熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球及其制備方法和應(yīng)用、膠乳結(jié)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球及其制備方法和應(yīng)用、膠乳結(jié)合物及其制備方法和應(yīng)用。該方法步驟包括：在水中將反應(yīng)單體、穩(wěn)定劑和乳化劑在保護(hù)氣體下與引發(fā)劑混合在加熱條件下反應(yīng)得膠乳，所述反應(yīng)單體包括熒光單體、芳香烯基化合物和功能基團(tuán)連接烯烴，所述功能基團(tuán)選自羧基、氨基或酰胺基中的一種或者多種。制得的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球?yàn)榧{米級(jí)的，且粒徑均一、大小可控，制得的物質(zhì)熒光性質(zhì)穩(wěn)定、分散變異系數(shù)小，在免疫檢測(cè)方面能得到很好的應(yīng)用，體現(xiàn)了更好的特異性和準(zhǔn)確性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球及其制備方法和應(yīng)用、膠乳結(jié)合 物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及熒光免疫技術(shù)，具體涉及一種熒光基團(tuán)的聚 苯乙烯微球及其制備方法和應(yīng)用、膠乳結(jié)合物及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種，始創(chuàng)于20世紀(jì)40年代初，由 Coons等首次用異氰酸熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗 原。至20世紀(jì)50年代末期，開(kāi)創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)。近年來(lái)由于免疫學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，在 臨床檢驗(yàn)工作免疫熒光技術(shù)已逐漸突出，如自身抗體的檢測(cè)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞的功能探索等 皆獲得了廣泛的應(yīng)用。由于將抗原、抗體的反應(yīng)特異性與熒光的敏感性結(jié)合起來(lái)，因此廣泛 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。免疫層析技術(shù)是建立在層析技 術(shù)和抗原-抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的一項(xiàng)新興免疫檢測(cè)技術(shù)。以固定有檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)的 條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，經(jīng)毛細(xì)作用使待測(cè)物在層析條上移動(dòng)。檢測(cè) 物在T線(xiàn)處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，游離物在C線(xiàn)處發(fā)生免疫反應(yīng)。當(dāng)前新型標(biāo)記材料發(fā)展迅 速，包括鑭系元素、有機(jī)納米粒子、納米磁性顆粒、熒光乳膠、熒光微球、量子點(diǎn)、磁珠等。因 此，根據(jù)膜上包被的免疫層析標(biāo)記物不同，可分為上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)、基于時(shí)間分辨突光免疫 分析的層析技術(shù)、熒光乳膠層析技術(shù)、熒光微球免疫層析技術(shù)、量子點(diǎn)層析技術(shù)、磁珠免疫 層析技術(shù)等新型免疫層析技術(shù)。
[0003] 其中，突光微球作為標(biāo)記材料在突光免疫技術(shù)中具有良好的應(yīng)用前景。突光微球 是指直徑在納米級(jí)至微米級(jí)范圍內(nèi)，通過(guò)物理和化學(xué)等方法負(fù)載熒光物質(zhì)，在激發(fā)光刺激 下發(fā)出熒光的固體微粒，其外形可為任意形狀，典型外形為球形。熒光微球的制備方法主要 有四種：
[0004] (1)吸附法，此種方法多用于有機(jī)/有機(jī)突光微球的制備。有機(jī)突光材料一般為非 水溶性的物質(zhì)，將其溶解在丙酮、酒精等水溶性的有機(jī)溶劑中，再將其與載體的水分散體系 混合，熒光材料即會(huì)析出并被吸附到載體上。
[0005] (2)包覆法，通過(guò)此種方法，可以制備無(wú)機(jī)/有機(jī)熒光微球及有機(jī)/有機(jī)熒光微球， 其基本原理是將熒光材料均勻分散在介質(zhì)中，利用聚合反應(yīng)、微膠囊化方法或分子自組裝 方法制備出突光微球，制備出的突光微球幾乎都具有明顯的核/殼結(jié)構(gòu)。
