本公開(kāi)涉及一種新型人松馳素類似物，包含其的藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：
松弛素(Relaxin簡(jiǎn)稱RLX)是一種多肽激素，其由哺乳動(dòng)物的卵巢黃體分泌。松弛素在體內(nèi)具有多種生理功能，包括松弛恥骨韌帶、抑制子宮收縮、軟化子宮頸、刺激乳腺發(fā)育、影響乳汁分泌。1926年，在研究妊娠期間骨盆帶變化時(shí)，松弛素由FrederickHisaw首次發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)70至80年代，松弛素被認(rèn)為是一種雙鏈蛋白質(zhì)。松弛素的結(jié)構(gòu)與胰島素相似。已經(jīng)證實(shí)松弛素是肽類激素家族的成員之一。在人類當(dāng)中，松弛素家族由7個(gè)基因所編碼：RLN1、RLN2、RLN3(也作INSL7)、INSL3/RLF、INSL4/EPIL、INSL5/RIF2和INSL6/RIF1。人體循環(huán)中的大多數(shù)人類松弛素是基因RLN2編碼的產(chǎn)物。RLN2的翻譯產(chǎn)物是松弛素前體，該松弛素前體包括(從N端至C端)：24個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列、29個(gè)氨基酸殘基的B鏈、104-107個(gè)氨基酸殘基的連接序列，以及約24個(gè)氨基酸殘基的A鏈。目前已明確，松弛素不僅在妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且對(duì)非妊娠動(dòng)物的血管結(jié)構(gòu)和功能也產(chǎn)生影響。松弛素具有廣泛的生物學(xué)作用，包括在哺乳動(dòng)物妊娠和機(jī)體老化過(guò)程中維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、抗炎、心肌保護(hù)、擴(kuò)張血管、促進(jìn)傷口愈合，尤為重要的作用是抗纖維化。各種原因引起的心臟、腎臟病變最終均導(dǎo)致纖維化、結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的發(fā)生。因此，纖維化過(guò)程的有效抑制，是挽救臟器功能的重要措施。鑒于此，松弛素的抗纖維化作用可能成為未來(lái)抗纖維化治療的有效措施。更為重要的是，松弛素可由心臟產(chǎn)生，并通過(guò)局部受體來(lái)保護(hù)心臟和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)。松弛素已成功地用于改善多種動(dòng)物模型的心臟纖維化。因而，松弛素有望用于人類心臟纖維化性疾病的治療(杜曉軍，周娟，Baker心臟研究所)?，F(xiàn)有技術(shù)中，在大腸桿菌中表達(dá)人松弛素(hRelaxin，野生型)前體；經(jīng)過(guò)純化后前體折疊復(fù)性；兩步酶切(分別用CPB和胰蛋白酶)；再純化得到有活性的產(chǎn)物松弛素?，F(xiàn)有技術(shù)中的缺陷是：生產(chǎn)過(guò)程中需要蛋白復(fù)性、兩步酶切和再純化。繁多的步驟導(dǎo)致產(chǎn)量大大降低以及成本的提高，因?yàn)槊恳徊蕉紩?huì)涉及蛋白的損失。而且，外源酶(CPB、胰蛋白酶等)本身的成本高，酶的質(zhì)量也會(huì)影響終產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。另一缺陷是，所表達(dá)的野生型松弛素活性低。這使得治療劑量所需的重組蛋白的量增多，成本增加；而且所表達(dá)的野生型松弛素的低活性，給進(jìn)一步開(kāi)發(fā)蛋白修飾產(chǎn)品帶來(lái)困難，因?yàn)樾揎棔?huì)損失蛋白的活性。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，通過(guò)對(duì)野生型松弛素的特定位點(diǎn)氨基酸改變，本公開(kāi)進(jìn)行了新型分子的設(shè)計(jì)，并發(fā)現(xiàn)了新型的人松弛素類似物，從而能非常好的解決上述問(wèn)題。新的技術(shù)方案顯示以下優(yōu)點(diǎn)：1.松弛素特定位點(diǎn)的氨基酸改變，使所得的類似物能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)完成正確的折疊，在這一過(guò)程中細(xì)胞自身的酶系統(tǒng)除去A和B鏈中的c-肽段。得到的完整有功能的活性分子被分泌到細(xì)胞外。通過(guò)一步純化得到活性分子。省去現(xiàn)有技術(shù)所需的表達(dá)后復(fù)性、酶切、純化等多個(gè)步驟。2.松弛素特定位點(diǎn)的氨基酸改變，使結(jié)構(gòu)更加適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)折疊、酶切和分泌，而且提高了生物學(xué)活性。這樣可以減少單位劑量所需的重組蛋白質(zhì)的量，從而降低成本。同時(shí)，因?yàn)榛钚蕴岣?，使得這樣的類似物更加容易分子修飾物的開(kāi)發(fā)。通過(guò)設(shè)計(jì)(松弛素序列中特定氨基酸的替換、缺失等)，本公開(kāi)得到特定序列的人松馳素類似物。這種類似物能在真核表達(dá)系統(tǒng)(細(xì)胞)里完成松弛素前體的蛋白折疊、酶切；并且分泌到發(fā)酵液中時(shí)，本公開(kāi)的人松馳素類似物是成熟的、完整、有功能的松弛素類似物。不僅如此，通過(guò)這些特定的設(shè)計(jì)所得到的松弛素類似物，其生物學(xué)活性比野生型松弛素高2倍以上。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本公開(kāi)提供一種人松弛素類似物，其包含A鏈和B鏈，所述A鏈和B鏈的氨基酸序列分別如下式所示：A鏈：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24個(gè)氨基酸殘基)B鏈：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29個(gè)氨基酸殘基)其中A1選自：Q、D、E和W；其中B14選自：E、D和N；任選地，B1和B2同時(shí)缺失；當(dāng)A1為Q時(shí)，B14不為E或D。