一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法，該方法是將樟芝發(fā)酵液分離的菌絲體通過超聲波和復(fù)合酶解進(jìn)行處理、分離得到樟芝多糖。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了樟芝多糖的提取收率和產(chǎn)品品質(zhì)，減少了生產(chǎn)中純化水用量和能源消耗，增加了經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]樟芝又名樟生薄孔菌,牛樟燕，牛樟芝，紅樟芝，樟燕，樟郝，樟窟內(nèi)郝，紅樟，隸屬真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌科，薄孔菌屬多年生蕈類，是臺灣特有一種珍稀、尚未開發(fā)的名貴食、藥用真菌。只生長在臺灣山區(qū)海拔450~2000公尺間特有的牛樟樹樹干腐朽之心材內(nèi)壁,或枯死倒伏之牛樟木材陰暗潮濕之表面,發(fā)現(xiàn)著實不易。樟芝作為臺灣特有的菌種，自然環(huán)境中牛樟樹是其唯一的寄主，一般真菌不能在其上生長。由于樟芝可造成牛樟樹中心空洞腐朽，加上人對牛樟樹亂砍亂伐,致使牛樟樹數(shù)量相當(dāng)稀少，目前已被列為一級保育樹種。近百年來，牛樟樹難得一見，而能夠長出牛樟芝的牛樟樹則更少，其結(jié)果導(dǎo)致野生樟芝資源嚴(yán)重短缺。因此樟芝十分珍貴，在港澳臺被稱為“神芝”，臺灣民間則稱樟芝為“森林中的紅寶石”。
[0003]近年來，研究得知樟芝能有效治療肝病及其它方面如:抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、降血脂、降血糖的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，樟芝多糖是樟芝中的主要活性物質(zhì)，具有免疫生理活性、預(yù)防及控制腫瘤等生理活性，主要含0-0^111(^11(0-0-葡聚糖))其作用是透過激發(fā)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及自然殺手細(xì)胞等來增強(qiáng)免疫功能，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。此外樟芝多糖還有強(qiáng)心、降血壓、降血糖、抗血栓等功效。
[0004]目前國內(nèi)外對樟芝的研究還不是很透徹，采取的主要培養(yǎng)法是固體發(fā)酵法。由于此法發(fā)酵周期長，勞動強(qiáng)度大，占地面積廣，受季節(jié)限制，而且容易污染，不宜進(jìn)行純種發(fā)酵等缺點，導(dǎo)致樟芝發(fā)酵規(guī)模一直得不到擴(kuò)大。為此，以生物技術(shù)方法進(jìn)行天然樟芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)可以縮短培養(yǎng)時間，獲得大量且純正的菌絲體，成本低，可實現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)的連續(xù)化、自動化，提升生產(chǎn)效益，成為十分值得開發(fā)的途徑。國內(nèi)外也有少量研究者對樟芝的深層發(fā)酵進(jìn)行過研究，但往往其主要側(cè)重點是如何獲取更高的生物量，而目前國內(nèi)關(guān)于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝的功效成分多糖的相關(guān)報道很少。目前關(guān)于真菌類原料多糖的提取工藝多為傳統(tǒng)的水提醇沉法，即向干燥后的菌絲體加入8-20倍重量的水，控制溫度80-100°C浸泡2_4h，靜止1-2h，然后反復(fù)浸提2-3次，然后合并上清液進(jìn)行濃縮，再用50-85%的酒精進(jìn)行醇沉，最終烘干即可得到粗多糖。此工藝的缺點是需加入大量水長時間進(jìn)行浸提，并且為提高收率需反復(fù)浸提2-3次，操作周期較長、勞動強(qiáng)度偏大，并且多糖的提取收率多在2-3%，產(chǎn)品成本比較昂貴。并且分離的上清液作為廢液直接棄液排掉，增加了治污成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)多糖的水提醇沉的技術(shù)瓶頸，采用此發(fā)明能夠快速、高效生產(chǎn)出樟芝多糖。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要按照下述步驟進(jìn)行:
[0007]—種樟芝菌絲體多糖的提取方法，該方法包括下述步驟:
[0008]I)分離:將樟芝發(fā)酵液經(jīng)分離，得到樟芝上清液和濕菌絲體；
[0009]2)超聲處理:向步驟I)所得的濕菌絲體中加入步驟I)所得2-5倍的樟芝上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10-40min，得到超聲處理液；上清液的添加主要是作為水溶性溶液來進(jìn)行提取菌絲體中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超聲過程中容易溫度偏高，影響設(shè)備使用；若添加過多，后期處理需消耗大量的能源，成本偏聞;
[0010]3)復(fù)合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7，控制溫度30_70°C，然后向其加入相當(dāng)于干菌絲體重量0.2-3 %的纖維素酶以及相當(dāng)于干菌絲體重量0.2-3 %的蛋白酶，進(jìn)行酶解l_4h，得到酶解液；
[0011]4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為
1.25~1.40的濃縮漿；
[0012]5)醇沉、烘干:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度為65-80 % (v/v)，靜置2-6h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干，溫度50-75°C，真空度不低于0.085MPa ;烘干至干燥物水分含量為3~8%，即得菌絲體多糖提取物。
[0013]其中，步驟1)、4)所述的所述的分離為離心分離，采用三足離心機(jī)或高速離心機(jī)等離心設(shè)備進(jìn)行，轉(zhuǎn)速控制在1500-5000rpm。
[0014]步驟2)超聲所用的設(shè)備為超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，其他同等超聲設(shè)備均可；超聲功率為 0.5-2.5kw0
[0015]所述的纖維素酶酶活為15000 μ /g~25000 μ /g,所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g ~53000 μ /g。
[0016]步驟4)所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
