本發(fā)明提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中富集分離藻藍蛋白方法。屬于生化分離工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
螺旋藻藻藍蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍藻所特有的一種超分子捕光色素復(fù)合體。藻藍蛋白色澤呈明亮的藍色，顏色鮮艷，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍蛋白還可以調(diào)節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍蛋白帶有很強的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷，免疫化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域。在我國，每年的螺旋藻全國總產(chǎn)量已達到7000噸。螺旋藻產(chǎn)量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當作保健品使用。螺旋藻的規(guī)模化開發(fā)和利用處于初級加工階段，還沒有深加工產(chǎn)品。螺旋藻中藻藍蛋白的提取還處于實驗室研究階段，沒有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法。目前，市場上銷售的高純度的藻藍蛋白商品都是從國外進口，價格昂貴，在應(yīng)用上受到限制。因此，開發(fā)簡便、快速的螺旋藻藻藍蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍蛋白產(chǎn)品純度是目前螺旋藻藻藍蛋白的規(guī)?；_發(fā)利用中亟待解決的關(guān)鍵問題。已報道的有關(guān)制備藻類藻藍蛋白的專利技術(shù)，例如中國專利CN1106414A、CN1130028A、CN101003565A、CN00117512.2、CN100434528C等的共同特征為藻藍蛋白提取都需經(jīng)過藻體細胞破壁、離心或過濾去除細胞碎片和其它固體微粒、鹽析或等電點粗提階段，然后用離子交換樹脂等層析方法提純，載體的分離藻藍蛋白的特異性差，過程繁瑣，產(chǎn)品純度低，生產(chǎn)成本高。本發(fā)明提供一種對藻藍蛋白具有特異性吸附的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球，可從螺旋藻破壁液中吸附、分離、純化藻藍蛋白。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚未見有關(guān)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球用于富集分離螺旋藻藻藍蛋白的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于分離螺旋藻藻藍蛋白，獲得較高純度的藻藍蛋白，應(yīng)用于天然色素、保健食品和新藥的研究開發(fā)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中吸附分離藻藍蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍蛋白具有較高的回收率、純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍蛋白資源規(guī)?；玫姆椒?。本發(fā)明的技術(shù)方案：一種用于分離螺旋藻藻藍蛋白的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，步驟為：(1)聚合乳液的制備；(2)進行聚合反應(yīng)獲得聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球；(3)用聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球從螺旋藻破壁清液中吸附藻藍蛋白；(4)藻藍蛋白從吸附微球上脫附；(5)脫附液經(jīng)濃縮和冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉。所述的方案，步驟1中，氧化鎂納米顆粒的直徑為5～50nm，非離子表面活性劑為失水山梨糖醇脂肪酸酯Span-80、平平加AEO9、壬基酚聚氧乙烯醚OP-10中任意一種，氧化鎂納米顆粒與非離子表面活性劑之間的重量比為1:0～2.5，植物油包括大豆油、棉籽油、茶籽油、菜籽油、橄欖油、葵花籽油中的一種，納米顆粒與植物油的重量比為1:10～20，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為20～70％，丙烯酸水溶液與植物油的體積比例為1:1～2，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化,獲w/o型乳狀液。所述的方案，步驟2中，在上述乳狀液中，加入0.2～0.5％的過硫酸鈉(以丙烯酸水溶液的體積計)，于30℃～40℃下在100～200r/min攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。所述的方案，步驟3中，對于螺旋藻的細胞破壁，采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25～100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50～1:150，攪拌均勻后，置于-10℃～-20℃下冷凍一定時間后，37℃溶解，如此反復(fù)凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0～5.6mg/ml，藻藍蛋白純度為0.5～0.72。所述的方案，步驟3中，在500ml三角燒瓶中，加入聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和螺旋藻破壁清液，微球與破壁液的重量比為1:10～25，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附40～90分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍蛋白的微球。所述的方案，步驟4中，將飽和吸附藻藍蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為500～1000mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，通過離心收集上清液為產(chǎn)品。所述的方案，步驟5中，將收集的含藻藍蛋白洗脫液真空濃縮和冷凍干燥，即得到純度A620/A280>2.0的藻藍蛋白粉末。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點：1.按流程：使用聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球從螺旋藻破壁清液中提取藻藍蛋白的操作方式是分批操作方式，適合不同規(guī)模和場地的工業(yè)化生產(chǎn)要求；2.聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球?qū)υ逅{蛋白的吸附選擇性高，生產(chǎn)成本低，可再生，適用于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用；3.制備藻藍蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。具體實施方式實施實例1(1)螺旋藻破壁清液的制備取產(chǎn)于江蘇東臺市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:50，置于-20℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復(fù)凍融4次，融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為1.0mg/ml。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)、200ml丙烯酸(購自上海實建實業(yè)有限公司)水溶液和200ml的大豆油(購自淄博坤興糧油有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為20％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入0.4g的過硫酸鈉(購自臨沂市天科工貿(mào)有限公司)，于30℃下在200r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和100ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附40分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍蛋白的微球。(4)藻藍蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為500mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為2.3，蛋白回收率為80％。實施例2(1)螺旋藻破壁液的制備取產(chǎn)于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-10℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復(fù)凍融5次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為3.1mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為0.45。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)和20g失水山梨糖醇脂肪酸酯Span-80(購自江蘇省海安石油化工廠)、200ml的丙烯酸(購自上海實建實業(yè)有限公司)水溶液和400ml的菜籽油(購自湖南亞美生物科技有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為50％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入1.0g的過硫酸鈉(購自臨沂市天科工貿(mào)有限公司)，于30℃下在100r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和40ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附70分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍蛋白的微球。(4)藻藍蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為800mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為3.5，蛋白回收率85％。實施例3(1)螺旋藻破壁液的制備取產(chǎn)于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用100mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:150，置于-20℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復(fù)凍融6次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍蛋白純度A620/A280為0.72，破壁液蛋白質(zhì)濃度為5.6mg/mlmg/ml。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)和25g壬基酚聚氧乙烯醚OP-10(購自江蘇省海安石油化工廠)、200ml的丙烯酸(購自上海實建實業(yè)有限公司)水溶液和300ml的茶籽油(購自湖南亞美生物科技有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為70％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入0.8g的過硫酸鈉，于40℃下在150r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時，過濾得到50～500nm粒徑分布的JDN-8微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和60ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附90分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍蛋白的微球。(4)藻藍蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為1000mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍蛋白純度A620/A280為3.0，蛋白回收率75.5％。