產(chǎn)物。
3. 根據(jù)專利申請權項1和2中任意一條進行的獲取步驟，因為階段c)后獲得的產(chǎn)物需 要進行提純。
4. 根據(jù)專利申請權項3所進行的獲取步驟，因為階段c)后獲得的產(chǎn)物需通過濃度為 7. 5-12. 5% (p/v)，pH值為6. 5-7. 25,氯化鈉濃度為5-10% (p/v)的水溶液，并且使用甲醇 沉淀法進行提純。
5. 根據(jù)專利申請權項1-4所進行的獲取步驟，因為需要在20-40°C的溫度下，在二氯甲 烷中進行解聚。
6. 根據(jù)專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為在階段b)中苯索肝素鹽與每個添加基 體的重量：體積比為1:0. 5和1:0. 05。
7. 根據(jù)專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為在階段b)中苯索肝素鹽與每個添加基 體的重量：體積比為1:0. 3和1:0. 1。
8. 根據(jù)專利申請權項2所進行的獲取步驟，因為在階段c)中苯索肝素鹽與過氧化氫的 重量：體積比為1:0. 1和1:0. 01。
9. 根據(jù)專利申請權項2所進行的獲取步驟，因為在階段c)中苯索肝素鹽與過氧化氫的 重量：體積比為1:0. 2和1:0. 05。
10. 通過專利申請權項1-9所獲得的產(chǎn)物。
【文檔編號】C08B37/10GK104507972SQ201380041068
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年8月2日 優(yōu)先權日:2012年8月2日
【發(fā)明者】古伊萊莫·弗蘭科羅德里格斯, 伊本·古蒂耶羅阿杜里斯 申請人:羅維藥品實驗室有限公司