[0006] (3)球外懸掛法，將帶有活性基團(tuán)的熒光材料顆粒與表面帶有功能基團(tuán)的聚合物 微球結(jié)合，可以獲得在聚合物微球表面懸掛有突光小球的"大"突光微球。
[0007] (4)共聚法，此法是特指帶有可聚合官能團(tuán)的熒光物質(zhì)與可聚合官能團(tuán)的有機(jī)單 體進(jìn)行聚合所制備的均一結(jié)構(gòu)的熒光微球。
[0008] 現(xiàn)有公開(kāi)采用共聚法制備熒光微球，但現(xiàn)有方法制備的熒光微球粒徑不均一、熒 光性質(zhì)不穩(wěn)定、分散變異系數(shù)大，不利于檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)較普遍的如專(zhuān)利CN103570879 中公開(kāi)的方法體系中一般含有丙酮或者甲醇等有機(jī)物，同時(shí)部分引發(fā)劑使用含氰化合物， 對(duì)人體和環(huán)境造成危害，不利于大規(guī)模應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為克服現(xiàn)有制備方法制備的熒光微球粒徑不均一、熒光性質(zhì)不穩(wěn)定、分散 變異系數(shù)大且對(duì)人體和環(huán)境造成危害的技術(shù)問(wèn)題，提供一種粒徑均一、大小可控的納米級(jí) 微球及熒光性質(zhì)穩(wěn)定、分散變異系數(shù)小的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球及其制備方法和應(yīng)用、 膠乳結(jié)合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，該方法步 驟包括：在水中將反應(yīng)單體、穩(wěn)定劑和乳化劑在保護(hù)氣體下與引發(fā)劑混合在加熱條件下反 應(yīng)得膠乳，所述反應(yīng)單體包括熒光單體、芳香烯基化合物和功能基團(tuán)連接烯烴，所述功能基 團(tuán)選自羧基、氨基或酰胺基中的一種或者多種。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球，該熒光基團(tuán)的聚苯乙 烯微球的表面含有功能基團(tuán)，所述功能基團(tuán)選自羧基、氨基或酰胺基中的一種或者多種。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種膠乳結(jié)合物的制備方法，該方法步驟包括，將膠 乳經(jīng)交聯(lián)劑活化后與抗體或抗原反應(yīng)得膠乳結(jié)合物，所述膠乳為上述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯 微球的制備方法所制備的或上述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球。
[0013] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種膠乳結(jié)合物，該膠乳結(jié)合物為上述膠乳結(jié)合物的 制備方法制得。
[0014] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法所制備的 熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球，或上述膠乳結(jié)合物的制備方法所制得的膠乳結(jié)合物在免疫檢測(cè) 中的應(yīng)用。
[0015] 本申請(qǐng)的發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明通過(guò)在水中懸浮乳化及熱引發(fā)的方式聚合制得 的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球?yàn)榧{米級(jí)的，且粒徑均一、大小可控，制得的物質(zhì)熒光性質(zhì)穩(wěn) 定、分散變異系數(shù)小，在免疫檢測(cè)方面能得到很好的應(yīng)用，體現(xiàn)了更好的特異性和準(zhǔn)確性。 特別是表面含有酰胺基的熒光微球，在抗原抗體檢測(cè)過(guò)程中，不會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。同 時(shí)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)體系為水系，實(shí)驗(yàn)過(guò)程安全無(wú)毒，制備出來(lái)的試劑不需要 特殊處理，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成影響，對(duì)免疫診斷技術(shù)的市場(chǎng)應(yīng)用具有很好的促進(jìn)作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1的樣品熒光值圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明提供了一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，該方法步驟包括：在水 中將反應(yīng)單體、穩(wěn)定劑和乳化劑在保護(hù)氣體下與引發(fā)劑混合在加熱條件下反應(yīng)得膠乳，所 述反應(yīng)單體包括熒光單體、芳香烯基化合物和功能基團(tuán)連接烯烴，所述功能基團(tuán)選自羧基、 氨基或酰胺基中的一種或者多種。