一種超順磁性脂-pla靶向納米顆粒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒，該靶向納米顆粒由PLA-磷脂-PEG納米顆粒和葉酸配體交聯(lián)構(gòu)成；PLA-磷脂-PEG納米顆粒由聚乳酸包裹Fe3O4處于中心作為PLA內(nèi)核，并以磷脂以單層環(huán)繞于該PLA內(nèi)核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于上述單層磷脂中作為靶向外殼形成；葉酸配體由二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺以及羥基琥珀酰亞胺按一定摩爾比室溫反應(yīng)后與葉酸交聯(lián)形成。其制備方法包括PLA-磷脂-PEG納米顆粒、葉酸配體制備和交聯(lián)成品制備。本發(fā)明顆粒交聯(lián)上葉酸靶向后能夠在靶向識別葉酸受體過表達的腫瘤細胞，通過磁鐵吸附分離腫瘤細胞。
【專利說明】—種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種超順磁性納米顆粒，具體地說是一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著納米技術(shù)的快速進步，超順磁性納米顆粒在分離細胞方面獲得了快速的發(fā)展，尤其是納米顆粒因其具有的超順磁性及表面可修飾性使其作為細胞磁性分離介質(zhì)具有獨特的優(yōu)勢，通過在其表面固定生物活性分子形成生物功能化磁納米顆粒，使其僅對特定細胞有親和力，在外磁場作用下，可直接從原始樣品中特異性分離所需要的細胞。該方法可省去離心、過濾等復(fù)雜操作，這給目標細胞的分離帶來了革命性的發(fā)展。科學(xué)發(fā)現(xiàn)，人類的一些惡性腫瘤細胞具有對葉酸受體的高表達。如果能制備一種具有葉酸配體修飾的靶向超順磁性納米顆粒就能很好的分離腫瘤細胞。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，而提供具有工藝簡單、制造成本低，腫瘤細胞分離好的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒及制備方法。其中--聚乳酸簡稱PLA、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基簡稱DSPE-PEG-C00HU-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺簡稱EDC、羥基琥珀酰亞胺簡稱NHS。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒，該祀向納米顆粒由PLA-磷脂-PEG納米顆粒和葉酸配體交聯(lián)構(gòu)成；PLA-磷脂-PEG納米顆粒由聚乳酸包裹Fe3O4處于中心作為PLA內(nèi)核，并以磷脂以單層環(huán)繞于該PLA內(nèi)核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于上述單層磷脂中作為靶向外殼形成；葉酸配體由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺以及羥基琥珀酰亞胺按一定摩爾比室溫反應(yīng)后與葉酸交聯(lián)形成。
[0005]一種的超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，該方法包括以下步驟:
a)、在四頸燒瓶中，先加入30mL去離子水，通N2IO min，快速稱取6.7573 g FeCl3OT2O和3.4753 g FeS047H20，加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水，并在溫度20°C至30°C條件下，機械劇烈攪拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液顏色由紅棕色逐漸變?yōu)楹谏?，再在室溫下攪?5 min至35 min后，升溫至55°C至65°C，反應(yīng)25 min至35 min，冷卻，用磁鐵分離，倒掉上清液，并用去離子水每次70 mL洗三次，并用超聲波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氫氧化銨溶解，然后加入二次蒸懼水至250 mL,用砂芯漏斗過濾從而獲得磁流體；
b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步驟a中的磁流體，制得含有磁流體的PLA乙氰溶液；
C)、取0.06mg 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加熱攪拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液； d)、將Iml步驟b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步驟c制得的混合乙醇水溶液中，在一定溫度的條件下連續(xù)攪拌I小時至3小時，期間允許溶劑揮發(fā)，即得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒；
e)、將二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺按摩爾比1: 1:2在室溫反應(yīng)一段時間后，加入葉酸，獲得葉酸配體；
