一種培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程、生物遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，國內(nèi)、外將楊樹作為綠化環(huán)保的首要樹種，用于防風(fēng)固沙、保土留肥、防止土壤沙化。國外運(yùn)用轉(zhuǎn)基因等先進(jìn)手段對楊樹進(jìn)行改良研究，屬黑楊歐美楊雜交品種，其特征是樹干聞大通直、樹皮灰色較粗、分枝角度小、樹冠窄、側(cè)枝細(xì)、葉片小而密、滿冠；雌株。速生，胸徑年平均生長量3.5?5 Cm，樹高平均生長量3.5M。干徑通直、材質(zhì)優(yōu)良，其纖維長度和木材密度均優(yōu)于1- 214楊等普通楊樹，是紙漿材和板材的優(yōu)良樹種，有纖維長、木材密度高，樹冠窄抗風(fēng)能力強(qiáng)，不易風(fēng)倒、風(fēng)折?？共∠x害，對光肩星天牛具有明顯抗性，抗寒等性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為解決增加楊樹對榆毒蛾幼蟲和天幕毛幼蟲的殺蟲活性，加快楊樹生長速度，降低主要病蟲害造成的損失，提高林木經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提供一種培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法。
本發(fā)明培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法內(nèi)容簡述:
本發(fā)明培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法，其特征在于:采用優(yōu)良品種楊樹為試材，進(jìn)行組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性試驗(yàn)，建立高效的外植體再生體系、進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化條件試驗(yàn)，確定葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗；
試驗(yàn)選用的材料為:
1、菌種和質(zhì)粒:含Bt基因的植物表達(dá)載PCUBVgb轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404；
2、植物材料:歐美楊107；
3、供試?yán)ハx:榆毒蛾幼蟲和天幕毛蟲幼蟲；
4、化學(xué)試劑:卡那霉素、羧芐青霉素、潮霉素、利福霉素；擴(kuò)增引物、Taq酶；
5、培養(yǎng)基:農(nóng)桿菌培養(yǎng)基、蔗糖、酵母提取物、瓊脂；葉片、生根培養(yǎng)基；
培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法按下列步驟:
1、潮霉素臨界濃度的確定:
設(shè)計(jì)4個(gè)潮霉素的濃度梯度，在楊樹不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段置于培養(yǎng)基中，定期觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；
2、菌種的活化
將含有植物植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液置于恒溫箱中，培養(yǎng)形成單菌落；挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中用于轉(zhuǎn)化； 3、葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹:
利用葉盤法對楊樹進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
4、轉(zhuǎn)化植株:
經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養(yǎng)基上，有抗性芽產(chǎn)生，將抗性芽同外植體一起繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；
5、轉(zhuǎn)化植株的鑒定:
采用潮霉素抗性鑒定、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、植物總DNA的提取、總DNA的PCR擴(kuò)增:以轉(zhuǎn)化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合情況，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的107楊DNA的PCR產(chǎn)物為陰性對照；
6、轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性測定、轉(zhuǎn)基因植株苗其生長與形態(tài)觀察，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態(tài)。
[0004]本發(fā)明應(yīng)用于國家三北防護(hù)林建設(shè)以及綠化環(huán)保、防風(fēng)固沙等公用事業(yè)以及林紙一體化建設(shè)項(xiàng)目，轉(zhuǎn)基因楊比較一般楊樹具有抗蟲害、速生、纖維含量高等優(yōu)越性，在造林綠化、防止土地沙化等方面具有廣闊的市場前景。
【具體實(shí)施方式】
[0005]本發(fā)明培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，下面做具體說明。
[0006]本發(fā)明培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法進(jìn)行了試驗(yàn)研究，采用優(yōu)良品種楊樹為試材，進(jìn)行組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性試驗(yàn)，建立高效的外植體再生體系、進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化條件試驗(yàn)，確定葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗；
試驗(yàn)選用的材料為:
菌種和質(zhì)粒:含Bt基因的植物表達(dá)載pCUBVgb轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404 ;植物材料:歐美楊107 ;供試?yán)ハx:榆毒蛾幼蟲和天幕毛蟲幼蟲；化學(xué)試劑:卡那霉素、羧芐青霉素、潮霉素、利福霉素；擴(kuò)增引物、Taq酶；培養(yǎng)基:農(nóng)桿菌培養(yǎng)基、蔗糖、酵母提取物、瓊脂；葉片、生根培養(yǎng)基；
培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法按下列步驟:
潮霉素臨界濃度的確定:設(shè)計(jì)4個(gè)潮霉素的濃度梯度，在楊樹不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段置于培養(yǎng)基中，定期觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；
