技術領域：
：本公開涉及分子生物學領域，具體地，涉及改變細胞的基因組的方法。以電子方式遞交的序列表的引用通過EFS-Web以電子方式將序列表的正式文本作為ASCII格式的序列表遞交，該文件名稱為“20140815_BB2344PCT_ST25_SequenceListing”，創(chuàng)建日期為2014年8月15日，文件大小為82千字節(jié)，并且該文件與本說明書同時提交。該ASCII格式文檔中所含的序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
背景技術：
：：重組DNA技術已使得可以將外來DNA序列插入到生物體的基因組中，從而改變該生物體的表型。一種插入或修飾DNA序列的方法涉及通過引入側接有與基因組靶標同源的序列的轉基因DNA序列來進行的同源DNA重組。美國專利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的預定序列的DNA序列轉化真核生物細胞。具體地，討論了使用位點特異性重組。轉化的細胞通過使用選擇性標記來鑒定，該選擇性標記作為所引入的DNA序列的一部分而被包含。已證實，在植物細胞中人工誘導的位點特異性基因組雙鏈斷裂通過使用兩個不同的途徑用外源供應的DNA進行同源重組而得到修復。(Puchta等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：5055-5060；2005年8月4日公布的美國專利申請公布2005/0172365A1；2006年12月14日公布的美國專利申請公布2006/0282914；2005年6月2日公布的WO2005/028942)。由于DNA區(qū)段(包括編碼序列和非編碼序列在內)的分離、克隆、轉移和重組用限制性內切核酸酶進行最便利。許多研究集中在研究和設計內切核酸酶，諸如2004年8月12日公布的WO2004/067736；1998年8月11日授予Dujon等人的美國專利5,792,632；2003年8月26日授予Dujon等人的美國專利6,610,545B2；Chevalier等人，(2002)MolCell10：895-905；Chevalier等人，(2001)NucleicAcidsRes29：3757-3774；Seligman等人，(2002)NucleicAcidsRes30：3870-3879。雖然已開發(fā)了若干種方法來靶向特異性位點以用于細胞基因組中的修飾，但仍然需要用于制備具有改變基因組的生物體的更高效和有效的方法，所述生物體諸如但不限于酵母和能育植物，所述改變的基因組在細胞基因組的限定區(qū)域中包含特異性修飾。技術實現要素：提供了使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的組合物和方法，用于對細胞或生物體的基因組中的靶序列進行基因組修飾，用于基因編輯，以及用于將感興趣的多核苷酸插入到細胞或生物體的基因組中。所述方法和組合物采用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)來提供用于修飾或改變靶位點以及編輯細胞基因組內感興趣的核苷酸序列的有效系統(tǒng)，其中引導多核苷酸由DNA、RNA或DNA-RNA組合序列構成。細胞包括但不限于非人類、動物、細菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細胞。一旦鑒定了基因組靶位點，便可采用多種方法來進一步修飾靶位點，使得它們包含多種感興趣的多核苷酸。公開了使用引導多核苷酸和Cas內切核酸酶系統(tǒng)的育種方法和選擇植物的方法。還提供了具有引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸構建體、細胞、酵母、植物、植物細胞、外植體、種子和谷粒。還提供了用于編輯細胞基因組中的核苷酸序列的組合物和方法。待編輯的核苷酸序列(感興趣的核苷酸序列)可位于由Cas內切核酸酶識別的靶位點之內或之外。因此在本公開的第一實施例中，組合物包含引導多核苷酸，該引導多核苷酸包含：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域；以及(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域，其中第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構成，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。第一核苷酸序列結構域(可變靶向結構域)和靶序列之間的互補性％可為至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。第一核苷酸序列結構域(VT結構域)包含12至30個核苷酸的連續(xù)片段。在一個實施例中，引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域(VT結構域)和第二核苷酸序列結構域位于單個分子上。在另一個實施例中，第二核苷酸序列結構域(Cas內切核酸酶識別結構域)包含能夠沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨分子。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域為DNA序列，并且第二核苷酸序列結構域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域和/或第二核苷酸序列結構域包含至少一種修飾，該修飾任選地提供另外的有益特征，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。另外的益處可為改變的或調節(jié)的穩(wěn)定性、亞細胞靶向、跟蹤、熒光標記、蛋白質或蛋白質復合物的結合位點、改變的互補靶序列結合親和力、改變的細胞降解抗性、或提高的細胞滲透性。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中引導多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域；以及(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中所述引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域和/或第二核苷酸序列結構域包含至少一種修飾，該修飾任選地提供另外的有益特征，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。在另一個實施例中，組合物包括包含本公開的引導多核苷酸或引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物的植物或種子。在另一個實施例中，方法包括用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括將引導多核苷酸引入到具有Cas內切核酸酶的細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。在另一個實施例中，方法包括用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括將引導多核苷酸和Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。在另一個實施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)向細胞提供引導多核苷酸、供體DNA和Cas內切核酸酶，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸。在另一個實施例中，方法包括用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)向細胞提供cr核苷酸、能夠表達tracrRNA的第一重組DNA構建體、能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。在另一個實施例中，方法包括用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)向細胞提供tracr核苷酸、能夠表達crRNA的第一重組DNA構建體、能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA，其中所述tracr核苷酸選自脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。在另一個實施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)將能夠表達引導多核苷酸的第一重組DNA構建體、以及能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA構建體引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸。在另一個實施例中，方法包括用于編輯細胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中Cas內切核酸酶在所述細胞的基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。在另一個實施例中，組合物包括包含引導多核苷酸和Cas內切核酸酶的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述Cas內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。在另一個實施例中，組合物包括包含重組DNA構建體和引導多核苷酸的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述重組DNA構建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內切核酸酶的核苷酸序列的啟動子，其中所述植物優(yōu)化Cas內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。在另一個實施例中，方法包括用于選擇植物的方法，所述植物在其植物基因組中包含改變的靶位點，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導多核苷酸的第二植物，所述引導多核苷酸能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物，其中該引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評價(c)的子代的靶位點改變；以及e)選擇具有所述靶位點的所需改變的子代植物。本公開的方法和組合物的另外實施例在下文公開。附圖和序列表簡述由以下的“具體實施方式”及構成本申請的一部分的附圖和序列表可以更完全地理解本公開。本申請隨附的序列說明和序列表符合美國聯(lián)邦法規(guī)37C.F.R.§§1.821-1.825中關于專利申請中的核苷酸和氨基酸序列公開的指導規(guī)則。序列說明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定義的氨基酸三字母代碼，將其以引用方式并入本文。附圖圖1A示出含有雙分子的雙鏈引導多核苷酸，該雙鏈引導多核苷酸包含與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域(稱為可變靶向結構域或VT結構域)以及與Cas內切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列結構域(稱為Cas內切核酸酶識別結構域或CER結構域)。雙鏈引導多核苷酸的CER結構域包含沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨分子。這兩個單獨分子可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。包含連接到CER結構域的VT結構域的雙鏈引導多核苷酸的第一分子(示為cr核苷酸)被稱為“crDNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“crRNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)，或“crDNA-RNA”(當由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構成時)。包含CER結構域的雙鏈引導多核苷酸的第二分子(示為tracr核苷酸)被稱為“tracrRNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“tracrDNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)，或“tracrDNA-RNA”(當由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構成時)。圖1B示出單鏈引導多核苷酸，該單鏈引導多核苷酸包含與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域(稱為可變靶向結構域或VT結構域)以及與Cas內切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸結構域(稱為Cas內切核酸酶識別結構域或CER結構域)。所謂“結構域”，意指核苷酸的連續(xù)片段，該連續(xù)片段可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。單鏈引導多核苷酸包含通過連接子核苷酸序列(示為環(huán))連接到tracr核苷酸(包含CER結構域)的cr核苷酸(包含連接到CER結構域的VT結構域)。由來自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列構成的單鏈引導多核苷酸可被稱為“單鏈引導RNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“單鏈引導DNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“單鏈引導RNA-DNA”(當由RNA核苷酸和DNA核苷酸的組合構成時)。圖2A至圖2C示出用于Cas9、crRNA和tracrRNA表達的表達盒。圖2A示出含有馬鈴薯ST-LS1內含子、SV40氨基末端核定位序列(SV40NLS)和VirD2羧基末端NLS(VirD2NLS)的玉米密碼子優(yōu)化的Cas9基因(編碼Cas9內切核酸酶)，其可操作地連接至植物泛素啟動子(UBIPro)(SEQIDNO：5)。玉米優(yōu)化的Cas9基因(僅為Cas9編碼序列，沒有NLS)對應于SEQIDNO：5的第2037-2411位和第2601-6329位核苷酸，其中馬鈴薯內含子存在于SEQIDNO：5的第2412-2600位處。SV40NLS存在于SEQIDNO：5的第2010-2036位處。VirD2NLS位于SEQIDNO：5的第6330-6386位處。圖2B示出可操作地連接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III啟動子，該核苷酸序列編碼可操作地連接至玉米U6終止子的crRNA分子。所得玉米優(yōu)化的crRNA表達盒以SEQIDNO：8列出。圖2C示出可操作地連接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III啟動子，該核苷酸序列編碼可操作地連接至玉米U6PolIII終止子的tracrRNA分子。所得玉米優(yōu)化的tracrRNA表達盒以SEQIDNO：9列出。圖3A示出相對于在玉米LIGCas-3靶序列處適當取向的PAM序列(AGG)(SEQIDNO：14，表1)的雙鏈引導RNA/Cas9內切核酸酶系統(tǒng)和靶DNA復合物。