f)、交步驟d中制得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒與步驟e中獲得的葉酸配體交聯(lián)，超濾水洗三次，即制得本產(chǎn)品。
[0006]上述的步驟a中恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水時，在溫度25 0C條件下，機械劇烈攪拌至pHIO。
[0007]上述的步驟a中再在室溫下攪拌30min后，升溫至60°C,反應(yīng)30min,冷卻。
[0008]上述的步驟b中PLA乙氰溶液中的PLA濃度為2mg/mL。
[0009]上述的步驟c中乙醇水溶液的濃度為4%，加熱攪拌至65°C。
[0010]上述的步驟d中的溫度條件為65°C，連續(xù)攪拌時間為2小時。
[0011]上述的步驟e中二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺在室溫反應(yīng)15min后，加入葉酸。
[0012]上述的步驟f中PLA-磷脂-PEG納米顆粒與葉酸配體的摩爾比為1:1。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點:
1、PLA、磷脂有良好的生物相容性，可生物降解并通過正常的生理途徑排出體外。
[0014]2、同時顆粒交聯(lián)上葉酸靶向后能夠在靶向識別葉酸受體過表達的腫瘤細胞，通過磁鐵吸附分離腫瘤細胞。
[0015]3、該顆粒制造成本低，便于操作推廣。
【具體實施方式】
[0016]以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0017]本發(fā)明的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒，該靶向納米顆粒由PLA-磷脂-PEG納米顆粒和葉酸配體交聯(lián)構(gòu)成；PLA-磷脂-PEG納米顆粒由聚乳酸包裹Fe3O4處于中心作為PLA內(nèi)核，并以磷脂以單層環(huán)繞于該PLA內(nèi)核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于所述的單層磷脂中作為靶向外殼形成；葉酸配體由二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺以及羥基琥珀酰亞胺按一定摩爾比室溫反應(yīng)后與葉酸交聯(lián)形成。
[0018]本發(fā)明的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，該方法包括以下步驟:
a)、在四頸燒瓶中，先加入30 mL去離子水，通N2IO min，快速稱取6.7573 g FeCl3OT2O
和3.4753 g FeS047H20，加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水，并在溫度20°C至30°C條件下，機械劇烈攪拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液顏色由紅棕色逐漸變?yōu)楹谏?，再在室溫下攪?5 min至35 min后，升溫至55°C至65°C，反應(yīng)25 min至35 min，冷卻，用磁鐵分離，倒掉上清液，并用去離子水每次70 mL洗三次，并用超聲波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氫氧化銨溶解，然后加入二次蒸餾水至250 mL,用砂芯漏斗過濾從而獲得磁流體； b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步驟a中的磁流體，制得含有磁流體的PLA乙氰溶液；
C)、取0.06mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加熱攪拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液；
d)、將Iml步驟b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步驟c制得的混合乙醇水溶液中，在一定溫度的條件下連續(xù)攪拌I小時至3小時，期間允許溶劑揮發(fā)，即得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒；
e)、將DSPE-PEG-COOH、EDC、NHS按摩爾比1:1:2在室溫反應(yīng)一段時間后，加入葉酸，獲得葉酸配體；
f)、交步驟d中制得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒與步驟e中獲得的葉酸配體交聯(lián)，超濾水洗三次，即制得本產(chǎn)品。以DelsaTM Nano C粒度分布測定儀進行檢測，平均粒徑為在50-300nm 之間。
[0019]上述的步驟a中恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水時，在溫度25 0C條件下，機械劇烈攪拌至pHIO。
[0020]上述的步驟a中再在室溫下攪拌30min后，升溫至60°C,反應(yīng)30min,冷卻。
[0021]上述的步驟b中PLA乙氰溶液中的PLA濃度為2mg/mL。
[0022]上述的步驟c中乙醇水溶液的濃度為4%，加熱攪拌至65°C。
[0023]上述的步驟d中的溫度條件為65°C，連續(xù)攪拌時間為2小時。
