一種功能化納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因?qū)氩牧稀炯夹g(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種功能化納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，包括：步驟一，二氧化鉬顆粒的制備；步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鉬；步驟三，包裹聚乙二醇；步驟四，葉酸修飾，得到納米MoO2-PEG-FA基因?qū)氩牧稀１景l(fā)明制得的納米MoO2-PEG-FA基因?qū)氩牧蠟橐环N平均直徑為100nm左右的納米球形材料，該納米MoO2-PEG-FA基因?qū)氩牧吓c綠色熒光蛋白質(zhì)?；騪GFP結(jié)合，用于轉(zhuǎn)染，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞相容性好、細(xì)胞生存率高的優(yōu)點(diǎn)；在人乳腺癌細(xì)胞中，該納米MoO2-PEG-FA和pEGFP-C1的聯(lián)合體的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%左右。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因?qū)氩牧稀炯夹g(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種功能化納米基因?qū)氩牧霞捌?制備方法和應(yīng)用。 一種功能化納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 基因?qū)敕椒梢苑譃閮深?lèi)：第一類(lèi)是病毒型基因?qū)敕椒?，是以逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺 病毒、腺相關(guān)病毒為載體；第二類(lèi)是非病毒型基因?qū)敕椒ǎ顼@微注射、基因槍、磷酸鈣共 沉淀、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、以及利用新興的納米基因?qū)氩牧线M(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。
[0003] 病毒型基因?qū)敕椒ù嬖谠S多嚴(yán)重的不足，例如病毒轉(zhuǎn)染時(shí)有可能激活原癌基 因。因此，非病毒型基因?qū)敕椒ㄊ悄壳暗难芯繜狳c(diǎn)，但是，上述所述的非病毒型基因?qū)?方法均存在不足：顯微注射一次只能處理一個(gè)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率非常低；基因槍的穿透力 十分有限；磷酸鈣共沉淀法的轉(zhuǎn)染效率受溫度、濃度、操作環(huán)境等眾多因素影響，轉(zhuǎn)染結(jié)果 很不穩(wěn)定；陽(yáng)離子脂質(zhì)體法雖然表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效率，但是陽(yáng)離子脂質(zhì)體因毒性高，使得 陽(yáng)離子脂質(zhì)體法的應(yīng)用受到了限制；現(xiàn)有技術(shù)中的納米基因?qū)氩牧洗嬖谏a(chǎn)成本高、制 備用原料不易得、難以普及推廣應(yīng)用的缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種功能化納米基因?qū)氩牧?的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種功能化納米基因?qū)氩?料。
[0006] 本發(fā)明的目的之三在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種功能化納米基因?qū)氩牧?的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎㄒ韵虏襟E： 步驟一，二氧化鑰顆粒的制備：將鑰、三氧化鑰和氯化銨進(jìn)行水熱反應(yīng)制得二氧化鑰顆 粒； 步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鑰：將步驟一制得的二氧化鑰顆粒與3-氨丙基三乙氧基 硅烷在乙醇中進(jìn)行回流反應(yīng)一定時(shí)間，并離心水洗后，得到硅烷修飾物； 步驟三，包裹聚乙二醇：將預(yù)先制得的聚乙二醇-0TS和步驟二制得的硅烷修飾物加入 到乙醇中，然后攪拌一定時(shí)間后，加入氫氧化銨，并進(jìn)行離心水洗，得到固體物； 步驟四，葉酸修飾：將葉酸加入到磷酸緩沖液中，并加入1- (3-二甲基氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，然后加入步驟三中得到的固體物，然后攪拌一定時(shí)間 后，離心并用乙醇洗漆，然后再用水洗漆，得到納米M〇0 2-PEG-FA基因?qū)氩牧稀?br> [0008] 上述技術(shù)方案中，步驟一中，所述鑰、所述三氧化鑰和所述氯化銨的摩爾比為 0· 5?1 :1?3 :4?6。
[0009] 上述技術(shù)方案中，步驟一中，所述水熱反應(yīng)的溫度為150°C ~170°C，所述水熱反應(yīng) 的時(shí)間為22小時(shí)~26小時(shí)；所述水熱反應(yīng)的壓力為600KPa~700KPa。
