本發(fā)明屬于新材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物及其制備方法。

背景技術(shù)：
酶是一類具有生物催化功能的生物大分子，是一種生物催化劑，其反應(yīng)速度快，選擇特異性強(qiáng)，能完成復(fù)雜的反應(yīng)過程，且反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，污染小。因此生物酶已經(jīng)在醫(yī)藥、工業(yè)、食品、飼料、環(huán)保、能源等多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，酶作為生物催化劑，它的生物活性常常在應(yīng)用過程中喪失，導(dǎo)致不可恢復(fù)性的酶失活，其穩(wěn)定性和重復(fù)利用率也很低。酶固定能克服一定的缺陷，但可能造成酶的構(gòu)象變化，從而在一定程度上導(dǎo)致酶活降低，且重復(fù)利用性很弱。很多酶的生產(chǎn)過程不易，價(jià)格昂貴，因此，增強(qiáng)酶活、提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率就顯得格外重要。氧化石墨烯（grapheneoxide，GO）是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯薄片是石墨粉末經(jīng)化學(xué)氧化后的產(chǎn)物，它的單原子層可以在橫向尺寸上擴(kuò)展，其結(jié)構(gòu)超越了一般化學(xué)和材料科學(xué)的尺度。因此，GO被視為一種非傳統(tǒng)型態(tài)材料，是一種性能極其優(yōu)越的新型碳材料，其比表面積較高且表面具有豐富的官能團(tuán)，比如羰基、羥基、羧基和酚羥基。GO因其在熱學(xué)、光學(xué)、機(jī)械力學(xué)等方面優(yōu)越的表現(xiàn)及其突出的納米結(jié)構(gòu)，21世紀(jì)以來(lái)吸引了眾多研究人員參與研究。其中，氧化石墨烯復(fù)合材料備受關(guān)注，包括聚合物類復(fù)合材料和無(wú)機(jī)物類復(fù)合材料等。改性的GO及其復(fù)合材料在能量?jī)?chǔ)存、傳感器、有機(jī)電化學(xué)、材料科學(xué)等眾多領(lǐng)域均具有深遠(yuǎn)意義。無(wú)機(jī)材料的納米花已經(jīng)在催化和分析科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，但是有機(jī)-無(wú)機(jī)材料的雜化納米花是2012年Ge等首次發(fā)現(xiàn)的，這種酶-無(wú)機(jī)雜化材料可提高酶活，提高酶穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。從目前的文獻(xiàn)報(bào)道可以將酶-無(wú)機(jī)雜化納米花的研究分為以下幾類：①機(jī)理的研究有機(jī)-無(wú)機(jī)材料的雜化納米花是2012年J.Ge（Protein-inorganichybridnanoflowers,Naturenanotechnology,2012,7,428-432）等首次發(fā)現(xiàn)的，研究表明大多數(shù)酶與磷酸銅晶體雜化后的復(fù)合物呈現(xiàn)出“花朵”狀的納米結(jié)構(gòu)，其復(fù)合物中酶的活性也都有不同程度的提高，并進(jìn)一步比較了不同酶與無(wú)機(jī)材料（磷酸銅晶體）雜化納米花的結(jié)構(gòu)及酶活的提高，解釋了在雜化復(fù)合材料中各個(gè)成分所起到的作用。最初磷酸銅晶體形成，蛋白質(zhì)骨架上的氨基和銅離子結(jié)合形成主要的成核位點(diǎn)，之后大量的蛋白質(zhì)分子和晶體在成核位點(diǎn)形成，最后，非均質(zhì)的生長(zhǎng)形成花一樣的結(jié)構(gòu)。此外，分析比較了不同酶形成的納米花。②實(shí)驗(yàn)條件的研究L.B.Wang等人(ANewNanobiocatalyticSystemBasedonAllostericEffectwithDramaticallyEnhancedPerformance,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2013,135,1272-1275)在J.Ge的基礎(chǔ)上詳細(xì)分析了各種條件對(duì)酶-無(wú)機(jī)材料納米花的影響，主要包括緩沖液的濃度、pH、酶的濃度、金屬離子的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)條件下得到不同的納米結(jié)構(gòu)：納米花、納米片、平行六面體，同時(shí)還證明了納米花中除了酶活增加以外，其穩(wěn)定性和重復(fù)利用率也大大提高。