雙鏈引導RNA(淺灰色背景)包含含有與LIGCas-3靶序列的互補鏈堿基配對的可變靶向結構域(VT結構域)的crRNA分子(SEQIDNO：10)，以及含有CER結構域的一部分的tracrRNA分子(SEQIDNO：11)。Cas9內切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預期DNA裂解位點。圖3B示出相對于在玉米基因組LIGCas-3靶位點處適當取向的PAM序列(AGG)(SEQIDNO：14，表1)與基因組LIGCas-3靶位點相互作用的單鏈引導RNA/Cas9內切核酸酶復合物。該單鏈引導RNA(淺灰色背景，SEQIDNO：96)是crRNA和tracrRNA之間的融合體并且包含與雙鏈DNA基因組靶位點的一條DNA鏈互補的可變靶向結構域。Cas9內切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預期DNA裂解位點。圖4A至圖4C示出由本文所述在玉米基因組無葉舌1基因座處的玉米優(yōu)化的引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)誘導的前10個最常見NHEJ突變的比對和計數。所述突變通過深度測序進行鑒定。還指示了PAM序列和預期的裂解位點。由NHEJ不完整導致的缺失或插入分別以“-”或標有下劃線且為斜體的核苷酸示出。在圖4A中，參考序列(SEQIDNO：23)表示靶位點標有下劃線的未修飾LIGCas-1基因座。包含LIGCas-1靶位點的第1-10個突變的序列分別對應于SEQIDNO：24-33。在圖4B中，參考序列(SEQIDNO：23)表示靶位點標有下劃線的未修飾LIGCas-2基因座。包含LIGCas-2靶位點的第1-10個突變的序列分別對應于SEQIDNO：34-43。在圖4C中，參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點標有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點的第1-10個突變的序列分別對應于SEQIDNO：45-54。圖5示出相對于在玉米LIGCas-3靶序列處適當取向的PAM序列(SEQIDNO：14，表1)的雙鏈引導多核苷酸/Cas9內切核酸酶系統(tǒng)和靶DNA復合物。雙鏈引導RNA(淺灰色背景)包含含有與LIGCas-3靶序列的互補鏈堿基配對的可變靶向結構域(VT結構域)的crDNA分子(SEQIDNO：55)，以及含有CER結構域的一部分的tracrRNA分子(SEQIDNO：11)。Cas9內切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預期DNA裂解位點。圖6A至圖6B示出由本文所述在玉米基因組無葉舌1基因座處的玉米優(yōu)化的雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)(圖6A)或玉米優(yōu)化的雙鏈引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)(圖6B)誘導的前3個最常見NHEJ突變的比對和計數。所述突變通過深度測序進行鑒定。還指示了PAM序列和預期的裂解位點。由NHEJ不完整導致的缺失或插入分別以“-”或標有下劃線且為斜體的核苷酸示出。在圖6A中，NHEJ突變源自合成crRNA加tracrRNA和Cas9表達盒。參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點標有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點的第1-3個突變的序列分別對應于SEQIDNO：56-58。在圖6B中，NHEJ突變源自合成crDNA加tracrRNA和Cas9表達盒。參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點標有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點的第1-3個突變的序列分別對應于SEQIDNO：59-61。圖7示出通過URA3編碼序列和305bp的重復ADE2基因序列破壞15號染色體上的酵母ADE2基因，產生ADE：URA3：DE2酵母篩選菌株。圖8示出可用于在酵母ADE：URA3：DE2篩選菌株中監(jiān)測裂解活性的方案。如果URA3靶位點被切斷，則URA3編碼序列旁側的ADE2序列重復可用作DNA雙鏈斷裂的同源重組修復的模板。如從ADE：URA3：DE2構型中的ADE2序列重復區(qū)域引向ADE2構型的虛線所示，雙鏈斷裂的同源重組介導的修復將去掉URA3基因編碼序列并獲得功能性ADE2基因。圖9示出用于定量裂解活性的酵母菌落的數值刻度和相應的紅色/白色扇形菌落。由于扇形菌落表型是裂解活性的定性度量，因此實施0-4數值評分系統(tǒng)。0分表示未觀察到白色扇形菌落(無切割)；4分表示完全白色菌落(識別位點的完全切割)；1-3分表示中間白色扇形菌落表型(以及中等程度的識別位點切割)。序列SEQIDNO：1為來自釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。SEQIDNO：2為馬鈴薯ST-LS1內含子的核苷酸序列。SEQIDNO：3為SV40氨基N末端的氨基酸序列。SEQIDNO：4為根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)雙分體VirD2T-DNA邊界內切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。SEQIDNO：5為表達玉米優(yōu)化的Cas9的表達盒的核苷酸序列。SEQIDNO：6為玉米U6聚合酶III啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO：7為SV40核定位信號的氨基酸序列。SEQIDNO：8為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結構域的玉米優(yōu)化crRNA表達盒的核苷酸序列。SEQIDNO：9為玉米優(yōu)化的tracrRNA表達盒的核苷酸序列。SEQIDNO：10為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結構域的crRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：11為來自釀膿鏈球菌MIGAS(SF370)＞的tracrRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：12為玉米基因組靶位點LIGCas-1的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：13為玉米基因組靶位點LIGCas-2的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：14為玉米基因組靶位點LIGCas-3的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：15-22為PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：23為LIGCas-1和LIGCas-2基因座的未修飾參考序列的核苷酸序列(圖4A至圖4B)。SEQIDNO：24-33為LIGCas-1基因座的第1-10個突變的核苷酸序列(圖4A)。SEQIDNO：34-43為LIGCas-2基因座的第1-10個突變的核苷酸序列(圖4B)。SEQIDNO：44為LIGCas-3的未修飾參考序列的核苷酸序列(圖4C)。SEQIDNO：45-54為LIGCas-3基因座的第1-10個突變的核苷酸序列(圖4C)。SEQIDNO：55為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結構域的crDNA(由脫氧核糖核酸構成)的核苷酸序列。SEQIDNO：56-58為LIGCas-3基因座(源自合成crRNA加tracrRNA和Cas9表達盒)的第1-3個突變的核苷酸序列。SEQIDNO：59-61為LIGCas-3基因座(源自合成crDNA加tracrRNA和Cas9表達盒)的第1-3個突變的核苷酸序列。SEQIDNO：62為不包含對其核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。SEQIDNO：63為不包含對其核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crRNA)的CER結構域的核苷酸序列。SEQIDNO：64為在其核苷酸序列的5’端包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端處的第一個N代表具有硫代磷酸酯鍵的G核糖核苷酸，第二個N代表具有硫代磷酸酯鍵的C核糖核苷酸，并且第三個N代表具有硫代磷酸酯鍵的G核糖核苷酸。SEQIDNO：65為在其核苷酸序列的3’端附近包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crRNA)的CER結構域的核苷酸序列(U*U*U*)。在序列表中，在第十九、第二十和第二十一位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的U核糖核苷酸。SEQIDNO：66為在其5’端處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列(mGmCmG)。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，第二個N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：67為在其核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER結構域的核苷酸序列(mUmUmG)。在序列表中，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2’-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：68為對于每個核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：69為對于每個核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十八位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十九位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：70為不包含對其脫氧核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。SEQIDNO：71為不包含對其脫氧核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crDNA)的CER結構域的核苷酸序列。SEQIDNO：72為在其核苷酸序列中包含一個鎖核酸核苷酸(+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：73為在其核苷酸序列中包含三個鎖核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：74為在其核苷酸序列中包含六個鎖核酸核苷酸(+C、+C、+T、+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位處的N代表C鎖核酸堿基，在第八位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十位處的N代表T鎖核酸堿基，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：75為在其核苷酸序列以及其核苷酸序列的5’端附近的硫代磷酸酯鍵中包含三個鎖核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端處的第一個N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，在第二位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的C脫氧核糖核苷酸，在第三位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：76為在核苷酸序列的3’端附近包含三個鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結構域的核苷酸序列(T*T*T)。在序列表中，在第十九位、第二十位和第二十一位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的T脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：77為在其核苷酸序列中包含一個5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位處的N代表5-甲基dC脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：78為在其核苷酸序列中包含三個5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位、第八位和第十二位處的N代表5-甲基dC脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：79為在其核苷酸序列中包含一個2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第十一位處的N代表2，6-二氨基嘌呤脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：80為在其核苷酸序列中包含兩個2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第五位和第十一位處的N代表2，6-二氨基嘌呤脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：81為在其核苷酸序列的5’端附近包含鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G鎖核酸堿基，第二個N代表C鎖核酸堿基，并且第三個N代表G鎖核酸堿基。SEQIDNO：82為在核苷酸序列的3’端附近包含鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位處的N代表T鎖核酸堿基，在第二十一位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第二十二位處的N代表G鎖核酸堿基。SEQIDNO：83為在其核苷酸序列的5’端附近包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，第二個N代表具有硫代磷酸酯鍵的C脫氧核糖核苷酸，并且第三個N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：84為在其核苷酸序列的5’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，第二個N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：85為在核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結構域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2’-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：86為在其核苷酸序列的除T之外的每個核苷酸處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：87為在核苷酸序列的除T之外的每個核苷酸處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結構域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在二十二位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：88為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)密碼子優(yōu)化的Cas9的核苷酸序列。