制得的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球?yàn)榧{米級(jí)的，且粒徑均 一、大小可控，制得的物質(zhì)熒光性質(zhì)穩(wěn)定、分散變異系數(shù)小，在免疫檢測(cè)方面能得到很好的 應(yīng)用，體現(xiàn)了更好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0019] 其中，本發(fā)明將反應(yīng)單體、穩(wěn)定劑和乳化劑與引發(fā)劑混合，加熱引發(fā)聚合反應(yīng)。本 發(fā)明是采用懸浮乳化法，在含有穩(wěn)定劑和乳化劑的水中加熱引發(fā)單體發(fā)生聚合反應(yīng)，制得 的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球粒徑均一、大小可控。
[0020] 其中，保護(hù)氣體本發(fā)明沒(méi)有限制，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種保護(hù)氣體，例 如氮?dú)獾榷栊詺怏w。
[0021] 其中，反應(yīng)單體包括熒光單體、芳香烯基化合物和功能基團(tuán)連接烯烴，其在熱引發(fā) 條件下發(fā)生共聚。
[0022] 其中，熒光單體本發(fā)明沒(méi)有限制，可以為本領(lǐng)域公知的各種可以發(fā)生聚合的熒光 單體，優(yōu)選為連接有烯烴結(jié)合物的熒光性單體物質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選為烯丙基熒光染料，更進(jìn)一 步優(yōu)選為丙烯-〇-熒光素和/或熒光素-二甲基丙烯酸。優(yōu)選，在水中所述熒光單體 的濃度為〇· 〇2wt %?2wt %。
[0023] 其中，芳香烯基化合物本發(fā)明沒(méi)有限制，可以為本領(lǐng)域公知的各種可以發(fā)生聚合 的芳香烯基化合物，例如可以為苯乙烯、苯丙烯、苯基丁烯等，也可以為苯環(huán)上或者烴基上 含有取代基的芳香烯基化合物，包括但不限于甲基苯乙烯、溴苯丙烯、α -苯丁烯-Y -酮 等。本發(fā)明優(yōu)選，芳香烯基化合物選自苯乙烯、苯丙烯、苯基丁烯、甲基苯乙烯、溴苯丙烯或 α_苯丁烯-Υ-酮中的一種或多種。優(yōu)選，在水中所述芳香烯基化合物的濃度為3wt%? 10wt %。
[0024] 功能基團(tuán)連接烯烴是指含有功能基團(tuán)的烯烴物質(zhì)。例如丙烯酰胺、丁烯酰胺、丙烯 酸、丙烯酸甲酯等以及含有取代基的丙烯酰胺、丁烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸甲酯等，包括但不 限于甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丁烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯等，本發(fā)明優(yōu)選，功能基團(tuán)連接烯 烴選自丙烯酰胺、丁烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丁烯酰胺或甲基 丙烯酸甲酯中的一種或多種。優(yōu)選，在水中，功能基團(tuán)連接烯經(jīng)的濃度為〇. lwt%?6wt%。
[0025] 其中，穩(wěn)定劑本發(fā)明沒(méi)有限制，可以為本領(lǐng)域公知的各種穩(wěn)定劑，本發(fā)明優(yōu)選穩(wěn)定 劑為高分子聚合物，能夠使膠乳在水中形成更均勻的分布，使得顆粒大小均一，并且不易發(fā) 生凝集。進(jìn)一步優(yōu)選，高分子聚合物的分子量為1000-20000,優(yōu)選高分子聚合物為聚乙二醇 (PEG)和/或聚乙烯砒咯烷酮（PVP)，具體可以為PEG20000、PEG6000或PVP3000。優(yōu)選，在 水中，高分子聚合物的濃度為lwt%?3wt%，進(jìn)一步保證膠乳體系的穩(wěn)定不紊亂。
[0026] 其中，乳化劑本發(fā)明沒(méi)有限制，可以為本領(lǐng)域公知的各種乳化劑，本發(fā)明優(yōu)選乳化 劑選自陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑或非離子表面活性劑中的一種或多種。優(yōu) 選，單獨(dú)乳化劑或者混合乳化劑的HLB值（表面活性劑的親水親油平衡值）大于8.0。其 中，優(yōu)選，當(dāng)使用陰離子表面活性劑時(shí)，水中陰離子表面活性劑的添加濃度為〇. 〇2wt%? 0. lwt% ;當(dāng)使用陽(yáng)離子表面活性劑時(shí)，水中陽(yáng)離子表面活性劑的添加濃度為0.5wt%? 2wt % ;當(dāng)使用非離子表面活性劑時(shí)，水中非離子表面活性劑的添加濃度為0. lwt %? 0. 5wt%，進(jìn)一步優(yōu)化膠乳顆粒的粒徑。
