一種長時間細胞膜成像試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于：由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素和疏水單元的乙二醇殼聚糖(glycol chitosan)高分子；所述組分B為接枝有異硫氰酸熒光素FITC的親和素分子。本發(fā)明提供的細胞膜成像試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長時間保持在細胞膜上而不被內(nèi)吞，可作為新一類細胞膜成像試劑。
【專利說明】一種長時間細胞膜成像試劑及其制備方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領域】，特別涉及了一種長時間細胞膜熒光成像試劑，還涉及該試劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]細胞膜不僅在結(jié)構(gòu)上作為細胞的邊界，為細胞提供一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時對細胞與外界環(huán)境之間的物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞過程也起著至關(guān)重要的作用。細胞膜成像技術(shù)作為一種有力的研究手段，利用熒光染料對細胞膜進行標記和示蹤，揭示了包括胞飲、胞吐、細胞分裂及凋亡在內(nèi)的許多重要的生物學過程。
[0003]然而，傳統(tǒng)的一些親脂性染料很快會發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象，成像時間短，給研究帶來很大的局限。如目前市售的熒光染料Dil、D1及DiD等，有效成像時間只有10分鐘左右，染料會逐漸進入細胞質(zhì)并將整個細胞染色，從而失去了研究細胞膜的效果。為了延長有效染色時間，減少染料內(nèi)吞，已有公司研制出新型染料分子，如CellMask? Orang、DeepRed系列，主要利用帶有負電荷的親脂性基團起錨定作用延長細胞膜染色時間，但染色時間也只局限在30分鐘至90分鐘。為了更好地對細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，開發(fā)一種長時間細胞膜成像試劑就顯得尤為重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種成像時間長的細胞膜成像試劑。
[0005]技術(shù)方案:一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素(b1tin)和疏水單元的乙二醇殼聚糖(glycol chitosan);所述組分B為接枝有熒光分子的親和素(avidin)分子。組分A選用乙二醇殼聚糖作為連接生物素和疏水單元的骨架是由于它在任何PH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特點。組分A中的疏水單元可通過疏水相互作用以多位點的方式插入到細胞膜上的磷脂雙分子層的疏水尾部區(qū)域，從而將殼聚糖高分子和生物素分子錨定到細胞膜上。組分B中的親和素通過與生物素特異性結(jié)合，將熒光分子引入到高分子側(cè)鏈，進而實現(xiàn)長時間細胞膜成像。作為優(yōu)選，所述生物素占乙二醇殼聚糖的重復單元數(shù)的5-30% ;所述疏水單元占乙二醇殼聚糖的重復單元數(shù)的5-30%。
[0006]作為另一種優(yōu)選，所述乙二醇殼聚糖的分子量在10000以上，優(yōu)選10000-100000。
[0007]作為另一種優(yōu)選，所述生物素包括(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯(NHS-b1tin，CAS號35013-72-0);所述生物素通過與氨基反應接枝在殼聚糖高分子上，用于與接枝有熒光素分子的親和素分子特異性結(jié)合(即bitoin與avidin的特異性識別)。
[0008]作為另一種優(yōu)選，所述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴以及維生素E，用于細胞膜的錨定；所述疏水單元通過聚乙二醇高分子(PEG)鏈接到乙二醇殼聚糖的氨基上，以增加水溶性；所述其中聚乙二醇高分子(PEG)分子量在500以上。
[0009]作為另一種優(yōu)選，所述熒光分子包括異硫氰酸熒光素或磺基羅丹明B磺酰氯，其通過與氨基反應接枝在親和素分子表面。
[0010]本發(fā)明還提供了上述長時間細胞膜成像試劑的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)將生物素、疏水單元和乙二醇殼聚糖分別溶于PBS緩沖液中，混勻，室溫反應；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分A ;
[0012](2)將異硫氰酸熒光素和親和素溶液混勻使反應；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分B。
[0013]有益效果:本發(fā)明提供的細胞膜成像試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長時間保持在細胞膜上而不被內(nèi)吞，可作為新一類細胞膜成像試劑。
[0014]具體而言，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下突出的優(yōu)勢:
[0015](I)本發(fā)明提供的試劑生物相容性好、成像效果優(yōu)良，且能長時間保持在細胞膜上而不被內(nèi)吞，其利用膽固醇修飾殼聚糖高分子側(cè)鏈進行多位點錨定，形成一層高分子成像基底，再利用生物素與親和素的特異性結(jié)合引入熒光分子，從而實現(xiàn)長達18小時的高質(zhì)量細胞膜成像。
[0016](2)本發(fā)明采用膽固醇修飾殼聚糖高分子側(cè)鏈，由于膽固醇在細胞膜上可以進行插入，起到對高分子錨定的作用，多個膽固醇分子更是增加了錨定的效率。因此組分A作為成像基底可以很快將細胞膜包圍，將接枝在殼聚糖高分子上的多個生物素分子暴露出來，用于之后與帶熒光分子的親和素分子結(jié)合，實現(xiàn)細胞膜的成像。這種“多位點錨定”并結(jié)合“雙重包覆”的策略,可以極大地提高成像質(zhì)量和成像時間；實驗顯示,該成像試劑對細胞染色18小時后也沒有明顯內(nèi)吞現(xiàn)象發(fā)生。
[0017](3)本發(fā)明采用生物素與親和素之間的高特異性穩(wěn)固結(jié)合，使熒光分子得以長時間包圍在細胞膜表面而不被內(nèi)吞。此外，由于生物素與親和素的結(jié)合效率極高，可大大節(jié)省了染色時間。親和素作為生物大分子也在一定程度上保證了熒光分子不易被內(nèi)吞。
[0018](4)本發(fā)明試劑的組成成分殼聚糖、PEG、生物素以及親和素都具備良好的生物相容性，而且起錨定作用的膽固醇更是動物細胞的細胞膜固有成分，因此該試劑對細胞的毒性低。組分A在100 μ g/mL以下，組分B在200 μ g/mL以下，MTT實驗顯示該成像試劑對細胞活力幾乎無影響，從而證明了該試劑良好的生物相容性。
[0019](5)本發(fā)明試劑的殼聚糖高分子上剩余的氨基帶有的正電荷，會與帶負電荷的細胞膜發(fā)生靜電相互作用，增加與細胞膜的親和力，因而進一步延長了染料在細胞膜上的保持時間。
[0020](6)本發(fā)明試劑可作為一種細胞膜長時間染色的應用平臺，通過替換不同的熒光分子可以實現(xiàn)多種顏色的熒光成像。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明長時間細胞膜熒光成像試劑的分子結(jié)構(gòu)圖。
[0022]圖2為本發(fā)明的細胞膜熒光成像試劑對A549肺癌細胞生存活力的影響評價試驗(MTT試驗，其中殼聚糖及組分A濃度均為100 μ g/mL,組分B濃度為200 μ g/mL)；
[0023]圖3(a) ,3(b) ,3(c)分別為本發(fā)明的細胞膜熒光成像試劑對A549肺癌細胞細胞膜染色I小時、8小時及18小時后的效果圖。

【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]長時間細胞膜突光成像試劑(組分A Khitosan-1O1^ cholesterol-10 % b1tin以及組分B:avidin-FITC)的設計、合成和細胞膜熒光染色方法如下:
[0026]試劑的設計:所述成像試劑的分子結(jié)構(gòu)圖見圖1，該試劑由兩種組分構(gòu)成:組分A以乙二醇殼聚糖高分子(glycol chitosan)為骨架，側(cè)鏈含有10%的聚乙二醇2000-膽固醇(PEG2000-cholesterol)疏水單元和10%的生物素分子(b1tin);組分B由接枝有異硫氰酸熒光素FITC的親和素(avidin)構(gòu)成。所述的乙二醇殼聚糖高分子，具有良好的生物相容性和水溶性。所述的膽固醇疏水側(cè)鏈，通過分子量在500以上的PEG2000連接到殼聚糖氨基上，即NHS-PEG2000-cholesterol，增加水溶性。所述的FITC熒光分子，經(jīng)過與氨基反應連接到親和素分子上。膽固醇疏水單元可通過疏水相互作用多位點地插入細胞膜，將高分子骨架錨定在細胞膜上；隨后，通過生物素與親和素高親和力的牢固結(jié)合將熒光分子接枝在高分子上，作為熒光成像單元。
[0027]試劑的合成，包括以下步驟:
[0028](I)組分A的制備:以N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇2000-膽固醇(NHS-PEG2000-cholesterol)、(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯(NHS-B1tin)以及分子量大于10000的乙二醇殼聚糖高分子為原料，合成疏水單元占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比為10%、生物素分子占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比為10%的組分A，即chitosan-10%cholesterol-10 % b1tin0 具體為:分別稱取 16mg NHS-PEG2000-cholesterol> 15.2mgglycol chitosan(聚合度:大于400 ;分子量約80000)以及2.5mg NHS-B1tin,將三者分別溶于PBS緩沖液(pH 7.4，50mM)，迅速混合均勻后，在搖床中室溫下反應過夜；反應結(jié)束后用截留分子量為1k的透析袋透析3天進行純化，最后在凍干機中凍干制成組分A:chitosan-10% cholesterol-10 % b1tin ；
[0029](2)組分B的制備:將5mg的avidin溶于2.5mL pH = 9.5的碳酸鈉_碳酸氫鈉緩沖溶液；取FITC并溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成濃度2mg/mL的FITC溶液；向avidin溶液中加入250 μ L的FITC溶液，混合均勻后，于4°C冰箱中反應過夜；反應結(jié)束后，用截留分子量2k的透析袋透析三天除去未反應的FITC進行純化，最后在凍干機中冷凍干燥制得組分 B:avidin-FITCo
