基于磁性納米粒子-pamam納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，步驟包括：制備PAMAM樹狀大分子，再利用PAMAM樹狀大分子制備磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料，將制備得到的磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取、磁分離金花茶中黃酮類物質(zhì)。本發(fā)明利用磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物濃縮液中萃取吸附具有弱酸性的黃酮類物質(zhì)，并通過磁分離、微波輔助萃取等技術(shù)實現(xiàn)黃酮類物質(zhì)的高效分離。
【專利說明】基于磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種基于磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金花茶是世界上稀有的珍貴植物。與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，是我國八種國家一級保護植物之一，屬《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄II中的植物種，最早于1993年為我國植物學(xué)家左景烈在廣西防城發(fā)現(xiàn)。目前世界上己知金花茶組物40個品種和5個變種，主要分布在越南及我國廣西境內(nèi)的亞熱帶南緣和熱帶北緣地區(qū)。
[0003]衛(wèi)生部2010年第9號文件，批準金花茶、顯脈旋覆花(小黑藥)、諾麗果漿、酵母β -葡聚糖、雪蓮培養(yǎng)物等5種物品為新資源食品。研究發(fā)現(xiàn)，金花茶葉和花中富含總黃酮(異黃酮、雙黃酮、花色苷及新黃酮類等)、茶多酚，多種氨基酸及微量元素等。
[0004]黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物，是色原烷的衍生物，其特點是具有C6-C3-C6的基本骨架。黃酮類化合物可以分為10多個類別:黃酮、黃烷醇、異黃酮、雙氫黃酮、雙氫黃酮醇、噢弄、黃烷酮、花色素、查耳酮、色原酮等，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約4000余種黃酮類化合物，主要存在于植物的葉、果實、根、皮中，實驗證明其具有廣泛的生理和藥理活性(包括抗氧化，清除氧自由基、抗病毒、抗癌、抗炎、抗衰老等)，因此對該化合物的研究已成為國內(nèi)外醫(yī)藥界研究的熱門話題。傳統(tǒng)提取方法主要包括超濾法、酶解法、大孔樹脂吸附法、超臨界流體萃取法、超聲波法、微波場提取法等(張睿，徐雅琴，時陽.黃酮類化合物提取工藝研究.食品與機械，2003，01，21-22)，但往往制約于提取效率或成本。
[0005]目前關(guān)于金花茶中黃酮類物質(zhì)活性成分研究大多局限在傳統(tǒng)紫外、色譜檢測或溶劑浸提、膜分離等，如:湛志華對金花茶葉中的化學(xué)成分進行了定性分析。通過定性分析，發(fā)現(xiàn)金花茶葉中黃酮類化合物約占2.33%(湛志華.金花茶葉中黃酮成分的提取與分離[D].廣西師范大學(xué)，2006);彭曉等采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20柱色譜法、ODS柱色譜法、反復(fù)重結(jié)晶等方法對金花茶花的化學(xué)成分進行分離純化，并通過理化常數(shù)測定和波譜分析等方法進行結(jié)構(gòu)鑒定。從金花茶花的乙醇提取物中分離得到包括黃酮類物質(zhì)在內(nèi)的13個化合物(彭曉，于大永，馮寶民，唐玲，王永奇，史麗穎.金花茶花化學(xué)成分的研究.廣西植物，2011,31 (04)，550-553 )。唐前等采用紫外分光光度法測定金花茶、毛瓣金花茶、凹脈金花茶、四季金花茶、薄葉金花茶不同植物部位中總皂苷、總多酚(鞣質(zhì))、總黃酮的含量。如金花茶花蕾醇提物中總皂苷、總多酚(鞣質(zhì))、總黃酮的含量依次為:21.30%、6.56%,21.76% (唐前，羅燕英，王永奇等.金花茶組植物化學(xué)成分的定量分析，時珍國醫(yī)國藥，2009，20 (4)，769-771);陳全斌等以金花茶葉為原料提取黃酮，黃酮經(jīng)水解，溶劑萃取、柱層析等手段，得到高純度甙元；經(jīng)熔點、TLC、液相色譜、紅外光譜、核磁共振法等分析手段進行結(jié)構(gòu)表征，首次證實金花茶葉含有黃酮甙，其甙元為槲皮素和山奈酚(陳全斌，湛志華，張巧云，廖娜.金花茶葉中黃酮甙元的分離提純及其表征.廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2005，6，10-11)。
[0006]張彩霞等采用微波輔助提取白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)中的黃酮類化合物，并優(yōu)化其提取工藝，對提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行鑒定，發(fā)現(xiàn)影響黃酮提取率的因素主次順序為:提取溫度乙醇濃度提取時間料液比；最佳提取工藝為:乙醇濃度為80%，提取時間為40 min,料液比為1: 40，提取溫度為80°C，在此條件下白花蛇舌草中黃酮的提取率達2.86% (張彩霞，蔡定建，方文英.白花蛇舌草中黃酮提取工藝的優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)鑒定.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39 (01)，131-133);李加林等通過正交實驗探討了提取溫度、提取時間、料液比及乙醇濃度對鹽膚木總黃酮提取率的影響。提取時間為10 min,溫度為60°C，料液比為1: 60，乙醇濃度為70%時提取效率最佳。研究結(jié)果顯示在最佳條件下總黃酮提取率達到6.65%。李加林，吳素珍，卑占宇.鹽膚木總黃酮提取工藝研究.時珍國醫(yī)國藥，2009， 20,1116-1117)。