K.Ghosh(Temperature-dependentmorphologyofhybridnanoflowersfromelastin-likepolypeptides,APLMaterials,2014,2,021101)研究了溫度對(duì)納米花的影響，發(fā)現(xiàn)不同的溫度對(duì)納米花的結(jié)構(gòu)有很大影響。③多酶的研究J.Sun等人(Multi-enzymeco-embeddedorganic-inorganichybridnanoflowers:synthesisandapplicationasacolorimetricsensor,Nanoscale,2014,6,255-262)研究了多酶-無(wú)機(jī)材料雜化納米花，其實(shí)驗(yàn)中復(fù)合物由兩種不同的酶和無(wú)機(jī)成分復(fù)合得到。綜上所述，就酶-無(wú)機(jī)雜化納米材料而言，目前研究還處于探索階段，主要的研究是圍繞單一的酶-無(wú)機(jī)雜化納米花。氧化石墨烯作為新型的無(wú)機(jī)材料雖然具有很好的性能，在酶固定中也有研究，但將酶-無(wú)機(jī)雜化材料和氧化石墨烯結(jié)合起來(lái)的研究還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物及其制備方法，所述復(fù)合物在不破壞酶和氧化石墨烯結(jié)構(gòu)的情況下，酶活有所提高，穩(wěn)定性增強(qiáng)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物的制備方法，先將氧化石墨烯均勻分散于磷酸緩沖液中，然后加入酶混勻得混合液，再將銅鹽水溶液加入混合液中，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)后即得所述酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物；所述的銅鹽為硫酸銅、醋酸銅或氯化銅。復(fù)合物中各物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為：氧化石墨烯25-30%，酶35-45%，磷酸銅晶體25-35%。其中，投料質(zhì)量比為：氧化石墨烯：酶：銅鹽為8-12:10-20:10-20。優(yōu)選的，所述銅鹽為硫酸銅，氧化石墨烯：酶：銅鹽為10:15:12.8。銅鹽溶液的濃度無(wú)嚴(yán)格要求。所述磷酸緩沖液的濃度為0.1-0.5mol/L，pH控制在5.5-7.5。在恒溫?fù)u床中反應(yīng)的條件為：溫度20-40℃，搖床轉(zhuǎn)速為100-160rpm，反應(yīng)2-3天；優(yōu)選的，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)的條件為：溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，反應(yīng)2天。反應(yīng)后分離沉淀、洗滌并冷凍干燥。優(yōu)選的，在不高于-30℃的條件下干燥4-8個(gè)小時(shí)。本發(fā)明中磷酸緩沖液的pH根據(jù)具體的酶而定，先將氧化石墨烯均勻分散于磷酸緩沖液中，超聲分散均勻后加入酶，搖勻，再加入銅鹽溶液，放入搖床中反應(yīng)，之后靜置12h，離心分離，冷凍干燥。冷凍干燥具體可在真空冷凍干燥儀中進(jìn)行。其中，所述復(fù)合物是在磷酸緩沖液中加入硫酸銅、氯化銅或醋酸銅溶液，生成磷酸銅晶體，進(jìn)而和酶、氧化石墨烯發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)而得到。本發(fā)明將酶、氧化石墨烯在二價(jià)銅離子存在的條件下生成一種新型有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米復(fù)合物，所述復(fù)合物結(jié)構(gòu)規(guī)則，實(shí)現(xiàn)了酶活性的提高，酶穩(wěn)定性的增強(qiáng)，同時(shí)還具有抗菌性能、吸附性能。其中的氧化石墨烯，一方面作為酶的結(jié)合物，另一方面為酶提供載體，可將氧化石墨烯的優(yōu)良性質(zhì)廣泛應(yīng)用于工業(yè)中。制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和。