[0027] 引發(fā)劑本發(fā)明為熱引發(fā)劑，可以為各種在加熱狀態(tài)下能提供游離活性基團(tuán)的氧化 性物質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選引發(fā)劑選自過(guò)硫酸銨、過(guò)硫酸鉀或過(guò)碘酸鈉中的一種或多種。優(yōu)選，弓丨 發(fā)劑的添加濃度為〇. 〇2wt %?lwt %，具體可以為0. 2wt %。可以采用將引發(fā)劑加入含有反 應(yīng)單體的水中引發(fā)反應(yīng)，引發(fā)劑可以分時(shí)間段加入，也可以一次性加入。
[0028] 其中，優(yōu)選加熱的溫度為60?98°C，加熱的方式本發(fā)明沒(méi)有限制，例如可以為水 浴加熱。
[0029] 本發(fā)明采用在水中懸浮乳化的方法制備微球，一般反應(yīng)時(shí)同時(shí)伴有攪拌，攪拌本 發(fā)明沒(méi)有限制，可以為常規(guī)攪拌。
[0030] 優(yōu)選，步驟還包括對(duì)膠乳進(jìn)行純化，除去產(chǎn)物中殘留的反應(yīng)單體、引發(fā)劑、以及表 面活性劑，避免這些物質(zhì)對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響。優(yōu)選，純化為透析純化，純化方式溫和，能 最大程度的保持膠乳的顆粒性狀，避免膠乳顆粒之間的自體凝集。其中，透析純化包括將膠 乳封裝于透析袋中，后于水中透析。優(yōu)選，透析袋在水相中的使用截留量為3000?8000,水 的pH值為6. 5?7. 0,電阻率大于18. 2M Ω · cm，溫度為25°C，總有機(jī)碳彡5ppb。
[0031] 本發(fā)明同時(shí)提供了一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球，該熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的 表面含有功能基團(tuán)，所述功能基團(tuán)選自羧基、氨基或酰胺基中的一種或者多種，可以與待交 聯(lián)物質(zhì)上的羧基、氨基、羥基等基團(tuán)通過(guò)交聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明制備的膠乳微球主要應(yīng)用 于層析方法上抗原抗體反應(yīng)的熒光信號(hào)檢測(cè)，具有良好的穩(wěn)定性以及顆粒均一性。
[0032] 本發(fā)明同時(shí)提供了一種膠乳結(jié)合物的制備方法，該方法步驟包括，將膠乳經(jīng)交聯(lián) 劑活化后與抗體或抗原反應(yīng)得膠乳結(jié)合物，所述膠乳為上述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制 備方法所制備的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球。
[0033] 優(yōu)選，步驟還包括在交聯(lián)后加入膠乳封閉穩(wěn)定劑反應(yīng)，將未反應(yīng)完的功能活性基 團(tuán)封閉。膠乳封閉穩(wěn)定劑本發(fā)明沒(méi)有限制，例如可以為匯松科技有限公司生產(chǎn)的膠乳封閉 穩(wěn)定劑。
[0034] 優(yōu)選，步驟還包括在交聯(lián)前對(duì)熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球進(jìn)行稀釋至0D450 = 2. 0、 pH = 7. 0。優(yōu)選，稀釋所用溶液為pH = 7. 0的2-嗎啉乙磺酸（MES)緩沖液。
[0035] 優(yōu)選，交聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰 胺。優(yōu)選，在所述交聯(lián)的反應(yīng)體系中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的濃 度為0· OOSwt1%?lwt%，進(jìn)一步優(yōu)選為0· OOSwt1%?0· lwt%，具體可以為0· 05wt%, N輕 基琥拍酰胺的濃度為0. 005wt%?lwt%，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 005wt%?0. lwt%，具體可以為 0. lwt%，進(jìn)一步保證交聯(lián)條件溫和，不破壞抗原抗體性質(zhì)，同時(shí)較低的交聯(lián)濃度能保證膠 乳顆粒性質(zhì)的穩(wěn)定性，減少顆粒的自體交聯(lián)以及保持抗原抗體的活性穩(wěn)定。
[0036] -般，交聯(lián)反應(yīng)需加熱，加熱可以采用水浴加熱，反應(yīng)完后可以分離出沉淀，分離 的方法可以為離心等，沉淀可以用膠乳結(jié)合物保存液重懸。
[0037] 本發(fā)明同時(shí)還提供了上述膠乳結(jié)合物的制備方法制得的膠乳結(jié)合物。