[0010] 上述技術(shù)方案中，步驟二中，所述二氧化鑰顆粒和所述3-氨丙基三乙氧基硅烷 的摩爾比為0. 5~2 :4~10 ;所述乙醇的用量為，使所述二氧化鑰顆粒的質(zhì)量-體積濃度為 0· 8g/L?1. 2g/L。
[0011] 上述技術(shù)方案中，步驟二中，所述回流反應(yīng)的溫度為70°C ~90°C，所述回流反應(yīng)的 時(shí)間為2小時(shí)~4小時(shí)。
[0012] 上述技術(shù)方案中，步驟三中，所述聚乙二醇-0TS的制備方法為：將4-甲苯磺酰氯 分散于甲苯中，并加入三乙胺和聚乙二醇，然后在室溫下攪拌22小時(shí)?24小時(shí)，然后利用去 氧水洗滌三乙胺后，進(jìn)行減壓蒸餾除去甲苯，得到蒸餾物，并利用己烷洗滌蒸餾物后，繼續(xù) 蒸餾得到聚乙二醇-0TS。
[0013] 上述技術(shù)方案中，步驟三中，所述聚乙二醇-0TS、所述硅烷修飾物和所述氫氧化銨 的質(zhì)量比為8?12 :0. 5?2 :6(Γ80 ;步驟三中乙醇的用量為，使所述硅烷修飾物的質(zhì)量-體積 濃度為〇. 8g/L~l. 2g/L ;所述攪拌時(shí)間為10小時(shí)~14小時(shí)。
[0014] 上述技術(shù)方案中，步驟四中，所述葉酸、所述1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺和所述N-羥基丁二酰亞胺的摩爾比為0. 1~0. 3 :0. 8~1. 5 :1~4 ;所述步驟四中的攪拌 時(shí)間為10小時(shí)~14小時(shí)。
[0015] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的之二，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種功能化納米基因?qū)氩牧?，運(yùn)用上述所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽?方法所制得的納米MO02-PEG-FA基因?qū)氩牧?，所述納米MO02-PEG-FA基因?qū)氩牧蠟橐?種平均直徑為100nm左右的納米球形材料。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的之三，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 上述所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ㄋ频玫募{米基因?qū)氩牧嫌?于制作抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有益效果在于： 本發(fā)明提供的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ㄋ频玫募{米MO02-PEG-FA 基因?qū)氩牧蠟橐环N平均直徑為l〇〇nm左右的納米球形材料，且該納米球形材料的粒徑 能夠通過(guò)反應(yīng)時(shí)間的控制進(jìn)而控制納米顆粒的粒徑，從而擴(kuò)大了粒徑的選擇范圍。該納 米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧夏芎途G色熒光蛋白質(zhì)?；?pGFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成 無(wú)機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。該納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧吓c綠色熒光 蛋白質(zhì)?；?PGFP結(jié)合后再與DNA中的亞鐵離子的正電性根發(fā)生作用，能夠達(dá)到穩(wěn)定的 轉(zhuǎn)染效率，并且能夠降低高濃度亞鐵離子可能導(dǎo)致的活性，從而使得本發(fā)明所制得的納米 M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧夏軌蛟谌梭w內(nèi)得到進(jìn)一步應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述制 得的納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧暇哂幸韵聝?yōu)點(diǎn) ： (1) 具有較高的轉(zhuǎn)染效率，在人乳腺癌細(xì)胞中可以達(dá)到40%左右； (2) 低毒性，因 M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧暇哂辛己玫纳锵嗳菪?，?xì)胞生存率很高； (3) 該納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧系姆稚⑿粤己?，符合?duì)轉(zhuǎn)染的要求； (4) 制備成本極低，因該納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧咸崛〉闹饕钚猿煞?-多酚 類(lèi)化合物的價(jià)格低廉；且反應(yīng)用試劑都是常見(jiàn)易得的廉價(jià)試劑； (5) 材料制備反應(yīng)簡(jiǎn)單，容易操作，可重復(fù)性好； (6) 應(yīng)用前景良好，可以應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