作為一種具有新型功能結(jié)構(gòu)的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米復(fù)合物，將生物研究和材料科學(xué)結(jié)合在一起，可望在有關(guān)酶工程應(yīng)用的食品加工、發(fā)酵工程、醫(yī)藥科學(xué)、造紙業(yè)、污水處理、生物反應(yīng)器等多方面得到廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物能提高酶活和酶的穩(wěn)定性；同時(shí)制備方法柔和環(huán)保，采用搖床反應(yīng)的動(dòng)態(tài)反應(yīng)方法，相對(duì)于現(xiàn)有有機(jī)-無(wú)機(jī)材料的雜化納米花制備多采用的靜態(tài)反應(yīng)法而言，可以得到規(guī)則的產(chǎn)品，有異于靜態(tài)法得到的顆粒狀產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)過程中沒有涉及任何高溫和有機(jī)試劑等，且設(shè)備非常簡(jiǎn)單，作為一種新型的有機(jī)-無(wú)機(jī)材料，其可望在酶固定、電化學(xué)、材料學(xué)、生物學(xué)等多領(lǐng)域有較大潛力。附圖說明圖1為實(shí)施例1獲得的溶菌酶/氧化石墨烯復(fù)合物的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例2獲得的漆酶/氧化石墨烯復(fù)合物的掃描電鏡圖；圖3為實(shí)施例3獲得的碳酸酐酶/氧化石墨烯復(fù)合物的掃描電鏡圖。具體實(shí)施方式以下以具體實(shí)施例來(lái)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此：實(shí)施例1酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物，質(zhì)量組成為：氧化石墨烯（GO）27%；溶菌酶41%；磷酸銅晶體32%。溶菌酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物的掃描電鏡圖如圖1所示，由圖可知，所述復(fù)合物具有非常規(guī)則的結(jié)構(gòu)。（1）復(fù)合物的制備：將10mg氧化石墨烯通過超聲充分溶解在pH6.0的磷酸緩沖液(0.2mol/L)中，加入15mg溶菌酶混勻，再加入0.667mL120mM的硫酸銅溶液，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)，條件為：溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，反應(yīng)48h。之后分離沉淀、洗滌并于真空冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍溫度設(shè)置在-30℃以下，干燥6小時(shí)。（2）復(fù)合物抑菌性能研究實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌ATCC25922作為試劑檢驗(yàn)復(fù)合物的抑菌性能。稱取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，加入1000ml蒸餾水，充分溶解，調(diào)pH至7.2-7.4，121℃滅菌20min，得到液體培養(yǎng)基。用移液槍取20ml液體培養(yǎng)基于錐形瓶中，挑取1-2環(huán)活化的菌種于液體培養(yǎng)基中，將錐形瓶放入37℃、160r/min的搖床中培養(yǎng)24h，制備出106數(shù)量級(jí)的大腸桿菌菌液備用。配置一定濃度的藥物貯存液，所有藥物為粉劑，其有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取藥物0.6826mg。將0.6826mg藥物溶于1mLLB稀釋液中，此稀釋液的藥物濃度為5120μg/mL。取無(wú)菌試管5支排成一排并依次編號(hào)，第1管中加入1.8mLLB，其余加入1mLLB。取藥物稀釋液0.2mL加入第1管，從第1管中吸取1mL加入第2管，依此操作至第5管，將第5管吸取1mL棄去。此時(shí)各管的藥物濃度依此是：512、256、128、64、32μg/mL。再向各管中加入106數(shù)量級(jí)的大腸桿菌菌液1mL。對(duì)照管設(shè)置兩個(gè)：只含2mL菌液；只含2mLLB。將各管置于37℃、250rpm的搖床中培養(yǎng)2h。培養(yǎng)后取出試管搖勻，吸取0.5mL菌液于4.5mL的無(wú)菌水中稀釋，該試管中菌濃度為培養(yǎng)后濃度的10-1，并按此稀釋，得到為稀釋濃度依次是10-2,10-3,10-4。