一種從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從豬小腸浸出液中獲得高純度肝素和高純度硫酸皮膚素的方法，本發(fā)明以豬小腸粘膜浸出液為原料，通過(guò)離子交換層析、透析、旋蒸、有機(jī)溶劑沉淀生產(chǎn)高純度的肝素鈉以及高純度的硫酸皮膚素。通過(guò)離子交換層析的分步洗脫得到兩步洗脫液，以透析法除鹽，經(jīng)旋蒸濃縮得濃縮液，再進(jìn)行一步醇沉即得到高純度肝素與硫酸皮膚素。在離子交換樹(shù)脂的洗脫中使用了梯度的氯化鈉溶液洗脫，從而使肝素和硫酸皮膚素能在不同的洗脫液濃度下分離下來(lái)，達(dá)到了肝素與硫酸皮膚素的分離，并且分別提高了肝素和硫酸皮膚素的純度，且效價(jià)也有了提高，分子量分布及旋光度均符合藥典要求。
【專利說(shuō)明】一種從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥與化工領(lǐng)域，涉及肝素和硫酸皮膚素的制備方法，具體涉及從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉(heparin sodium)是N-硫酸和艾杜糖醒酸含量較多的一種糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重復(fù)二糖單位組成的多糖，目前肝素鈉生產(chǎn)主要是從豬的小腸粘膜中提取，它屬粘多糖(GAG)類物質(zhì)，在體內(nèi)外都有抗凝血作用。臨床上主要用于血管栓塞性疾病、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)和血液透析等。[0003]硫酸皮膚素(dermatan sulfate, DS或CSB)也是糖胺聚糖的一種，由N-乙酰氨基半乳糖-β -1, 4-L-艾杜糖醛酸-α (或D-葡萄糖醛酸-β ) -1，3的二糖重復(fù)單位構(gòu)成的多糖。DS廣泛分布于動(dòng)物組織中，屬于硫酸軟骨素(CS)的一種，具有抗血栓、抗水腫、促進(jìn)皮膚更新、阻止皮膚的過(guò)度角質(zhì)化和棘皮癥、滋潤(rùn)皮膚和保持水分的作用，可用于降血脂、骨關(guān)節(jié)疾病治療以及滴藥液。
[0004]傳統(tǒng)的硫酸皮膚素來(lái)源于動(dòng)物皮層或牛肺中，特別是水生生物(如鮫錬魚(yú)等)的皮層，通過(guò)酶降解和酸堿沉淀的方式得到，最后再通過(guò)離子交換層析獲得高純度的硫酸皮膚素。目前較為成熟的提取方法是從鮫錬魚(yú)皮中進(jìn)行提取，再通過(guò)醇沉凍干后即可得硫酸皮膚素粗品，該法得到的硫酸皮膚素粗品灰色粉末狀，純度為75 %。
[0005]2006年唐明龍等人(專利申請(qǐng)?zhí)?200610039006.5)以粗品肝素為原料，通過(guò)離子交換、高錳酸鉀氧化、超濾和有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀生產(chǎn)高純度肝素鈉原料藥，該方法使用不同濃度的氯化鈉溶液進(jìn)行了多次洗脫，有效的分離了雜質(zhì)，所得的肝素鈉效價(jià)、光吸收等指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家藥典要求。
[0006]2009年李坦等人(專利申請(qǐng)?zhí)?200910039361.6)以肝素副產(chǎn)物為原料，通過(guò)酸堿
沉淀，再以離子交換吸附，線性梯度洗脫，最后以濃縮醇沉后得到高純度的硫酸皮膚素，其所得的硫酸皮膚素的HPLC測(cè)定純度，旋光度及抗凝效價(jià)的檢測(cè)均較為理想。
[0007]目前國(guó)內(nèi)的肝素生產(chǎn)以粗品肝素為主，其中含有大量的硫酸皮膚素，本發(fā)明提供的從豬小腸粘膜浸出液中一步純化肝素和硫酸皮膚素的方法，不僅提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，得到了高純度的肝素，并且充分利用了生產(chǎn)的副產(chǎn)物，得到了高純度硫酸皮膚素，所得的肝素和硫酸皮膚素的純度均較高，適合用于工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法和一種從小腸浸出液中提取肝素的方法，以改進(jìn)現(xiàn)有粗品肝素的生產(chǎn)工藝，提高肝素產(chǎn)品的純度，以解決目前生產(chǎn)的粗品肝素中含有大量硫酸皮膚素雜質(zhì)的問(wèn)題，獲得能用于生產(chǎn)注射級(jí)精品肝素以及藥用級(jí)硫酸皮膚素。[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]本發(fā)明提供的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟一:稱取新鮮豬小腸粘膜，在絞肉機(jī)中絞碎，加入重量為豬小腸粘膜重量
