一種光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠的制備方法。將可光交聯的藻酸鹽溶液、光引發(fā)劑、具有生物活性的鎂離子作為前體溶液，通過離子反應和紫外光照雙交聯反應制成。本發(fā)明將鎂離子通過離子交聯的方式引入到支架中，簡單有效地改良了支架的生物學特性；同時通過光交聯形成主體骨架，保證了支架的穩(wěn)定性；紫外光引發(fā)以及鎂離子的慢速交聯特性，還保證了支架良好的可控性。本發(fā)明制備方法簡單，無需引入其他材料，通過調控鎂離子的濃度，能有效調整水凝膠的理化性能和生物性能，便于實際應用時的需要。
【專利說明】一種光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠及其制備方法
[0001]【技術領域】
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，涉及一種海藻酸鹽水凝膠及其制備方法，具體涉及一種光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]由創(chuàng)傷、腫瘤、感染、發(fā)育異常等原因導致的骨缺損一直是臨床治療的難點。骨移植是重建缺損骨組織的主要方法，但采用自體骨移植時，自體骨的來源較少，且會給病人帶來一定痛苦；采用異體骨移植時又存在感染、排斥反應等問題。組織工程學的發(fā)展為研制理想的骨移植物提供了一條全新的思路。支架是骨組織工程的三要素之一，除了無毒、無免疫原性、可降解和良好的機械性能之外，支架還應能有效促進種子細胞的粘附、增殖以及定向分化，從而引導組織再生。
[0003]海藻酸是從可再生資源如褐藻或細菌中提取出的天然線性分子多糖，具有無毒、無免疫原性，來源豐富、價格低廉、易塑形、可降解等一系列優(yōu)勢。作為骨組織工程支架，藻酸鹽水凝膠可通過注射的方法進行應用，從而減小了手術創(chuàng)傷，適用于形狀復雜的骨缺損。但海藻酸鹽水凝膠支架仍然存在一些不足。比如，海藻酸鹽水凝膠采用離子交聯制備時，聚合速率常常過快，導致水凝膠結構不均勻；凝膠中的二價陽離子也容易與周圍環(huán)境發(fā)生離子交換，進而導致凝膠溶解，失去凝膠特性。當海藻酸鹽水凝膠采用光交聯制備時，雖然具備良好的理化性能，但水凝膠的高度親水性導致細胞粘附性能較差，且單純的水凝膠支架缺乏骨誘導性(Jeon, 0., et al.Biomaterials, 2009.30(14): p.2724-34)。
[0004]近年來，大量體 內、外研究表明:某些二價陽離子具有一些潛在的生物學作用，能有效調控細胞的增殖、分化，甚至組織形成。在支架材料中引入適量具有生物活性的二價陽離子已成為改善材料生物性能的新途徑。比如，Place等利用離子交聯的方式將鍶、鋅離子引入到海藻酸鹽水凝膠支架中，通過離子交換，將生物活性離子緩釋出來促進種子細胞的分化(Place, ES., et al.Tissue Eng Part A.2011 Nov; 17 (21-22): 2713-22)。鎂離子是人體內含量第四豐富的陽離子，是維持健康骨生長、發(fā)育和穩(wěn)定的必需元素，被證實具有廣泛的生物學效應。除了與鍶、鋅離子相似的、在促進細胞增殖及分化方面的作用外，鎂離子還被證實能促進前成骨細胞在支架上的粘附(Park, J.W.，et al.Clin Oral ImplantsRes.2010 Nov; 21 (11): 1278-87)。通過引入鎂離子對支架進行改性，不僅成本低，還具有較好的穩(wěn)定性，不像載細胞因子、蛋白、藥物時存在變性失效的風險。
[0005]過去，鎂離子一直被認為不能使海藻酸鹽發(fā)生離子交聯。最近，Topuz證實單獨使用鎂離子也可制備出海藻酸鹽水凝膠，只是交聯時所用的離子濃度較高，交聯時間更長(Topuz, F.，et al.Soft Matter , 2012, 8, 4877-4881)。然而，僅用鎂離子交聯形成的海藻酸鹽水凝膠結合力較弱，易溶脹破裂，穩(wěn)定性差。因此，單獨鎂離子交聯的海藻酸鹽水凝膠不能直接應用于組織工程。