[0018] 本發(fā)明提供的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：步驟 一中制得的二氧化鑰顆粒與商業(yè)的二氧化鑰相比，水溶性大大增加，光熱性能也加強(qiáng)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本發(fā)明的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǖ膶?shí)施例1所制得的納 米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧系膾呙桦婄R圖。
[0020] 圖2是本發(fā)明的納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧显谵D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中納米M〇02-PEG-FA 和pEGFP-Cl的聯(lián)合體在轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖。
[0021] 圖3是本發(fā)明的納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧显谵D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中納米M〇02-PEG-FA 和pEGFP-Cl的聯(lián)合體在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率圖。
[0022] 圖4是本發(fā)明的納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧显谵D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中納米M〇02-PEG-FA 和pEGFP-Cl的聯(lián)合體的轉(zhuǎn)染效率圖。
[0023] 其中，在圖3至圖4中，cell viability (%)代表細(xì)胞存活率，transfection efficiency(%)代表轉(zhuǎn)染效率。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025] 實(shí)施例1。
[0026] 一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，它包括以下步驟： 步驟一，二氧化鑰顆粒的制備：將lmmol鑰、2mmol三氧化鑰和250mg氯化銨進(jìn)行水熱 反應(yīng)制得二氧化鑰顆粒；其中，水熱反應(yīng)是以雙蒸水作為溶劑，本實(shí)施例中，采用50mL的反 應(yīng)釜作為反應(yīng)容器，并加入40mL的雙蒸水作為溶劑。
[0027] 其中，水熱反應(yīng)的溫度為160°C，水熱反應(yīng)的時(shí)間為24小時(shí)；水熱反應(yīng)的壓力為 618KPa。
[0028] 步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鑰：將步驟一制得的50mg二氧化鑰顆粒與5mL3_氨 丙基三乙氧基硅烷在乙醇中進(jìn)行回流反應(yīng)3小時(shí)，并離心水洗后，得到硅烷修飾物。
[0029] 其中，回流反應(yīng)的溫度為80°C ;步驟二中乙醇的用量為，使二氧化鑰顆粒的質(zhì) 量-體積濃度為lg/L。
[0030] 步驟三，包裹聚乙二醇：將預(yù)先制得的0. 5g聚乙二醇-0TS和步驟二制得的硅烷修 飾物加入到乙醇中，然后攪拌12小時(shí)后，加入4mL氫氧化銨，并進(jìn)行離心水洗，得到固體物。
[0031] 其中，聚乙二醇-0TS的制備方法為：將4-甲苯磺酰氯分散于甲苯中，并加入三乙 胺和聚乙二醇，然后在室溫下攪拌24小時(shí)，然后利用去氧水洗滌三乙胺后，進(jìn)行減壓蒸餾 除去甲苯，得到蒸餾物，并利用己烷洗滌蒸餾物后，繼續(xù)蒸餾得到聚乙二醇-0TS。
[0032] 其中，聚乙二醇-0TS、硅烷修飾物和氫氧化銨的質(zhì)量比為10 :1 :70。
[0033] 其中，步驟三中乙醇的用量為，使硅烷修飾物的質(zhì)量-體積濃度為1. Og/L。
[0034] 步驟四，葉酸修飾：將90mg葉酸加入到60mL磷酸緩沖液中，并加入12mL0. lmol/L 的1- (3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺和24mL0. lmol/L的N-羥基丁二酰亞胺，然后 加入步驟三中得到的固體物，然后攪拌12小時(shí)后，離心并用乙醇洗滌，然后再用水洗滌，得 到納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧稀?br> [0035] 實(shí)施例2。
[0036] -種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，它包括以下步驟： 步驟一，二氧化鑰顆粒的制備：將鑰、三氧化鑰和氯化銨進(jìn)行水熱反應(yīng)制得二氧化鑰顆 粒； 其中，水熱反應(yīng)的溫度為150°C，水熱反應(yīng)的時(shí)間為26小時(shí)；水熱反應(yīng)的壓力為 600KPa ;本實(shí)施例中，鑰、三氧化鑰和氯化銨的摩爾比為0. 5 :1 :4。