[0007]樹形分子(Dendrimer)是最近幾年出現(xiàn)的一類三維的、高度有序的新型大分子。聚酰胺-胺(PAMAM)是目前研究最廣泛、最深入的樹狀大分子之一，由于其具有高度支化、高度對稱及表面含有大量官能團等獨特的結(jié)構(gòu)特點，廣泛應(yīng)用于藥物載體、表面活性劑、催化劑、納米材料、膜材料等領(lǐng)域。樹狀大分子中結(jié)構(gòu)單元每重復(fù)一次成為一次繁衍，得到的產(chǎn)物的代數(shù)就增加1，目前聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子已合成到10.0代發(fā)散合成法是目前合成PAMAM樹狀大分子采用最多、最成熟的一種合成方法，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速、選擇性高等優(yōu)點(譚惠民，羅運軍.樹枝形聚合物[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001)。
[0008]聚酰胺-胺型樹狀大分子具有豐富的端氨基結(jié)構(gòu)及內(nèi)部仲、季胺結(jié)構(gòu)，使整體聚酰胺-胺型樹狀大分子呈弱堿性。黃酮類化合物大多具有酚羥基，整體呈弱酸性，易溶于堿水，酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黃酮酚羥基的酸性，二是由于黃酮母核在堿性條件下開環(huán)，形成2'-羥基查耳酮，極性增大而溶解(郭雪峰，岳永德.黃酮類化合物的提取分離純化和含量測定方法的研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35 (26)，8083-8086)。本發(fā)明擬利用呈弱堿性的PAMAM樹狀大分子材料與呈弱酸性的黃酮類物質(zhì)的萃取吸附作用，實現(xiàn)金花茶中黃酮類物質(zhì)的高效分離。
[0009]為更好地對PAMAM吸附后的黃酮類物質(zhì)進行分離，本發(fā)明將PAMAM與磁性納米粒子如鐵氧體類(四氧化三鐵、Y -三氧化鐵、MeFe204 (Me=Co, Ni, Mn)), Fe, Co, Ni及其合金顆粒類、氮化鐵類(FeN，F(xiàn)e2N, ε -Fe3N, Fe 16N2)等粒子復(fù)合制備磁性粒子-PAMAM納米復(fù)合材料，通過磁性作用將萃取吸附有弱酸性黃酮物質(zhì)的磁性粒子-PAMAM納米復(fù)合材料從萃取液中分離；最后通過超聲輔助萃取技術(shù)將吸附的黃酮物質(zhì)與磁性粒子-PAMAM納米復(fù)合材料進行分離。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種萃取率高的基于磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
基于磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，步驟包括:
I)PAMAM樹狀大分子的制備 PAMAM樹狀大分子以乙二胺為中心核進行準備，第一步將乙二胺與丙烯酸甲酯進行Michael加成反應(yīng)，得到0.5代聚酰胺胺樹狀大分子，記作PAMAM G0.5，該反應(yīng)在25°C下選擇性高；第二步是將得到的0.5代聚酰胺-胺型樹狀大分子與過量的乙二胺在25°C下反應(yīng)，得到1.0代聚酰胺-胺型樹狀大分子，記作PAMAM Gl.0 ;每重復(fù)以上兩步反應(yīng)，分子代數(shù)增長I代，在適當條件下，不斷重復(fù)以上兩個步驟得到不同代數(shù)的聚酰胺-胺型樹狀大分子;
2)磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料的制備
磁分離把磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L ;將上述制備的25mL的磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,并超聲處理30min ;然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h ;所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得5wt%的溶液備用；
取50mL的5wt%的磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的體積濃度為20%，把此混合液在室溫水浴中超聲7h ;然后用磁鐵收集磁性納米粒子，隨后用甲醇洗滌5次，并磁分離；在洗滌之后，向該磁性納米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的體積濃度為50%，室溫下超聲處理3h ;然后用甲醇洗滌該磁性納米粒子5次，并進行磁分離；重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循環(huán)一次就獲得更高代數(shù)的樹形分子修飾的磁性納米粒子；循環(huán)后的溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得PAMAM樹形分子修飾的磁性納米粒子；
3)金花茶中黃酮類物質(zhì)萃取分離
將制備得到的磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取0.5-3h，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)的磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料分離，分離后的磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料采用有機溶劑萃取分離被磁性納米材料吸附的黃酮類物質(zhì)，磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料洗凈活化后能重新循環(huán)使用。