[0017]5)所述的真空烘干的溫度控制在50-75 °C，真空度不低于0.085Mpa。
[0018]本發(fā)明中醇沉次數(shù)越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本發(fā)明提取的多糖含量在30-60%。
[0019]本發(fā)明具有以下幾個突出的優(yōu)點:
[0020]傳統(tǒng)的工藝是至少用菌絲體干重的20倍的純化水進(jìn)行稀釋，而本工藝采用上清液進(jìn)行稀釋，并且添加量只為菌絲體干重的2-5倍；具有以下優(yōu)點:1、本發(fā)明利用上清液替代純化水進(jìn)行稀釋，減少了廢液排放，減少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作為溶液稀釋時，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代純化水，節(jié)約了純化水，降低生產(chǎn)成本。
[0021]本發(fā)明提取路線簡潔，節(jié)約了大量的能源消耗:因減少了純化水的加入量，相應(yīng)的在后期的分離、濃縮等工序減少了大量的電、蒸汽能源的消耗。
[0022]縮短了操作周期，減少了勞動強(qiáng)度:本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多次浸提，采用一次短時間處理，是傳統(tǒng)處理時間的1/3-1/6，減輕了工人的勞動強(qiáng)度。
[0023]提高了提取收率:傳統(tǒng)的水提多糖的提取收率在2_3%，此發(fā)明用超聲和酶解加劇了菌絲體胞內(nèi)產(chǎn)物的溶出度，本發(fā)明提取多糖收率在4-5%，比傳統(tǒng)工藝提升了近I倍。
[0024]提升了產(chǎn)品品質(zhì):因本發(fā)明采用超聲和復(fù)合酶解處理菌絲體，將部分菌絲體的蛋白降解成可溶性的小分子物質(zhì)，減少了在醇沉過程中雜質(zhì)蛋白的含量，提升了多糖的產(chǎn)品品種，采用本發(fā)明提取多糖含量多在40%以上，比傳統(tǒng)工藝提升了 30%以上。
[0025]采用本發(fā)明可根據(jù)市場需求和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，制得不同含量的高品質(zhì)的多糖，多糖含量可在30-60%。

【具體實施方式】
[0026]以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。但實施例的具體細(xì)節(jié)僅用于解釋本發(fā)明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明總的技術(shù)方案的限定。本發(fā)明使用于普遍的樟芝菌，其來源不受實施例的限制，實施例中使用的菌種編號為CGMCC N0.0543的樟芝菌種僅是為了舉例說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0027]實施例1
[0028]本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行:
[0029]1、樟芝發(fā)酵液的制備:樟芝菌種購買于中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.0543)。將活化好的樟芝搖瓶菌株按接種量10% (v/v)接種于種子培養(yǎng)基(1L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉1%、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0.15%、豆油0.02%，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值4.8，通風(fēng)比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa，26~28°C振蕩培養(yǎng)7天即得樟芝種子液；將種子液按接種量15% (v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.8 %、蛋白胨0.5 %、酵母粉1.0%、磷酸二氫鉀0.2 %、七水硫酸鎂0.2%、硫酸鋅 0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值4.8 ;通風(fēng)比為1:0.5vvm，罐壓0.03Mpa, 26~28°C培養(yǎng)7天，發(fā)酵至發(fā)酵液香氣濃郁(牛奶香味)、菌球變碎、濾液渾濁；pH值降至最低3.2并略有波動，還原糖降至最低0.6并略有波動；鏡檢菌絲細(xì)碎，大量孢子，無雜菌污染，即得樟芝發(fā)酵液。其中上述培養(yǎng)基組成中的“ ”均表示g/100ml。
[0030]2、樟芝發(fā)酵液分離:取上述樟芝發(fā)酵液1Kg通過高速離心機(jī)3000rpm進(jìn)行分離，得到樟芝上清液液9.5Kg和0.5Kg的濕菌絲體(含水量為80% );
[0031]3、超聲處理:向步驟2所得的0.5Kg濕菌絲體中加入1.SKg的樟芝上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行1.0kw超聲處理20min，得到超聲處理液2.3Kg ；
[0032]4、復(fù)合酶解:將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5.5，在水浴控制溫度45 °C，然后向其緩慢加入纖維素酶2.0g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶1.Sg(購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)并不斷攪拌，攪拌均勻后計時進(jìn)行酶解2h，得到酶解液；
[0033]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機(jī)5000rpm進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液1.9Kg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為1.3(50°C熱測)的濃縮漿50g ；
[0034]6、醇沉、烘干:向50g濃縮漿的中加入180ml的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度72% (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置2h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進(jìn)行烘干，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得樟芝菌絲體多糖提取物12.6g。檢測水分含量為3.7%，多糖含量為42%，折合純多糖提取收率為5.29%。