SEQIDNO：89為來自噬菌體T7的T7啟動子的核苷酸序列。SEQIDNO：90為ADE：URA3：DE2靶序列的核苷酸序列(不包括PAM序列)。SEQIDNO：91-95為Cas9內切核酸酶的核苷酸序列。SEQIDNO：96為靶向LIGCas-3靶序列的單鏈引導RNA的核苷酸序列(圖3B)。具體實施方式本公開包括用于細胞基因組中的靶序列的基因組修飾的組合物和方法。該方法和組合物采用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)來提供用于修飾細胞基因組內的靶位點的有效系統(tǒng)。細胞包括但不限于動物、細菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。一旦鑒定了基因組靶位點，便可采用多種方法來進一步修飾靶位點，使得它們包含多種感興趣的多核苷酸。還公開了使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的育種方法。還提供了用于編輯細胞基因組中的核苷酸序列的組合物和方法。待編輯的核苷酸序列(感興趣的核苷酸序列)可位于由Cas內切核酸酶識別的靶位點之內或之外。CRISPR基因座(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，規(guī)律成簇間隔短回文重復序列)(也稱為SPIDRs--SPacerInterspersedDirectRepeats，間隔區(qū)散在同向重復序列))構成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重復序列(通常24至40bp，重復1至140次，也稱CRISPR重復序列)組成，所述DNA重復序列是部分回文的。重復的序列(通常是物種特異性的)被恒定長度的可變序列(通常20至58bp，取決于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))間隔。CRISPR基因座首先在大腸桿菌(E.coli)中確認(Ishino等人(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。在地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)、釀膿鏈球菌、魚腥藻屬(Anabaena)和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中已鑒定出類似的散在短序列重復序列(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座與其他SSR不同之處在于重復序列的結構，所述重復序列也被命名為短規(guī)則間隔重復序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICSJ.Integ.Biol.6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。所述重復序列是成簇出現的短元件，其通常被恒定長度的可變序列規(guī)則地間隔(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)?！癈as基因”包括這樣的基因，該基因通常與旁側CRISPR基因座偶聯(lián)、相關或接近或在旁側CRISPR基因座的附近。術語“Cas基因”、“CRISPR相關(Cas)基因”在本文中可互換使用。Cas蛋白質家族的全面綜述在Haft等人(2005)ComputationalBiology，PLoSComputBiol1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。如該文獻中所描述，除了四個之前已知的基因家族外，還描述了41個CRISPR相關(Cas)基因家族。該文獻表明，CRISPR系統(tǒng)屬于不同的類別，具有不同的重復序列模式、不同組的基因以及不同物種范圍。給定的CRISPR基因座中的Cas基因的數目可隨物種而不同。Cas內切核酸酶與由Cas基因編碼的Cas蛋白質相關，其中所述Cas蛋白質能夠將雙鏈斷裂引入到DNA靶序列中。Cas內切核酸酶接近基因組靶位點解旋DNA雙鏈并且在識別靶序列時通過引導多核苷酸裂解兩條DNA鏈，但唯一條件是正確的原間隔序列相鄰基元(PAM)大致在靶序列的3′端處取向(圖3A，圖3B)。在一個實施例中，Cas內切核酸酶為能夠在DNA靶位點處引入雙鏈斷裂的Cas9內切核酸酶，其中在特定位置處的DNA裂解通過以下方式實現：a)在DNA靶位點和引導多核苷酸的可變靶向結構域之間堿基配對互補，以及b)存在緊鄰DNA靶位點的短原間隔序列相鄰基元(PAM)。在一個實施例中，Cas內切核酸酶基因為Cas9內切核酸酶，諸如但不限于2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097的SEQIDNO：462、474、489、494、499、505和518中列出的Cas9基因。在另一個實施例中，Cas內切核酸酶基因為植物如玉米或大豆優(yōu)化的Cas9內切核酸酶(圖1A)。在另一個實施例中，Cas內切核酸酶基因可操作地連接至Cas密碼子區(qū)域上游的SV40核靶向信號以及Cas密碼子區(qū)域下游的雙分體VirD2核定位信號(Tinland等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7442-6)。在一個實施例中，Cas內切核酸酶基因為SEQIDNO：1、91、92、93、94、95的Cas9內切核酸酶基因或SEQIDNO：5的第2037-6329位核苷酸、或它們的任意功能片段或變體。術語“功能片段”、“功能上等同的片段”和“功能等同片段”在本文中可互換使用。這些術語是指其中產生雙鏈斷裂的能力得以保持的Cas內切核酸酶序列的一部分或亞序列。術語“功能變體”、“功能上等同的變體”和“功能等同變體”在本文中可互換使用。這些術語是指其中產生雙鏈斷裂的能力得以保持的Cas內切核酸酶的變體。片段和變體可通過諸如定點誘變和合成構建之類的方法來獲得。在一個實施例中，Cas內切核酸酶基因為植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9基因，其可識別原則上N(12-30)NGG可被靶向的形式的任何基因組序列。內切核酸酶是裂解多核苷酸鏈內的磷酸二酯鍵的酶，包括裂解DNA成特異性位點而不損傷堿基的限制性內切核酸酶。限制性內切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型內切核酸酶，它們進一步包括亞型。在I型和III型系統(tǒng)中，甲基化酶活性和限制酶活性兩者都包含在單一復合物中。內切核酸酶還包括大范圍核酸酶，也稱為歸巢內切核酸酶(HEases)，其如同限制性內切核酸酶，在特定識別位點處結合和切割，然而大范圍核酸酶的識別位點通常較長，約18bp或更長。(2012年3月22日提交的專利申請WO-PCTPCT/US12/30061)大范圍核酸酶已基于保守序列基元分為四個家族(BelfortM，和PerlmanPSJ.Biol.Chem.1995(270)：30237-30240)。這些基元參與金屬離子的配位和磷酸二酯鍵的水解。HE酶的顯著之處在于它們的識別位點長，并且能容忍它們的DNA底物中有一定的序列多態(tài)性。大范圍核酸酶的命名規(guī)范與其他限制性內切核酸酶的規(guī)范相似。對于分別由獨立式ORF、內含子和內含肽編碼的大范圍核酸酶，它們也通過前綴F-、I-或PI-進行表征。重組過程中的一個步驟涉及在識別位點之處或附近進行多核苷酸裂解。這個裂解活性可用來產生雙鏈斷裂。有關位點特異性重組酶及其識別位點的綜述，參見Sauer(1994)CurrOpBiotechnol5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB7：760-7。在一些例子中，重組酶來自整合酶或解離酶家族。TAL效應物核酸酶是新一類序列特異性核酸酶，可用來在植物或其他生物體的基因組中的特定靶序列處產生雙鏈斷裂。(Miller等人(2011)NatureBiotechnology29：143-148)。鋅指核酸酶(ZFN)包括工程改造的雙鏈斷裂誘導劑，由鋅指DNA結合結構域和雙鏈斷裂誘導劑結構域構成。識別位點特異性由鋅指結構域賦予，鋅指結構域通常包含兩個、三個或四個例如具有C2H2結構的鋅指，但是其他鋅指結構也是已知的并被工程構建。鋅指結構域易于設計特異性結合選定的多核苷酸識別序列的多肽。ZFN由工程改造的DNA結合鋅指結構域與非特異性內切核酸酶結構域連接組成，所述非特異性內切核酸酶結構域例如來自II型內切核酸酶(如FokI)的核酸酶結構域?？蓪⒘硗獾墓δ苄匀诤系戒\指結合結構域，包括轉錄激活因子結構域、轉錄阻遏蛋白結構域和甲基化酶。在一些例子中，核酸酶結構域的二聚化為裂解活性所需。每個鋅指能識別靶DNA中的三個連續(xù)堿基對。例如，一個3鋅指結構域識別9個連續(xù)核苷酸的序列，由于該核酸酶要求二聚化，使用兩組鋅指三聯(lián)體來結合一條18個核苷酸的識別序列。在本公開的一個實施例中，組合物包括包含引導多核苷酸和Cas9內切核酸酶的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述Cas9內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。細菌和古細菌已進化出適應性免疫防御機制，又稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR相關聯(lián)的(Cas)系統(tǒng)，其使用短RNA來指導外源核酸的降解(2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097)。來自細菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)采用crRNA和tracrRNA來將Cas內切核酸酶引導至其DNA靶標。crRNA(CRISPRRNA)包含與雙鏈DNA靶標中的一條鏈互補的區(qū)域并且與tracrRNA(反式激活CRISPRRNA)堿基配對，從而形成指導Cas內切核酸酶裂解DNA靶標的RNA雙鏈體。如本文所用，術語“引導多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，該多核苷酸序列可與Cas內切核酸酶形成復合物并且使Cas內切核酸酶能夠識別并且任選地裂解DNA靶位點。引導多核苷酸可為單分子或雙分子。引導多核苷酸序列可為RNA序列、DNA序列、或它們的組合(RNA-DNA組合序列)。任選地，引導多核苷酸可包含至少一個核苷酸、磷酸二酯鍵或鍵修飾，諸如但不限于鎖核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18(六乙二醇鏈)分子)、或導致環(huán)化的5’至3’共價鍵。在本公開的一些實施例中，引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸(RNA)。單獨包含核糖核酸的引導多核苷酸也稱為“引導DNA”。引導多核苷酸可為雙分子(也稱為雙鏈引導多核苷酸)，其包含與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域(稱為可變靶向結構域或VT結構域)以及與Cas內切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列結構域(稱為Cas內切核酸酶識別結構域或CER結構域)(圖1A)。雙分子引導多核苷酸的CER結構域包含沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨分子(圖1A)。這兩個單獨分子可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。在本公開的一個實施例中，雙鏈引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸(RNA)，如例如但不限于圖3A所示。在一些實施例中，包含連接到CER結構域的VT結構域的雙鏈引導多核苷酸的第一分子(在圖1A中示為“cr核苷酸”)被稱為“crDNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“crRNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)，或“crDNA-RNA”(當由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構成時)。在一些實施例中，包含CER結構域的雙鏈引導多核苷酸的第二分子(在圖1A中示為tracr核苷酸)被稱為“tracrRNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“tracrDNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)，或“tracrDNA-RNA”(當由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構成時)。引導多核苷酸也可為單分子，其包含與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域(稱為可變靶向結構域或VT結構域)以及與Cas內切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸結構域(稱為Cas內切核酸酶識別結構域或CER結構域)(圖1B)。所謂“結構域”，意指核苷酸的連續(xù)片段，該連續(xù)片段可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。單鏈引導多核苷酸的VT結構域和/或CER結構域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列。在一些實施例中，單鏈引導多核苷酸包括連接到tracr核苷酸(包含CER結構域)的cr核苷酸(包含連接到CER結構域的VT結構域)，其中所述鍵為包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列的核苷酸序列(圖1B)。由來自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列構成的單鏈引導多核苷酸可被稱為“單鏈引導RNA”(當由RNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“單鏈引導DNA”(當由DNA核苷酸的連續(xù)片段構成時)或“單鏈引導RNA-DNA”(當由RNA核苷酸和DNA核苷酸的組合構成時)。使用單鏈引導多核苷酸與雙鏈引導多核苷酸相比的一個優(yōu)點是僅需要形成一個表達盒即可表達單鏈引導多核苷酸。術語“可變靶向結構域”或“VT結構域”在本文中可互換使用并且指與雙鏈DNA靶位點的一條鏈(核苷酸序列)互補的核苷酸序列。第一核苷酸序列結構域(VT結構域)和靶序列之間的互補性％可為至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％?？勺儼薪Y構域的長度可為至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，可變靶向結構域包含12至30個核苷酸的連續(xù)片段。可變靶向結構域可由DNA序列、RNA序列、修飾的DNA序列、修飾的RNA序列(參見例如本文所述的修飾)、或它們的任何組合構成。