[0012]作為本發(fā)明進一步的方案:磁性納米粒子包括Fe、Co、Ni及其合金顆粒類、鐵氧體類與氮化鐵類；鐵氧體類包括四氧化三鐵、Y -三氧化鐵與MeFe2O4,其中Me=Co、N1、Mn ;氮化鐵類包括 FeN、Fe2N, ε -Fe3N 與 Fe16N2。
[0013]作為本發(fā)明進一步的方案:有機溶劑包括乙醇、甲醇、DMS0、丙酮。
[0014]作為本發(fā)明進一步的方案:該方法還適用于富含黃酮類物質(zhì)的植物葉、花朵、果實與根莖。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物濃縮液中萃取吸附具有弱酸性的黃酮類物質(zhì)，并通過磁分離、微波輔助萃取等技術(shù)實現(xiàn)黃酮類物質(zhì)的高效分離。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為PAMAM樹狀大分子的典型合成路線。
[0017]圖2所示為四氧化三鐵磁粒子-PAMAM復(fù)合材料合成及分離金花茶等植物中黃酮類物質(zhì)示意圖。

【具體實施方式】
[0018]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0019]本發(fā)明的黃酮物質(zhì)分離步驟，為更好地對PAMAM吸附后的黃酮類物質(zhì)進行高效分離，本發(fā)明將PAMAM樹狀大分子與磁性納米粒子如鐵氧體類(四氧化三鐵、Y-三氧化鐵、MeFe2O4 (Me=Co, Ni, Mn) )、Fe，Co，Ni 及其合金顆粒類、氮化鐵類(FeN, Fe2N, ε-Fe3N,Fe16N2)等粒子和1.0-10.0代的PAMAM樹狀大分子復(fù)合制備磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料。該類復(fù)合材料因其球狀結(jié)構(gòu)末端具有豐富的伯胺官能團，中間則有大量仲、叔、季胺等，整體呈弱堿性，在水中溶解度在每100克水10-30克，對呈弱酸性的黃酮類物質(zhì)有較強吸附效應(yīng)，利于黃酮類物質(zhì)的分離。本發(fā)明通過磁分離作用將萃取吸附有弱酸性黃酮類物質(zhì)的磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料從萃取液中分離，隨后通過溶劑萃取技術(shù)將被萃取吸附的黃酮類物質(zhì)與磁性納米粒子-PAMAM納米復(fù)合材料分離。
[0020]實施例1
金花茶葉濃縮液制備:采摘春季新鮮的金花茶原葉；采用電子秤稱重；對采摘的春季新鮮金花茶原葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出金花茶原葉洗凈后，粉碎；將粉碎后的金花茶原葉20公斤；加入丙酮(95%以上)50L，利用索氏提取器提取5-6小時，得提取液A ;提取后殘渣加入40L左右丙酮(95%以上)，在40-60攝氏度條件下超聲波處理約1.5小時，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分丙酮溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約2.0L。
[0021]四氧化三鐵磁粒子-4.0GPAMAM復(fù)合材料制備過程:在氮氣保護下，ρΗ=1.7時，配制0.085mol/L的三氯化鐵溶液和0.05mol/L的硫酸亞鐵的混合物。然后，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并劇烈攪拌，直至pH=9。所獲得的四氧化三鐵磁性納米粒子立即用水洗滌5次，然后用甲醇洗滌3次，磁分離把四氧化三鐵磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述制備的25mL的四氧化三鐵磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，產(chǎn)物分散于甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5wt%的四氧化三鐵磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室溫水浴下超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，隨后甲醇洗滌5次，并磁分離。在洗滌之后，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。不斷重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)四次得到四代(4.0G)樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得4.0G PAMAM樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0022]金花茶中黃酮物質(zhì)萃取分離:將制備得到的四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM復(fù)合材料1g加入到第一步制備好的2.0L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取0.5h，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)的Fe3O4-PAMAM納米復(fù)合材料分離。分離后吸附有黃酮物質(zhì)的磁性復(fù)合材料采用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黃酮類物質(zhì)。合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇、無水硫酸鈉干燥過夜即得到金花茶中的黃酮類物質(zhì)。按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM磁性納米復(fù)合材料用水、乙醇洗滌多次后干燥活化重新循環(huán)使用。
