本發(fā)明涉及一株硫酸鹽還原菌。

背景技術(shù)：
AgCl是一種很重要的光敏材料,當(dāng)AgCl表面摻雜金屬銀時(shí),由于其獨(dú)特的等離子效應(yīng)，這種復(fù)合納米粒子具有優(yōu)異的可見光催化性能，提高了處理廢水、廢氣中有機(jī)污染物的效率。Ag/AgCl納米顆粒主要由化學(xué)方法合成，不足之處在于需要嚴(yán)格的反應(yīng)條件和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，合成的納米顆粒粒徑很大，穩(wěn)定性差，形貌也很難控制。而生物法因其成本低廉、條件溫和環(huán)境友好等優(yōu)勢引起了人們廣泛的關(guān)注。據(jù)報(bào)道一些細(xì)菌、真菌或植物粉末能夠合成Ag/AgCl納米顆粒。硫酸鹽還原菌在生長過程中能夠異化硫酸鹽緩慢釋放還原物質(zhì)，生成的納米粒子粒徑小，穩(wěn)定性好，而且硫酸鹽還原菌可以反復(fù)使用，有利于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。因此，尋找能合成Ag/AgCl納米顆粒的菌株并應(yīng)用于生產(chǎn)Ag/AgCl納米顆粒具有重要的研究價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一株硫酸鹽還原菌，可以制備Ag/AgCl納米顆粒，為Ag/AgCl納米顆粒的生產(chǎn)和應(yīng)用提供重要菌源。本發(fā)明可制備Ag/AgCl納米顆粒的硫酸鹽還原菌為Garciellasp.wxz01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年7月3日，保藏編號(hào)為CGMCCNo：9410。本發(fā)明Garciellasp.wxz01為短桿菌，菌體長1.0～2.2μm，寬0.4～0.9μm，無鞭毛和芽孢，生長菌落為黑色，多為橢圓形，少量星狀，接觸空氣一段時(shí)間后，菌落變?yōu)榘咨w大部分死亡。本發(fā)明Garciellasp.wxz01為革蘭氏陰性菌，接觸酶陰性，明膠液化陽性，淀粉水解陰性，甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)陽性，伏普實(shí)驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原和檸檬酸鹽還原為陽性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸鈉、甲酸鈉、葡萄糖、蘋果酸、琥珀酸為碳源生長，在酵母膏和蛋白胨中生長最好。Garciellasp.wxz01能以硫酸氨和尿素作為氮源。菌株在pH5.0～pH10.0的條件下生長，最適pH為7.8；10℃以下菌株停止生長，60℃以上不生長，最適生長溫度為37℃，屬于嗜中溫菌。本發(fā)明Garciellasp.wxz01通過16SrDNA序列比對分析，與其最相近的種屬是Garciellasp.EMZY-1，相似性為99％。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定，該菌屬于梭菌科中的一個(gè)新屬Garciellasp.。本發(fā)明Garciellasp.wxz01在含有硝酸銀的改良的Starkey培養(yǎng)基中生長并合成Ag/AgCl納米顆粒，為生產(chǎn)Ag/AgCl納米顆粒提供菌源。本發(fā)明Garciellasp.wxz01，屬于Garciellasp.屬，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年7月3日，保藏編號(hào)為CGMCCNo：9410。附圖說明圖1為本發(fā)明菌株Garciellasp.wxz01的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖2為本發(fā)明菌株Garciellasp.wxz01與GenBank中收錄的相近菌株的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖3為菌株Garciellasp.wxz01合成的Ag/AgCl納米顆粒透射電子顯微鏡圖；圖4為菌株Garciellasp.wxz01合成的Ag/AgCl納米顆粒的X射線衍射圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式可制備Ag/AgCl納米顆粒的硫酸鹽還原菌為Garciellasp.wxz01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年7月3日，保藏編號(hào)為CGMCCNo：9410。本實(shí)施方式Garciellasp.wxz01為短桿菌，菌體長1.0～2.2μm，寬0.4～0.9μm，無鞭毛和芽孢，生長菌落為黑色，多為橢圓形，少量星狀，接觸空氣一段時(shí)間后，菌落變?yōu)榘咨w大部分死亡。本實(shí)施方式Garciellasp.wxz01為革蘭氏陰性菌，接觸酶陰性，明膠液化陽性，淀粉水解陰性，甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)陽性，伏普實(shí)驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原和檸檬酸鹽還原為陽性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸鈉、甲酸鈉、葡萄糖、蘋果酸、琥珀酸為碳源生長，在酵母膏和蛋白胨中生長最好。Garciellasp.wxz01能以硫酸氨和尿素作為氮源。菌株在pH5.0～pH10.0的條件下生長，最適pH為7.8；10℃以下菌株停止生長，60℃以上不生長，最適生長溫度為37℃，屬于嗜中溫菌。本實(shí)施方式Garciellasp.wxz01是從大慶油田采油廠含油污水中分離得到的，分離方法按以下步驟進(jìn)行：取1mL大慶油田采油廠含油污水水樣加入到19mL改良的Starkey培養(yǎng)基中，35℃恒溫厭氧富集培養(yǎng)至培養(yǎng)基變黑且瓶口處散發(fā)出硫化氫的臭雞蛋味，用潤濕的醋酸鉛試紙檢測有大量H2S生成，得富集培養(yǎng)液。