[0030]組分A及組分B均于-20°C中冷凍保存。
[0031]細胞膜染色成像實驗:將組分A與組分B分別溶于細胞培養(yǎng)用PBS制成lmg/mL的儲存液，并用0.45 μ m的無菌過濾頭進行過濾除去細菌制得工作液。A549肺癌細胞在共聚焦培養(yǎng)板上培養(yǎng)12小時后，先吸去原有培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，再加入2mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM不完全培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗)。先加入組分A200 μ L并放回二氧化碳培養(yǎng)箱孵育30分鐘，隨后吸出培養(yǎng)板中液體并PBS清洗I次，換入DMEM完全培養(yǎng)基；再加入400 μ L組分B于培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，染色結(jié)束后PBS清洗3次，重新加入DMEM完全培養(yǎng)基并將細胞置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，并每隔一定時間跟蹤觀察細胞膜染色情況。
[0032]染色結(jié)果:圖3(a) ,3(b) ,3(c)分別為染色I小時、8小時及18小時后細胞膜成像圖；可見細胞膜被均勻地標記上綠色熒光，隨著染色時間的延長并沒有發(fā)生明顯內(nèi)吞，實現(xiàn)了細胞膜長時間熒光成像。
[0033]實施例2
[0034]本實施例的實施方法與實施例1中的方法一致，只是選用的乙二醇殼聚糖高分子分子量約10000，NHS-PEG2000-cholesterol分子中的膽固醇疏水單元依次改成磷脂分子(1，2-肉豆蘧?；字Ｒ掖及?，DMPE)、烷烴(十八個碳原子，C18)或者維生素E等疏水側(cè)鏈，合成得到三種細胞膜熒光成像試劑。
[0035]實施例3
[0036]為了實現(xiàn)其他顏色的細胞膜熒光成像，本實施例的實施方法與實施例1中的方法類似，，只是選用的乙二醇殼聚糖高分子分子量約100000，將實施例1中的熒光分子FITC替換成為磺基羅丹明B磺酰氯熒光試劑，實施方法與實施例1中方法一致。
[0037]實施例4
[0038]本實施例的實施方法與實施例1中的方法類似，只是成像試劑組分A中的錨定單元占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比改為30%，生物素單元占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比改為5%,所制得的成像試劑組成為 chitosan-30% cholesterol-5% b1tin。
[0039]實施例5
[0040]本實施例的實施方法與實施例1中的方法類似，只是成像試劑組分A中的錨定單元占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比改為5%，生物素單元占殼聚糖重復單元數(shù)的百分比改為30%,所制得的成像試劑組成為 chitosan-5% cholesterol-30% b1tin。
【權(quán)利要求】
1.一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:由組分A和組分B組成；所述組分A為側(cè)鏈含有生物素和疏水單元的乙二醇殼聚糖高分子；所述組分B為接枝有熒光分子的親和素分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:所述生物素占組分A的乙二醇殼聚糖重復單元數(shù)的5-30% ;所述疏水單元占組分A的乙二醇殼聚糖高分子重復單元數(shù)的5-30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:所述乙二醇殼聚糖分子量在10000以上，優(yōu)選10000-100000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:所述生物素包括(+)生物素-N-琥珀酰亞胺基酯；所述生物素通過與氨基反應接枝在殼聚糖高分子上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:所述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴和維生素E ;所述疏水單元通過聚乙二醇高分子鏈接到乙二醇殼聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種長時間細胞膜成像試劑，其特征在于:所述熒光分子包括異硫氰酸熒光素或磺基羅丹明B磺酰氯，其通過與氨基反應接枝在親和素分子表面。
7.一種長時間細胞膜成像試劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將生物素、疏水單元和乙二醇殼聚糖分別溶于PBS緩沖液中，混勻，室溫反應；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分A ; (2)將異硫氰酸熒光素和親和素溶液混勻使反應；產(chǎn)物透析、凍干，即得組分B。
【文檔編號】C08B37/08GK104316500SQ201410485961
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】吳富根, 賈浩然, 王宏銀 申請人:東南大學