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種如上所述的人松弛素類似物，其包含A鏈和B鏈，所述A鏈和B鏈的氨基酸序列分別如下式所示：A鏈：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24個(gè)氨基酸殘基)B鏈：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29個(gè)氨基酸殘基)其中A1選自：Q、D、E和W；其中B14選自：E、D和N；當(dāng)A1為Q時(shí)，B14不為E或D。在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，所述的A1為D、E或W，優(yōu)選為D。在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，所述的A1為D，B14為D。具體地，實(shí)例為SEQIDNO：134(A鏈)和SEQIDNO：135(B鏈)，通過(guò)二硫鍵連接而形成的人松弛素類似物。在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，所述的B14為D。在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述的A鏈和B鏈的氨基酸序列選自如下組合：在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述B鏈通過(guò)連接序列(本公開(kāi)中簡(jiǎn)稱L)與所述A鏈連接，所述連接序列的長(zhǎng)度為1至15個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為2至8個(gè)氨基酸殘基，所述的連接序列的氨基酸序列選自：在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述的人松弛素類似物的N端連接有信號(hào)肽序列(本公開(kāi)中簡(jiǎn)稱S)，所述信號(hào)肽序列的長(zhǎng)度為4至15個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選6至11個(gè)氨基酸殘基；更優(yōu)選的，所述的信號(hào)肽序列的氨基酸序列選自：S1：EEGEPK，SEQIDNO：33，S2：EEGEPKR，SEQIDNO：34，和S3：MKKNIAFLLKRSEQIDNO：35。在本公開(kāi)一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于制備如上所述的人松弛素類似物的表達(dá)前體，表達(dá)前體的氨基酸序列選自SEQIDNO：1至SEQIDNO：26的一種或多種。表1.人松弛素類似物表達(dá)前體匯總本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種人松弛素類似物的衍生物，其是如上所述的人松弛素類似物經(jīng)PEG化修飾所得，換言之其中如上所述的人松弛素類似物被PEG分子所修飾。在一些實(shí)施方案中，所述的PEG分子的分子量為5-100KDa；在一些實(shí)施方案中，是10-80KDa；在一些實(shí)施方案中，15-45KDa；在一些實(shí)施方案中，20-40KDa；在一些實(shí)施方案中，所述的PEG分子為支鏈型或直鏈型。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種多核苷酸，其編碼如上所述的人松弛素類似物的表達(dá)前體。多核苷酸選自DNA或RNA。技術(shù)人員理解，多核苷酸的互補(bǔ)序列也涵蓋在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種含有如上所述多核苷酸的表達(dá)載體。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種轉(zhuǎn)化有如上所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述的宿主細(xì)胞為細(xì)菌，在一些具體實(shí)施方案中為大腸桿菌；在另一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為酵母菌，在一些具體實(shí)施方案中為畢赤酵母。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種藥物組合物，其含有或由如下組成：a)一種或多種如上所述的人松弛素類似物、和/或一種或多種如上所述的人松弛素類似物衍生物，和b)一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種人松弛素類似物或其衍生物的可注射溶液，其含有溶解形式或可溶解形式的如上所述的藥物組合物。應(yīng)當(dāng)理解，可注射溶液的干粉或凍干粉形式也涵蓋在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。本公開(kāi)進(jìn)一步提供如上所述的人松弛素類似物、如上所述的人松弛素類似物衍生物、或如上所述的藥物組合物、或如上所述的可注射溶液，在制備用于治療或預(yù)防纖維化疾病或心血管疾病的藥物中的用途，參見(jiàn)Cardiovasculareffectsofrelaxin；frombasicsciencetoclinicaltherapy，Nat.Rev.Cardiol.7，48-58(2010)；Relaxindecreasesrenalinterstitialfibrosisandslowsprogressionofrenaldisease，KindneyInternational，Vol.59(2001)，pp.876-882。本公開(kāi)進(jìn)一步提供一種治療或預(yù)防纖維化疾病或心血管疾病的方法，該方法包括向所需的受試者施用治療有效量的如上所述的人松弛素類似物或其衍生物，或如上所述的藥物組合物。發(fā)明詳述一、術(shù)語(yǔ)為了更容易理解本公開(kāi)，以下具體定義了某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)。除非另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。本公開(kāi)所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。