向富集培養(yǎng)液中加入0.5mmol/L的AgNO3避光培養(yǎng)5天，取1mL該培養(yǎng)液接種于含有1.0mmol/LAgNO3的改良的Starkey培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)5天，取1mL培養(yǎng)液接種于含有1.5mmol/LAgNO3的改良Starkey培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)5天，依據(jù)此方法，將AgNO3的濃度逐步提高到3mmol/L。將含有3mmol/LAgNO3的培養(yǎng)液涂布于固體夾層平板，石蠟封口，35℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)夾層中間出現(xiàn)使周圍固體培養(yǎng)基變黑的單菌落時(shí)，將這些單菌落挑入改良的Starkey培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從中挑取長勢良好、濃黑色的單菌落，接種于100mL改良的Starkey培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至液體培養(yǎng)基變黑，將變黑的菌液繼續(xù)平板劃線，挑取單菌落，作進(jìn)一步的純化，得到了菌株Garciellasp.wxz01。改良的Starkey培養(yǎng)基成分：0.5gK2HPO4、1.0gNH4Cl、0.08g無水CaCl2、2.0gNaNO3、2.0gMg(NO3)2·6H2O、1.0g酵母膏、體積濃度60％的乳酸鈉溶液5mL，將上述試劑溶解在1000mL水中，調(diào)節(jié)pH值為8.0，加入500μL刃天青溶液(購買得到)，培養(yǎng)基煮沸后，加入0.5gL-半胱氨酸，通入高純氮?dú)怛?qū)氧，121℃高壓滅菌15min。冷卻后再加入經(jīng)過濾除菌的硫酸亞鐵銨1g。對分離篩選得到的菌株Garciellasp.wxz01進(jìn)行分子鑒定，取對數(shù)生長期新鮮菌液，離心收集菌體，用試劑盒(購買自北京莊盟生物)按說明書提取菌株DNA，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16SrDNA序列的引物為F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：2μLdNTP(10mmol·L-1)，2μL10×PCRbuffer(含15mmol/LMgCl2)，0.4μLTaq酶，1.0μLDNA，兩個(gè)引物各1.0μL(10pmol·μL-1)，ddH2O12.6μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)熱3min，94℃變性2min，56℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，循環(huán)次數(shù)為30次，最后72℃延伸8min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖檢測。電泳后膠回收PCR產(chǎn)物，如圖1所示，將產(chǎn)物連接到T載體后轉(zhuǎn)入E.coliDH-5α，得到帶有細(xì)菌16SrDNA的轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子大腸桿菌送華大基因公司進(jìn)行測序。利用BLAST將所測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性序列比對，從數(shù)據(jù)庫中得到相關(guān)種屬16SrDNA序列信息，利用MEGA5.2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示。鑒定結(jié)果：菌株Garciellasp.wxz01的16SrDNA序列長度為1390bp，其序列提交至GenBank獲得的注冊號(hào)是KM044264，利用BLAST搜索與所得到的序列相似性高的序列，該菌的序列與Garciellasp.EMZY-1的相似性達(dá)到99％，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合其形態(tài)鑒定及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定該菌是硫酸鹽還原菌，屬于梭菌科中的一個(gè)新屬Garciellasp.。為驗(yàn)證本實(shí)施方式Garciellasp.wxz01的功能，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：用注射器吸取10mL菌液接種在含有改良的Starkey培養(yǎng)基的厭氧瓶里，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天，然后加入1mL0.1MAgNO3溶液避光培養(yǎng)15天，將培養(yǎng)液在5000rpm的條件下離心收集菌體，利用HITACHIH-7650儀器在80kV下進(jìn)行成像；結(jié)果如圖3所示，該細(xì)菌合成了Ag/AgCl納米顆粒，大部分呈球形，小部分有團(tuán)聚現(xiàn)象，由此可見本實(shí)施方式篩選出的菌株，是一株可制備Ag/AgCl納米顆粒的硫酸鹽還原菌。用注射器吸取10mL菌液接種在含有改良的Starkey培養(yǎng)基的厭氧瓶里，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天，然后加入1mL0.1MAgNO3溶液避光培養(yǎng)15天，將培養(yǎng)液在5000rpm的條件下離心收集菌體沉淀，然后在真空烘箱中烘干24h，干燥后產(chǎn)物放入馬弗爐，400℃煅燒1h，得到粒徑為10～40nm的Ag/AgCl納米顆粒。將得到的Ag/AgCl納米顆粒直接裝載在XRD樣品載片上，進(jìn)行XRD分析。X-射線由功率為1.6KW(40KV，40mM)的銅X-射線管產(chǎn)生。在2θ為20-80度之間進(jìn)行測量。如圖4所示，所得光譜2θ值峰值在27.831°，32.243°，46.233°，54.478°，57.478°，67.471°，74.471°和76.734°對應(yīng)(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(311)和(420)面觀察到Ag/AgCl衍射峰的存在。