[0023]實施例2
金花茶花朵濃縮液制備:采摘秋季新鮮的金花茶花朵；采用電子秤稱重；對采摘的秋季新鮮金花茶花朵按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出金花茶花朵洗凈后，粉碎；將粉碎后的金花茶花朵10公斤；加入丙酮(95%以上)20-30L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后殘渣加入20L左右丙酮(95%以上)，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分丙酮溶齊U，得到有機相的金花茶濃縮液約1.0L。
[0024]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM復(fù)合材料制備:將2mol/L氫氧化鈉溶液加入到lmol/L硫酸亞鐵溶液中，反應(yīng)有白色絮狀沉淀Fe (OH)2生成，并迅速變成灰綠色沉淀:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用膠頭滴管向上述含沉淀的溶液中滴加適量雙氧水，沉淀由綠色變?yōu)楹谏笸Ｖ乖偌尤搿⑸鲜龊恋淼娜芤豪谜婵粘闉V機分離沉淀，然后將其放入80°C干燥箱中干燥lh。將干燥后的沉淀在馬弗爐中100-240°C焙燒半小時，得Y-Fe2O3紅色粉末。把制備好的磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述制備的25mL的
Y-Fe2O3磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得5wt %的溶液備用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴下超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，并磁分離。洗滌之后,往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。不斷重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)五次獲得五代(5.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得5.0G PAMAM樹形分子修飾的Y-Fe2O3磁性納米粒子。
[0025]金花茶中花朵中黃酮物質(zhì)萃取分離:將制備得到的Y -Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM復(fù)合材料5g加入到第一步制備好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間lh，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)的Y-Fe203-5.0G PAMAM納米復(fù)合材料分離，分離后的吸附有黃酮物質(zhì)的Y-Fe203-5.0G PAMAM納米復(fù)合材料采用有機溶劑甲醇萃取多次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇溶劑，無水硫酸鎂干燥得到金花茶中的黃酮類物質(zhì)，按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述金花茶花朵中黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。
Y-Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM復(fù)合材料則洗滌多次干燥活化后循環(huán)使用。
[0026]實施例3
金花茶果實濃縮液制備:采摘11-12月新鮮的金花茶果實；采用電子秤稱重；對采摘的金花茶果實按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出金花茶果實洗凈后，粉碎，50°C真空干燥8h除去水分，取粉碎后真空干燥的金花茶果實15公斤；加入95%以上的乙醇45L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后殘渣加入30L左右95%以上的乙醇，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙醇溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約1.5L。
[0027]CoxNihFe2O4納米鈷鎳鐵氧體磁性顆粒_3.0G PAMAM復(fù)合材料制備:x可以為0.1、0.3,0.5,0.7,0.9等，按化學(xué)計量比稱量硝酸鈷，硝酸鎳，硝酸鐵，檸檬酸；用蒸餾水溶解為透明的有色溶液。滴入氨水，使溶液PH值在7?8之間。90°C水浴中加熱4?5h至粘稠的膠體狀；在120°C下烘干為干燥凝膠。將干燥凝膠在馬弗爐中以120°C /h加溫至850°C后，保溫lh，關(guān)掉電源，自然冷卻。將制得的磁性納米顆粒超聲分散于甲醇之中，獲得濃度為