當(dāng)應(yīng)用于動(dòng)物、人、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)，“給予”、“施用”、“治療”和“處理”是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動(dòng)物、人、受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”、“治療”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、診斷、研究和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞的處理包括試劑與細(xì)胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細(xì)胞接觸?！敖o予”、“施用”、“治療”和“處理”還意指通過(guò)試劑、診斷、結(jié)合組合物或通過(guò)另一種細(xì)胞，在體外和離體處理細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于人、獸醫(yī)學(xué)或研究受試者時(shí)，“處理”是指治療處理、預(yù)防或預(yù)防性措施、研究和診斷應(yīng)用?！爸委煛币庵附o予患者內(nèi)用或外用治療劑，諸如給予患者包含本公開(kāi)的任一種結(jié)合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病癥狀，而已知所述治療劑對(duì)這些癥狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病癥狀的量給予治療劑。所述的有效緩解的量包括無(wú)論是通過(guò)誘導(dǎo)這類癥狀退化還是抑制這類癥狀發(fā)展到任何臨床右測(cè)量的程度。有效緩解任何具體疾病癥狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據(jù)多種因素變化，例如患者的疾病狀態(tài)、年齡和體重，以及藥物在患者產(chǎn)生需要療效的能力。通過(guò)醫(yī)生或其它專業(yè)衛(wèi)生保健人士通常用于評(píng)價(jià)該癥狀的嚴(yán)重性或進(jìn)展?fàn)顩r的任何臨床檢測(cè)方法，可評(píng)價(jià)疾病癥狀是否已被減輕。盡管本公開(kāi)的實(shí)施方案(例如治療方法或制品)在緩解每個(gè)患者都有的目標(biāo)疾病癥狀方面，可能效果不同，但是根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法，如Studentt檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、Mann和Whitney的U檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)(H檢驗(yàn))、Jonckheere-Terpstra檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)，確定其在患者中應(yīng)當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著減輕目標(biāo)疾病癥狀。除非另有說(shuō)明，否則在本公開(kāi)中所述的松弛素或人松馳素為人松馳素RLN2，其包含具有生物活性的全長(zhǎng)序列或部分序列。人松馳素包含A鏈和B鏈，兩者之間通過(guò)二硫鍵結(jié)合。本公開(kāi)中所用人松馳素的序列描述參見(jiàn)GenBank序列號(hào)：EAW58770。本公開(kāi)中用于作為陽(yáng)性對(duì)照的人松馳素800828為野生型。本公開(kāi)中所述的人松馳素類似物前體按照從氨基端至羧基端的順序包含：信號(hào)肽序列、B鏈或其突變體、連接序列、A鏈或其突變體。其中信號(hào)肽序列的長(zhǎng)度是4-15個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選6-11個(gè)氨基酸殘基；B鏈或其變體的長(zhǎng)度是29個(gè)氨基酸殘基；連接序列的長(zhǎng)度是1-15個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選2-8個(gè)氨基酸殘基；以及A鏈或其變體的長(zhǎng)度是約24個(gè)氨基酸殘基。本公開(kāi)中所述的突變體指在序列上進(jìn)行氨基酸的修飾、替換、置換或取代。本公開(kāi)的B鏈優(yōu)選的突變?yōu)樵贐鏈第14位(簡(jiǎn)稱B14)上將E替換為D，且A鏈第1位(簡(jiǎn)稱A1)Q替換為D。本公開(kāi)的序列縮寫(xiě)中，Ln表示本公開(kāi)中的某種連接序列(如L1至L6)，Sn表示本公開(kāi)中的某種信號(hào)肽序列(如S1、S2、S3)；DA1表示在A鏈第1個(gè)氨基酸突變?yōu)镈，DB14表示在B鏈第14個(gè)氨基酸突變?yōu)镈，DelB1，B2表示B鏈第1和2個(gè)氨基酸缺失；A(wt)，表示野生型無(wú)突變的A鏈，B(wt)，表示野生型無(wú)突變的B鏈?！氨Ｊ匦揎棥被颉氨Ｊ刂脫Q或取代”是指：蛋白中的氨基酸殘基被具有類似特征(例如電荷、側(cè)鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸殘基所置換；即使蛋白中的這種氨基酸殘基被頻繁改變，也不改變蛋白的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，一般而言，多肽的非必需區(qū)域中的單個(gè)氨基酸置換不改變生物學(xué)活性(參見(jiàn)例如Watson等(1987)MolecularBiologyoftheGene，TheBenjamin/CummingsPub.Co.，第224頁(yè)，第4版)。另外，結(jié)構(gòu)或功能類似的氨基酸殘基的置換不大可能破環(huán)生物學(xué)活性?！坝行Я俊卑阋愿纳苹蝾A(yù)防醫(yī)學(xué)病癥的癥狀或病癥的量。有效量還意指足以允許或促進(jìn)診斷的量。用于特定患者或獸醫(yī)學(xué)受試者的有效量可依據(jù)以下因素而變化：如待治療的病癥、患者的總體健康情況、給藥的方法、途徑、和劑量、以及副作用嚴(yán)重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案?！巴庠葱浴敝竵?lái)源在生物、細(xì)胞或人體外產(chǎn)生的物質(zhì)?！皟?nèi)源性”來(lái)源在細(xì)胞、生物或人體內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)。