氧化水解酶基因BtLPMO10A及氧化水解酶與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新型氧化水解酶化LPM010A的基因序列（來(lái)源于蘇云金芽抱桿菌 庫(kù)斯塔克亞種ACCC 10066)及其編碼的氧化水解酶的制備方法和應(yīng)用（Pr巧aration and application of a novel lytic polysaccharide monooxygenase)。本發(fā)明還提供了該氧 化水解酶的重組質(zhì)粒和重組基因工程菌株。本發(fā)明設(shè)及的氧化水解酶化LPMOIOA可應(yīng)用在 生物能源、綠色農(nóng)業(yè)、健康食品及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾下質(zhì)是一種主要來(lái)源于海洋郵蟹殼、昆蟲外殼等的等難溶性天然多糖，幾下質(zhì) 的高效生物降解在生物能源、綠色農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、材料化工等領(lǐng)域具有重要的意義。目前 可用于幾下質(zhì)生物降解的酶主要為糖巧水解酶，從其催化反應(yīng)模式上又可分為=類：內(nèi)切 型糖巧水解酶、外切型糖巧水解酶、二糖水解酶。到目前為止，已有大量的關(guān)于運(yùn)些糖巧水 解酶的報(bào)道，然而由于運(yùn)些難溶性天然多糖的晶體結(jié)構(gòu)難W被破壞，致使糖巧水解酶的催 化效率較低。2010年挪威生命科學(xué)大學(xué)的團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了一種來(lái)自粘質(zhì)沙雷氏菌的幾下質(zhì) 氧化水解酶（SmCBP21)，該酶可催化位于幾下質(zhì)糖鏈Cl位上的氧化反應(yīng)，生成具有不同聚 合度的糖酸，該酶可W通過(guò)氧化破壞幾下質(zhì)表面的晶體結(jié)構(gòu)，輔助幾下質(zhì)酶高效降解幾下 質(zhì)。對(duì)于該類酶的新發(fā)現(xiàn)和深入研究對(duì)于實(shí)現(xiàn)幾下質(zhì)等多糖物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化具有重要的意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新型氧化水解酶化LPM010A及其編碼基因。
[0004] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備新型氧化水解酶化LPM010A的方法。 陽(yáng)0化]本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供含有所述的新型氧化水解酶化LPM010A基因的基因 工程表達(dá)體系。
[0006] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供新型氧化水解酶化LPM010A在多糖降解中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的新型氧化水解酶化LPM010A，來(lái)源于蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞 種菌株（購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、，編號(hào)為ACCC 10066)，其氨基酸序列具有 如下特征之一：
[0008] 1)序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸殘基序列；
[0009] 2)將序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加后，具有降解多糖活性的蛋白質(zhì)；
[0010] 3)與序列表SEQ ID NO. 2中所限定的氨基酸序列的同源性達(dá)到90%及W上且具 有降解多糖活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明還提供了新型氧化水解酶化LPM010A的編碼基因（命名為化LPM010A)，具 有下述核巧酸序列特征之一： 陽(yáng)01引 1)具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0013] 2)編碼SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0014] 扣具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸值NA)序列的同源性達(dá)到 90%及W上，且能編碼降解多糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸值NA)序列。
[0015] 本發(fā)明的氧化水解酶化LPM010A的氨基酸序列及其核巧酸編碼序列也可W根據(jù) 預(yù)測(cè)的化LPM010A的氨基酸序列及其核巧酸編碼序列人工合成獲得。
[0016] 制備重組酶化LPM010A的方法，是將編碼基因化LPM010A克隆入重組表達(dá)載體，導(dǎo) 入宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)的氧化水解酶。
[0017] 所述的重組表達(dá)氧化水解酶化LPM010A的表達(dá)載體可W是大腸桿菌表達(dá)載體、酵 母表達(dá)載體、枯草桿菌表達(dá)載體、乳酸菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體、隧菌體載體、絲狀真菌 表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體等。
[0018] 用于重組表達(dá)氧化水解酶化LPM010A的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，可W是大腸 桿菌宿主細(xì)胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D冊(cè) a 等）、酵母菌宿主細(xì)胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等）、枯草桿菌宿主細(xì)胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細(xì)胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI 等）、放線菌 宿主細(xì)胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細(xì)胞（如I'richoderma viride、 Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細(xì)胞（女日 Bombyx mo;ri、Antharaea eucalypti等）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO、幼小 倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞BHK、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL等）。
[0019] 本發(fā)明提供的氧化水解酶化LPM010A對(duì)于幾下質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可氧化水 解幾下質(zhì)等多糖物質(zhì)，可輔助多糖水解酶提高多糖的降解效率。