0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸粘膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達(dá)到9.0 ;于55°C保溫繼續(xù)以20rpm速度攪拌2~3小時(shí)；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸粘膜浸出液；將豬小腸粘膜浸出液用2層市售醫(yī)用紗布過(guò)濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無(wú)色液體；加入0.5-1.5倍體積的去離子水，使豬小腸粘膜浸出液總體積達(dá)到稀釋1.5-2.5倍，即得到稀釋后的豬小腸粘膜浸出液；
[0012]步驟二:取已填充D254樹(shù)脂或Amberlite樹(shù)脂或Lewatit樹(shù)脂的填充柱,將填充柱固定到常規(guī)的層析設(shè)備上，填充柱以去離子水清洗2個(gè)柱體積；利用蠕動(dòng)泵以3mL/min的速度將稀釋后的豬小腸粘膜浸出液加入D254樹(shù)脂填充柱，加入稀釋后豬小腸粘膜浸出液體積為柱體積的1.5~2.0倍；待豬小腸粘膜浸出液后全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱體積的PH8.5的Tris-HCl的緩沖液；
[0013]步驟三:向填充柱加入1.1~1.3mol/L氯化鈉溶液，進(jìn)行第一次洗脫，洗脫流速為5mL/min，具體收集體積以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準(zhǔn)，將收集的洗脫液標(biāo)為洗脫液I ;向填充柱加入2.0~2.3mol/L氯化鈉溶液，進(jìn)行第二次洗脫，洗脫流速為5mL/min ；具體收集體積也以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準(zhǔn)，將收集洗脫液標(biāo)為洗脫液2 ;
[0014]步驟四:先按以下(A)、(B)兩種方法中的一種制取濃縮洗脫液1: [0015](A)將步驟3獲得的洗脫液I通過(guò)1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液I ;旋蒸度具體可以是60°C。
[0016](B)采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液I進(jìn)行超濾，當(dāng)體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液I ;所述的采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液I進(jìn)行超濾的具體方法可以是:采用密理博公司的Pellicom超濾系統(tǒng)，以1000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，當(dāng)體積濃縮4.5~5.0倍即可。
[0017]再向所得濃縮洗脫液I中加入分析純無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到40~50%，出現(xiàn)白色沉淀物，通過(guò)離心，去除上清，將沉淀在60°C烘箱中放置過(guò)夜，獲得純度為85~89%的硫酸皮膚素。
[0018]本發(fā)明提供的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法是:
[0019]先將權(quán)利要求1之步驟三獲得的洗脫液2，按照以下(a)、(b)兩種方法中的一種制備濃縮洗脫液2:
[0020](a)將步驟3獲得的洗脫液2通過(guò)1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液2 ;旋蒸度具體可以是60°C ；
[0021](b)采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液2進(jìn)行超濾，當(dāng)體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液2 ;所述的采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液2進(jìn)行超濾的具體方法可以是:采用密理博公司的Pellicom超濾系統(tǒng)，以1000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，當(dāng)體積濃縮4.5~5.0倍即可；[0022]再向所得濃縮洗脫液2中加入分析純無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到40~50%，出現(xiàn)白色沉淀物，通過(guò)離心去除上清，將沉淀在60°C烘箱中放置過(guò)夜，獲得純度為95~98%的肝素。
