采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步驟：A．原料的脫脂預(yù)處理；B．熱水浸提制備粗多糖；C．粗多糖酶解；D．大孔吸附樹脂732陽離子樹脂處理；E．超濾去除小分子；F．真空冷凍干燥；制備樺褐孔菌多糖。使用該工藝最終得到脫色的并去除大部分蛋白和小分子雜質(zhì)的樺褐孔菌精制多糖，適合產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)樺褐孔菌精制多糖。
【專利說明】采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及一種采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]樺褐孔菌[Τ/7θ/7θ--5.CvWiiJTOZ1S (Fr.)Pilat]是一著名的民間野生藥用真菌。研究表明，樺褐孔菌多糖是重要的活性成分之一，具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多種藥理活性，已成為國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域之一。但目前對樺褐孔菌多糖的分離純化的研究報道相對較少。
[0003]由于多糖的組成復(fù)雜性，多糖粗提物的分子量分布較廣，多糖種類也很多，而且前期實驗表明，提取后的樺褐孔菌粗多糖中含有一定量的蛋白、色素和小分子物質(zhì)，影響多糖的生物活性的發(fā)揮和化學(xué)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究，因此有必要對粗多糖進(jìn)一步分離純化，但去除粗多糖中的蛋白和色素等雜質(zhì)，一直是多糖分離純化中的一大難題，傳統(tǒng)的去蛋白以Sevage法為主，方法操作繁瑣，效率低，采用的有機(jī)溶劑有毒性因而影響多糖的生物活性；活性炭法去除色素效果較好，但后期的活性炭粉末不易去除，過氧化氫法因為較強(qiáng)的抗氧化活性去除色素效果很好，但對多糖的活性影響較大，因此急需探索一種新的精制方法。 [0004]大孔樹脂具有大孔立體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，因此具有良好的交換吸附活性，近年來廣泛用于天然產(chǎn)物的活性成分的精制，有些大孔樹脂已經(jīng)用以去除植物和真菌多糖中的蛋白和色素，并取得了很好的效果。采用大孔樹脂去除樺褐孔菌粗多糖中色素和蛋白的研究尚未見有文獻(xiàn)報道。
[0005]申請公布號CN102603906A (申請?zhí)?01110461635.8)的中國專利文獻(xiàn)公開了一種樺褐孔菌多糖水溶液的制備方法:一種樺褐孔菌多糖水溶液的制備方法，包括以下步驟:三氯乙酸脫蛋白:向樺褐孔菌提取物中加入三氯乙酸，靜置，然后固液分離，取分離得到的固體物質(zhì)；活性炭脫色:向步驟:所得固體物質(zhì)按體積加入50~100倍的水，然后加入活性炭脫色，然后固液分離，取所得上清液；用天然澄清劑澄清:所得上清液加入天然澄清劑澄清。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目是提供一種精制樺褐孔菌粗多糖的工藝，本發(fā)明的核心技術(shù)是:應(yīng)用生物酶和陰離子交換吸附樹脂替代傳統(tǒng)的Sevage法、活性炭法和過氧化氫法去除蛋白和色素，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種新型的適合規(guī)?；苽錁搴挚拙贫嗵堑姆椒?。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步驟:A.原料的脫脂預(yù)處理；B.熱水浸提制備粗多糖；C.粗多糖酶解；D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理；E.超濾去除小分子；F.真空冷凍干燥；制備得到樺褐孔菌精制多糖。[0008]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟A.原料的脫脂預(yù)處理是指，取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍體積的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24 h (優(yōu)選的，置于6_7倍體積的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20 h，更加優(yōu)選的，置于6.5倍體積的80%乙醇溶液中浸泡20 h)，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
[0009]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟B.熱水浸提制備粗多糖是指，預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加10-20倍蒸餾水(v/w)，沸水提取1-3 h，80-120目紗布過濾(優(yōu)選的，加13-18倍蒸餾水(v/w)，沸水提取1.5-2.5 h，85-100目紗布過濾，更加優(yōu)選的，加15倍蒸餾水(v/w)，沸水提取2 h，100目紗布過濾)，濾渣重復(fù)提取1-3次，合并濾液，濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0010]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟C.粗多糖酶解是指，將粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，35-45°C反應(yīng)20-40 min (優(yōu)選的，36-42°C反應(yīng)25-35 min，更加優(yōu)選的，40°C反應(yīng)30 min)，得粗多糖的酶解液。更加優(yōu)選的，粗多糖加水溶解后配制為0.5-2.0% (w/w)的水溶液(優(yōu)選的，配制為0.6-1.8% (w/w)的水溶液,更加優(yōu)選的,配制為1.5% (w/w)的水溶液)。更加優(yōu)選的，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的3-5% (w/w)(優(yōu)選的，加入量為粗多糖水溶液的3.5-4.5% (w/w)，更加優(yōu)選的，加入量為粗多糖水溶液的4.0% (w/w))。
[0011]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟D.大孔吸附樹脂732陽離子樹脂處理是指，粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.2-2.0: l(w/v)，流速控制在l_3ml/min (優(yōu)選的，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.5-1.8: I (w/v),流速控制在1.5-2 ml/min,更加優(yōu)選的,按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.6: 1(?八)，流速控制在1.81111/1^11)，收集流出液。更加優(yōu)選的，所述的預(yù)處理是指，大孔吸附樹脂732陽離子樹脂先用水浸泡24 h，用水洗至水液澄清，傾去 水后加I M HCl溶液浸泡24 h，水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性。
[0012]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟E.超濾去除小分子是指，采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)。