[0006]基于以上論述，我們選擇采用光照-離子雙交聯的方法將鎂離子引入到海藻酸鹽水凝膠上。以光交聯為主，保證了支架的穩(wěn)定性；以離子交聯為輔，通過鎂離子的慢速交聯特性保證海藻酸鹽水凝膠的可控性。當凝膠在體內通過離子交換釋放鎂離子時，則賦予支架一定的生物學活性。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明為了克服離子交聯海藻酸鹽水凝膠穩(wěn)定性差和光交聯海藻酸鹽水凝膠生物活性差的不足，提供一種具有穩(wěn)定性、可控性、生物活性的光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠及其制備方法。
[0008]一種光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
將可光交聯海藻酸鹽溶解到含有光引發(fā)劑的去離子水中，再與MgSO4溶液充分混勻，形成凝膠前體溶液，凝膠前體溶液中可光交聯海藻酸鹽的濃度為2g/100mL，光引發(fā)劑的濃度為0.05g/100mL, MgSO4的濃度為f500 mM ;將凝膠前體溶液滴入模具中，然后將模具置于紫外燈下，照射時間為5飛O min，得到雙交聯海藻酸鹽水凝膠。
[0009]所述的光引發(fā)劑為12959。[0010]所述的紫外燈,其波長為365 nm,強度為8 mW/cm2。
[0011]所述的照射時間為10 min。
[0012]所述的可光交聯海藻酸鹽的制備方法，包括以下步驟:將4 g海藻酸鹽溶解于400mL氯化鈉/ 2- (N-嗎啡啉)乙磺酸溶液(氯化鈉濃度為0.5 M、2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸濃度為50 mM)中,磁力攪拌過夜,制成I % (w/v)的海藻酸鹽溶液；在室溫下，用5 M氫氧化鈉溶液滴定海藻酸鹽溶液至pH=6.5，然后加入N-羥基-硫代琥珀酰亞胺和1-乙烷基_( 二甲基氨丙基)_含碳硝化甘油來活化海藻酸鹽上的羧基，靜置5 min后，加入15.8 g 2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽；其中，N-羥基-硫代琥珀酰亞胺:1-乙烷基_( 二甲基氨丙基)_含碳硝化甘油:2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽的摩爾比為1: 2:1;室溫下反應I天后，將反應液倒入1600 mL丙酮中使產物甲基丙烯酰化海藻酸鹽沉淀，再將其倒入布氏漏斗進行真空抽濾，然后將沉淀物溶解到400 mL去離子水中；待沉淀物完全溶解后，將溶解液分裝到截留分子量為3500的透析袋中，置入盛有去離子水的透析缸內透析3天，去離子水每隔12 h更換一次；透析完成后用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾，冷凍干燥，即得到可光交聯海藻酸鹽。
[0013]一種根據上述制備方法得到的光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠。
[0014]本發(fā)明通過將兩種常用的交聯方式光交聯和離子交聯結合起來，制備出一種含鎂離子的海藻酸鹽水凝膠:以光交聯為主，保證水凝膠支架的穩(wěn)定性；以鎂離子慢速交聯為輔，保證支架的可控性；同時，離子交換釋放的鎂離子能夠賦予支架一定的生物活性。
[0015]本發(fā)明提供的光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠的制備方法具有以下有益效果:
(I)將離子交聯和光交聯兩種海藻酸鹽交聯方法巧妙結合，闡述了一種新型的、簡單易行的雙交聯方法，制得的水凝膠在理化性能和生物性能上都具備潛在的優(yōu)勢。
[0016](2)引入鎂離子后光交聯海藻酸鹽的溶脹降低，降解速率減慢；通過調整鎂離子的引入量，雙交聯海藻酸鹽水凝膠的溶脹降解可在一定范圍內得以調整，便于適應實際應用時的需要。
[0017](3)隨著鎂離子引入量的增加，兩種交聯網絡使支架更致密，支架的力學強度得以明顯提高，擴大了水凝膠的適應證，可能成為需要耐壓的骨缺損部位的良好選擇。
[0018](4)隨著鎂離子引入量的增加，水凝膠表面接種細胞的粘附增強，支架的生物性能得到改善，有利于種子細胞的增殖、分化以及組織形成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明雙交聯海藻酸鹽水凝膠的制備過程示意圖。