取10-4濃度的稀釋液0.1mL于平板上，涂布均勻（此步驟做兩個(gè)平行）。將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h后觀察結(jié)果，采集圖像并菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率（BR）。抑菌率達(dá)到90%的最小濃度即是藥物的最小抑菌濃度。從上述實(shí)驗(yàn)中得知，溶菌酶的最小抑菌濃度為1250μg/mL，氧化石墨烯的最小抑菌濃度為1024μg/mL，磷酸銅晶體的最小抑菌濃度為256μg/mL（此濃度下的抑菌率為95%），而復(fù)合物最小抑菌濃度為256μg/mL（此濃度下的抑菌率為98%）?？梢娤嗤|(zhì)量下同時(shí)含有氧化石墨烯、磷酸銅和溶菌酶的復(fù)合物其中溶菌酶的活性有所提高，總體復(fù)合物的抑菌性也增強(qiáng)。（3）貯藏穩(wěn)定性研究將0.03mg/mL的溶菌酶溶液和復(fù)合物溶液分別放置一周后，測(cè)其抑菌性，復(fù)合物抑菌性保留81%，游離溶菌酶抑菌性則僅保留43%?？梢?，溶菌酶/氧化石墨烯雜化納米復(fù)合物中酶的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。實(shí)施例2酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物，質(zhì)量組成為：GO27%；漆酶41%；磷酸銅晶體32%。漆酶/氧化石墨烯復(fù)合物掃描電鏡圖如圖2所示。（1）復(fù)合物的制備將10mg氧化石墨烯通過超聲充分溶解在pH5.7的磷酸緩沖液(0.2mol/L)中，加入15mg漆酶混勻，再加入0.667mL120mM的硫酸銅溶液，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)，條件為：溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，反應(yīng)48h。之后分離沉淀、洗滌并于真空冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍溫度設(shè)置在-30℃以下，干燥4小時(shí)。（2）復(fù)合物對(duì)染料的去除配置一定濃度的染料溶液，將一定量的復(fù)合物加入染料溶液中反應(yīng)一段時(shí)間，離心取上清液測(cè)吸光度，計(jì)算出復(fù)合物對(duì)染料的去除率。0.0732mg/mL的復(fù)合物在100min后對(duì)200mg/L的亞甲基藍(lán)的去除率為65.17%，0.03mg/mL游離漆酶在100min后對(duì)亞甲基藍(lán)的去除率幾乎為0。0.0732mg/mL的復(fù)合物在10min后對(duì)200mg/L的茜素紅的去除率為88.62%，0.03mg/mL游離漆酶在10min后對(duì)茜素紅的去除率為14.36%。（3）貯藏穩(wěn)定性研究將0.03mg/mL的漆酶溶液和復(fù)合物溶液分別放置一周后，測(cè)其活性。相對(duì)于游離的漆酶，復(fù)合物則保持了較高的酶活，可達(dá)60%，而游離漆酶僅為保留37%的酶活。實(shí)施例3酶/氧化石墨烯功能型雜化納米復(fù)合物，質(zhì)量組成為：GO27%；碳酸酐酶41%；磷酸銅晶體32%。碳酸酐酶/氧化石墨烯復(fù)合物掃描電鏡圖如圖3所示。（1）復(fù)合物的制備：將氧化石墨烯通過超聲充分溶解在pH7.0的磷酸緩沖液(0.2mol/L)中，加入15mg碳酸酐酶混勻，再加入0.667mL120mM的硫酸銅溶液，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)，條件為：溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，反應(yīng)48h。之后分離沉淀、洗滌并于真空冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍溫度設(shè)置在-30℃以下，干燥6小時(shí)。（2）復(fù)合物對(duì)二氧化碳的固定將復(fù)合物（3mg）溶解在30mL1M氯化鈣溶液中，在冰水浴條件下，持續(xù)通入二氧化碳?xì)怏w30min。離心冷凍干燥后，在復(fù)合物的表面可看到生成的碳酸鈣顆粒。實(shí)施例4將硫酸銅替換為氯化銅，加入的質(zhì)量為13.6mg，其他同實(shí)施例1。實(shí)施例5將硫酸銅替換為醋酸銅，加入的質(zhì)量為16mg，其他同實(shí)施例1。