[0020] 本發(fā)明提供的氧化水解酶化LPM010A可廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加和 醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有較大的生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 :氧化水解酶化LPM010A的蛋白表達(dá)及純化的聚丙締酷胺凝膠電泳圖 (SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是：泳道M :蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)物（marker);泳道1 :發(fā)酵液上 清，上樣量10 y 1，泳道2 :5 y g純化后的化LPM010A。
[0022] 圖2 :氧化水解酶化LPM010A的底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)。a為上清中未與底物結(jié)合的蛋白，電 泳實(shí)驗(yàn)的上樣量為10yL;b為沉淀中與底物結(jié)合的蛋白。CK，對(duì)照度tLPMOlOA+緩沖液）； 1，化LPM010A+a -幾下質(zhì)粉末；2, BtLPMOlOA+0 -幾下質(zhì)粉末；3, BtLPMOlOA+微晶纖維素； 4,化LPMOIOA+a -膠體幾下質(zhì)；5, BtLPMOlOA+幾下質(zhì)珠。
[0023] 圖3 :氧化水解酶化LPM010A的酶解產(chǎn)物分析。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞種的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取
[00巧]蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞種菌株（購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、，編 號(hào)為ACCC 10066)的單克隆接種到IOml液體LB培養(yǎng)基中，接著放入溫度為30°C，轉(zhuǎn)數(shù)為 15化pm的搖床培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)，取3ml菌液，離屯、收集菌體，用于基因組DNA的提取。基因組 DM的提取與純化方法按照試劑盒說(shuō)明書操作完成。
[0026] 實(shí)施例沈tLPMOlOA基因在大腸桿菌中的重組表達(dá)
[0027] W蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞種ACCC 10066基因組DNA為模板，用下述引物對(duì)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)如下：
[0028] IES 引f勿 P-F :5，一C邑Ct邑ccca邑CC邑邑C邑at邑邑cccat邑邑atat邑ta邑aatcacca邑C邑_3，；
[0029] 反向引物 P-R :5, -gctttgttagcagccggatctcaaaatagtgtaggagtttgcatacg-3，；聚 合酶PrimeSTAR購(gòu)自寶生物公司，PCR反應(yīng)體系按照公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明操作。PCR反應(yīng)條 件：94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性30sec-50°C退火30sec-72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物作為引物，W祀T2化質(zhì)粒作為載體，按照 上述PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物利用化nl進(jìn)行過(guò)夜處理，并進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳和DNA測(cè)序驗(yàn)證。
[0030] 驗(yàn)證成功的帶有目的基因的載體電轉(zhuǎn)至大腸桿菌ToplO中，37°C培養(yǎng)12h，挑取單 克??；將單克隆接入含有50 Ji g/ml氨節(jié)西林的液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì) 粒；將質(zhì)粒用正向引物和反向引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步 證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒送去大連寶生物工程有限公司測(cè)序，結(jié)果表 明，在祀T-22b的信號(hào)膚末端和終止密碼子之間插入SEQ ID NOl所示的化LPM010A基因， 且插入方向正確，所W進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
[0031] 將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株化21 0E3)(購(gòu)自美國(guó)Novagen公司），然后按 照該公司提供的操作步驟進(jìn)行氧化水解酶化LPM010A的誘導(dǎo)表達(dá)及純化，結(jié)果如圖1所示， 氧化水解酶化LPM010B的表達(dá)成功，且主要W可溶的形式分布于周質(zhì)空間中，經(jīng)過(guò)幾下質(zhì) 親和層析純化后的氧化水解酶化LPM010A在電泳膠上呈單一條帶，分子量大小為19kDa，與 通過(guò)氨基酸序列預(yù)測(cè)的分子量一致。
[0032] (1) SEQ ID No: 1的信息（參見序列表） 陽(yáng)〇3引 （a)序列特征
[0034] *長(zhǎng)度：561個(gè)堿基對(duì) 齡35] *類型：核酸
[0036] *鏈型：雙鏈
[0037] *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0038] 化）分子類型：DNA
[0039] (C)假設(shè)杏
[0040] (d)反義杏
[0041] (e)最初來(lái)源：蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞種菌株ACCC 10066
[0042] (f)與核巧酸序列相關(guān)的特征關(guān)鍵詞：為"氧化水解酶" 陽(yáng)0創(chuàng) 似SEQ ID NO 2:的信息（參見序列表） 柳44] (a)序列特征：
[0045] *長(zhǎng)度：187個(gè)氨基酸殘基 陽(yáng)046] *類型：蛋白
[0047] *結(jié)構(gòu)：包含1個(gè)AAlO家族氧化水解酶結(jié)構(gòu)域 W48] 化）分子類型：蛋白質(zhì)
[0049] (C)假設(shè)杏
[0050] (d)反義杏
[0051] (e)最初來(lái)源：蘇云金芽抱桿菌庫(kù)斯塔克亞種菌株ACCC 10066 陽(yáng)0巧 序列表
[0053]沈Q ID NO. 1

[0057] 實(shí)施例3氧化水解酶化LPMOIOB的生化特性分析
[0058] (1)多糖結(jié)合能力分析