[0023]本發(fā)明以豬小腸粘膜浸出液為原料，在原有工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)離子交換層析、梯度洗脫、透析、旋蒸和醇沉最終生產(chǎn)得到高純度肝素和硫酸皮膚素。對(duì)獲得的硫酸皮膚素與肝素采用常規(guī)旋光儀測(cè)定其旋光度，采用常規(guī)高效液相色譜測(cè)定其純度，采用羊血漿法測(cè)定其效價(jià)。本發(fā)明利用硫酸皮膚素和肝素的離子強(qiáng)度差異所導(dǎo)致的與強(qiáng)陰離子樹(shù)脂的吸附強(qiáng)度的不同，在不同的氯化鈉濃度下洗脫使肝素與硫酸皮膚素分離，硫酸皮膚素在較低濃度的洗脫下得到充分的分離，肝素在第二個(gè)梯度的洗脫液濃度下得到充分的分離，洗脫步驟中應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定濃度的洗脫液進(jìn)行，否則將影響硫酸皮膚素與肝素的純度。本發(fā)明仍然是采用傳統(tǒng)的離子交換層析的方法進(jìn)行分離，對(duì)肝素和硫酸皮膚素的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)并沒(méi)有影響，本發(fā)明在維持了當(dāng)前肝素生產(chǎn)工藝的生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，并且充分利用也生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，純化所得到的肝素的效價(jià)及分子量測(cè)定均符合《中國(guó)藥典》相關(guān)要求。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有公開(kāi)的中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?00610039006.5的技術(shù)方案相比，200610039006.5號(hào)專利的主要特征是將粗品肝素通過(guò)二次離子交換層析獲得更純的肝素，而本發(fā)明與其主要差別在于省去了第二次的重復(fù)層析步驟；直接以豬小腸粘膜為原料進(jìn)行，而不是以粗品肝素為原料；改進(jìn)了現(xiàn)在常用的洗脫方法，使肝素純度得到了提升；同時(shí)得到了純度為85~89%的硫酸皮膚素。本發(fā)明不僅簡(jiǎn)化了肝素生產(chǎn)工藝，同時(shí)也提高了生產(chǎn)的收益，獲得了更大的綜合效益。在肝素與硫酸皮膚素濃縮階段引進(jìn)與應(yīng)用超濾技術(shù)，可直接擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模，提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約了生產(chǎn)成本。與現(xiàn)有公開(kāi)的硫酸皮膚素的專利(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200910039361.6)提取方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于，不是在肝素生產(chǎn)工藝之外，專門(mén)從從副產(chǎn)物里分離純化硫酸皮膚素，而是在肝素生產(chǎn)的同時(shí)，基本不增加額外的工藝手段，僅僅更改一次洗脫濃度，即獲得了純度高達(dá)85~89%的硫酸皮膚素，大大減少了工藝步驟并且縮短了生產(chǎn)周期。
[0025]總體而言，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)`在于一次層析技術(shù)，分步洗脫獲得純度高達(dá)95~98%的肝素與純度高達(dá)85~89%的硫酸皮膚素，工藝技術(shù)可直接擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模。本發(fā)明可一次實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的粗品肝素生產(chǎn)、粗品肝素再加工成精品肝素(純度95%以上的肝素)、肝素生產(chǎn)副產(chǎn)品中提取硫酸皮膚素等三類生產(chǎn)過(guò)程，極大提高生產(chǎn)效率。
[0026]本發(fā)明在分析肝素與硫酸皮膚素在結(jié)構(gòu)上的差異(硫酸化程度不同而導(dǎo)致的帶電荷數(shù)與分子量的差異)基礎(chǔ)上，利用離子交換層析對(duì)豬小腸粘膜浸出液進(jìn)行純化，通過(guò)兩次不同的洗脫液濃度將肝素和硫酸皮膚素分別洗脫下來(lái)，通過(guò)精確的控制洗脫液的濃度及其它相關(guān)條件，本發(fā)明不僅有效地分離肝素和硫酸皮膚素，而且肝素和硫酸皮膚素純度經(jīng)SAX-HPLC分析，分別達(dá)到95~98%和85~89%，旋光度分別為+55和-40，效價(jià)分別為170USP/mg和 8USP/mg。
