本發(fā)明屬于飼料微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以豆粕、麩皮、玉米粉為基質(zhì)，利用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備益生菌劑的應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)：
現(xiàn)有益生菌制品多采用益生菌直接與液態(tài)牛乳和豆乳發(fā)酵，得到功能性的酸牛奶或酸豆奶，或者將其采用液態(tài)發(fā)酵后，直接收集益生菌菌體，制作成益生菌粉劑、片劑或者膠囊。在采用液態(tài)發(fā)酵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的廢水污染環(huán)境，后處理比較困難，機(jī)器設(shè)備操作也較為繁瑣。由于益生菌能夠改善宿主微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及代謝產(chǎn)物，因此，現(xiàn)在對(duì)益生菌的研究已經(jīng)非常深入和細(xì)致化，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、家庭等各個(gè)項(xiàng)領(lǐng)域。目前，將益生菌制品應(yīng)用于動(dòng)物微生物制劑、添加至動(dòng)物飼料中也已較為常見(jiàn)；例如，公開(kāi)號(hào)為CN103202391A的發(fā)明專利《一種有效預(yù)防及改善牛乳房炎的復(fù)合乳酸菌微生態(tài)制劑》，公開(kāi)了一種由保藏號(hào)為CGMCCNo.6736的干酪乳桿菌HM-09、保藏號(hào)為CGMCCNo.6741的植物乳桿菌HM-10和沸石粉按質(zhì)量份數(shù)組合而成的復(fù)合微生態(tài)制劑，能有效的降低體細(xì)胞數(shù)，預(yù)防減少隱性牛乳房炎發(fā)病率；公開(kāi)號(hào)為CN103243043A的發(fā)明專利《一株用于改善次等豬苗養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用》，公開(kāi)了一種保藏號(hào)為CGMCCNo.6729的凝結(jié)芽孢桿菌，通過(guò)應(yīng)用這種菌株，可有效的改善豬苗的健康狀況、提高次等豬苗養(yǎng)殖的生產(chǎn)性能。公開(kāi)號(hào)為CN103421711A的發(fā)明專利《用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌》公開(kāi)了用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌HM-66、干酪乳桿菌F-08、植物乳桿菌HM-20和動(dòng)物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCNo.6733、CGMCCNo.6735、CGMCCNo.6744和CGMCCNo.5470；通過(guò)這幾種菌株的應(yīng)用能有效改善飼料的酸香味、色澤和口感等感官特征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)HM-09和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)HM-10等菌對(duì)豆粕、麩皮和玉米粉基質(zhì)進(jìn)行分段固態(tài)發(fā)酵的方法，利用此方法發(fā)酵出的益生菌劑產(chǎn)品具有特殊的酸香味，且含有的活菌數(shù)高，豆粕蛋白質(zhì)的降解率也高，還能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物菌群，促進(jìn)腸道吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善生產(chǎn)性能，提高飼料的利用率，有效抑制養(yǎng)殖后期機(jī)體糞便和殘餌料的腐爛，改善環(huán)境衛(wèi)生，降低氨氮和亞硝酸鹽的產(chǎn)生，降低整個(gè)養(yǎng)殖成本。本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種利用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌制備的益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09于恒溫箱中30-38℃，170轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)20-24h；將植物乳桿菌HM-10與干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)HM-09于恒溫箱中30-38℃培養(yǎng)20-24h；所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09的種子培養(yǎng)基為：蛋白胨2-5％，葡萄糖2-5％，加水至100％，pH7.0-7.2；發(fā)酵培養(yǎng)條件：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液添加到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行混合后發(fā)酵0-16h,再接種植物乳桿菌HM-10種子液與干酪乳桿菌HM-09種子液繼續(xù)發(fā)酵12-36h，共計(jì)發(fā)酵時(shí)間12-52h，發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為30-38℃，濕度為60-80％,發(fā)酵結(jié)束其游離氨基態(tài)氮含量在480umol/g以上；所述固體培養(yǎng)基為：25-30％豆粕，25-30％麩皮，2-5％玉米粉，水分含量40-50％,初始pH6.8-7.2。所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的3-6％，植物乳桿菌HM-10種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的2-4％，干酪乳桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的4-6％。益生菌劑中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)(1.45-2.98)×109CFU/g，植物乳桿菌HM-10活菌數(shù)(1.55-2.65)×109CFU/g，干酪乳桿菌HM-09活菌數(shù)(3.31-9.98)×109CFU/g。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中的添加量為25-60g/kg。有益效果本發(fā)明利用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09和植物乳桿菌HM-10等為發(fā)酵菌劑對(duì)豆粕、麩皮和玉米粉進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵，降低了發(fā)酵生產(chǎn)成本，處理方便，污染小，并且設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作，是一種可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)；采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09進(jìn)行前期發(fā)酵，可以產(chǎn)生大量乳酸及乙酸等酸味小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)賦予產(chǎn)品特有的酸香味、色澤和口感等，提高了產(chǎn)品的適口性；本發(fā)明在固態(tài)發(fā)酵一段時(shí)間后添加了植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09進(jìn)行混合發(fā)酵，能夠高效利用干酪乳桿菌HM-09菌調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)機(jī)體消化吸收的功能，同時(shí)還能夠利用干酪乳桿菌促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，產(chǎn)生抗體免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫；所述植物乳桿菌在繁殖過(guò)程中能產(chǎn)出特有的乳酸桿菌素，因此利用此特性，在養(yǎng)殖后期能很好的抑制底部糞便和殘餌料的腐爛，降低氨氮和亞硝酸鹽的產(chǎn)生，大量減少化工降解素的用量，使養(yǎng)殖成本降低；利用分段固態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)的益生菌制劑中含有大量的活菌，因此，協(xié)同各菌種的特性，能夠有效調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物菌群，促進(jìn)腸道吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善斷奶仔豬菌群失調(diào)性腹瀉，提高飼料的利用率，降低整個(gè)養(yǎng)殖成本。本發(fā)明產(chǎn)品用于早期斷奶乳豬的飼喂時(shí)能有效降低乳豬的腹瀉率30％以上，飼料的轉(zhuǎn)化率提高了25-30％。