[0037] 步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鑰：將步驟一制得的二氧化鑰顆粒與3-氨丙基三乙 氧基硅烷在乙醇中進(jìn)行回流反應(yīng)4小時(shí)，并離心水洗后，得到硅烷修飾物； 其中，回流反應(yīng)的溫度為70°C ;本實(shí)施例中，二氧化鑰顆粒和3-氨丙基三乙氧基硅烷 的摩爾比為0. 5 :4 ;步驟二中乙醇的用量為，使二氧化鑰顆粒的質(zhì)量-體積濃度為0. 8g/L。
[0038] 步驟三，包裹聚乙二醇：將預(yù)先制得的聚乙二醇-0TS和步驟二制得的硅烷修飾物 加入到乙醇中，然后攪拌10小時(shí)后，加入氫氧化銨，并進(jìn)行離心水洗，得到固體物； 其中，聚乙二醇-0TS的制備方法為：將4-甲苯磺酰氯分散于甲苯中，并加入三乙胺和 聚乙二醇，然后在室溫下攪拌22小時(shí)，然后利用去氧水洗滌三乙胺后，進(jìn)行減壓蒸餾除去 甲苯，得到蒸餾物，并利用己烷洗滌蒸餾物后，繼續(xù)蒸餾得到聚乙二醇-0TS。
[0039] 其中，聚乙二醇-0TS、硅烷修飾物和氫氧化銨的質(zhì)量比為8 :0. 5 :60。
[0040] 其中，步驟三中乙醇的用量為，使硅烷修飾物的質(zhì)量-體積濃度為0. 8g/L。
[0041] 步驟四，葉酸修飾：將葉酸加入到磷酸緩沖液中，并加入1-(3-二甲基氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，然后加入步驟三中得到的固體物，然后攪拌10 小時(shí)后，離心并用乙醇洗滌，然后再用水洗滌，得到納米M〇0 2-PEG-FA基因?qū)氩牧希?本實(shí)施例中，葉酸、1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的 摩爾比為0. 1 :〇. 8 :1。
[0042] 實(shí)施例3。
[0043] 一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎㄒ韵虏襟E： 步驟一，二氧化鑰顆粒的制備：將鑰、三氧化鑰和氯化銨進(jìn)行水熱反應(yīng)制得二氧化鑰顆 粒； 其中，水熱反應(yīng)的溫度為170°C，水熱反應(yīng)的時(shí)間為22小時(shí)；水熱反應(yīng)的壓力為 700KPa ;本實(shí)施例中，鑰、三氧化鑰和氯化銨的摩爾比為1 :3 :6。
[0044] 步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鑰：將步驟一制得的二氧化鑰顆粒與3-氨丙基三乙 氧基硅烷在乙醇中進(jìn)行回流反應(yīng)2小時(shí)，并離心水洗后，得到硅烷修飾物； 其中，回流反應(yīng)的溫度為90°C ;本實(shí)施例中，二氧化鑰顆粒和3-氨丙基三乙氧基硅烷 的摩爾比為2 :4 ;步驟二中乙醇的用量為，使二氧化鑰顆粒的質(zhì)量-體積濃度為1. 2g/L。
[0045] 步驟三，包裹聚乙二醇：將預(yù)先制得的聚乙二醇-0TS和步驟二制得的硅烷修飾物 加入到乙醇中，然后攪拌14小時(shí)后，加入氫氧化銨，并進(jìn)行離心水洗，得到固體物； 其中，聚乙二醇-0TS的制備方法為：將4-甲苯磺酰氯分散于甲苯中，并加入三乙胺和 聚乙二醇，然后在室溫下攪拌23小時(shí)，然后利用去氧水洗滌三乙胺后，進(jìn)行減壓蒸餾除去 甲苯，得到蒸餾物，并利用己烷洗滌蒸餾物后，繼續(xù)蒸餾得到聚乙二醇-0TS。
[0046] 其中，聚乙二醇-0TS、硅烷修飾物和氫氧化銨的質(zhì)量比為12 :2 :80。
[0047] 其中，步驟三中乙醇的用量為，使硅烷修飾物的質(zhì)量-體積濃度為1. 2g/L。
[0048] 步驟四，葉酸修飾：將葉酸加入到磷酸緩沖液中，并加入1-(3-二甲基氨基丙 基）-3_乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，然后加入步驟三中得到的固體物，然后攪拌14 小時(shí)后，離心并用乙醇洗滌，然后再用水洗滌，得到納米m〇o 2-peg-fa基因?qū)氩牧希?本實(shí)施例中，葉酸、1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的 摩爾比為0. 3 :1. 5 :4。
[0049] 將上述實(shí)施例1制得的納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧嫌糜谝韵聦?shí)驗(yàn)。
[0050] 結(jié)合性能的測(cè)定 1、主要材料 實(shí)施例1制得的納米m〇o2-peg-fa基因?qū)氩牧?見(jiàn)圖1);綠色熒光蛋白質(zhì)粒 (pEGFP-Cl) ;HEPES平衡鹽溶液（自配）；電泳緩沖液（0. 5XTBE，自配）；DNA上樣緩沖液；溴 化乙啶（EB)。
[0051] 2、主要方法 1 μ L M〇02-PEG-FA 溶液（5mgMo02-PEG-FA 溶解在 500 μ L 雙蒸水中）與 1 μ LpEGFP-Cl 水溶液（〇. 1 mg /mL)以及8 ml雙蒸水（pH=7. 4)在1. 5mL離心管中混合，置于室溫下30分 鐘讓其充分結(jié)合。M〇02-PEG-FA和pEGFP-Cl的質(zhì)量比分別為100:1，50:1，30:1，10:1，5:1 ，1:1。在5000rpm的速度下離心5min，得到沉淀物。將沉淀物加載到1%的瓊脂糖（ΕΒ0. 1 mg/mL)中，并在TAE的緩沖下，在100V電壓下跑40min，然后在320nm處觀察條帶。