本文使用的表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有這類名稱都包括后代。因此，表述“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)目。還應(yīng)當(dāng)理解的是，由于故意或非有意的突變，所有后代在DNA含量方面不可能精確相同。以上表述還包括與最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見(jiàn)。本文使用的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”是指，例如美國(guó)專利號(hào)4,683,195中所述擴(kuò)增的程序或技術(shù)。一般來(lái)說(shuō)，需要獲得來(lái)自目標(biāo)區(qū)域末端或之外的序列信息，從而能夠設(shè)計(jì)寡核苷酸引物；這些引物的序列與待擴(kuò)增模板的對(duì)應(yīng)鏈相同或相似。2個(gè)引物的5’末端核苷酸可以與待擴(kuò)增材料的末端一致。PCR可用于擴(kuò)增特定的RNA序列、來(lái)自總基因組DNA的特定DNA序列、以及由總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般，參見(jiàn)Mullis等(1987)ColdSpringHarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCRTECHNOLOGY(StocktonPress，N.Y.)。本文使用的PCR被視為用于擴(kuò)增核酸測(cè)試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)法的一個(gè)實(shí)例，但不是唯一的實(shí)例；所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴(kuò)增或產(chǎn)生核酸的特定部分?！叭芜x”或“任選地”意味著隨后所描述的事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生?！八幬锝M合物”表示含有一種或多種本文所述類似物或前體以及其他化學(xué)組分的混合物，其中其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。其他化學(xué)組分的目的是促進(jìn)對(duì)生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。本公開(kāi)中所述的用轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的步驟可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。獲得的轉(zhuǎn)化體可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，其表達(dá)本公開(kāi)的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。從表達(dá)前體產(chǎn)物中釋放所述人松弛素類似物的化學(xué)和/或酶方法可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，比如胰蛋白酶、羧肽酶B、賴氨酸內(nèi)肽酶C等。具體實(shí)施方式實(shí)施例1、重組人松弛素800800的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素800800表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的人松弛素800800的DNA序列通過(guò)OverlapPCR方法合成。由Invitrogen公司合成6條單鏈DNA片段作為合成引物，序列如下：800-引物1CTCGAGGATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTSEQIDNO：36800-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTTAATAACTTCTTCCATCCAAGAASEQIDNO：37800-引物3AGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACASEQIDNO：38800-引物4ATGACAACACTTGTTAGCCAAAGCAGAGTACAATTGTCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：39800-引物5CTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTSEQIDNO：40800-引物6GAATTCTTAACAAAATCTAGCCAAAGATCTCTTASEQIDNO：41松弛素的合成采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)，采用兩步PCR完成。第一步PCR，25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KOD緩沖液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2，3，4，5，6(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，12.5μLddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5分鐘；94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃30秒鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后；再68℃30分鐘以結(jié)束PCR擴(kuò)增程序。第二步PCR，25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1和6(10μM)各1μL，1μL第一輪PCR產(chǎn)物，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，15.5uLddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5分鐘；94℃30秒鐘，68℃60秒鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后；再68℃10分鐘以結(jié)束PCR擴(kuò)增程序。