[0020]圖2為本發(fā)明的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠的掃描電鏡圖；其中，圖2-a、圖
2-b、圖2-c、圖2-d分別代表Mg-0、Mg-1、Mg-10、Mg-1OO的掃描電鏡圖，標尺為100μ m。
[0021]圖3為本發(fā)明的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠的X射線能譜分析圖譜；其中，圖
3-a、圖3-b、圖3-c、圖3-d分別代表Mg-0、Mg-1、Mg-10、Mg-1OO的X射線能譜分析圖譜。
[0022]圖4為本發(fā)明的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠的溶脹降解變化趨勢圖；其中，圖
4-A為制備完成時水凝膠的尺寸變化圖；圖43為去離子水中溶脹24h后水凝膠的尺寸變化圖；圖4-C為水凝膠在去離子水中浸泡3w的溶脹變化曲線圖；圖4-D為水凝膠在去離子水中浸泡3w的降解曲線圖。
[0023]圖5為本發(fā)明鎂 離子含量不同的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠的彈性模量對比圖。
[0024]圖6為本發(fā)明鎂離子含量不同的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠接種MC3T3-E1細胞4h后的粘附率對比圖。
[0025]圖7為本發(fā)明的雙交聯水凝膠與光交聯水凝膠接種MC3T3-E1細胞4天后的細胞形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合優(yōu)選實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明，但本發(fā)明絕不限于下述實施例。
[0027]實施例中由光交聯海藻酸鹽、100 mmol/L鎂離子前體溶液制備的雙交聯水凝膠，此實例中簡稱Mg-1OO ;以此類推,鎂離子濃度為O mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L的凝膠前體溶液制備的雙交聯水凝膠分別簡稱為Mg-0、Mg-1、Mg-1O。
[0028]實施例1
(I)首先根據文獻(Jeon, 0., et al.Biomaterials, 2009.30(14): p.2724-34)中報道的方法制備可光交聯海藻酸鹽:將4 g海藻酸鹽溶解于400 mL氯化鈉/ 2- (N-嗎啡啉)乙磺酸溶液(氯化鈉濃度為0.5 M、2- (N-嗎啡啉)乙磺酸濃度為50 mM)中，磁力攪拌過夜，制成I % (w/v)的海藻酸鹽溶液；在室溫下，用5 M氫氧化鈉溶液滴定海藻酸鹽溶液至pH=6.5，然后加入N-羥基-硫代琥珀酰亞胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油來活化海藻酸鹽上的羧基，靜置5 min后，加入15.8 g: 2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽；其中，N-羥基-硫代琥珀酰亞胺:1-乙烷基_( 二甲基氨丙基)_含碳硝化甘油:2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽加入的摩爾比為1: 2:1;室溫下反應I d后，將反應液倒Λ 1600 mL丙酮中使產物甲基丙烯?；Ｔ逅猁}沉淀，再將其倒入布氏漏斗進行真空抽濾，然后將甲基丙烯酰化海藻酸鹽沉淀物溶解到400 mL去離子水中；待甲基丙烯?；Ｔ逅猁}完全溶解后，將溶解液分裝到截留分子量為3500的透析袋中，置入盛有去離子水的透析缸內透析3天，去離子水每12 h更換一次；透析完成后用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾，冷凍干燥后，即得到可光交聯海藻酸鹽。經1H核磁共振檢測，海藻酸鹽上甲基丙烯酸酯基團的接枝率約為22%。