術語引導多核苷酸的“Cas內切核酸酶識別結構域”或“CER結構域”在本文中可互換使用并且涉及與Cas內切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(諸如引導多核苷酸的第二核苷酸序列結構域)。CER結構域可由DNA序列、RNA序列、修飾的DNA序列、修飾的RNA序列(參見例如本文所述的修飾)、或它們的任何組合構成。連接單鏈引導多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列。在一個實施例中，連接單鏈引導多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的長度可為至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個核苷酸。在另一個實施例中，連接單鏈引導多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四環(huán)序列，諸如但不限于GAAA四環(huán)序列。引導多核苷酸、VT結構域和/或CER結構域的核苷酸序列修飾可選自但不限于5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。這些修飾可產生至少一種另外的有益特征，其中所述另外的有益特征選自改變的或調節(jié)的穩(wěn)定性、亞細胞靶向、跟蹤、熒光標記、蛋白質或蛋白質復合物的結合位點、改變的互補靶序列結合親和力、改變的細胞降解抗性、和提高的細胞滲透性。在本公開的一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸，該引導多核苷酸包括：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域(VT結構域)；以及(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域(CER結構域)，其中第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構成，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。第一核苷酸序列結構域(可變靶向結構域)和靶序列之間的互補性％可為至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在本公開的一個實施例中，引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域(VT結構域)和第二核苷酸序列結構域(CER結構域)位于單個分子上。在另一個實施例中，第二核苷酸序列結構域(Cas內切核酸酶識別結構域)包含能夠沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨分子。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域為DNA序列，并且第二核苷酸序列結構域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。在一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域(VT結構域)為DNA序列，并且第二核苷酸序列結構域(CER結構域)選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成稱為“引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物”的復合物，該復合物使Cas內切核酸酶能夠在DNA靶位點處引入雙鏈斷裂。在一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中引導多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域；以及(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。在另一個實施例中，組合物包含引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域(VT結構域)和第二核苷酸序列結構域(CER結構域)由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構成，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。在一個實施例中，引導多核苷酸可使用粒子轟擊直接引入到植物細胞中。當引導多核苷酸僅由RNA序列(也稱為“引導RNA”)組成時，其可通過引入包含有效連接到植物特異性啟動子的相應引導DNA序列的重組DNA分子而間接引入，該植物特異性啟動子能夠轉錄所述植物細胞中的引導多核苷酸。術語“相應引導DNA”是指如下DNA分子，該DNA分子與RNA分子相同但是RNA分子的每個“U”替換為“T”。在一些實施例中，引導多核苷酸通過粒子轟擊或包含可操作地連接至植物U6聚合酶III啟動子的相應引導DNA的重組DNA構建體的農桿菌(Agrobacterium)轉化來引入。術語“靶位點”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因組靶位點”、“基因組靶序列”和“基因組靶基因座”在本文中可互換使用并且指細胞的基因組(包括葉綠體和線粒體DNA)中的多核苷酸序列，在細胞基因組中在該多核苷酸序列處通過Cas內切核酸酶誘導雙鏈斷裂。靶位點可為細胞或生物體的基因組中的內源位點，或者另選地，靶位點可與細胞或生物體是異源的，從而不天然存在于基因組中，或靶位點與其天然出現的位置相比可存在于異源基因組位置中。如本文所用，術語“內源靶序列”和“天然靶序列”可在本文中互換使用并且是指這樣的靶序列，該靶序列對細胞或生物體的基因組為內源或天然的并且位于該靶序列在細胞或生物體的基因組中的內源或天然位置處。細胞包括但不限于動物、細菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。在一個實施例中，靶位點可類似于DNA識別位點或由雙鏈斷裂誘導劑特異性識別和/或結合的靶位點，所述雙鏈斷裂誘導劑諸如LIG3-4內切核酸酶(2009年5月21日公布的美國專利公布2009-0133152A1)或MS26++大范圍核酸酶(2012年6月19日提交的美國專利申請13/526912)。“人工靶位點”或“人工靶序列”在本文中可互換使用并且指已被引入到細胞或生物體(諸如但不限于植物或酵母)的基因組中的靶序列。這種人工靶序列可在序列上與細胞基因組中的內源或天然靶序列相同，但可位于細胞或生物體的基因組中的另一不同位置(即，非內源或非天然位置)?！案淖兊陌形稽c”、“改變的靶序列”、“修飾的靶位點”、“修飾的靶序列”在本文中可互換使用，并且指如本文所公開的當與未改變的靶序列相比時包含至少一種改變的靶序列。此類“改變”包括例如：(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何組合。本文中公開了用于修飾生物體(諸如但不限于植物或酵母)的基因組靶位點的方法。在一個實施例中，用于修飾植物細胞基因組中的靶位點的方法包括將引導多核苷酸引入到具有Cas內切核酸酶的細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。該方法可進一步包括鑒定至少一個在所述靶標處具有修飾的細胞，其中在所述靶位點處的修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。該方法還可進一步包括將供體DNA引入到所述細胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。還提供了用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括將引導多核苷酸和Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。該方法可進一步包括鑒定至少一個在所述靶標處具有修飾的細胞，其中在所述靶位點處的修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。該方法還可進一步包括將供體DNA引入到所述細胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。還提供了用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)將cr核苷酸、能夠表達tracrRNA的第一重組DNA構建體、能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA引入到細胞中，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。還提供了用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)將tracr核苷酸、能夠表達crRNA的第一重組DNA構建體、以及能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA引入到細胞中，其中所述tracr核苷酸選自脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。靶位點的長度可改變，并且包括例如長度為至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸的靶位點。靶位點還有可能是回文的，即一條鏈上的序列在互補鏈上從相反方向讀起來是一樣的。切口/裂解位點可在靶序列內，或切口/裂解位點可在靶序列之外。在另一個變型形式中，裂解可發(fā)生在互相正對著的核苷酸位置處以產生平端切口，或在其他情況中，切口可交錯以產生單鏈突出端，也稱“粘性末端”，可以為5′突出端或3′突出端。還可使用基因組靶位點的活性變體。此類活性變體可與給定靶位點具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性變體保留生物活性并且因此能夠由Cas內切核酸酶識別和裂解。通過內切核酸酶測量靶位點的雙鏈斷裂的測定法是本領域中已知的，并且通常測量該試劑對含有識別位點的DNA底物的總體活性和特異性。各種方法和組合物均可用于獲得具有插入到Cas內切核酸酶的靶位點中的感興趣的多核苷酸的細胞或生物體。此類方法可采用同源重組來提供感興趣的多核苷酸在靶位點處的整合。在提供的一種方法中，向供體DNA構建體中的細胞提供感興趣的多核苷酸。如本文所用，“供體DNA”是包含待插入到cas內切核酸酶的靶位點中的感興趣的多核苷酸的DNA構建體。任選地，供體DNA構建體還可包含感興趣的多核苷酸旁側的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域。供體DNA的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域分別與存在于植物基因組的靶位點中或旁側的第一基因組區(qū)域和第二基因組區(qū)域共享同源性。所謂“同源性”是指類似的DNA序列。例如，存在于供體DNA上的“基因組區(qū)域的同源性區(qū)域”是與植物基因組中的給定“基因組區(qū)域”具有類似序列的DNA區(qū)域。同源性區(qū)域可具有任何長度，該長度足以促進裂解靶位點處的同源重組。例如，同源性區(qū)域的長度可為至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多個堿基，使得同源性區(qū)域具有充分的同源性與相應的基因組區(qū)域發(fā)生同源重組。“充分的同源性”表明兩個多核苷酸序列具有充分的結構相似性以充當同源重組反應的底物。結構相似性包括每個多核苷酸片段的總體長度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通過序列的總長度上的序列同一性百分數，和/或通過包含局部化相似性的保守區(qū)域(如具有100％序列同一性的連續(xù)核苷酸)以及序列長度的一部分上的序列同一性百分數來描述。靶標和供體多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可變，包括總長度和/或具有在以下范圍內的單位整數值的區(qū)域：約1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或直到并包括該靶位點的總長度。這些范圍包括該范圍內的每個整數，例如1-20bp的范圍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通過兩個多核苷酸的完全比對長度上的序列同一性百分數來描述，所述序列同一性百分數包括約至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性百分數。充分的同源性包括多核苷酸長度、全局序列同一性百分數和連續(xù)核苷酸的任選保守區(qū)域或局部序列同一性百分數的任何組合，例如充分的同源性可描述為75-150bp的與靶基因座區(qū)域具有至少80％序列同一性的區(qū)域。充分的同源性還可通過所預測的兩個多核苷酸在高嚴格條件下特異性雜交的能力來描述，參見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)；CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人編輯(1994)CurrentProtocols，(GreenePublishingAssociates，Inc.和JohnWiley&Sons，Inc)；以及Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，(Elsevier，NewYork)。如本文所用，“基因組區(qū)域”是植物細胞基因組中的染色體的區(qū)段，該區(qū)段存在于靶位點的任一側上，或者另選地，還包含靶位點的一部分?；蚪M區(qū)域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多個堿基，使得基因組區(qū)域具有充分的同源性與相應的同源性區(qū)域發(fā)生同源重組。供體DNA上的同源性區(qū)域可與靶位點旁側的任何序列具有同源性。雖然在一些實施例中，同源性區(qū)域與緊鄰靶位點旁側的基因組序列共享顯著的序列同源性，但應當認識到，同源性區(qū)域可被設計為與如下區(qū)域具有充分的同源性，該區(qū)域可進一步位于靶位點的5′或3′處。在另外的實施例中，同源性區(qū)域還可與靶位點的片段連同下游基因組區(qū)域具有同源性。在一個實施例中，第一同源性區(qū)域還包含靶位點的第一片段并且第二同源性區(qū)域包含靶位點的第二片段，其中第一片段和第二片段不相似。如本文所用，“同源重組”是指兩個DNA分子之間在同源性位點處的DNA片段交換。同源重組的頻率受多個因素影響。不同的生物體在同源重組的量和同源與非同源重組的相對比例方面不同。一般地講，同源性區(qū)域的長度影響同源重組事件的頻率，同源性區(qū)域越長，頻率越高。為觀察到同源重組而需要的同源性區(qū)域的長度也是隨物種而異的。在許多情況下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情況下就已觀察到同源重組。參見例如Singer等人，(1982)Cell31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)MolCellBiol12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)MolCellBiol4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics115：161-7。植物細胞基因組的改變，例如通過同源重組(HR)改變，是遺傳工程的強大工具。盡管高等植物中的同源重組頻率低，但還是有植物內源基因同源重組的少數成功例子。植物中同源重組的參數已主要通過拯救(rescue)所引入的截短的選擇性標記基因進行了研究。