[0027]本發(fā)明制得的肝素可做為原料藥，用于口服或注射用肝素鈉的生產(chǎn)，亦可用于下游低分子量肝素鈉的生產(chǎn)；本發(fā)明制得的硫酸皮膚素可用于口服或注射用硫酸皮膚素的生產(chǎn)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的離子交換層析工藝的改進(jìn)，在原有工藝上的升級(jí)使粗品肝素的生產(chǎn)向上提升了一個(gè)臺(tái)階，向精品肝素與精品硫酸皮膚素的生產(chǎn)上過(guò)渡，對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)以生產(chǎn)粗品肝素用于出口的現(xiàn)狀改善有一定的幫助。本發(fā)明有其獨(dú)特的創(chuàng)新性與實(shí)用性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1:豬小腸粘膜浸出液AKTA蛋白層析檢測(cè)的洗脫峰，其中:A1、A2分別為215nm、298nm吸收光譜下的洗脫液I ;B1、B2分別為215nm、298nm吸收光譜下的洗脫液2。
[0029]圖2、圖3、圖4、圖5:為各類樣品的強(qiáng)陽(yáng)離子高效液相色譜(SAX-HPLC)圖譜，其
[0030]中:圖2為市售肝素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品混合樣品的SAX-HPLC圖譜，圖2中
[0031]A為硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品；B為肝素標(biāo)準(zhǔn)品；
[0032]圖3為市售粗品肝素的SAX-HPLC圖譜，圖3中A為粗品肝素中的硫酸皮膚素雜質(zhì)；B為粗品肝素中的肝素峰；
[0033]圖4為洗脫液I的SAX-HPLC圖譜，圖4中A為洗脫液I中的硫酸皮膚素峰；B為洗脫液I中的肝素峰；
[0034]圖5為洗脫液2的SAX-HPLC圖譜，圖5中A為洗脫液2中的硫酸皮膚素峰應(yīng)出現(xiàn)的位置為洗脫液2中的肝素峰。
[0035]圖6:本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1:50mL豬小腸粘膜浸出液層析分離肝素與硫酸皮膚素
[0037]取新鮮豬小腸粘膜，在絞肉機(jī)中絞碎，加入重量為豬小腸粘膜重量0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸粘膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達(dá)到9.0 ;于55°C保溫繼續(xù)以20rpm速度攪拌2.5小時(shí)；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸粘膜浸出液；將豬小腸粘膜浸出液用2層市售醫(yī)用紗布過(guò)濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無(wú)色液體；加入I倍體積的去離子水，使豬小腸粘膜浸出液總體積達(dá)到稀釋2倍，得到稀釋后的豬小腸粘膜浸出液；再依次按以下步驟操作:
[0038]1.取發(fā)明步驟3所得的豬小腸粘膜浸出液50mL，以2層潔凈的市售醫(yī)用紗布過(guò)濾除去大顆粒的不溶物；
[0039]2.加入去離子水50mL，充分?jǐn)嚢瑁?br> [0040]3.取200g大孔陰離子樹(shù)脂D254，加入4%氫氧化鈉與4mol/L氯化鈉溶液浸泡過(guò)夜，將經(jīng)過(guò)浸泡的樹(shù)脂填入填充柱(Φ3αιιΧ 15cm)，柱體積為60mL ；
[0041]4.將上步驟制備的填充柱固定在AKTA蛋白純化儀的支架上，上下端口分別連接硅膠管，上端硅膠管固定在蠕動(dòng)泵上，下端硅膠管連接到檢測(cè)器入口 ；
[0042]5.層析實(shí)驗(yàn)條件如下:
[0043]215/298nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)；
[0044]A泵:去離子水O;
[0045]B 泵:4mol/L 氯化鈉 O ;
[0046]以手動(dòng)方式控制蠕動(dòng)泵速度和開(kāi)關(guān)，調(diào)控樣品、緩沖液加入填充柱；
[0047]6.以3mL/min的速度加入待分離的樣品共lOOmL，然后開(kāi)動(dòng)A泵用緩沖液A淋洗60mL ；
[0048]7.加入1.15mol/L氯化鈉緩沖液進(jìn)行第1次洗脫，當(dāng)洗脫峰A2下降到漸趨水平時(shí)，收集洗脫液90mL，參見(jiàn)圖1 ;
[0049]8.加入2.0mol/L氯化鈉緩沖液進(jìn)行第2次洗脫，當(dāng)洗脫峰B2下降到漸趨平緩時(shí)，收集洗脫液60mL，參見(jiàn)圖1 ;
[0050]9.將步驟7、8所得洗脫液收集后分別于60°C下旋蒸濃縮5倍；
[0051]10.取所得的濃縮液各lmL，分別加入4mol/L氫氧化鈉0.1mL,振蕩10分鐘，再分別加入2mol/L鹽酸0.2mL，振蕩10分鐘，進(jìn)行酸堿除蛋白處理；