將PCR合成的DNA序列和pPIC9K表達(dá)載體(Invitrogen，Cat.K1750-01)分別進(jìn)行EcoRI/XhoI(NewEnglandBiolabs，Cat.R0101S/R0146V)雙酶切，得到的目的片段經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠回收，用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，Cat.M0202V)連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽(yáng)性克隆由Invitrogen公司作測(cè)序分析。800前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：42上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：1。2、重組人松弛素800800表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將5-10μg的上述步驟中得到的松弛素800800表達(dá)載體用SalI(Takata，Cat.D1080a)進(jìn)行線性化。再加入1/10體積的3M醋酸鈉，2倍體積的無(wú)水乙醇，充分混合后，放置于-20℃，2hr?；旌衔锔咚匐x心(13,000rpm)5min，去處上清，用75％乙醇清洗沉淀2次，將沉淀倒置晾干后，用10μLddH2O溶解。將線性化的質(zhì)粒與80μL電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(畢赤酵母GS115，Invitrogen，Cat.K1750-01)混合轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯(BioRad，Cat.1652086)中，并置冰浴5min。將電轉(zhuǎn)儀(BioRadMicropulser)參數(shù)設(shè)至2kV，25Ω，200uF，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。結(jié)束后迅速加入1ml冰浴的D-山梨醇(生工生物工程有限公司)混合，將100-300μl混合物涂布于MD培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)3d至形成菌落。3、重組人松弛素800800表達(dá)克隆的G418篩選用3mlYPD培養(yǎng)基洗脫MD培養(yǎng)板上的菌落，重懸，并用分光光度計(jì)(Beckman，DU800)測(cè)定重懸的細(xì)胞濃度(1OD600＝5×107cell/ml)。將1×105細(xì)胞涂在4mg/ml濃度G418(GIBCO，Cat.11811-031)的YPD培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)5d至形成菌落。4、重組人松弛素800800的誘導(dǎo)表達(dá)從YPD培養(yǎng)板上挑取單菌落置于4mLBMGY培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。第二天檢測(cè)OD600值，應(yīng)處于2-6之間。離心機(jī)(BeckmanCoulter)室溫低速(1,500g)離心5min收集細(xì)胞，并用BMMY培養(yǎng)基重懸至OD600為1.0。在培養(yǎng)基中加入1/200總體積的100％甲醇(終濃度為0.5％)，并于28℃，250rpm培養(yǎng)72hr，其中每24hr補(bǔ)加1/200總體積的100％甲醇。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心機(jī)低速(1,500g)離心并收集上清。SDS-PAGE(Invitrogen，Cat.No.456-1083)電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)，挑選表達(dá)較好克隆進(jìn)行下一步發(fā)酵。得到的重組人松弛素800800序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實(shí)施例2、重組人松弛素800801的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素800801表達(dá)載體的構(gòu)建松弛素800801用PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點(diǎn)突變引物，序列如下：801-引物1GTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCSEQIDNO：43801-引物2GAGTACAATTGTCTCTTCAAAGATCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：44PCR定點(diǎn)突變以松弛素800800載體為模板，采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KOD緩沖液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5分鐘，94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃12分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，再68℃12分鐘以結(jié)束PCR擴(kuò)增程序。在PCR產(chǎn)物中直接加入內(nèi)切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小時(shí)后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽(yáng)性克隆由Invitrogen公司作測(cè)序分析。