[0038] 本發(fā)明同時(shí)還提供了上述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法所制備的聚苯乙 烯微球及上述膠乳結(jié)合物的制備方法所制得的膠乳結(jié)合物在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。具體可以 為在層析方法上抗原抗體反應(yīng)的熒光信號(hào)檢測(cè)。具體可以為將上述制得的膠乳結(jié)合物和檢 測(cè)樣本，滴加到硝酸纖維素膜的試劑卡，通過(guò)熒光免疫檢測(cè)儀得到結(jié)果，其中，熒光免疫檢 測(cè)儀可以為匯松科技有限公司的熒光免疫檢測(cè)儀。
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳述。
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 本實(shí)施例結(jié)合PCT(降鈣素原）特定蛋白檢測(cè)為例進(jìn)行說(shuō)明。
[0042] 以下原料成分百分比均為重量百分含量
[0043] 反應(yīng)單體：0. 3%丁二烯，3%苯乙烯，2%丙烯酸，1 %丙烯-0-熒光素
[0044] 非離子表面活性劑：0· 05%吐溫20
[0045] 穩(wěn)定劑：3% PVP3000
[0046] 引發(fā)劑：0· 2 %過(guò)硫酸鉀
[0047] 透析袋截留量：6000
[0048] 交聯(lián)劑：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽0.05% (阿拉丁試劑）
[0049] N羥基琥珀酰胺0· 05% (阿拉丁試劑）
[0050] 交聯(lián)抗體：鼠抗人PCT單克隆抗體lmg/ml (匯松科技有限公司）
[0051] 硝酸纖維素膜包被抗體：鼠抗人PCT單克隆抗體lmg/ml (匯松科技有限公司）
[0052] 檢測(cè)樣本：PCT 10例陽(yáng)性樣本、PCT 10例陰性樣本
[0053] 膠乳封閉穩(wěn)定劑：（匯松科技有限公司）
[0054] 膠乳結(jié)合物保存液：（匯松科技有限公司）
[0055] 膠乳反應(yīng)液：（匯松科技有限公司）
[0056] 熒光免疫檢測(cè)儀：（匯松科技有限公司）
[0057] 78-1磁力加熱攪拌器：上海予正儀器設(shè)備有限公司
[0058] 水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司
[0059] 離心機(jī)：eppendorf
[0060] 具體步驟如下：
[0061] (1)在如上帶有攪拌裝置的反應(yīng)容器中加入純凈水，并加熱到80°C。
[0062] (2)加入如上反應(yīng)單體、穩(wěn)定劑和非離子表面活性劑，加熱攪拌20分鐘后通入氮 氣并繼續(xù)加熱攪拌30分鐘。
[0063] (3)加入如上引發(fā)劑。
[0064] (4)80°C反應(yīng)12小時(shí)，可以觀察到乳白色膠乳的形成。
[0065] (5)制備完成的膠乳攪拌冷卻至室溫，采用透析純化的方法在純凈水中透析三次， 每次不小于3小時(shí)。
[0066] (6)去透析后的膠乳用pH = 7. 0的MES緩沖液稀釋至0D450等于2. 0,終溶液pH 為 7. 0。
[0067] (7)取稀釋后的膠乳10毫升，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸 鹽和N羥基琥珀酰胺，37°C水浴2小時(shí)。
[0068] (8)加入PCT單克隆抗體10mg，37°C水浴4小時(shí)。
[0069] (9)加入膠乳封閉穩(wěn)定劑1000微升，37°C水浴1小時(shí)。
[0070] (10) lOOOOg 離心 1 小時(shí)。
[0071] (11)去上清，沉淀用10毫升膠乳結(jié)合物保存液重懸。
[0072] (12)在離心管中加80微升膠乳結(jié)合物和8微升檢測(cè)樣本，取60ul加到PCT抗體 硝酸纖維素膜的試劑卡，通過(guò)熒光免疫檢測(cè)儀，l〇min后出結(jié)果。
[0073] 結(jié)果判斷：以標(biāo)準(zhǔn)品中陰陽(yáng)分介值中判斷，當(dāng)T/C大于該標(biāo)準(zhǔn)品的T/C時(shí)，為陽(yáng)性 標(biāo)本，小于該標(biāo)準(zhǔn)品的τ/c時(shí)，為陰性標(biāo)本。10例陽(yáng)性標(biāo)本和10例陰性標(biāo)本都全部檢出。 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和圖1。
[0074] 表 1
