一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法，該方法是將灰樹花發(fā)酵液分離的菌絲體通過超聲波和復(fù)合酶解進(jìn)行處理、分離得到灰樹花多糖。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了灰樹花多糖的提取收率和產(chǎn)品品質(zhì)，減少了生產(chǎn)中純化水用量和能源消耗，增加了經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]灰樹花[Grifola frondosa(Dicks.Fr.) S.F.Gray]隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非裙菌目、多孔菌科、樹花菌屬，又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗子菌、云蕈、蓮花菌等，日本稱之為舞茸，美國稱之為林雞。其肉質(zhì)脆嫩，味如雞絲，能烹調(diào)成多種美味佳肴，且含有多種生理活性物質(zhì)，是一種極具開發(fā)和研究價值的食、藥兼用蕈菌。
[0003]灰樹花多糖是灰樹花眾多生物活性物質(zhì)中最主要的一類活性成分，它系從灰樹花的子實(shí)體或菌絲體與發(fā)酵液中分離得到的一類富含β — 1，6 —及β - 1，3 —糖苷鍵的真菌多糖。研究表明，灰樹花多糖具有非常廣泛的生物學(xué)活性，在抗腫瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV (艾滋病病毒)以及改善免疫系統(tǒng)功能等方面均有很好的作用；并且在某些方面(如抗腫瘤作用)，灰樹花多糖具有明顯高于其它食藥用真菌多糖的醫(yī)療效果，同時還具有用藥方便(如口服有效)的優(yōu)越性，為此，人們對灰樹花多糖的研究興趣愈來愈濃，不斷有關(guān)于其生物活性及藥理功能的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究報(bào)道產(chǎn)生，眾多科研工作者也都積極投入到其制備、結(jié)構(gòu)分析、構(gòu)效關(guān)系及生物活性等相關(guān)性質(zhì)的研究中去，使灰樹花多糖的相關(guān)性質(zhì)研究已成為當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
[0004]我國從80年代初開始對其進(jìn)行人工栽培馴化，90年代開始商品化生產(chǎn)，發(fā)展勢頭強(qiáng)勁。但是，灰樹花子實(shí)體的人工栽培周期長、占地面積大、受自然氣候條件的影響大、且暴露在環(huán)境中易被雜菌污染，大規(guī)模的人工栽培難以推廣。而天然灰樹花子實(shí)體產(chǎn)量有限，難以滿足灰樹花及其系列產(chǎn)品的市場需求，故目前已傾向于利用不受自然條件限制的、可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)來培養(yǎng)灰樹花菌絲體。
[0005]目前國內(nèi)已有院校展開深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花的研究，都是以獲得灰樹花的菌絲體為主要目標(biāo)展開研究的，而目前國內(nèi)關(guān)于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花的功效成分多糖的相關(guān)報(bào)道較少。目前關(guān)于真菌類原料多糖的提取工藝多為傳統(tǒng)的水提醇沉法，即向干燥后的菌絲體加入8 - 20倍重量的水,控制溫度80 - 100°C浸泡2 - 4h,靜止1- 2h,然后反復(fù)浸提
2-3次，然后合并上清液進(jìn)行濃縮，再用50 -85%的酒精進(jìn)行醇沉，最終烘干即可得到粗多糖。此工藝的缺點(diǎn)是需加入大量水長時間進(jìn)行浸提，并且為提高收率需反復(fù)浸提2 - 3次，操作周期較長、勞動強(qiáng)度偏大，并且多糖的提取收率多在2 -3%，產(chǎn)品成本比較昂貴。并且分離的上清液作為廢液直接棄液排掉，增加了治污成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)多糖的水提醇沉的技術(shù)瓶頸，采用此發(fā)明能夠快速、高效生產(chǎn)出灰樹花多糖。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要按照下述步驟進(jìn)行:
[0008]本發(fā)明的高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法包括下述步驟:
[0009]I)分離:將灰樹花發(fā)酵液經(jīng)分離，得到灰樹花上清液和濕菌絲體；
[0010]2)超聲處理:向步驟I)所得的濕菌絲體中加入步驟I)所得2 -5倍質(zhì)量的灰樹花上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10 - 40min，得到超聲處理液；上清液的添加主要是作為水溶性溶液來進(jìn)行提取菌絲體中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超聲過程中容易溫度偏高，影響設(shè)備使用；若添加過多，后期處理需消耗大量的能源，成本偏高；
[0011]3)復(fù)合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4 - 7，控制溫度30 - 70°C,然后向其加入相當(dāng)于干菌絲體重量0.2 - 3%的纖維素酶、和0.2 - 3%的蛋白酶，進(jìn)行酶解I — 4h，得到酶解液；
[0012]4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫濃縮，得到濃縮比重為1.25~1.40(50°C熱測)的濃縮漿；
[0013]5)醇沉、烘干:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計(jì)檢測混合液酒精度為65-80% (v/v)，靜置2-6h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3~8%，即得菌絲體多糖提取物。
[0014]其中，步驟1)、4)所述的分離為離心分離，采用三足離心機(jī)或高速離心機(jī)等離心設(shè)備進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為150 0 - 5000rpm。
[0015]步驟2)超聲所用的設(shè)備為超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，其他同等超聲設(shè)備均可；超聲的功率為 0.5 - 2.5kw。