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09于2012年10月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)分別為CGMCCNo.6729、CGMCCNo.6741和CGMCCNo.6736；保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101；實(shí)施例1一種利用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌制備的益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：種子液的制備：凝結(jié)芽孢桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09從凍藏的甘油管中接種到裝有液體種子的培養(yǎng)基中，所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的種子培養(yǎng)條件：37℃，170轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24h；植物乳桿菌HM-10與干酪乳桿菌HM-09于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h；其中種子培養(yǎng)基為：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2。固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)條件：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液添加到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行混合后發(fā)酵12h,再接種植物乳桿菌HM-10種子液和干酪乳桿菌HM-09種子液繼續(xù)發(fā)酵24h，共計(jì)發(fā)酵時(shí)間36h，發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為37℃，濕度為70％,發(fā)酵結(jié)束其游離氨基態(tài)氮含量為489umol/g；所述固體培養(yǎng)基為：29％豆粕，29％麩皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高壓滅菌25min。所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的5％，植物乳桿菌HM-10種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的3％，干酪乳桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的5％。益生菌劑中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)2.98×109CFU/g，植物乳桿菌HM-10活菌數(shù)2.07×109CFU/g，干酪乳桿菌HM-09的活菌數(shù)5.98×109CFU/g。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中的添加量為45g/kg。實(shí)施例2:一種利用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌制備的益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09于恒溫箱中37℃，170轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24h；將植物乳桿菌HM-10與干酪乳桿菌HM-09于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h。其中種子培養(yǎng)基為：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；發(fā)酵培養(yǎng)條件：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液添加到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行混合后發(fā)酵16h,再接種植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09種子液繼續(xù)發(fā)酵15h，共計(jì)發(fā)酵時(shí)間31h，發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為37℃，濕度為80％，發(fā)酵結(jié)束其游離氨基態(tài)氮含量在486umol/g；固體培養(yǎng)基為：29％豆粕，29％麩皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高壓滅菌25min。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的3％，植物乳桿菌HM-10種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的2％，干酪乳桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的6％。益生菌劑中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)1.45×109CFU/g，植物乳桿菌HM-10活菌數(shù)1.55×109CFU/g，干酪乳桿菌HM-09活菌數(shù)9.98×109CFU/g。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中的添加量為30g/kg。實(shí)施例3一種利用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌制備的益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：種子液的制備：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09于恒溫箱中37℃，170轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24h；將植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10和干酪乳桿菌HM-09的種子培養(yǎng)基為：蛋白胨2％，葡萄糖2％，加水至100％，pH7.0-7.2；發(fā)酵培養(yǎng)條件：將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液添加到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行混合后發(fā)酵6h,再接種干酪乳桿菌HM-09和植物乳桿菌HM-10種子液繼續(xù)發(fā)酵36h，共計(jì)發(fā)酵時(shí)間42h，發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為37℃，濕度為60％,發(fā)酵結(jié)束其游離氨基態(tài)氮含量在460umol/g；固體培養(yǎng)基為：29％豆粕，29％麩皮，2％玉米粉，水分含量40％，初始pH7.0，115℃高壓滅菌25min。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的6％，植物乳桿菌HM-10的種子液添加量為固體培養(yǎng)基總重量的4％，干酪乳桿菌HM-09種子液的添加量為固體培養(yǎng)基總重量的4％。益生菌劑中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)3.18×109CFU/g，植物乳桿菌HM-10活菌數(shù)2.65×109CFU/g，干酪乳桿菌HM-09活菌數(shù)3.31×109CFU/g。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中的添加量為60g/kg。使用效果實(shí)驗(yàn)應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例1的益生菌劑在斷奶仔豬中的使用效果試驗(yàn)：試驗(yàn)動(dòng)物選擇養(yǎng)殖場(chǎng)平均體重為(10.5±0.45)kg的健康乳豬120頭，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析體重差異不顯著。采用單因子隨機(jī)化設(shè)計(jì)，將120頭健康乳豬，按公母各半，隨機(jī)分成2組(對(duì)照組和試驗(yàn)組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。試驗(yàn)組添加實(shí)施例1制得的本發(fā)明產(chǎn)品45g/kg，對(duì)照組不添加本發(fā)明產(chǎn)品。連續(xù)飼喂20天，與對(duì)照組相比，使用發(fā)明飼料添加劑可獲得如下效果：項(xiàng)目試驗(yàn)組對(duì)照組始重(kg)10.4510.65末重(kg)20.5719.59日采食量(g)720.1705.2日增重(g)506447料肉比1.421.58腹瀉率(頭)624試驗(yàn)結(jié)果表明：乳豬飼喂含有本發(fā)明益生菌劑的飼料后，日采食量增加，日增重提高了，同時(shí)還降低了乳豬的料肉比，腹瀉率也顯著降低了。