[0013]前面所述的方法，優(yōu)選的方案是，步驟F.真空冷凍干燥是指，先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入-80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0014]本發(fā)明公開了一種樺褐孔菌精制多糖及其制備工藝，制備工藝如下:1、原料的預(yù)處理；2、樺褐孔菌粗多糖的溶出；3、蛋白酶水解；4、陰離子樹脂處理；5、超濾，然后干燥。使用該工藝最終得到脫色的并去除大部分蛋白和小分子雜質(zhì)的樺褐孔菌精制多糖，獲得較高的多糖保留率、脫色率、蛋白脫除率和得率。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案詳加描述，但保護(hù)范圍不被此限制。實施例中所用的材料皆可從市場購買。
[0016]實施例1采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步驟:
A.原料的脫脂預(yù)處理:取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于4倍體積的60%乙醇溶液中浸泡16 h，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。[0017]B.熱水浸提制備粗多糖:預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加10倍蒸餾水(v/w)，沸水提取
Ih,80目紗布過濾，濾液濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0018]C.粗多糖酶解:將粗多糖加水溶解，配制為0.5% (w/w)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的3% (w/w)，35°C反應(yīng)20min，得粗多糖的酶解液。
[0019]D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理:粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理(大孔吸附樹脂732陽離子樹脂先用水浸泡24 h,用水洗至水液澄清,傾去水后加I M HCl溶液浸泡24 h,水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性)的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.2: I (w/v)，流速控制在I ml/min，收集流出液。
[0020]E.超濾去除小分子:采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)，得樺褐孔菌多糖樣品。
[0021]F.真空冷凍干燥:先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入_80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0022]實施例2采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步驟:
A.原料的脫脂預(yù)處理:取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于8倍體積的95%乙醇溶液中浸泡24 h，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
[0023]B.熱水浸提制備粗多糖:預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加20倍蒸餾水(v/w)，沸水提取 3h，120目紗布過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0024]C.粗多糖酶解:將粗多糖加水溶解，配制為2.0% (w/w)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的5% (w/w)，45°C反應(yīng)40min，得粗多糖的酶解液。
[0025]D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理:
大孔吸附樹脂732陽離子樹脂預(yù)處理，先用水浸泡24 h，用水洗至水液澄清，傾去水后加I M HCl溶液浸泡24 h，水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性。
[0026]粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=2.0:1 (w/v),流速控制在3 ml/min,收集流出液。
[0027]E.超濾去除小分子:采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)。
[0028]F.真空冷凍干燥:先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入_80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0029]實施例3采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步驟:
A.原料的脫脂預(yù)處理:取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于7倍體積的90%乙醇溶液中浸泡20 h，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
[0030]B.熱水浸提制備粗多糖:預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加18倍蒸餾水(v/w)，沸水提取
2.5h，100目紗布過濾，濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液，濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0031]C.粗多糖酶解:將粗多糖加水溶解，配制為1.8% (w/w)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的4.5% (w/w)，42°C反應(yīng)35min，得粗多糖的酶解液。
[0032]D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理:粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理(預(yù)處理方式與是實施例1-3相同)的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.8: I (w/v),流速控制在2 ml/min,收集流出液。[0033]E.超濾去除小分子:采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)。
[0034]F.真空冷凍干燥:先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入_80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0035]實施例4采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步驟:
A.原料的脫脂預(yù)處理:取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于6倍體積的70%乙醇溶液中浸泡18 h，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
[0036]B.熱水浸提制備粗多糖:預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加13倍蒸餾水(v/w)，沸水提取
1.5h，85目紗布過濾，提取I次，濾液濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0037]C.粗多糖酶解:將粗多糖加水溶解，配制為0.5% (w/w)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的3.5%(w/w), 36°C反應(yīng)25min，得粗多糖的酶解液。