[0029](2)配制Mg-1OO的凝膠前體溶液:將可光交聯海藻酸鹽按2.5% (w/v)的比例溶解于含0.0625% (w/v)光引發(fā)劑12959的去離子水中；配制濃度為500 mmol/L的MgSO4溶液，MgSO4溶液按1:4的體積比與上述海藻酸鹽溶液混合均勻，即得到凝膠前體溶液，各組分的濃度如下:可光交聯海藻酸鹽，2% (w/v) ； 12959,0.05% (w/v) ；MgS04,100 mmol/L。
[0030](3)將凝膠前體溶液滴入模具中，靜置30 min,然后置于波長為365 nm、強度為8mW/cm2的紫外燈下照射10 min，即得到光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠(Mg-100)。其操作示意圖如圖1所示。
[0031]MA上接枝的碳碳雙鍵在紫外線和光引發(fā)劑的共同作用下斷裂，發(fā)生共價交聯。此外，若經步驟(3)的離子交聯尚未達到飽和狀態(tài)，離子交聯可同步進行，更多鎂離子可在此階段結合到海藻酸鹽上。
[0032]實施例2
(I)配制Mg-1的凝膠前體溶液:將可光交聯海藻酸鹽按2.5% (w/v)的比例溶解于含0.0625% (w/v)光引發(fā)劑12959的去離子水中；配制濃度為5 mmol/L的MgSO4溶液，MgSO4溶液按1:4的體積比與上述海藻酸鹽溶液混合均勻，即得到凝膠前體溶液，各組分的終濃度如下:可光交聯海藻酸鹽，2% (w/v) ； 12959,0.05% (w/v) ；MgS04,1 mmol/L。
[0033](2)將凝膠前體溶液滴入模具中，靜置30 min,然后置于波長為365 nm、強度為8mff/cm2的紫外燈下照射10 m in,即得到光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠(Mg-1 )。
[0034]實施例3
(I)配制Mg-1O的凝膠前體溶液:將可光交聯海藻酸鹽按2.5% (w/v)的比例溶解于含0.0625% (w/v)光引發(fā)劑12959的去離子水中；配制濃度為50 mmol/L的MgSO4溶液，MgSO4溶液按1:4的體積比與上述海藻酸鹽溶液混合均勻，即得到凝膠前體溶液，各組分的終濃度如下:可光交聯海藻酸鹽，2% (w/v) ； 12959,0.05% (w/v) ；MgS04,10 mmol/L。
[0035](2)將凝膠前體溶液滴入模具中，靜置30 min,然后置于波長為365 nm、強度為8mff/cm2的紫外燈下照射10 min,即得到光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠(Mg_10)。
[0036]性能測試
結合圖2~圖7的結果，雙交聯海藻酸鹽水凝膠Mg-1和Mg-1O的溶脹、降解、壓縮、粘附性能皆介于光交聯海藻酸鹽水凝膠Mg-O及實施例1中的Mg-100之間，其遞變趨勢與鎂尚子的引入量相關。
[0037]1.表面結構及組成的檢測
將制備完成的水凝膠置于37°C大量去離子水中溶脹24 h，使其達到溶脹平衡。經冷凍干燥、噴金后于掃描電鏡下觀察其表面結構，同時進行X射線能譜分析觀察其組成的變化。掃描電鏡結果如圖2所示，光交聯海藻酸鹽水凝膠(Mg-O)及光照-鎂離子雙交聯海藻酸鹽水凝膠(Mg-l、Mg-10、Mg-100)均顯示出良好的三維多孔結構；鎂離子的引入使凝膠中的交聯網絡更致密，孔徑減小。X射線能譜分析圖譜如圖3所示，Mg-10、Mg-100可檢測到一定量的鎂離子(分別為2.76 wt%、3.53wt%);此外，鈉離子的含量(3.66 wt%、0.59wt%)對比Mg-O(7.47wt%)大幅度下降，提示海藻酸鈉中的鈉離子與鎂離子發(fā)生了置換反應。[0038]2.溶脹及降解性能測試
將水凝膠制備成直徑6 mm、高度2 mm的圓柱狀水凝膠，冷凍干燥后稱重為Wi。將水凝膠置于4 mL去離子水于37°C溫箱中溶脹3周，每3天更換一次浸泡液。在設定的時間點將水凝膠取出后用濾紙吸干表面，稱重為Ws，按下式計算溶脹率:Q=Ws/Wi。隨后冷凍干燥至恒重，稱重為W，其降解率按公式(W1-Wd) /Wi X 100%來計算。由圖4-A、圖4-B、圖4-C可見Mg-0、Mg-1在浸泡24 h后溶脹明顯，在3 w的觀察期內溶脹率不斷變化，總體呈先上升后下降的趨勢；Mg-10、Mg-100溶脹不明顯，Mg-100在3 w的溶脹期始終保持較穩(wěn)定的狀態(tài)。圖4-D為降解結果:截止至3 w時，Mg-10、Mg-100僅有少量降解，而光交聯海藻酸鹽及Mg-1則大部分發(fā)生降解。