0.0128mol/L。上述制備的25mL的CoxNihFe2O4磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5 wt%的C0xNi^Fe2O4磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入室溫水浴中超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，并磁分離。在洗滌之后，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。然后重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)三次獲得三代(3.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得3.0G PAMAM樹形分子修飾的CoxNi^xFe2O4磁性納米粒子。
[0028]金花茶果實中黃酮物質(zhì)萃取:將制備得到的CoxNi^xFe2O4磁粒子-PAMAM復(fù)合材料(弱堿性)適量7.5g加入到第一步制備好的金花茶果實萃取液1.5L中，在400W條件下超聲萃取一定時間1.5h，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取黃酮類物質(zhì)(弱酸性)的CoxNi1^xFe2O4-S.0G PAMAM納米復(fù)合材料分離，分離后的磁性復(fù)合材料(附有黃酮物質(zhì))采用有機溶劑乙醇萃取多次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，室溫真空干燥2h，得到金花茶中的黃酮類物質(zhì)，按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述該黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。CoxNi^xFe2O4磁粒子-3.0G PAMAM復(fù)合材料則洗滌多次干燥活化后重新循環(huán)使用。
[0029]實施例4
金花茶葉濃縮液制備:采摘春季新鮮的金花原葉；采用電子秤稱重；對采摘的春季新鮮金花茶原葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出金花茶原葉洗凈后，粉碎；將粉碎后的金花茶原葉5公斤；加入95%以上的甲醇15L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后殘渣加入1L左右95%以上的甲醇，在40_60°C條件下超聲約
1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分甲醇溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約0.5L。
[0030]y -Fe4N-6.0G PAMAM復(fù)合材料制備過程:鐵粉10克，鐵粉粒度為0.1微米，氫氣還原后，按氨/氫氣比例3:4的比例通入氨氣及氫氣的混合氣體，在550攝氏度條件下氮化3h，將產(chǎn)物在氬氣氛下球墨1h后于240°C下進行4h退后得到Y(jié) -Fe4N,把Y -Fe4N納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述制備的25mL的Y-Fe4N磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL,并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5wt%的Y-Fe4N磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴中超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，并磁分離。在洗滌之后，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。不斷重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)六次得到六代(6.0G)樹形分子修飾的Y_Fe4N磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得6.0G PAMAM樹形分子修飾的Y -Fe4N磁性納米粒子。
[0031]金花茶中黃酮物質(zhì)的萃取分離:將制備得到的Y -Fe4N磁粒子-PAMAM復(fù)合材料(弱堿性)適量2.5 g加入到第一步制備好的0.5L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間2 h，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取黃酮類物質(zhì)的Fe304-6.0G PAMAM納米復(fù)合材料分離，分離后吸附有黃酮物質(zhì)的Fe304-6.0G PAMAM納米復(fù)合材料采用有機溶劑乙醇萃取多次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，室溫這空干燥2h，得到金花茶中的黃酮類物質(zhì)，按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述該黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-6.0GPAMAM復(fù)合材料則洗滌多次干燥活化后循環(huán)使用。
[0032]實施例5
白花蛇舌草濃縮液制備:采摘秋季新鮮的白花蛇舌草，除去根，采用電子秤稱重；對采摘的秋季新鮮的白花蛇舌草按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出白花蛇舌草洗凈后，粉碎；將粉碎后的白花蛇舌草20公斤；加入95%以上的丙酮50L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取后殘渣加入40L左右95%以上的丙酮，在40_60°C條件下超聲波處理約1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分丙酮溶劑，得到有機相的白花蛇舌草濃縮液約2.0L。