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，其特征在于，步驟包括：在水中將反應(yīng) 單體、穩(wěn)定劑和乳化劑在保護(hù)氣體下與引發(fā)劑混合在加熱條件下反應(yīng)得膠乳，所述反應(yīng)單 體包括熒光單體、芳香烯基化合物和功能基團(tuán)連接烯烴，所述功能基團(tuán)選自羧基、氨基或酰 胺基中的一種或者多種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，其特征在于，所述 步驟還包括對(duì)膠乳進(jìn)行純化，所述純化為透析純化，所述透析純化包括將膠乳封裝于透析 袋中，后于水中透析，所述透析袋在水相中的使用截留量為3000~8000,所述水的pH值為 6. 5?7. 0,電阻率大于18. 2ΜΩ · cm，溫度為25°C，總有機(jī)碳彡5ppb。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，其特征在于，所述穩(wěn) 定劑為高分子聚合物，所述高分子聚合物的分子量為1000-20000,所述高分子聚合物為聚 乙二醇和/或聚乙烯砒咯烷酮； 所述乳化劑選自陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑或非離子表面活性劑中的一種 或多種； 所述引發(fā)劑選自過(guò)硫酸銨、過(guò)硫酸鉀或過(guò)碘酸鈉中的一種或多種； 所述熒光單體選自丙烯-〇-熒光素和/或熒光素-二甲基丙烯酸； 所述芳香烯基化合物選自苯乙烯、苯丙烯、苯基丁烯、甲基苯乙烯、溴苯丙烯或α-苯 丁烯-Υ-酮中的一種或多種； 所述功能基團(tuán)連接烯烴選自丙烯酰胺、丁烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酰胺、 Ν-叔丁基丁烯酰胺或甲基丙烯酸甲酯中的一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，其特征在于，在水中， 所述熒光單體的濃度為〇.〇2wt%~2 wt %，所述芳香烯基化合物的濃度為3 wt 9Γ10 wt %， 所述功能基團(tuán)連接烯經(jīng)的濃度為〇. 1 wt %~6 wt %，所述高分子聚合物的濃度為1 wt %~3 wt %，所述陰離子表面活性劑的濃度為0. 02 wt °/Γ〇. 1 wt %，所述陽(yáng)離子表面活性劑的濃度 為0. 5 wt 9Γ2 wt %，所述非離子表面活性劑的濃度為0. lwt9T〇. 5wt% ;所述引發(fā)劑的濃度 為 0·02wt %?lwt %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法，其特征在于，所述加 熱的溫度為6(T98°C。
6. -種熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球，其特征在于，所述熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的表面 含有功能基團(tuán)，所述功能基團(tuán)選自羧基、氨基或酰胺基中的一種或者多種。
7. -種膠乳結(jié)合物的制備方法，其特征在于，步驟包括，將膠乳經(jīng)交聯(lián)劑活化后與抗體 或抗原反應(yīng)得膠乳結(jié)合物，所述膠乳為權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的 制備方法所制備的或權(quán)利要求6所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠乳結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述步驟還包括交聯(lián) 后加入膠乳封閉穩(wěn)定劑反應(yīng)；所述步驟還包括交聯(lián)前對(duì)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述熒光基 團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法所制備的或權(quán)利要求6所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球進(jìn) 行稀釋至0D450 =2. 0、pH=7. 0 ;所述稀釋所用溶液為pH=7. 0的2-嗎啉乙磺酸緩沖液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠乳結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰胺，在所述交聯(lián)的反應(yīng)體系中 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為0. 005wt9T〇. lwt%，N羥基琥珀酰 胺的濃度為〇· 〇〇5wt%?0· lwt%。
10. -種膠乳結(jié)合物，其特征在于，所述膠乳結(jié)合物為權(quán)利要求7-9任意一項(xiàng)所述膠乳 結(jié)合物的制備方法制得。
11. 一種如權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)突光基團(tuán)的聚苯乙烯微球的制備方法所制備的或權(quán) 利要求6所述的熒光基團(tuán)的聚苯乙烯微球，或權(quán)利要求7-9任意一項(xiàng)所述膠乳結(jié)合物的制 備方法所制得的膠乳結(jié)合物在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08F220/54GK104193873SQ201410419735
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】陳海彬, 唐金春, 楊永崧, 高燕靜 申請(qǐng)人:深圳市匯松科技發(fā)展有限公司