[0038]D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理:粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理(大孔吸附樹脂732陽離子樹脂先用水浸泡24 h,用水洗至水液澄清,傾去水后加I MHCl溶液浸泡24 h,水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性)的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.5: 1(?八)，流速控制在1.51111/1^11，收集流出液。
[0039]E.超濾去除小分子:采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)。
[0040]F.真空冷凍干燥:先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入_80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0041]實施例5采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步驟:
A.原料的脫脂預(yù)處理:取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于6.5倍體積的80%乙醇(質(zhì)量濃度)溶液中浸泡20 h，以除去脂肪、部分寡糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
[0042]B.熱水浸提制備粗多糖:預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加15倍蒸餾水(v/w)，沸水提取2 h，100目紗布過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
[0043]C.粗多糖酶解:將粗多糖加水溶解，配制為1.5% (w/w)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的4.0%(w/w), 40°C反應(yīng)30 min，得粗多糖的酶解液。
[0044]D.大孔樹脂732陽離子樹脂處理:粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理(所述的預(yù)處理是指，大孔吸附樹脂732陽離子樹脂先用水浸泡24 h，用水洗至水液澄清，傾去水后加I MHCl溶液浸泡24 h，水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性)的732陽離子樹脂樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂樹脂:粗多糖酶解液=1.6: 1(?八)，流速控制在1.8ml/min,收集流出液。
[0045]E.超濾去除小分子:采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)。
[0046]F.真空冷凍干燥:先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入_80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
[0047]試驗例實施例5所得樺褐孔菌多糖多糖含量和蛋白含量的測定，以及蛋白脫除率、色素脫除率和多糖保留率的計算。其中多糖含量(%)=總糖的含量(%)_還原糖的含量(%)。
[0048]總糖含量測定采用苯酚-硫酸法；還原糖含量測定采用DNS法；蛋白含量測定采用 Bradford 法。
【權(quán)利要求】
1.采用732陽離子樹脂精制樺褐孔菌粗多糖的方法，其特征是，包括如下步驟:A.原料的脫脂預(yù)處理；B.熱水浸提制備粗多糖；C.粗多糖酶解；D.大孔吸附樹脂732陽離子樹脂處理；E.超濾去除小分子；F.真空冷凍干燥；制備樺褐孔菌多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟A.原料的脫脂預(yù)處理是指，取干燥的樺褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍體積的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24 h(優(yōu)選的，置于6_7倍體積的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20 h，更加優(yōu)選的，置于6.5倍體積的80%乙醇溶液中浸泡20 h)，以除去脂肪、部分單(寡)糖及脂溶性色素，殘渣陰涼處風(fēng)干。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟B.熱水浸提制備粗多糖是指，預(yù)處理后的殘渣風(fēng)干后，加10-20倍蒸餾水(v/w)，沸水提取1-3 h，80-120目紗布過濾(優(yōu)選的，加13-18倍蒸餾水(v/w)，沸水提取1.5-2.5 h，85-100目紗布過濾，更加優(yōu)選的，加15倍蒸餾水(v/w)，沸水提取2h，100目紗布過濾)，濾渣重復(fù)提取1-3次，合并濾液，濃縮，離心，噴霧干燥得粗多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟C.粗多糖酶解是指，將粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，35-450C反應(yīng)20-40 min(優(yōu)選的，36-42°C反應(yīng)25-35 min,更加優(yōu)選的，40°C反應(yīng)30 min)，得粗多糖的酶解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，粗多糖加水溶解后配制為0.5-2.0% (w/w)的水溶液(優(yōu)選的，配制為0.6-1.8% (w/w)的水溶液,更加優(yōu)選的,配制為1.5% (w/w)的水溶液)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，木瓜蛋白酶加入量為粗多糖水溶液的3-5%(w/w)(優(yōu)選的，加入量為粗多糖水溶液的3.5-4.5% (w/w)，更加優(yōu)選的，加入量為粗多糖水溶液的 4.0% (w/w))0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟D.大孔吸附樹脂732陽離子樹脂處理是指，粗多糖的酶解液加入經(jīng)預(yù)處理的732陽離子樹脂層析柱中，按照732陽離子樹脂:粗多糖酶解液=1.2-2.0:1 (w/v),流速控制在1-3 ml/min (優(yōu)選的,按照732陽離子樹脂:粗多糖酶解液=1.5-1.8:1 (w/v),流速控制在1.5-2 ml/min,更加優(yōu)選的,按照732陽離子樹脂:粗多糖酶解液=1.6: I (w/v),流速控制在1.8 ml/min),收集流出液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，所述的預(yù)處理是指，大孔吸附樹脂732陽離子樹脂先用水浸泡24 h,用水洗至水液澄清,傾去水后加I M HCl溶液浸泡24 h,水洗至中性，加I M NaOH溶液浸泡24 h，用水洗至中性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟E.超濾去除小分子是指，采用超濾膜分子量為I萬的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，去除I萬以下的小分子物質(zhì)，得樺褐孔菌多糖樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟F.真空冷凍干燥是指，先將樺褐孔菌多糖樣品放置于_20°C下3 h，然后轉(zhuǎn)入-80°C下冷凍6 h以上，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，得精制的樺褐孔菌多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK104031159SQ201410288202
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】陳文靈 申請人:陳文靈