[0033]四氧化三鐵磁粒子-4.0GPAMAM復(fù)合材料制備過程:在氮氣保護下，pH= 1.7時，配制0.085mol/L的三氯化鐵溶液和0.05mol/L的硫酸亞鐵的混合物。然后，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并劇烈攪拌，直至pH=9。所獲得的四氧化三鐵磁性納米粒子立即用水洗滌5次，然后用甲醇洗滌3次，磁分離把四氧化三鐵磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述制備的25mL的四氧化三鐵磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，產(chǎn)物分散于甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5 wt%的四氧化三鐵磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室溫水浴下超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，隨后甲醇洗滌5次，并磁分離。在洗滌之后，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。不斷重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)四次得到四代(4.0G)樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得4.0G PAMAM樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0034]白花蛇舌草中黃酮物質(zhì)萃取分離:將制備得到的四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM復(fù)合材料(弱堿性)1g加入到第一步制備好的2.0L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取0.5h，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)(弱酸性)的Fe3O4-PAMAM納米復(fù)合材料分離。分離后吸附有黃酮物質(zhì)的Fe3O4- PAMAM納米復(fù)合材料采用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黃酮類物質(zhì)。合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇、無水硫酸鈉干燥過夜即得到白花蛇舌草中的黃酮類物質(zhì)。按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM磁性納米復(fù)合材料用水、乙醇洗滌多次后干燥活化重新循環(huán)使用。
[0035]實施例6
鹽膚木葉濃縮液制備:采摘新鮮的鹽膚木葉；采用電子秤稱重；對采摘的新鮮鹽膚木葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優(yōu)選出鹽膚木葉洗凈后，粉碎；將粉碎后的鹽膚木葉10公斤；加入95%以上的乙醇20-30L，利用索氏提取器提取5_6h，得提取液A ;提取后殘渣加入20L左右95%以上的乙醇，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙醇溶劑，得到有機相的鹽膚木葉濃縮液約1.0L。
[0036]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM復(fù)合材料制備:將2mol/L氫氧化鈉溶液加入到lmol/L的硫酸亞鐵溶液中，反應(yīng)有白色絮狀沉淀Fe (OH)2生成，并迅速變成灰綠色沉淀:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用膠頭滴管向上述含沉淀的溶液中滴加適量雙氧水，沉淀由綠色變?yōu)楹谏笸Ｖ乖偌尤?。將上述含沉淀的溶液利用真空抽濾機分離沉淀，然后將其放入80°C干燥箱中干燥lh。將干燥后的沉淀在馬弗爐中100-240°C焙燒半小時，得Y-Fe2O3紅色粉末。把制備好的磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述制備的25mL的
Y-Fe2O3磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,并超聲處理30min。然后加入1mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得5wt %的溶液備用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然后加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴下超聲處理7h。然后用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，并磁分離。洗滌之后,往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然后用甲醇洗滌此納米粒子5次，并進行磁分離。不斷重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環(huán)五次獲得五代(5.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，并用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得5.0G PAMAM樹形分子修飾的Y-Fe2O3磁性納米粒子。