在這些實驗中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之間。觀察到的同源重組頻率大約為10-4至10-5。參見例如Halfter等人，(1992)MolGenGenet231：186-93；Offringa等人，(1990)EMBOJ9：3077-84；Offringa等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)EMBOJ7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)MolGenGenet243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)PlantJ7：109-19。同源重組在昆蟲中已得到證明。Dray和Gloor在果蠅中發(fā)現，少至3kb的總模板：靶標同源性就足夠以適當的效率將大的非同源DNA區(qū)段復制到靶標中(Dray和Gloor，(1997)，Genetics，147：689-99)。Golic等人采用在果蠅中的靶標FRT處進行FLP介導的DNA整合，證實了當供體和靶標共享4.1kb的同源性時，與1.1kb的同源性時相比，整合效率大約高10倍(Golic等人，(1997)，NucleicAcidsRes，25：3665)。來自果蠅的數據表明，2-4kb的同源性對于有效靶向是充足的，但是有一些證據證明低得多的同源性-約30bp至約100bp范圍內-可能就足夠(Nassif和Engels，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)MolCellBiol17：627-34)。也在其他生物體中實現了同源重組。例如，在寄生性原生動物利什曼蟲中進行同源重組需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)NucleicAcidsRes25：4278-86)。在絲狀真菌構巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，用少至50bp旁側同源性實現了基因替換(Chaveroche等人，(2000)NucleicAcidsRes28：e97)。在纖毛蟲嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中也證明了所靶向基因替換(Gaertig等人，(1994)NucleicAcidsRes22：5391-8)。在哺乳動物中，使用可培養(yǎng)生長、轉化、選擇和引入到小鼠胚胎中的多能胚胎干細胞系(ES)，同源重組在小鼠中已經是最成功的。帶有插入的轉基因ES細胞的胚胎發(fā)育成遺傳后代。通過將同胞小鼠進行雜種繁殖，可獲得攜帶選定的基因的純合小鼠。該方法的概述在以下文獻中提供：Watson等人，(1992)RecombinantDNA，第2版，(ScientificAmericanBooks，WHFreeman&Co.出版)；Capecchi，(1989)TrendsGenet5：70-6；以及Bronson，(1994)JBiolChem269：27155-8。由于缺乏能夠移植到卵母細胞或發(fā)育的胚胎中的干細胞，在小鼠以外的哺乳動物中的同源重組曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature405：1066-9(2000)報道了通過在原代胚胎成纖維細胞中進行轉化和選擇在綿羊中成功進行了同源重組。一旦在DNA中誘導產生雙鏈斷裂，細胞的DNA修復機制就被激活以修復斷裂。易錯DNA修復機制可在雙鏈斷裂位點產生突變。將斷裂端連到一起的最常用修復機制是非同源末端連接(NHEJ)途徑(Bleuyard等人，(2006)DNARepair5：1-12)。染色體的結構完整性通常通過修復來保持，但缺失、插入或其他重排都是可能發(fā)生的(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。一個雙鏈斷裂的兩個末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBOJ19：5562-6)，但是，如果出現兩個不同的雙鏈斷裂，則來自不同斷裂的游離末端可連接并導致染色體缺失(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell14：1121-31)，或不同染色體之間的染色體易位(Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。也可將附加型DNA分子連接到雙鏈斷裂中，例如將T-DNA整合到染色體雙鏈斷裂中(Chilton和Que，(2003)PlantPhysiol133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)EMBOJ17：6086-95)。一旦雙鏈斷裂周圍的序列被改變，例如被參與雙鏈斷裂成熟的外切核酸酶活性改變，則基因轉換途徑可恢復原始結構，如果有同源序列的話，如非分裂的體細胞中的同源染色體，或DNA復制后的姊妹染色單體(Molinier等人，(2004)PlantCell16：342-52)。異位的和/或表成的DNA序列也可充當DNA修復模板用于同源重組(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。另選地，雙鏈斷裂可通過同源DNA序列之間的同源重組來修復。一旦雙鏈斷裂周圍的序列被改變，例如被參與雙鏈斷裂成熟的外切核酸酶活性改變，如果有同源序列的話，如非分裂的體細胞中的同源染色體，或DNA復制后的姊妹染色單體(Molinier等人，(2004)PlantCell16：342-52)，則基因轉換途徑可恢復原始結構。異位的和/或表成的DNA序列也可充當DNA修復模板用于同源重組(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。DNA雙鏈斷裂似乎是刺激同源重組途徑的有效因子(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol28：281-92；Tzfira和White，(2005)TrendsBiotechnol23：567-9；Puchta，(2005)JExpBot56：1-14)。使用DNA斷裂劑，在植物中人工構建的同源DNA重復序列之間觀察到同源重組提高兩倍至九倍(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol28：281-92)。在玉米原生質體中，用線狀DNA分子進行實驗證明了質粒之間的同源重組增強(Lyznik等人，(1991)MolGenGenet230：209-18)。在一些實施例中，本文中提供的方法包括使細胞與供體DNA和Cas內切核酸酶接觸。一旦通過Cas內切核酸酶將雙鏈斷裂引入靶位點中，則供體DNA的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域可經歷與其相應的同源性基因組區(qū)域的同源重組，從而在供體和基因組之間進行DNA交換。因此，所提供的方法使供體DNA的感興趣的多核苷酸整合到細胞或生物體基因組的靶位點處的雙鏈斷裂中，從而改變原始靶位點并產生改變的基因組靶位點。在本公開的一個實施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)將引導多核苷酸、供體DNA和Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸?？赏ㄟ^本領域中已知的任何方式引入引導多核苷酸、Cas內切核酸酶和供體DNA。這些方式包括但不限于通過粒子轟擊直接遞送每種組分，通過一個或多個重組DNA表達盒遞送，或它們的任意組合。在本公開的一些實施例中，該方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，其中使用能夠表達供體DNA和/或Cas內切核酸酶的至少一個重組DNA構建體將供體DNA和Cas內切核酸酶引入到所述細胞中；并且/或其中引導多核苷酸通過粒子轟擊直接引入。在本公開的另一個實施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)將能夠表達引導多核苷酸的第一重組DNA構建體、以及能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA構建體引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸?？赏ㄟ^本領域已知的任何方式引入供體DNA。例如，提供了細胞或生物體，諸如但不限于具有靶位點的植物或酵母。供體DNA可通過本領域中已知的任何轉化方法來提供，所述轉化方法包括例如農桿菌介導的轉化或基因槍粒子轟擊。供體DNA可瞬時地存在于細胞中或其可通過病毒復制子引入。在Cas內切核酸酶和靶位點的存在下，供體DNA被插入到轉化的基因組中。另一個方法采用對現有的歸巢內切核酸酶進行蛋白質工程改造以改變它們的靶標特異性。歸巢內切核酸酶，如I-SceI或I-CreI，能結合和裂解相對較長的DNA識別序列(分別為18bp和22bp)。這些序列據預測在基因組中很少天然發(fā)生，通常僅1或2個位點/基因組。歸巢內切核酸酶的裂解特異性可通過合理設計在DNA結合結構域處的氨基酸替換和/或突變單體的組合裝配和選擇來改變(參見例如Arnould等人，(2006)JMolBiol355：443-58；Ashworth等人，(2006)Nature441：656-9；Doyon等人，(2006)JAmChemSoc128：2477-84；Rosen等人，(2006)NucleicAcidsRes34：4791-800；以及Smith等人，(2006)NucleicAcidsRes34：e149；Lyznik等人(2009)美國專利申請公布20090133152A1；Smith等人(2007)美國專利申請公布20070117128A1)。已證明了經工程改造的大范圍核酸酶能裂解同族突變位點而不擴大它們的特異性。將對野生型酵母I-SceI歸巢核酸酶具有特異性的人工識別位點引入到玉米基因組中，檢測到當轉基因I-SceI通過雜交引入并且通過基因切除激活時，在1％的被分析的F1植物中存在識別序列的突變(Yang等人，(2009)PlantMolBiol70：669-79)。更實際的是，使用基于I-CreI大范圍核酸酶序列進行設計的工程改造的單鏈內切核酸酶靶向玉米無舌葉基因座(ligulelesslocus)。當設計的歸巢核酸酶通過農桿菌介導轉化不成熟胚來引入時，在3％的TO轉基因植物中檢測到選定的無舌葉基因座識別序列的突變(Gao等人，(2010)PlantJ61：176-87)。感興趣的多核苷酸在本文中進一步描述并且反映出作物開發(fā)參與者的商業(yè)市場和利益。感興趣的作物和市場在變化，隨著發(fā)展中國家開放了世界市場，也將出現新的作物和技術。另外，隨著我們對農學性狀和特性諸如產量和雜種優(yōu)勢的理解逐漸深入，基因工程的選擇將相應地變化。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)進行的基因組編輯。如本文所述，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板結合使用，允許編輯感興趣的基因組核苷酸序列。雖然存在許多雙鏈斷裂制造系統(tǒng)，但其實際應用于基因編輯可能由于所誘導的雙鏈斷裂(DSB)的頻率相對較低而受限。迄今為止，許多基因組修飾方法依賴于同源重組系統(tǒng)。同源重組(HR)可提供用于找到感興趣的基因組DNA序列并且根據實驗規(guī)范修飾它們的分子方法。同源重組以低頻率在植物體細胞中發(fā)生。該過程可通過在所選擇的內切核酸酶靶位點處引入雙鏈斷裂(DSB)而增強到用于基因組工程的實際水平。所面臨的挑戰(zhàn)是有效地在感興趣的基因組位點處形成DSB，因為兩個相互作用的DNA分子之間的信息傳遞的方向性存在偏差(斷裂的分子充當遺傳學信息的受體)。本文描述了引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)的用途，即，提供靈活的基因組裂解特異性并且在DNA靶位點處產生高頻率的雙鏈斷裂，從而實現在感興趣的核苷酸序列中的高效基因編輯，其中待編輯的感興趣的核苷酸序列可位于由Cas內切核酸酶識別和裂解的靶位點之內或之外?！靶揎椀暮塑账帷被颉熬庉嫷暮塑账帷笔侵冈谂c未修飾的核苷酸序列相比時包含至少一種改變的感興趣的核苷酸序列。此類“改變”包括例如：(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何組合。術語“多核苷酸修飾模板”是指當與待編輯的核苷酸序列相比時包含至少一種核苷酸修飾的多核苷酸。核苷酸修飾可為至少一個核苷酸的替換、添加或缺失。任選地，多核苷酸修飾模板還可包含至少一種核苷酸修飾旁側的同源核苷酸序列，其中旁側同源核苷酸序列向待編輯的所需核苷酸序列提供充分的同源性。在一個實施例中，本公開描述了用于編輯細胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中Cas內切核酸酶在所述細胞基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。細胞包括但不限于動物、細菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。待編輯的核苷酸可位于由Cas內切核酸酶識別和裂解的靶位點之內或之外。在一個實施例中，所述至少一種核苷酸修飾不是在由Cas內切核酸酶識別和裂解的靶位點處的修飾。在另一個實施例中，待編輯的至少一個核苷酸與基因組靶位點之間存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000個核苷酸。待編輯的核苷酸序列可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的序列。例如，細胞基因組中的核苷酸序列可為穩(wěn)定地摻入到細胞基因組中的轉基因。編輯這樣的轉基因可得到另外的所需表型或基因型。細胞基因組中的核苷酸序列還可為突變的或預先存在的序列，其為從諸如感興趣的內源基因或突變基因之類的起源內生或人造的。在一個實施例中，核苷酸序列可為啟動子，其中編輯啟動子導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動子活性、提高的啟動子組織特異性、降低的啟動子活性、降低的啟動子組織特異性、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的缺失或添加。在一個實施例中，核苷酸序列可為細胞基因組中的調控序列。調控序列為能夠提高或降低生物體內特定基因的表達的核酸分子的區(qū)段。調控序列的例子包括但不限于轉錄激活因子、轉錄阻遏子和翻譯阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、CAAT盒、CCAAT盒、普里布諾盒、TATA盒、SECIS元件和聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，編輯調控元件導致改變的蛋白質翻譯、RNA裂解、RNA剪接或轉錄終止。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的調控序列修飾在一個實施例中，待修飾的核苷酸序列可為調控序列，諸如啟動子，其中編輯啟動子包括將啟動子或啟動子片段替換(也稱為“啟動子交換”或“啟動子替換”)為不同的啟動子(也稱為替換啟動子)或啟動子片段(也稱為替換啟動子片段)，其中啟動子替換導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動子活性、提高的啟動子組織特異性、降低的啟動子活性、降低的啟動子組織特異性、新的啟動子活性、誘導型啟動子活性、延長的基因表達窗、同一細胞層或其他細胞層中基因表達的時機或發(fā)育進度的修飾(諸如但不限于延長玉米花藥的絨氈層中基因表達的時機(1998年11月17日公布的US5,837,850))、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的缺失或添加。