[0024]上述的步驟e中DSPE-PEG-COOH、EDC、NHS在室溫反應(yīng)15min后，加入葉酸。
[0025]上述的步驟f中PLA-磷脂-PEG納米顆粒與葉酸配體的摩爾比為1:1。
[0026]葉酸受體腫瘤靶向作用的體外驗證
將葉酸受體過表達的MCF-7細胞接種于培養(yǎng)瓶，待細胞生長至對數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗2-3遍，用胰酶消化液消化分散細胞，離心收集數(shù)目達IO4個/m L的所有細胞置于離心管內(nèi)。加入100 μ L超順磁性脂-PLA葉酸靶向納米顆粒分散液加入到細胞懸浮液中，37°C共孵育30 m in，將離心管置于磁分離器中進行磁分離，分離細胞數(shù)達到初始加入量的91%。而葉酸受體表達量低的對照細胞A549經(jīng)過同樣的操作,分離細胞數(shù)量僅為初始加入量的10%?？梢姵槾判灾?PLA葉酸祀向納米顆粒特異性分離葉酸受體過表達的腫瘤細胞。
【權(quán)利要求】
1.一種超順磁性脂-PLA祀向納米顆粒,其特征是:所述的祀向納米顆粒由PLA-磷脂-PEG納米顆粒和葉酸配體交聯(lián)構(gòu)成；所述的PLA-磷脂-PEG納米顆粒由聚乳酸包裹Fe3O4處于中心作為PLA內(nèi)核，并以磷脂以單層環(huán)繞于該PLA內(nèi)核表面，且以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸穿插于所述的單層磷脂中作為靶向外殼形成；所述的葉酸配體由二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺以及羥基琥珀酰亞胺按一定摩爾比室溫反應(yīng)后與葉酸交聯(lián)形成。
2.—種權(quán)利要求1所述的超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:該方法包括以下步驟: a)、在四頸燒瓶中，先加入30mL去離子水，通N2IO min，快速稱取6.7573 g FeCl3*6H20和3.4753 g FeS04*7H20，加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水，并在溫度20°C至30°C條件下，機械劇烈攪拌，至ρΗ9、Η11，共滴加氨水24 mL,溶液顏色由紅棕色逐漸變?yōu)楹谏僭谑覝叵聰嚢?5 min至35 min后，升溫至55°C至65°C，反應(yīng)25 min至35 min，冷卻，用磁鐵分離，倒掉上清液，并用去離子水每次70 mL洗三次，并用超聲波分散，再用乙醇每次70 mL洗三次，最后加入45 mL四甲基氫氧化銨溶解，然后加入二次蒸懼水至250 mL,用砂芯漏斗過濾從而獲得磁流體； b)、取聚乳酸溶于乙氰中，然后加入ImL步驟a中的磁流體，制得含有磁流體的PLA乙氰溶液； C)、取0.06mg 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、0.24mg大豆卵磷脂，加入至3ml的乙醇水溶液中，加熱攪拌至55°C至70°C，制得混合乙醇水溶液； d)、將Iml步驟b中制得的PLA乙氰溶液逐滴加至3ml步驟c制得的混合乙醇水溶液中，在一定溫度的條件下連續(xù)攪拌I小時至3小時，期間允許溶劑揮發(fā)，即得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒； e)、將二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺按摩爾`比1: 1:2在室溫反應(yīng)一段時間后，加入葉酸，獲得葉酸配體； f)、交步驟d中制得的PLA-磷脂-PEG納米顆粒與步驟e中獲得的葉酸配體交聯(lián)，超濾水洗三次，即制得本產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟a中恒壓滴液漏斗緩慢滴加氨水時，在溫度25 0C條件下，機械劇烈攪拌至ρΗΙΟο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟a中再在室溫下攪拌30min后，升溫至60°C,反應(yīng)30min,冷卻。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟b中PLA乙氰溶液中的PLA濃度為2mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟c中乙醇水溶液的濃度為4%，加熱攪拌至65°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟d中的溫度條件為65°C，連續(xù)攪拌時間為2小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟e中二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺在室溫反應(yīng)15min后，加入葉酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超順磁性脂-PLA靶向納米顆粒的制備方法，其特征是:所述的步驟f中PLA- 磷脂-PEG納米顆粒與葉酸配體的摩爾比為1:1。
【文檔編號】C08J3/24GK103745793SQ201410006311
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】劉 東 申請人:江蘇東博生物醫(yī)藥有限公司