[0037]鹽膚木葉中花朵中黃酮物質(zhì)萃取分離:將制備得到的Y-Fe2O3磁粒子-5.0GPAMAM復(fù)合材料(弱堿性)5g加入到第一步制備好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間lh，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)的
Y-Fe203-5.0G PAMAM納米復(fù)合材料分離，分離后的吸附有黃酮物質(zhì)的Y-Fe203_5.0G PAMAM納米復(fù)合材料采用有機溶劑甲醇萃取多次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇溶劑，無水硫酸鎂干燥得到鹽膚木葉中的黃酮類物質(zhì)，按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)中“保健食品中總黃酮的測定方法”，本發(fā)明所述金花茶花朵中黃酮物質(zhì)分離純化方法，黃酮物質(zhì)含量在85%以上。Y -Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM復(fù)合材料則洗滌多次干燥活化后循環(huán)使用。
[0038]本發(fā)明所述技術(shù)同樣適用于其它富含黃酮類物質(zhì)的植物葉、花朵、果實、根莖，如:茶葉、野菊花、銀杏、桑葉、艾葉、金銀花、柚子、橘子、大豆、生姜、八角、芹菜、菠蘿、番石榴、玉米須、敗醬、三葉草、魚腥草、甘草、鹽膚木、葉下珠、仙人掌、卷柏、白花蛇舌草、牛蒡、闊葉十大功勞、半邊旗、羅布麻、春花胡枝子、鎖陽、草珊瑚等，上述植物中黃酮類成分的萃取分離同樣采用類似的磁性粒子-PAMAM納米磁分離技術(shù)。
[0039]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0040]此外，應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。
【權(quán)利要求】
1.基于磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，其特征在于，步驟包括: 1)樹狀大分子的制備 ？八嫩1樹狀大分子以乙二胺為中心核進行準備，第一步將乙二胺與丙烯酸甲酯進行110^61加成反應(yīng)，得到0.5代聚酰胺胺樹狀大分子，記作？八嫩1 60.5，該反應(yīng)在251下選擇性高；第二步是將得到的0.5代聚酰胺-胺型樹狀大分子與過量的乙二胺在251下反應(yīng)，得到1.0代聚酰胺-胺型樹狀大分子，記作？八嫩1 61.0 ；每重復(fù)以上兩步反應(yīng)，分子代數(shù)增長1代，在適當條件下，不斷重復(fù)以上兩個步驟得到不同代數(shù)的聚酰胺-胺型樹狀大分子； 2)磁性納米粒子納米復(fù)合材料的制備 磁分離把磁性納米粒子分散于甲醇之中，獲得濃度為0.0128001/1 ；將上述制備的251111的磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至1501111，并超聲處理30111111 ；然后加入101111的3-胺丙基三甲氧基硅烷，強烈攪拌并超聲處理71！；所得溶液用甲醇洗滌5次后進行磁分離，分散于甲醇獲得50%的溶液備用； 取50此的5被％的磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液，加入2001含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的體積濃度為20%，把此混合液在室溫水浴中超聲7卜；然后用磁鐵收集磁性納米粒子，隨后用甲醇洗滌5次，并磁分離；在洗滌之后，向該磁性納米粒子的甲醇溶液中加入40此含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的體積濃度為50%，室溫下超聲處理311 ；然后用甲醇洗滌該磁性納米粒子5次，并進行磁分離；重復(fù)地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循環(huán)一次就獲得更高代數(shù)的樹形分子修飾的磁性納米粒子；循環(huán)后的溶液用25此甲醇洗滌3次，并用25此水洗滌5次，磁分離收集獲得？八嫩1樹形分子修飾的磁性納米粒子； 3)金花茶中黃酮類物質(zhì)萃取分離 將制備得到的磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取0.5-31！，萃取結(jié)束后通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(zhì)的磁性納米粒子-?八心\1納米復(fù)合材料分離，分離后的磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料采用有機溶劑萃取分離被磁性納米材料吸附的黃酮類物質(zhì)，磁性納米粒子-?八嫩1納米復(fù)合材料洗凈活化后能重新循環(huán)使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，其特征在于，磁性納米粒子包括？6、00? ^1及其合金顆粒類、鐵氧體類與氮化鐵類；鐵氧體類包括四氧化三鐵、V -三氧化鐵與16？6204，其中16二?:0、附、III ；氮化鐵類包括？6隊琴、2 與？6』2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，其特征在于，所述有機溶劑包括乙醇、甲醇、0180與丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性納米粒子-?八納米復(fù)合材料的金花茶中黃酮類物質(zhì)分離方法，其特征在于，該方法還適用于富含黃酮類物質(zhì)的植物葉、花朵、果實與根莖。
【文檔編號】C08G83/00GK104492393SQ201410639271
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】程金生 申請人:程金生