[0016]步驟3)所述的纖維素酶的單位酶活為15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g~53000 μ /g。
[0017]所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
[0018]所述的真空烘干的溫度50-75 °C，真空度不低于0.085Mpa。
[0019]本發(fā)明中醇沉次數(shù)越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本發(fā)明提取的多糖含量在30 - 60%。
[0020]本發(fā)明具有以下幾個突出的優(yōu)點(diǎn):
[0021]傳統(tǒng)的工藝是至少用菌絲體干重的20倍的純化水進(jìn)行稀釋，而本工藝采用上清液進(jìn)行稀釋，并且添加量只為菌絲體干重的2 -5倍；具有以下優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明利用上清液替代純化水進(jìn)行稀釋，減少了廢液排放，減少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作為溶液稀釋時，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代純化水，節(jié)約了純化水，降低生產(chǎn)成本。
[0022]本發(fā)明提取路線簡潔，節(jié)約了大量的能源消耗:因減少了純化水的加入量，相應(yīng)的在后期的分離、濃縮等工序減少了大量的電、蒸汽能源的消耗。
[0023]縮短了操作周期，減少了勞動強(qiáng)度:本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多次浸提，采用一次短時間處理，是傳統(tǒng)處理時間的1/3-1/6，減輕了工人的勞動強(qiáng)度。
[0024]提高了提取收率:傳統(tǒng)的水提多糖的提取收率在2_3%，此發(fā)明用超聲和酶解加劇了菌絲體胞內(nèi)產(chǎn)物的溶出度，本發(fā)明提取多糖收率在4-7%，比傳統(tǒng)工藝提升了 I倍多。
[0025]提升了產(chǎn)品品質(zhì):因本發(fā)明采用超聲和復(fù)合酶解處理菌絲體，將部分菌絲體的蛋白降解成可溶性的小分子物質(zhì)，減少了在醇沉過程中雜質(zhì)蛋白的含量，提升了多糖的產(chǎn)品品種，采用本發(fā)明提取多糖含量多在40%以上，比傳統(tǒng)工藝提升了 30%以上。
[0026]采用本發(fā)明可根據(jù)市場需求和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，制得不同含量的高品質(zhì)的多糖，多糖含量可在30 - 60%。

【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。但實(shí)施例的具體細(xì)節(jié)僅用于解釋本發(fā)明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明總的技術(shù)方案的限定。本發(fā)明使用于普遍的灰樹花菌，其來源不受實(shí)施例的限制，實(shí)施例中使用的菌種編號為CGMCC N0.4179的灰樹花菌種僅是為了舉例說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行:
[0030]1、灰樹花發(fā)酵液的制備 :灰樹花菌種購買于中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.4179)。將活化好的灰樹花搖瓶菌株按接種量10%接種于種子培養(yǎng)基(1L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、黃豆餅粉I %、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0.15%、豆油0.02%，調(diào)節(jié)pH值5.5，通風(fēng)比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa，26~28°C振蕩培養(yǎng)7天即得灰樹花種子液；將種子液按接種量15%接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.5%、蛋白胨0.3%、黃豆餅粉1.5%、磷酸二氫鉀0.2%、七水硫酸鎂0.2%、豆油0.03%，調(diào)節(jié)pH值5.5 ;通風(fēng)比為1:0.5vvm，罐壓0.03Mpa, 26~28°C培養(yǎng)6天，發(fā)酵至發(fā)酵液有菌球大量增加，濾液渾濁；還原糖降至最低0.3%并略有波動；鏡檢菌絲細(xì)碎，無雜菌污染，即得灰樹花發(fā)酵液。其中上述培養(yǎng)基組成中的均表示g/100ml。
[0031]2、灰樹花發(fā)酵液分離:取上述灰樹花發(fā)酵液1Kg通過高速離心機(jī)2000rpm進(jìn)行分離，得到灰樹花上清液液9.35Kg和0.65Kg的濕菌絲體(含水量為80% )。
[0032]3、超聲處理:向步驟2所得的0.65Kg濕菌絲體中加入2.35Kg的灰樹花上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行1.5kw超聲處理20min，得到超聲處理液3Kg。
[0033]4、復(fù)合酶解:將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5.5，在水浴控制溫度45 °C，然后向其緩慢加入纖維素酶2.1g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶1.9g(購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)并不斷攪拌，攪拌均勻后計(jì)時進(jìn)行酶解2h，得到酶解液。
[0034]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機(jī)4000rpm進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液2.5Kg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為1.3(50°C熱測)的濃縮漿65g。
[0035]6、醇沉、烘干:向65g濃縮漿的中加入250ml的95%酒精，用酒精計(jì)檢測混合液酒精度72% (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置2h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進(jìn)行烘干，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得灰樹花菌絲體多糖提取物16.5g。檢測水分含量為3.7%，多糖含量為44%，多糖提取收率為5.58%。