菌種的活化:將含有植物植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液置于恒溫箱中，培養(yǎng)形成單菌落；挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中用于轉(zhuǎn)化；
葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹:利用葉盤法對楊樹進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
轉(zhuǎn)化植株:經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養(yǎng)基上，有抗性芽產(chǎn)生，將抗性芽同外植體一起繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；
轉(zhuǎn)化植株的鑒定:采用潮霉素抗性鑒定、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、植物總DNA的提取、總DNA的PCR擴(kuò)增:以轉(zhuǎn)化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合情況，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的107楊DNA的PCR產(chǎn)物為陰性對照；
轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性測定、轉(zhuǎn)基因植株苗其生長與形態(tài)觀察，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態(tài)。
[0007]本發(fā)明應(yīng)用于國家三北防護(hù)林建設(shè)以及綠化環(huán)保、防風(fēng)固沙等公用事業(yè)以及林紙一體化建設(shè)項(xiàng)目，轉(zhuǎn)基因楊比較一般楊樹具有抗蟲害、速生、纖維含量高等優(yōu)越性，在造林綠化、防止土地沙化等方面具有廣闊的市場前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法，其特征在于:采用優(yōu)良品種楊樹為試材，進(jìn)行組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性試驗(yàn)，建立高效的外植體再生體系、進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化條件試驗(yàn)，確定葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗； 試驗(yàn)選用的材料為: (1)、菌種和質(zhì)粒:含Bt基因的植物表達(dá)載PCUBVgb轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404； (2)、植物材料:歐美楊107； (3)、供試?yán)ハx:榆毒蛾幼蟲和天幕毛蟲幼蟲； (4)、化學(xué)試劑:卡那霉素、羧芐青霉素、潮霉素、利福霉素；擴(kuò)增引物、Taq酶； (5)、培養(yǎng)基:農(nóng)桿菌培養(yǎng)基、蔗糖、酵母提取物、瓊脂；葉片、生根培養(yǎng)基； 培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法按下列步驟: (1)、潮霉素臨界濃度的確定: 設(shè)計(jì)4個(gè)潮霉素的濃度梯度，在楊樹不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段置于培養(yǎng)基中，定期觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度； (2)、菌種的活化 將含有植物植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液置于恒溫箱中，培養(yǎng)形成單菌落；挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中用于轉(zhuǎn)化； (3)、葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹: 利用葉盤法對楊樹進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (4)、轉(zhuǎn)化植株: 經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養(yǎng)基上，有抗性芽產(chǎn)生，將抗性芽同外植體一起繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根； (5)、轉(zhuǎn)化植株的鑒定: 采用潮霉素抗性鑒定、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、植物總DNA的提取、總DNA的PCR擴(kuò)增:以轉(zhuǎn)化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合情況，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的107楊DNA的PCR產(chǎn)物為陰性對照； (6)、轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性測定、轉(zhuǎn)基因植株苗其生長與形態(tài)觀察，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態(tài)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種培育楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因的方法，其特征在于：采用優(yōu)良品種楊樹為試材，進(jìn)行組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性試驗(yàn)，建立高效的外植體再生體系、進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化條件試驗(yàn)，確定葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗。本發(fā)明應(yīng)用于國家三北防護(hù)林建設(shè)以及綠化環(huán)保、防風(fēng)固沙等公用事業(yè)以及林紙一體化建設(shè)項(xiàng)目，轉(zhuǎn)基因楊比較一般楊樹具有抗蟲害、速生、纖維含量高等優(yōu)越性，在造林綠化、防止土地沙化等方面具有廣闊的市場前景。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82, C12Q1/68
【公開號】CN105713918
【申請?zhí)枴緾N201410730433
【發(fā)明人】滿書岐
【申請人】滿書岐