待修飾的啟動子(或啟動子片段)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的啟動子(或啟動子片段)。替換啟動子(或替換啟動子片段)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的啟動子(或啟動子片段)。在一個實施例中，核苷酸序列可為啟動子，其中編輯啟動子包括將ARGOS8啟動子替換為玉蜀黍(Zeamays)GOS2PRO：GOS2-內含子啟動子。在一個實施例中，核苷酸序列可為啟動子，其中編輯啟動子包括將天然EPSPS1啟動子替換為植物泛素啟動子。在一個實施例中，核苷酸序列可為啟動子，其中編輯啟動子包括將內源玉米NPK1啟動子替換為脅迫誘導型玉米RAB17啟動子。在一個實施例中，核苷酸序列可為啟動子，其中待編輯的啟動子選自玉蜀黍-PEPCI啟動子(Kausch等人，PlantMolecularBiology，45：1-15，2001)、玉蜀黍泛素啟動子(UBI1ZMPRO，Christensen等人，plantMolecularBiology18：675-689，1992)、玉蜀黍-Rootmet2啟動子(US7,214,855)、稻肌動蛋白啟動子(OS-ACTINPRO，US5641876；McElroy等人，ThePlantCell，第2卷，163-171，1990年2月)、高粱RCC3啟動子(2012年2月13日提交的US2012/0210463)、玉蜀黍-GOS2啟動子(US6,504,083)、玉蜀黍-ACO2啟動子(2014年3月14日提交的美國申請14/210,711)或玉蜀黍-油質蛋白啟動子(US8466341B2)。在另一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板或供體DNA序列結合使用以允許將啟動子或啟動子元件插入到感興趣的基因組核苷酸序列中，其中啟動子插入(或啟動子元件插入)導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動子活性(提高的啟動子強度)、提高的啟動子組織特異性、降低的啟動子活性、降低的啟動子組織特異性、新的啟動子活性、誘導型啟動子活性、延長的基因表達窗、基因表達的時機或發(fā)育進度的修飾、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的添加。待插入的啟動子元件可為但不限于啟動子核心元件(諸如但不限于CAAT盒、CCAAT盒、普里布諾盒和/或TATA盒)、用于誘導型表達的翻譯調控序列和/或阻遏子系統(tǒng)(諸如TET操縱子阻遏子/操縱子/誘導物元件、或磺酰脲類(Su)阻遏子/操縱子/誘導物元件)。脫水響應元件(DRE)首先經鑒定為干旱響應基因rd29A的啟動子中的順式作用啟動子元件，其包含9bp保守核心序列TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)PlantCell6，251-264)。將DRE插入到內源啟動子中可賦予下游基因干旱誘導型表達。另一個例子是ABA響應元件(ABRE)，其包含據發(fā)現存在于許多ABA和/或脅迫調節(jié)的基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(BuskP.K.，PagesM.(1998)PlantMol.Biol.37：425-435)。將35S增強子或MMV增強子插入到內源啟動子區(qū)中將提高基因表達(美國專利5196525)。待插入的啟動子(或啟動子元件)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的啟動子(或啟動子元件)。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于在內源FMT1啟動子前面插入增強子元件(諸如但不限于花椰菜花葉病毒35S增強子)以增強FTM1的表達。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于將TET操縱子阻遏子/操縱子/誘導物系統(tǒng)的組分、或磺酰脲類(Su)阻遏子/操縱子/誘導物系統(tǒng)的組分插入到植物基因組中，以生成或控制誘導型表達系統(tǒng)。在另一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于允許啟動子或啟動子元件的缺失，其中啟動子缺失(或啟動子元件缺失)導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：永久失活的基因座、提高的啟動子活性(提高的啟動子強度)、提高的啟動子組織特異性、降低的啟動子活性、降低的啟動子組織特異性、新的啟動子活性、誘導型啟動子活性、延長的基因表達窗、基因表達的時機或發(fā)育進度的修飾、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的添加。待缺失的啟動子元件可為但不限于啟動子核心元件、啟動子增強子元件或35S增強子元件(如實例32中所述)。待缺失的啟動子或啟動子片段對于正在編輯的細胞可為內源、人工、預先存在、或轉基因的。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于缺失存在于玉米基因組中的ARGOS8啟動子，如本文所述。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于缺失存在于植物基因組中的35S增強子元件，如本文所述。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的終止子修飾在一個實施例中，待修飾的核苷酸序列可為終止子，其中編輯終止子包括將終止子或終止子片段替換(也稱為“終止子交換”或“終止子替換”)為不同的終止子(也稱為替換終止子)或終止子片段(也稱為替換終止子片段)，其中終止子替換導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的缺失或添加。待修飾的終止子(或終止子片段)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的終止子(或終止子片段)。替換終止子(或替換終止子片段)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的終止子(或終止子片段)。在一個實施例中，待修飾的核苷酸序列可為終止子，其中待編輯的終止子選自：來自玉米Argos8或SRTF18基因的終止子，或其他終止子，諸如馬鈴薯PinII終止子、高粱肌動蛋白終止子(SB-ACTINTERM，2013年12月公布的WO2013/184537A1)、高粱SB-GKAFTERM(WO2013019461)、稻T28終止子(OS-T28TERM，WO2013/012729A2)、AT-T9TERM(WO2013/012729A2)或GZ-W64ATERM(US7053282)。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板或供體DNA序列結合使用以允許將終止子或終止子元件插入到感興趣的基因組核苷酸序列中，其中終止子插入(或終止子元件插入)導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性(提高的終止子強度)、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的添加。待插入的終止子(或終止子元件)可為對于正在編輯的細胞為內源、人工、預先存在、或轉基因的終止子(或終止子元件)。在另一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于允許終止子或終止子元件的缺失，其中終止子缺失(或終止子元件缺失)導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性(提高的終止子強度)、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結合元件的突變和/或DNA結合元件的添加。待缺失的終止子或終止子片段對于正在編輯的細胞可為內源、人工、預先存在、或轉基因的。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的另外的調控序列修飾在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于修飾或替換細胞基因組中的調控序列。調控序列為能夠提高或降低生物體內特定基因的表達并且/或能夠改變生物體內基因的組織特異性表達的核酸分子的區(qū)段。調控序列的例子包括但不限于3’UTR(非翻譯區(qū))區(qū)、5’UTR區(qū)、轉錄激活因子、轉錄增強子、轉錄阻遏子、翻譯阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、啟動子元件、CAMV35S增強子、MMV增強子元件(2013年3月11日提交的PCT/US14/23451)、SECIS元件、聚腺苷酸化信號，以及聚泛素化位點。在一些實施例中，編輯(修飾)或替換調控元件導致改變的蛋白質翻譯、RNA裂解、RNA剪接、轉錄終止或翻譯后修飾。在一個實施例中，可鑒定啟動子內的調控元件并且可編輯或修飾這些調控元件，從而優(yōu)化這些調控元件對啟動子的上調或下調。在一個實施例中，待修飾的感興趣的基因組序列是聚泛素化位點，其中聚泛素化位點的修飾改變了蛋白質降解速度。泛素標簽使蛋白質通過蛋白酶體或自體吞噬降解。已知蛋白酶體抑制劑導致蛋白質生產過剩。對編碼感興趣的蛋白質的DNA序列的修飾可產生感興趣的蛋白質的至少一種氨基酸修飾，其中所述修飾允許蛋白質的聚泛素化(翻譯后修飾)，從而導致對蛋白質降解的修飾。在一個實施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為玉米EPSPS基因上的聚泛素化位點，其中聚泛素化位點經修飾后，由于EPSPS蛋白質降解速度減慢，所以蛋白質含量提高。在一個實施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內含子位點，其中該修飾包括將內含子增強基元插入到內含子中，這引起對包含所述內含子的基因的轉錄活性的調節(jié)。在一個實施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內含子位點，其中該修飾包括將大豆EPSP1內含子替換為大豆泛素內含子1，如本文所述(實例25)。在一個實施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內含子或UTR位點，其中該修飾包括將至少一個微RNA插入到所述內含子或UTR位點，其中包含內含子或UTR位點的基因的表達還引起所述微RNA的表達，這繼而可沉默由微RNA靶向的任何基因而不破壞包含所述內含子的天然/轉基因的基因表達。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于允許鋅指轉錄因子的缺失或突變，其中鋅指轉錄因子的缺失或突變導致或允許形成顯性負性鋅指轉錄因子突變體(Li等人2013RicezincfingerproteinDSTenhancesgrainproductionthroughcontrollingGnla/OsCKX2expressionPNAS110：3167-3172)。在鋅指結構域下游插入單個堿基對將導致移碼并且產生新蛋白質，該新蛋白質可在沒有轉錄活性的情況下仍結合到DNA。突變型蛋白將競爭結合到細胞分裂素氧化酶基因啟動子并且阻斷細胞分裂素氧化酶基因的表達。細胞分裂素氧化酶基因表達的減少將提高細胞分裂素水平并且促進稻中的稻穗生長和玉米中的穗生長，并且提高在正常和脅迫條件下的產量。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)修飾剪接位點和/或引入替代剪接位點蛋白質合成使用由前mRNA分子經受成熟過程產生的mRNA分子。通過添加多A尾對前mRNA分子進行加帽、剪接和穩(wěn)定化。真核細胞進化出復雜的剪接過程，該過程產生原始前mRNA分子的備選變體。真核細胞中的一些可能不產生用于蛋白質合成的功能模板。在玉米細胞中，剪接過程受外顯子-內含子連接位點處的剪接位點影響。典型的剪接位點的例子是AGGT。基因編碼序列可包含多個替代剪接位點，其可影響前mRNA成熟過程的總體效率，因而可限制細胞中的蛋白質積累。引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板結合使用來編輯感興趣的基因，從而在剪接位點的所述連接點或任何變體處引入典型的剪接位點，所述剪接位點改變前mRNA分子的剪接模式。在一個實施例中，待修飾的感興趣的核苷酸序列為玉米EPSPS基因，其中基因的修飾包括修飾可選的剪接位點，從而提高功能基因轉錄物和基因產物(蛋白質)的產量。在一個實施例中，待修飾的感興趣的核苷酸序列為基因，其中基因的修飾包括編輯可選地剪接的基因的內含子邊界以改變剪接變體的積累。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)進行的編碼感興趣的蛋白質的核苷酸序列的修飾在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于修飾或替換細胞基因組中的編碼序列，其中修飾或替換導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的蛋白質(酶)活性、提高的蛋白質功能性、降低的蛋白質活性、降低的蛋白質功能性、位點特異性突變、蛋白質結構域交換、蛋白質敲除、新的蛋白質功能性、修飾的蛋白質功能性。在一個實施例中，蛋白質敲除是由于將終止密碼子引入到感興趣的編碼序列中造成的。在一個實施例中，蛋白質敲除是由于感興趣的編碼序列中的起始密碼子的缺失造成的。使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的氨基酸和/或蛋白質融合在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼第一蛋白質的第一編碼序列融合到編碼細胞基因組中的第二蛋白質的第二編碼序列，其中蛋白質融合導致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的蛋白質(酶)活性、提高的蛋白質功能性、降低的蛋白質活性、降低的蛋白質功能性、新的蛋白質功能性、修飾的蛋白質功能性、新的蛋白質定位、新的蛋白質表達時機、修飾的蛋白質表達模式、嵌合蛋白質，或具有顯性表型功能性的修飾蛋白質。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號的第一編碼序列融合到編碼感興趣的蛋白質的第二編碼序列，其中蛋白質融合將感興趣的蛋白質靶向到葉綠體。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號的第一編碼序列融合到編碼感興趣的蛋白質的第二編碼序列，其中蛋白質融合將感興趣的蛋白質靶向到葉綠體。在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號(例如，葉綠體轉運肽)的第一編碼序列融合到第二編碼序列，其中蛋白質融合產生具有顯性表型功能性的修飾蛋白質。通過使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)在感興趣的基因中表達反向重復進行的基因沉默在一個實施例中，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列結合使用以將反向基因片段插入到生物體基因組的感興趣的基因中，其中插入反向基因片段可允許在體內創(chuàng)建反向重復(發(fā)夾)并且導致所述內源基因的沉默。在一個實施例中，插入反向基因片段可導致在基因的天然(或修飾的)啟動子和/或天然基因的天然5’端中形成體內創(chuàng)建的反向重復(發(fā)夾)。反向基因片段還可包含內含子，其可導致所靶向基因的增強沉默。用于性狀基因座表征的基因組缺失植物育種中的性狀定位通常會檢測其中含有控制感興趣的性狀表達的一個或多個基因的染色體區(qū)域。