[0039]3.壓縮性能測試
將水凝膠制備成直徑6 mm、高度6 mm的圓柱狀水凝膠，用萬能拉力測試儀在室溫下以1mm/min的變形速率檢測其壓縮性能。圖5為壓縮測試的結果，鎂離子的引入明顯提高了水凝膠的力學性能。其中，Mg-1OO的彈性模量達7.55±0.69 kPa，對比Mg-O提高了 90%。
[0040]4.粘附性能測試
將水凝膠制備成I mm厚的凝膠塊，溶脹24 h后切割成I cmXl cm大小的小片，將前成骨MC3T3-E1按10000個/cm2的密度接種到凝膠表面。粘附4 h后用PBS洗去未粘附的細胞，加入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，然后用胰酶消化凝膠表面的細胞，細胞計數板下計數。早期粘附率計算公式如下:早期粘附率=粘附細胞量/接種細胞量X 100%。培養(yǎng)4 d時取出水凝膠，用二乙酸熒光素處理后，置熒光顯微鏡下觀察細胞的粘附伸展狀況。圖6顯示:Mg-0與Mg-1之間細胞粘附率無明顯差異；Mg-10、Mg-100較Mg-O粘附性能有顯著改善，細胞早期粘附率增加。圖7顯示Mg-1OO在4 d時大部分細胞均伸展良好。
【權利要求】
1.一種海藻酸鹽水凝膠的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 將可光交聯海藻酸鹽溶解到含有光引發(fā)劑的去離子水中，再與MgSO4溶液充分混勻，形成凝膠前體溶液，凝膠前體溶液中可光交聯海藻酸鹽的濃度為2g/100mL，光引發(fā)劑的濃度為0.05g/100mL, MgSO4的濃度為1~500 mM ;將凝膠前體溶液滴入模具中，然后將模具置于紫外燈下，照射時間為5~6O min，得到海藻酸鹽水凝膠。
2.根據權利要求1所述的海藻酸鹽水凝膠的制備方法，其特征在于:所述的光引發(fā)劑為 12959。
3.根據權利要求1所述的海藻酸鹽水凝膠的制備方法，其特征在于:所述的紫外燈，其波長為365 nm,強度為8 mW/cm2。
4.根據權利要求1所述的海藻酸鹽水凝膠的制備方法，其特征在于:所述的照射時間為 10 min。
5.根據權利要求1所述的海藻酸鹽水凝膠的制備方法，其特征在于:所述的可光交聯海藻酸鹽的制備方法，包括以下步驟:將4 g海藻酸鹽溶解于400 mL氯化鈉/ 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液(氯化鈉濃度為0.5 M、2- (N-嗎啡啉)乙磺酸濃度為50 mM)中，磁力攪拌過夜，制成1 % (w/v)的海藻酸鹽溶液；在室溫下，用5 M氫氧化鈉溶液滴定海藻酸鹽溶液至pH=6.5，然后加入N-羥基-硫代琥珀酰亞胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油來活化海藻酸鹽上的羧基，靜置5 min后，加入15.8 g 2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽；其中，N-羥基-硫代琥珀酰亞胺:1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油:2-氨乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽的摩爾比為1: 2:1;室溫下反應I天后，將反應液倒入1600 mL丙酮中使產物甲基丙烯?；Ｔ逅猁}沉淀，再將其倒入布氏漏斗進行真空抽濾，然后將沉淀物溶解到400 mL去離子水中；待沉淀物完全溶解后，將溶解液分裝到截留分子量為3500的透析袋中，置入盛有去離子水的透析缸內透析3天，去離子水每隔12 h更換一次；透析完成后用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾，冷凍干燥，即得到可光交聯海藻酸鹽。
6.一種根據權利要求f 5所述制備方法得到的海藻酸鹽水凝膠。
【文檔編號】C08J3/28GK103923224SQ201410149353
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】王家偉, 尹苗, 徐飛, 鄧婷 申請人:武漢大學