[0036]本發(fā)明中的多糖提取收率是按干菌粉計(jì)算的，即多糖提取收率=灰樹花菌絲體多糖提取物質(zhì)量*多糖含量/ [濕菌絲體質(zhì)量* (1-濕菌絲體含水量)]*100 %
[0037]實(shí)施例2
[0038]本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行:
[0039]1、灰樹花發(fā)酵液的制備:灰樹花菌種購買于中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.4179)。將活化好的灰樹花搖瓶菌株按接種量14% (v/v)接種于種子培養(yǎng)基(20L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.0 %、蛋白胨0.3 %、黃豆餅粉I %、磷酸二氫鉀
0.3%、七水硫酸鎂0.15%、豆油0.02%，調(diào)節(jié)pH值5.5，通風(fēng)比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa,26~28°C振蕩培養(yǎng)7天即得灰樹花種子液；將種子液按接種量18% (v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(100L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、黃豆餅粉1.5%、磷酸二氫鉀
0.2%、七水硫酸鎂0.2%、豆油0.03%，調(diào)節(jié)pH值5.5 ;通風(fēng)比為1:0.5vvm，罐壓0.03Mpa,26~28°C培養(yǎng)5天，發(fā)酵至發(fā)酵液有菌球大量增加，濾液渾濁；還原糖降至最低0.3%并略有波動；鏡檢菌絲細(xì)碎，無雜菌污染，即得灰樹花發(fā)酵液。其中上述培養(yǎng)基組成中的”均表示 g/100ml。
[0040]2、灰樹花發(fā)酵液分離:取上述灰樹花發(fā)酵液20Kg通過高速離心機(jī)2000rpm進(jìn)行分離，得到灰樹花上清液液18.7Kg和1.3Kg的濕菌絲體(含水量為78% )。
[0041]3、超聲處理:向步驟2所得的1.3Kg濕菌絲體中加入3.7Kg的灰樹花上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行2.0kw
[0042]超聲處理30min，得到超聲處理液5Kg。
[0043]4、復(fù)合酶解:將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5.0，在水浴控制溫度55°C，然后向其緩慢加入纖維素酶4.5g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶4.2g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)并不斷攪拌，攪拌均勻后計(jì)時進(jìn)行酶解2h，得到酶解液。
[0044]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機(jī)4000rpm進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液3.SKg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到濃縮比重為1.4(50°C熱測)的濃縮漿120g。
[0045]6、醇沉、烘干:向120g濃縮漿的中加入400ml的95%酒精，用酒精計(jì)檢測混合液酒精度73% (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置2.5h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進(jìn)行烘干，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得灰樹花菌絲體多糖提取物38.5g。檢測水分含量為
3.3%，多糖含量為41%，多糖提取收率為5.52%。
【權(quán)利要求】
1.一種灰樹花菌絲體多糖的提取方法，其特征在于該方法包括下述步驟: 1)分離:將灰樹花發(fā)酵液經(jīng)分離，得到灰樹花上清液和濕菌絲體； 2)超聲處理:向步驟I)所得的濕菌絲體中加入步驟I)所得2-5倍質(zhì)量的灰樹花上清液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10-40min，得到超聲處理液； 3)復(fù)合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7，控制溫度30-70°C，然后向其加入相當(dāng)于干菌絲體重量0.2-3%的纖維素酶、和0.2-3%的蛋白酶，進(jìn)行酶解l-4h，得到酶解液； 4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫濃縮，得到濃縮比重為1.25~1.40的濃縮漿； 5)醇沉、烘干:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計(jì)檢測混合液酒精度為65-80% (v/v)，靜置2-6h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3~8%，SP得菌絲體多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰樹花菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的分離為離心分離，轉(zhuǎn)速為1500-5000rpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰樹花菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的纖維素酶的單位酶活為15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g~53000 μ/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的灰樹花菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰樹花菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的真空烘干的溫度50-75°C，真空度不低于0.085Mpa。
【文檔編號】C08B37/00GK104072632SQ201410337687
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】徐玲, 徐國華, 王文風(fēng), 王英燕, 楊亞威, 秦建麗, 張芙蓉 申請人:江蘇阜豐生物科技有限公司