[0052] 3、結(jié)果 結(jié)果觀察，有多種條帶出現(xiàn)，這是因?yàn)閜EGFP-Cl有多種構(gòu)型所致。在質(zhì)量比30:1， 10:1，5:1，1:1處條帶清晰明顯，說(shuō)明在這些質(zhì)量比之下，DNA和納米M〇02-PEG-FA顆粒結(jié) 合不是很好，到了 1〇〇:1，50:1條帶消失，說(shuō)明DNA和納米M〇02-PEG-FA顆粒結(jié)合完全了。
[0053] 上述結(jié)果表明：帶正電荷的pEGFP-Cl和納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧洗嬖谝粋€(gè) 最佳的結(jié)合比，當(dāng)納米M〇0 2-PEG-FA基因?qū)氩牧虾蚿EGFP-Cl的質(zhì)量比大于50:1，繼續(xù)添 加納米m〇o2-peg-fa基因?qū)氩牧希G色熒光蛋白質(zhì)粒也不會(huì)再與多余的納米m〇o 2-peg-fa 基因?qū)氩牧辖Y(jié)合，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，以納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧虾蚿EGFP-Cl 的質(zhì)量比為50:1的結(jié)合比進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0054] 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 1、主要材料 人乳腺癌細(xì)胞；M〇02-PEG-FA和pEGFP-Cl聯(lián)合體(上述制備）；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清 FBS ;6孔培養(yǎng)板。
[0055] 2、主要方法 (1)細(xì)胞的培養(yǎng)：將人乳腺癌細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后加入到6孔板中 (5 X 106/孔)，用含F(xiàn)BS10%的DMEM溶液并加轉(zhuǎn)染優(yōu)化試劑培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%?70%的 融合度。
[0056] (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞上清除去，并換上新的培養(yǎng)液，然后分成三份， 分別為第一樣品、第二樣品和第三樣品，第一樣品中不添加任何其它物質(zhì)，往第二樣品中 加入質(zhì)量比為50:1的納米M〇0 2-PEG-FA和pEGFP-Cl的聯(lián)合體，往第三樣品中加入脂質(zhì)體 2000和pEGFP-Cl的聯(lián)合體，然后對(duì)第一樣品、第二樣品和第三樣品分別培養(yǎng)48小時(shí)，然后 對(duì)第二樣品進(jìn)行熒光測(cè)定(見(jiàn)圖2)，并對(duì)第一樣品、第二樣品和第三樣品分別進(jìn)行細(xì)胞存活 率測(cè)定(見(jiàn)圖3)、轉(zhuǎn)染效率測(cè)定(見(jiàn)圖4)。其中，細(xì)胞存活率測(cè)定時(shí)，是用碘化吡啶進(jìn)行標(biāo) 識(shí)，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)染效率測(cè)定是使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0057] 3、結(jié)果分析 從圖2中的熒光圖可以看出有明顯的綠色熒光，并且綠色熒光的覆蓋面較大，說(shuō)明納 米M〇02-PEG-FA和pEGFP-Cl的聯(lián)合體在人乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。
[0058] 圖3的細(xì)胞存活率圖片中，由左到右分別代表第一樣品（control)、第二樣品 (nano)和第三樣品（lipofectamine 2000)的存活率，其中，第一樣品的存活率為98%，第二 樣品的存活率約為90%，第三樣品的存活率為75%。因此，從圖3中可以看到，質(zhì)量比為50:1 的納米M〇0 2-PEG-FA和pEGFP-Cl的聯(lián)合體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的存活率的影響是很小的，相比 之下，脂質(zhì)體2000和pEGFP-Cl的聯(lián)合體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的存活率的影響較大。
[0059] 圖4的轉(zhuǎn)染效率圖片中，由左到右分別代表第一樣品（control)、第二樣品（nano) 和第三樣品（lipofectamine 2000)的轉(zhuǎn)染效率。由圖4中可以看到，納米M〇02-PEG_FA和 pEGFP-Cl的聯(lián)合體可以達(dá)到約40%的轉(zhuǎn)染效率，這是在保證了人乳腺癌細(xì)胞存活率約為 90%的前提下達(dá)到的轉(zhuǎn)染效率。雖然納米M〇0 2-PEG-FA和pEGFP-Cl的聯(lián)合體的轉(zhuǎn)染效率不 及脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染效率高，但是，納米M〇02-PEG-FA和pEGFP-Cl的聯(lián)合體的高細(xì)胞相容 性是脂質(zhì)體2000所無(wú)法比擬的。