[0035]發(fā)明中的多糖提取收率是按干菌粉計算的。即多糖提取收率=菌絲體多糖提取物質(zhì)量*多糖含量/ [濕菌絲體質(zhì)量* (1-濕菌絲體含水量)]*100 %
[0036]實施例2
[0037]本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行:
[0038]1、樟芝發(fā)酵液的制備:樟芝菌種購買于中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.0543)。將活化好的樟芝搖瓶菌株按接種量12% (v/v)接種于種子培養(yǎng)基(20L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉I %、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0.15 %、豆油0.02%，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值4.8，通風(fēng)比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa,26~28°C振蕩培養(yǎng)7天即得樟芝種子液；將種子液按接種量18% (v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(100L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.8%、蛋白胨0.4%、酵母粉1.2%、磷酸二氫鉀
0.2%、七水硫酸鎂0.2%、硫酸鋅0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值4.8 ;通風(fēng)比為1:0.5vvm,罐壓0.03Mpa, 26~28°C培養(yǎng)7天，發(fā)酵至發(fā)酵液香氣濃郁(牛奶香味)、菌球變碎、濾液渾濁；pH值降至最低3.2并略有波動，還原糖降至最低0.3并略有波動；鏡檢菌絲細(xì)碎，大量孢子，無雜菌污染，即得樟芝發(fā)酵液。其中上述培養(yǎng)基組成中的“ ％ ”均表示g/100ml。
[0039]2、樟芝發(fā)酵液分離:取上述樟芝發(fā)酵液20Kg通過高速離心機(jī)3000rpm進(jìn)行分離，得到樟芝上清液液19.0Kg和1.0Kg的濕菌絲體(含水量為80% );
[0040]3、超聲處理:向步驟2所得的1.0Kg濕菌絲體中加入2.6Kg的樟芝上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行2.0kw超聲處理25min，得到超聲處理液3.6Kg ；
[0041]4、復(fù)合酶解:將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5.0，在水浴控制溫度50°C，然后向其緩慢加入纖維素酶4.2g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶3.Sg(購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)并不斷攪拌，攪拌均勻后計時進(jìn)行酶解2h，得到酶解液；
[0042]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機(jī)5000rpm進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液2.SKg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為1.4(50°C熱測)的濃縮漿105g ；
[0043]6、醇沉、烘干:向105g濃縮漿的中加入350ml的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度74% (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置2.5h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進(jìn)行烘干，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得樟芝菌絲體多糖提取物23.8g。檢測水分含量為
3.1%，多糖含量為45%，多糖提取收率為5.35%。
【權(quán)利要求】
1.一種樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特征在于該方法包括下述步驟: 1)分離:將樟芝發(fā)酵液經(jīng)分離，得到樟芝上清液和濕菌絲體； 2)超聲處理:向步驟I)所得的濕菌絲體中加入步驟I)所得2-5倍的樟芝上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10-40min，得到超聲處理液； 3)復(fù)合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7，控制溫度30-70°C，然后向其加入相當(dāng)于干菌絲體重量0.2-3 %的纖維素酶以及相當(dāng)于干菌絲體重量0.2-3 %的蛋白酶，進(jìn)行酶解l_4h，得到酶解液； 4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為1.25~1.40的濃縮漿； 5)醇沉、烘干:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度為65-80% (v/v)，靜置2-6h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干，溫度50-75 °C，真空度不低于0.085MPa ；烘干至干燥物水分含量為3~8%，即得菌絲體多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的所述的分離為離心分離，轉(zhuǎn)速控制在1500-5000rpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的纖維素酶酶活為15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g~53000 μ /g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟4)所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟5)所述的真空烘干的溫度控制在50-75°C，真空度不低于0.085Mpa。
【文檔編號】C08B37/00GK104072631SQ201410336261
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】王文風(fēng), 徐國華, 徐玲, 王英燕, 楊亞威, 黃盟盟, 張芙蓉 申請人:江蘇阜豐生物科技有限公司