[0052]11.分別加入到常規(guī)離心式透析管(1000Da)，離心透析，再分別采用0.45 μ m—次性濾器過(guò)濾，利用SAX-HPLC分別檢測(cè)；
[0053]12.HPLC 條件如下:
[0054]儀器為AgilentllOO高效液相色譜儀
[0055]色譜柱為1nPac ASll-HC戴安陰離子分析柱(250X4mm)
[0056]流動(dòng)相A為超純水
[0057]流動(dòng)相B為2.5mo l/L氯化鈉,含20mmol/LTris,用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0
[0058]線性梯度洗脫:流速為0.3mL/min,進(jìn)樣體積為10 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm 二元梯度為:02min:95%流動(dòng)相A和5%流動(dòng)相B ；26min:100%流動(dòng)相B ；31min:100%流動(dòng)相B ；32-40min:95%流動(dòng)相A和5%流動(dòng)相B
[0059]13.將市售的肝素標(biāo)準(zhǔn)品與硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品按2: I的質(zhì)量比混合，按照步驟12的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，獲得肝素標(biāo)準(zhǔn)品與硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC液相圖譜，見(jiàn)附圖2，圖2中A為硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品；B為肝素標(biāo)準(zhǔn)品；
[0060]14.將市售的粗品肝素按照步驟12的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，獲得粗品肝素HPLC液相圖譜，見(jiàn)附圖3，圖3中A為粗品肝素中的硫酸皮膚素雜質(zhì)；B為粗品肝素中的肝素峰；
[0061]15.將步驟11處理后的濃縮洗脫液I按照步驟12的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，獲得洗脫液IHPLC液相圖譜，見(jiàn)附圖4，圖4中A為洗脫液I中的硫酸皮膚素峰；B為洗脫液I中的肝素峰；
[0062]16.將步驟11處理后的濃縮洗脫液2按照步驟12的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，獲得洗脫液2HPLC液相圖譜，見(jiàn)附圖5，圖5中A為洗脫液2中的硫酸皮膚素峰應(yīng)出現(xiàn)的位置；B為洗脫液2中的肝素峰；
[0063]計(jì)算得圖4中硫酸皮膚素的純度為88%,圖5中肝素的純度為96.6% ；
[0064]17.將步驟9分別得到的濃縮洗脫液1、洗脫液2分別加入相同體積的無(wú)水乙醇，出現(xiàn)沉淀，將沉淀置于60°C烘箱過(guò)夜烘干；
[0065]18.將步驟17制備的烘干樣品分別取少量，加入去離子水溶解成40mg/mL的樣品，在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)旋光度儀上測(cè)定旋光度，洗脫液I與洗脫液2的旋光度分別為+55和-40，采用羊血漿法測(cè)得效價(jià)分別為170USP/mg和8USP/mg。
[0066]【參考文獻(xiàn):(I)張虹，鮫錬魚(yú)皮硫酸皮膚素的提取，食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(2):167 ； (2)唐明龍，粗品肝素黃分離純化為高純度肝素鈉的方法，發(fā)明專利，2006 ;(3)李坦等，一種從肝素副產(chǎn)物中純化硫酸皮膚素的方法，發(fā)明專利，2009 ; (3)國(guó)家藥典委員會(huì)，《中華人民共和國(guó)藥典》(三部)，化學(xué)工業(yè)出版社，2010.】。
【權(quán)利要求】
1.一種從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，包括以下步驟:
步驟一:稱取新鮮豬小腸粘膜，在絞肉機(jī)中絞碎，加入重量為豬小腸粘膜重量0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸粘膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達(dá)到9.0 ;于55°C保溫繼續(xù)以20rpm速度攪拌2~3小時(shí)；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸粘膜浸出液；將豬小腸粘膜浸出液用2層市售醫(yī)用紗布過(guò)濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無(wú)色液體；加入0.5-1.5倍體積的去離子水，使豬小腸粘膜浸出液總體積達(dá)到稀釋1.5~2.5倍，即得到稀釋后的豬小腸粘膜浸出液； 步驟二:取已填充D254樹(shù)脂或Amberlite樹(shù)脂或Lewatit樹(shù)脂的填充柱,將填充柱固定到常規(guī)的層析設(shè)備上，填充柱以去離子水清洗2個(gè)柱體積；利用蠕動(dòng)泵以3mL/min的速度將稀釋后的豬小腸粘膜浸出液加入D254樹(shù)脂填充柱，加入稀釋后豬小腸粘膜浸出液體積為柱體積的1.5~2.0倍；待豬小腸粘膜浸出液后全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱體積的PH8.5的Tris-HCl的緩沖液； 步驟三:向填充柱加入1.1~1.3mol/L氯化鈉溶液，進(jìn)行第一次洗脫，具體收集體積以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準(zhǔn)，將收集的洗脫液標(biāo)為洗脫液I ;向填充柱加入2.0~2.3mol/L氯化鈉溶液，進(jìn)行第二次洗脫，具體收集體積也以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準(zhǔn)，將收集洗脫液標(biāo)為洗脫液2 ； 步驟四:先按以下(A)、(B)兩種方法中的一種制取濃縮洗脫液1: (A)將步驟3獲得的洗脫液I通過(guò)1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液I ; (B)采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液I進(jìn)行超濾，當(dāng)體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液I ; 再向所得濃縮洗脫液I中加入分析純無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到40~50%，出現(xiàn)白色沉淀物，通過(guò)離心，去除上清，將沉淀在60°C烘箱中放置過(guò)夜，獲得純度為85~89%的硫酸皮膚素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特征在于，在步驟三中，洗脫流速為5mL/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特征在于，在步驟四之方法(A)中，旋蒸溫度為60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特征在于，在步驟四之方法(B)中，所述的采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液I進(jìn)行超濾的具體方法是:采用密理博公司的Pellicom超濾系統(tǒng)，以1000Da的超濾膜進(jìn)行超濾。
5.一種從小腸浸出液中提取肝素的方法，其步驟是: 先將權(quán)利要求1之步驟三獲得的洗脫液2，按照以下(a)、(b)兩種方法中的一種制備濃縮洗脫液2: (a)將步驟3獲得的洗脫液2通過(guò)1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液2 ； (b)采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液2進(jìn)行超濾，當(dāng)體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液2 ；再向所得濃縮洗脫液2中加入分析純無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到40~50%，出現(xiàn)白色沉淀物，通過(guò)離心去除上清，將沉淀在60°C烘箱中放置過(guò)夜，獲得純度為95~98%的肝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從小腸浸出液中提取肝素的方法，其特征在于，在方法(a)中，旋蒸溫度為60°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從小腸浸出液中提取肝素的方法，其特征在于:方法(b)中所述的采用切向流超濾方法對(duì)步驟3獲得的洗脫液2進(jìn)行超濾的具體方法是:采用密理博公司的Pellicom超濾系統(tǒng)，以1000Da的超濾膜進(jìn)行超濾。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103804506SQ201410047671
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】朱俊銘, 馬繼華, 楊祥良 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)