[0060] 終上所述，由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析可知，納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧献鳛檗D(zhuǎn)染 試劑具有巨大的潛力。
[0061] 最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)地說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí) 質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：它包括以下步驟： 步驟一，二氧化鑰顆粒的制備：將鑰、三氧化鑰和氯化銨進(jìn)行水熱反應(yīng)制得二氧化鑰顆 粒； 步驟二，氨基硅烷修飾二氧化鑰：將步驟一制得的二氧化鑰顆粒與3-氨丙基三乙氧基 硅烷在乙醇中進(jìn)行回流反應(yīng)一定時(shí)間，并離心水洗后，得到硅烷修飾物； 步驟三，包裹聚乙二醇：將預(yù)先制得的聚乙二醇-OTS和步驟二制得的硅烷修飾物加入 到乙醇中，然后攪拌一定時(shí)間后，加入氫氧化銨，并進(jìn)行離心水洗，得到固體物； 步驟四，葉酸修飾：將葉酸加入到磷酸緩沖液中，并加入1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，然后加入步驟三中得到的固體物，然后攪拌一定時(shí)間 后，離心并用乙醇洗滌，然后再用水洗滌，得到納米M〇0 2-PEG-FA基因?qū)氩牧稀?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：?驟一中，所述鑰、所述三氧化鑰和所述氯化銨的摩爾比為〇. 5?1 :廣3 :4飛。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟冢翰?驟一中，所述水熱反應(yīng)的溫度為150°C ~170°C，所述水熱反應(yīng)的時(shí)間為22小時(shí)~26小時(shí)；所 述水熱反應(yīng)的壓力為600KPa?700KPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：?驟二中，所述二氧化鑰顆粒和所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為0. 5?2 :〇0;所述乙 醇的用量為，使所述二氧化鑰顆粒的質(zhì)量-體積濃度為〇. 8g/L~l. 2g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：?驟二中，所述回流反應(yīng)的溫度為70°C ~90°C，所述回流反應(yīng)的時(shí)間為2小時(shí)~4小時(shí)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：?驟三中，所述聚乙二醇-OTS的制備方法為：將4-甲苯磺酰氯分散于甲苯中，并加入三乙胺 和聚乙二醇，然后在室溫下攪拌22小時(shí)?24小時(shí)，然后利用去氧水洗滌三乙胺后，進(jìn)行減壓 蒸餾除去甲苯，得到蒸餾物，并利用己烷洗滌蒸餾物后，繼續(xù)蒸餾得到聚乙二醇-OTS。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于?步驟三中，所述聚乙二醇-OTS、所述硅烷修飾物和所述氫氧化銨的質(zhì)量比為8?12 :0. 5?2 : 6(Γ80 ;步驟三中乙醇的用量為，使所述硅烷修飾物的質(zhì)量-體積濃度為0. 8g/L?l. 2g/L ;所 述攪拌時(shí)間為10小時(shí)~14小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?，其特征在于：?驟四中，所述葉酸、所述1- (3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺和所述N-羥基丁二酰亞 胺的摩爾比為〇. l~〇. 3 :0. 8~1. 5 :1~4 ;所述步驟四中的攪拌時(shí)間為10小時(shí)?14小時(shí)。
9. 一種功能化納米基因?qū)氩牧?，其特征在于：運(yùn)用權(quán)力要求1至8任意一項(xiàng)所述的 一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ㄋ频玫募{米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧希?納米M〇02-PEG-FA基因?qū)氩牧蠟橐环N平均直徑為100nm左右的納米球形材料。
10. 權(quán)利要求1至8任意一項(xiàng)所述的一種功能化納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ㄋ频?的納米基因?qū)氩牧嫌糜谥谱骺鼓[瘤藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08G65/00GK104109690SQ201410274601
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】王深明, 林穎, 張德元, 常光其, 周鴻雁, 李梓倫, 邵楠 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院