801前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：45上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：22、重組人松弛素800801的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)重組人松弛素800801的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)施例1。得到的重組人松弛素800801序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實(shí)施例3、重組人松弛素800802的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素800802表達(dá)載體的構(gòu)建松弛素800802用PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點(diǎn)突變引物，序列如下：802-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：46802-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：47PCR定點(diǎn)突變以松弛素800801載體為模板，采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5分鐘，94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃12分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，再68℃12分鐘以結(jié)束PCR擴(kuò)增程序。在PCR產(chǎn)物中直接加入內(nèi)切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小時(shí)后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽(yáng)性克隆由Invitrogen公司作測(cè)序分析。802前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：48上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：3。2、重組人松弛素800802的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)重組人松弛素800802的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)施例1。得到的重組人松弛素800802序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實(shí)施例4、重組人松弛素800802-1的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素800802-1表達(dá)載體的構(gòu)建松弛素800802-1用PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變完成，由Invitrogen公司合成4條單鏈DNA片段作為定點(diǎn)突變引物，序列如下：802-1-引物1GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGSEQIDNO：49802-1-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAACSEQIDNO：50802-1-引物3GTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGSEQIDNO：51802-1-引物4CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTCTTTCTAGAACSEQIDNO：52PCR定點(diǎn)突變以松弛素800802載體為模板，突變過(guò)程同實(shí)施例2。800802-1前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：53上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：4。2、重組人松弛素800802-1的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)重組人松弛素800802-1的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)施例1。得到的重組人松弛素類似物800802-1序列如下：B鏈(DB14)DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：137A鏈(DA1)DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：138。實(shí)施例5、重組人松弛素800803的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素800803表達(dá)載體的構(gòu)建松弛素800803用PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點(diǎn)突變引物，序列如下：803-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：54803-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：55PCR定點(diǎn)突變以松弛素800801載體為模板，突變過(guò)程同實(shí)施例2。800803前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：56上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：5。2、重組人松弛素800803的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)重組人松弛素800803的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)同實(shí)施例1。得到的重組人松弛素800803序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實(shí)施例6、重組人松弛素800803-1的分子克隆和表達(dá)1、重組人松弛素80...