對于質量性狀，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于消除所鑒定的染色體區(qū)域中的候選基因，以確定所述基因的缺失是否影響性狀的表達。對于數量性狀，感興趣的性狀的表達取決于在一個或多個染色體上效應量、復雜性和統(tǒng)計顯著性不同的多個數量性狀基因座(QTL)。在負面效應或有害QTL區(qū)域影響復雜性狀的情況下，引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)可用于消除由標記輔助的精細定位界定的整個區(qū)域，以及用于靶向特定區(qū)域來進行其選擇性消除或重排。類似地，存在/不存在變異(PAV)或拷貝數變異(CNV)可使用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)通過選擇性基因組缺失操縱。在一個實施例中，感興趣的區(qū)域可在旁側帶有兩個獨立的引導多核苷酸/CAS內切核酸酶靶序列。裂解將同時進行。缺失事件將為不具有感興趣的區(qū)域的兩個染色體末端的修復。可選結果將包括感興趣的區(qū)域的倒位，在切割位點處的突變以及感興趣的區(qū)域的重復。用于鑒定在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸的至少一個植物細胞的方法。還提供了用于鑒定在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸的至少一個植物細胞的方法。有多種方法可用于鑒定在靶位點處或附近具有對基因組的插入的那些植物細胞，而無須使用可篩選的標記表型。這種方法可認為是直接分析靶序列以檢測靶序列中的任何變化，包括但不限于PCR方法、測序方法、核酸酶消化、DNA印跡法以及它們的任何組合。參見例如，美國專利申請12/147,834以本文所述方法所需的程度并入本文中。該方法還包括由包含整合到其基因組中的感興趣的多核苷酸的植物細胞再生植物。該植物可為不育的或能育的。已經認識到任何感興趣的多核苷酸均可在靶位點處提供、整合到植物基因組中，并且在植物中表達。感興趣的多核苷酸/多肽包括但不限于除草劑耐受性編碼序列、殺昆蟲編碼序列、殺線蟲編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物和生物脅迫耐受性編碼序列、或修飾植物性狀例如產量、谷粒質量、營養(yǎng)成分、淀粉質量和數量、固氮和/或氮利用、脂肪酸以及含油量和/或油組成的序列。更具體的感興趣的多核苷酸包括但不限于改善作物產量的基因，改善作物合意性的多肽，編碼賦予對非生物壓力例如干旱、氮、溫度、鹽度、有毒金屬或微量元素的抗性的蛋白或賦予對毒素例如殺蟲劑和除草劑的抗性的那些蛋白或賦予對生物壓力例如真菌、病毒、細菌、昆蟲和線蟲入侵的抗性及對與這些生物體相關疾病的發(fā)展的抗性的那些蛋白的基因。感興趣的基因的大體類別包括例如涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及管家的那些基因(如熱休克蛋白)。轉基因的更具體類別例如包括編碼對農藝學、昆蟲抗性、病害抗性、除草劑抗性、能育性或不育性、谷粒特性和商業(yè)產品重要的性狀的基因。一般而言，感興趣的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營養(yǎng)物質代謝的那些以及影響籽粒大小、蔗糖載量等的那些，所述性狀可與其他性狀堆疊或組合使用，所述其他性狀諸如但不限于本文所述的除草劑抗性。除了使用傳統(tǒng)的育種方法外，還可通過遺傳方式改變農藝上重要的性狀，比如油脂含量、淀粉含量和蛋白質含量。修飾包括提高油酸、飽和油脂與不飽和油脂的含量，提升賴氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修飾淀粉。美國專利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389描述了大麥硫堇(Hordothionin)蛋白質修飾法，這些專利都以引用方式并入本文。另一個例子是美國專利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或富含硫的種子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的來自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，這些文獻的公開內容都以引用方式并入本文。還可在感興趣的多核苷酸上編碼可提高例如用于乙醇生產的淀粉，或提供蛋白質的表達的商業(yè)性狀。經轉化植物的另一個重要商業(yè)用途是生產聚合物和生物塑料，如美國專利5,602,321中所述。諸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙?；?CoA還原酶的基因(參見Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達?？赏ㄟ^定點誘變產生編碼序列的衍生物，由此提高預選氨基酸在所編碼的多肽中的水平。舉例來說，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因源自大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑(1996年11月1日提交的美國申請序列號08/740,682，以及WO98/20133，這些專利的公開內容以引用方式并入本文)。其他蛋白質包括富含甲硫氨酸的植物蛋白質，諸如來自葵花籽的蛋白質(Lilley等人(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，Applewhite編輯(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，第497-502頁；該文獻以引用方式并入本文)；來自玉米的蛋白質(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359，這兩篇文獻均以引用方式并入本文)和來自稻的蛋白質(Musumura等人(1989)PlantMol.Biol.12：123，該文獻以引用方式并入本文)。其他農藝上重要的基因編碼膠乳、Floury2、生長因子、種子貯藏因子和轉錄因子。改善作物產量的多核苷酸包括矮化基因，如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature400：256-261)以及提高植物生長的那些，如銨誘導型谷氨酸脫氫酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允許植物具有減少的飽和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物營養(yǎng)價值的那些多核苷酸、以及提高籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善鹽耐受性的多核苷酸是提高或允許植物在與已引入耐鹽基因的該植物的天然環(huán)境相比更高鹽度的環(huán)境中生長的那些多核苷酸。影響氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如鄰氨基苯甲酸合酶(AS；EC4.1.3.27)，該酶催化植物、真菌和細菌中從芳族氨基酸途徑分支到色氨酸生物合成的第一反應。在植物中，色氨酸生物合成的化學過程處于葉綠體區(qū)室中。參見例如美國公布20080050506，這篇文獻以引用方式并入本文。另外的感興趣的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指編碼催化分支酸轉化為丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已從大腸桿菌中分離并具有GenBank登錄號M96268。參見美國專利7,361,811，將其以引用的方式并入本文。這些感興趣的多核苷酸序列可編碼涉及提供病害或害蟲抗性的蛋白。所謂“病害抗性”或“害蟲抗性”意指植物避開作為植物-病原體相互作用的后果的有害癥狀。害蟲抗性基因可編碼對嚴重影響產量的害蟲如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和昆蟲抗性基因，如用于抗細菌保護的溶菌酶或天蠶抗菌肽(cecropin)，或用于抗真菌保護的蛋白質如防御素、葡聚糖酶或幾丁質酶，或用于防治線蟲或昆蟲的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)內毒素、蛋白酶抑制劑、膠原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因產物的例子。編碼病害抗性性狀的基因包括解毒基因，如抗伏馬毒素(美國專利5,792,931)；無毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)等等。昆蟲抗性基因可編碼針對會導致產量大跌的害蟲(諸如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等)的抗性。這種基因包括例如蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因(美國專利5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109)等等?！俺輨┛剐缘鞍住被蛴伞俺輨┛剐跃幋a核酸分子”表達生成的蛋白質包括這樣的蛋白質，其賦予細胞與未表達該蛋白質的細胞相比耐受更高濃度除草劑的能力，或賦予細胞與未表達該蛋白質的細胞相比對某種濃度除草劑耐受更長時間的能力。除草劑抗性性狀可通過如下基因引入到植物中：編碼對乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草劑(特別是磺酰脲類除草劑)的抗性的基因、編碼對谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草劑例如膦絲菌素或basta的抗性的基因(如，bar基因)、對草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、對HPPD抑制劑的抗性的基因(如，HPPD基因)或本領域已知的其他這類基因。參見例如美國專利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美國臨時申請61/401,456，將所述專利每一者以引用的方式并入本文。bar基因編碼對除草劑basta的抗性，nptII基因編碼對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因突變體編碼對除草劑氯磺隆的抗性。不育基因也可編碼在表達盒中，為物理去雄提供備選方案。以此類方式使用的基因的例子包括雄性育性基因，諸如MS26(參見例如美國專利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(參見例如美國專利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(參見例如美國專利7,919,676)。玉米植物(玉蜀黍(ZeamaysL.))可通過自花授粉和異花授粉兩種技術來進行育種。在同一植株上，玉米具有位于雄穗上的雄花，以及位于雌穗上的雌花。其可自花授粉(“自交”)或異花授粉。當風將花粉從雄穗吹至從初始雌穗頂部突出的穗絲時在玉米中發(fā)生天然的授粉。授粉可通過本領域的技術人員已知的技術容易地控制。玉米雜交體的開發(fā)需要純合近交系的開發(fā)、這些近交系的雜交和雜交的評估。譜系選擇和輪回選擇是用于從群體開發(fā)近交系的兩種育種方法。育種程序將來自兩種或更多種近交系或各種廣泛來源的所需性狀結合到育種庫中，從育種庫中通過自交并選擇所需表型來開發(fā)新的近交系。雜交玉米品種是兩個此類近交系的雜交，所述近交系中的每個可能具有一種或多種在另一近交系中缺乏的所需特性，或補充另一近交系的所需特性。使新的近交株與其他近交系雜交，并且對來自這些雜交的雜交體進行評價以確定哪些具有商業(yè)潛力。第一代雜交子代稱為F1。F1雜交體比其自交親本更有活力。該雜交體活力(或雜種優(yōu)勢)可以多種方式體現，包括提高的營養(yǎng)生長和提高的產量。雜交玉米種子可通過結合了人工去雄的雄性不育系統(tǒng)產生。為了產生雜交種子，將雄穗從生長的雌性近交親本移除，其可以與雄性近交親本成交替行的多種模式種植。因此，在與外來玉米花粉的來源充分隔離的前提條件下，磁性近交株的雌穗將僅通過來自雄性近交株的花粉受精。因此所得種子是雜交體(F1)并且將形成雜交植物。影響植物發(fā)育的田地變化可導致植物在雌性親本的人工去雄完成之后抽穗。或者，雌性近交植物雄穗可能無法在去雄過程期間被完全移除。在任何情況下，結果是雌性植物將成功地散出花粉并且一些雌性植物將自花授粉。這將導致雌性近交株的種子連同正常產生的雜交種子一起收獲。雌性近交株種子不表現出雜種優(yōu)勢并且因此不如F1種子高產。此外，雌性近交株種子的存在對于生產雜交體的公司可能意味著種質安全風險。另選地，雌性近交株可通過機器機械地去雄。機械去雄大致如手工去雄一樣可靠，但是更快并且成本更低。然而，大多數去雄機器比手工去雄對植物產生更多損害。因此，目前沒有一種去雄形式是完全令人滿意的，并且仍然需要進一步降低生產成本的替代品以及消除雜交種子生產中雌性親本的自花授粉。造成植物中雄性不育的突變有潛力可用于作物植物(諸如玉米)的雜交種子生產的方法中，并且可通過以下方式來降低生產成本：消除耗費勞力地從用作雜交親本的母本植物移除雄花(也稱為去雄)的需要。已有多種方法可產生造成玉米中雄性不育的突變，諸如X射線或紫外線照射、化學處理或轉座元件插入(ms23、ms25、ms26、ms32)(Chaubal等人(2000)AmJBot87：1193-1201)。通過育性/不育性“分子開關”對育性基因進行條件調控可增強設計用于作物改良的新雄性不育性系統(tǒng)的選擇性(Unger等人(2002)TransgenicRes11：455-465)。除了鑒定影響雄性育性的新型基因之外，還需要提供產生遺傳雄性不育性的可靠系統(tǒng)。在美國專利5,478,369中，描述了一種方法，通過該方法將Ms45雄性育性基因加標簽并克隆在玉米9號染色體上。此前，已描述了9號染色體上的從未被克隆和測序的雄性育性基因ms2。該基因不是‘369專利中提到的基因的等位基因。參見Albertsen，M.和Phillips，R.L.，“DevelopmentalCytologyof13GeneticMaleSterileLociinMaize”CanadianJournalofGenetics&Cytology23：195-208(1981年1月)。在此之前克隆的僅有的育性基因是Aarts等人(出處同上)描述的擬南芥(Arabidopsis)基因。隨后發(fā)現的對于雄性育性重要的基因的例子有很多并且包括擬南芥敗育小孢子(AMS)基因(Sorensen等人，ThePlantJournal(2003)33(2)：413-423)；擬南芥MS1基因(Wilson等人，ThePlantJournal(2001)39(2)：170-181)；NEF1基因(Ariizumi等人，ThePlantJournal(2004)39(2)：170-181)；擬南芥AtGPAT1基因(Zheng等人，ThePlantCell(2003)15：1872-1887)；擬南芥dde2-2突變被示為缺乏丙二烯氧合酶基因(Malek等人，Planta(2002)216：187-192)；擬南芥匿名(faceless)花粉-1基因(flp1)(Ariizumi等人，PlantMol.Biol.(2003)53：107-116)；擬南芥雄性性母細胞死亡1基因(Yang等人，ThePlantCell(2003)15：1281-1295)；絨氈層特異性鋅指基因TAZ1(Kapoor等人，ThePlantCell(2002)14：2353-2367)；以及絨氈層決定子1基因(Lan等人，ThePlantCell(2003)15：2792-2804)。其他已知的來自玉蜀黍的雄性育性突變體或基因在美國專利7,919,676中列出，該專利以引用方式并入本文。其他基因包括激酶和編碼對雄性或雌性配子體發(fā)育有毒的化合物的那些基因。