[0059] 氧化水解酶化LPM010A與各種多糖的結(jié)合實(shí)驗(yàn)按W下條件進(jìn)行：在1. 5ml的 Eppendcxrf管中將5mg各種不同多糖與0. 5mg純化后的氧化水解酶化LPM010A混合，反應(yīng) 終體積通過(guò)20mM、抑8. 0的化is-HCl緩沖液定容為1ml。酶與底物的結(jié)合在室溫下進(jìn)行 24小時(shí)，為了讓酶與多糖更好的結(jié)合，利用畑-II旋轉(zhuǎn)混合儀（寧波新芝公司）。結(jié)束后， 通過(guò)離屯、分別收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，氧化水解酶 化LPM010A與晶體性質(zhì)的幾下質(zhì)（a -幾下質(zhì)和0 -幾下質(zhì)）具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，而與晶 體幾下質(zhì)（幾下質(zhì)珠和膠體幾下質(zhì)）結(jié)合能力較弱，與微晶纖維素的結(jié)合能力幾乎無(wú)法觀 測(cè)到。
[0060] (2)酶反應(yīng)產(chǎn)物分析 陽(yáng)061] 為了分析酶反應(yīng)產(chǎn)物，將氧化水解酶化LPMOIOAQ y M)，抗壞血酸（ImM)和0 -幾 下質(zhì)（2. Omg/ml)混合在一起，反應(yīng)總體積通過(guò)抑8. 0,20mM化is-肥1緩沖液定容為1ml。 反應(yīng)在30°C進(jìn)行2地。產(chǎn)物通過(guò)MLTI T0F/T0F MS進(jìn)行分析（如圖3)。結(jié)果表明氧化水 解酶化LPM010A能氧化水解晶體幾下質(zhì)，產(chǎn)生聚合度為4-10的幾下寡糖糖酸，且偶數(shù)聚合 度的糖酸呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)分布。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種氧化水解酶基因 BtLPMOlOA，其核苷酸序列具有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 2) 編碼SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 3) 具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸（DNA)序列的同源性達(dá)到90% 及以上，且能編碼降解多糖的蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸（DNA)序列。2. -種權(quán)利要求1所述的氧化水解酶基因編碼的氧化水解酶，其編碼的氨基酸序列具 有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸序列； 2) 將序列表中的SEQ ID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加后，具有降解多糖活性的蛋白質(zhì)； 3) 與序列表中SEQ ID NO. 2所限定的氨基酸序列的同源性達(dá)到90%及以上且具有氧 化水解多糖活性的蛋白質(zhì)。3. -種權(quán)利要求2所述的氧化水解酶的制備方法，其特征在于：是將權(quán)利要求1所述 的氧化水解酶基因克隆入重組表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得重組表達(dá)的氧化水解酶； 所述的重組表達(dá)氧化水解酶的表達(dá)載體，是指大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、枯草 桿菌表達(dá)載體、乳酸菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達(dá)載體、植物表 達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。4. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：用于重組表達(dá)氧化水解酶的重組菌或轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系，是指大腸桿菌宿主細(xì)胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM 109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主細(xì)胞（如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等）、枯草桿菌宿主細(xì)胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細(xì)胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放線菌宿主細(xì)胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細(xì)胞（如Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細(xì)胞 (如Bombyx mori、Antharaea eucalypti等），哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO， 幼小倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞BHK、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL等）中的一種。5. -種權(quán)利要求2所述的氧化水解酶在多糖氧化水解中的應(yīng)用，其特征在于：具有如 下用途之一或二種以上； 1) 氧化水解幾丁質(zhì)、殼聚糖、纖維素、半纖維素、淀粉等多糖物質(zhì)中的一種或二種以上， 可用于功能性寡糖產(chǎn)品的生產(chǎn)或生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇； 2) 通過(guò)氧化水解真菌細(xì)胞壁多糖的方式抑制真菌病害，可用于生物農(nóng)藥或生物醫(yī)藥的 制備； 3) 根據(jù)其強(qiáng)大的多糖結(jié)合能力，可作為多糖類物質(zhì)的識(shí)別分子。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氧化水解酶基因及其編碼的氧化水解酶的制備與應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的氧化水解酶BtLPMO10A基因來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種(ACCC 10066)。本發(fā)明還提供了一種制備氧化水解酶BtLPMO10A的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該酶的基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體上，獲得可表達(dá)該酶的大腸桿菌重組菌株，用該工程菌株表達(dá)制備的氧化水解酶BtLPMO10A對(duì)不溶性幾丁質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可氧化水解多糖物質(zhì)產(chǎn)生具有不同聚合度的糖酸。本發(fā)明提供的氧化水解酶BtLPMO10A可輔助多糖水解酶，提高多糖的水解效率。
【IPC分類】C12N15/53, C12P19/14, A01P3/00, A01N63/02, C12N15/70, C12N9/02
【公開號(hào)】CN105713912
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410719898
【發(fā)明人】趙勇, 尹恒, 王文霞, 張卉妍
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所