此外，已經認識到感興趣的多核苷酸可還包含與所靶向的感興趣的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補的反義序列。構建反義核苷酸以與對應的mRNA雜交?？蓪Ψ戳x序列作出修飾，只要該序列能雜交對應的mRNA并干擾其表達。以此方式，可使用與對應的反義序列具有70％、80％或85％序列同一性的反義構建體。此外，反義核苷酸的部分可用來破壞靶基因的表達。一般而言，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸或更多個核苷酸的序列。另外，感興趣的多核苷酸還可以以有義取向使用來抑制植物中的內源基因的表達。用有義取向的多核苷酸抑制植物中的基因表達的方法是本領域已知的。該方法通常涉及用包含這樣的啟動子的DNA構建體轉化植物，該啟動子可操作地連接至對應于該內源基因的轉錄物的核苷酸序列的至少一部分，能驅動在植物中的表達。通常，這種核苷酸序列與內源基因的轉錄物的序列具有實質的序列同一性，通常高于約65％的序列同一性、約85％的序列同一性或高于約95％的序列同一性。參見美國專利5,283,184和5,034,323；將這些專利以引用方式并入本文。感興趣的多核苷酸還可以是表型標記。表型標記是可篩選或可選擇的標記，其包括可視標記和選擇標記，無論它是陽性還是陰性選擇標記?？墒褂萌魏伪硇蜆擞洝＞唧w地，可選擇的或可篩選的標記包含這樣的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段使得可以常常在特定條件下鑒別或選取或不選取含有它的分子或細胞。這些標記可編碼活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白質的產生，或可為RNA、肽、蛋白質、無機和有機化合物或組合物等提供結合位點。選擇性標記的例子包括但不限于包含限制性酶位點的DNA區(qū)段；編碼提供對于有毒化合物的抗性的產物的DNA區(qū)段，所述有毒化合物包括抗生素，諸如壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Basta、新霉素磷酸轉移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)；編碼另外缺乏受體細胞的產物的DNA區(qū)段(例如，tRNA基因、營養(yǎng)缺陷標記)；編碼可易于鑒定的產物的DNA區(qū)段(例如，表型標記，諸如β-半乳糖苷酶、GUS；熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)，青色熒光蛋白(CFP)，黃色熒光蛋白(YFP)，紅色熒光蛋白(RFP)，以及細胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位點(例如，之前尚未并置的兩個DNA序列的并置)的DNA區(qū)段；包含未受限制性內切核酸酶或其他DNA修飾酶、化學品等作用或受其作用的DNA序列的DNA區(qū)段；以及包含特異性修飾(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA區(qū)段，該特異性修飾使得可以鑒別該DNA序列。另外的選擇性標記包括能賦予對除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。參見例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell71：63-72；Reznikoff，(1992)MolMicrobiol6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell49：603-12；Figge等人，(1988)Cell52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol10：143-62；Degenkolb等人，(1991)AntimicrobAgentsChemother35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgentsChemother36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature334：721-4。也可以在一種或多種基因上編碼商業(yè)性狀，所述基因可提高例如用于乙醇生產的淀粉，或提供蛋白質表達。經轉化植物的另一個重要商業(yè)用途是生產聚合物和生物塑料，如美國專利5,602,321中所述。諸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA還原酶的基因(參見Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達。外源產物包括植物酶和植物產物，以及來自包括原核生物和其他真核生物在內的其他來源的那些產物。這類產物包括酶、輔因子、激素等。可提高蛋白質，特別是具有能夠提高植物營養(yǎng)價值的改善氨基酸分布的經修飾蛋白質的水平。這可通過表達具有提高的氨基酸含量的這類蛋白質來實現。感興趣的轉基因、重組DNA分子、DNA序列以及感興趣的多核苷酸可包含一個或多個用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表達DNA序列的基因沉默方法是本領域已知的，包括但不限于共抑制、反義抑制、雙鏈RNA(dsRNA)干擾、發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾、含內含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾、轉錄基因沉默以及微RNA(miRNA)干擾。本文所用的“核酸”是指多核苷酸，包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。核酸也可包括片段和修飾的核苷酸。因此，術語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互換使用，表示單鏈或雙鏈的RNA和/或DNA聚合物，其任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)通過它們的單字母命名指代如下：“A”指代腺苷或脫氧腺苷(分別對于RNA或DNA)，“C”指代胞嘧啶或脫氧胞嘧啶，“G”指代鳥苷或脫氧鳥苷，“U”指代尿苷，“T”指代脫氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或T)，“K”指代G或T，“H”指代A或C或T，“I”指代肌苷，“N”指代任何核苷酸?！伴_放閱讀框”縮寫為ORF。術語“功能上等同的亞片段”和“功能等同亞片段”在本文中可互換使用。這些術語指代分離核酸片段的這樣的部分或亞序列，其中改變基因表達或產生某種表型的能力得到保持，無論該片段或亞序列是否編碼活性酶。例如，該片段或亞片段可用于設計基因以在轉化的植物中產生所需的表型?？赏ㄟ^將核酸片段或其亞片段——無論其是否編碼活性酶——相對于植物啟動子序列以有義或反義方向進行連接，來設計基因用于抑制。術語“保守結構域”或“基元”是指在進化上相關的蛋白質的經比對的序列上特定位置處保守的一組氨基酸。雖然其他位置處的氨基酸在同源蛋白質之間可變，但在特定位置處高度保守的氨基酸表示對于蛋白質的結構、穩(wěn)定性或活性而言必需的氨基酸。由于它們因其在蛋白質同源物家族的經比對的序列中的高保守度而被鑒定，它們可用作鑒定物或“識別標志(signature)”，以鑒定具有新確定的序列的蛋白質是否屬于之前鑒定的蛋白質家族。多核苷酸和多肽序列、其變體以及這些序列的結構關系，可用術語“同源性”、“同源的”、“實質上相同的”、“實質上相似的”和“實質上對應”描述，這些術語在本文中可互換使用。這些是指多肽或核酸片段，其中一個或多個氨基酸或核苷酸堿基的變化不影響分子的功能，如介導基因表達或產生某種表型的能力。這些術語還指核酸片段的這樣的修飾，相對于初始的未修飾的片段，所述修飾不實質上改變所得的核酸片段的功能性質。這些修飾包括在核酸片段中缺失、替換和/或插入一個或多個核苷酸。所涵蓋的實質上相似的核酸序列，可通過其與本文所例示的序列雜交，或與本文所公開的且與任何本文所公開的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分雜交(在中等嚴格條件下，例如0.5XSSC，0.1％SDS，60℃)的能力來定義?？烧{整嚴格性條件以篩選中等相似片段，如來自遠緣關系生物的同源序列，以及高度相似片段，如來自近緣關系生物的復制功能酶的基因。雜交后的洗滌決定了嚴格性條件。術語“選擇性雜交”包括指涉在嚴格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)，并且實質上排除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互補性)。術語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括指代在體外雜交測定中探針將與其靶序列選擇性雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同的情況中將會不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒定與探針100％互補的靶序列(同源探測)。另選地，可以調節(jié)嚴格性條件以允許序列中的一些錯配，從而檢測到較低程度的相似性(異源探測)。一般地講，探針長度小于約1000個核苷酸，任選地長度小于500個核苷酸。通常，嚴格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH為7.0至8.3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少30℃，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言溫度為至少約60℃的那些條件。嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實現。示例性的低嚴格條件包括用30％-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37℃下雜交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中在50-55℃下洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在40％-45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中在37℃下雜交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗滌。示例性的高嚴格條件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下雜交并在0.1倍SSC中在60-65℃下洗滌。在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗范圍為獲得最大對應而比對時兩條序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。術語“序列同一性百分數”意指通過在比較窗上比較兩個最佳比對的序列所確定的數值，其中多核苷酸或多肽序列在比較窗中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。通過以下方式計算這種百分數：確定在兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數目以得到匹配的位置的數目，將匹配的位置的數目除以比較窗中位置的總數目，然后將結果乘以100以得到序列同一性百分數。序列同一性百分數的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％的任何整數百分數。這些同一性可用本文描述的任何程序確定。序列比對和百分比同一性或相似性計算可用多種被設計用于檢測同源序列的比較方法來確定，包括但不限于LASERGENE生物信息學計算軟件包的MegAlignTM程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。在本申請的上下文中，應理解，在使用序列分析軟件進行分析的情況中，除非另有指明，否則分析的結果將基于所提到的程序的“默認值”。本文所用的“默認值”將意指軟件第一次初始化時原始裝載在該軟件中的任何數值或參數組?！癈lustalV比對方法”對應于標記為ClustalV的比對方法(通過以下文獻描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci8：189-191)并且可見于LASERGENE生物信息學計算軟件包的MegAlignTM程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。對于多序列比對，默認值對應于GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝10。使用Clustal方法進行蛋白質序列的雙序列比對和同一性百分數計算的默認參數是KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5，以及DIAGONALSSAVED＝5。對于核酸，這些參數是KTUPLE＝2、GAPPENALTY＝5，WINDOW＝4，以及DIAGONALSSAVED＝4。在用ClustalV程序進行序列比對后，可以通過觀察同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”。“ClustalW比對方法”對應于標記為ClustalW的比對方法(通過以下文獻描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci8：189-191)并且可見于LASERGENE生物信息學計算軟件包的MegAlignTMv6.1程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。用于多序列比對的默認參數(GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝0.2，DelayDivergenSeqs(％)＝30，DNA轉換權重＝0.5，蛋白質權重矩陣＝Gonnet系列，DNA權重矩陣＝IUB)。在用ClustalW程序進行序列比對后，可以通過觀察同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”。除非另有規(guī)定，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，SanDiego，CA)用以下參數獲得的值：使用空位產生罰分權重50和空位長度延伸罰分權重3以及nwsgapdna.cmp打分矩陣獲得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用空位產生罰分權重8和空位長度延伸罰分2以及BLOSUM62打分矩陣獲得的氨基酸序列的同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。GAP利用Needleman和Wunsch，(1970)JMolBiol48：443-53的算法來尋找兩個完整序列的比對，該比對使匹配數最大而使空位數最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并使用以匹配堿基為單位的空位產生罰分和空位延伸罰分產生出具有最大數目的匹配堿基和最少的空位的比對?！癇LAST”是美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供的用于尋找生物序列之間的相似性區(qū)域的搜索算法。該程序將核苷酸或蛋白質序列與序列數據庫比較，并計算各匹配的統(tǒng)計學顯著性以鑒定出與查詢序列具有足夠的相似性的序列，使得相似性不會被預測為隨機發(fā)生。BLAST報告所鑒定的序列以及它們與查詢序列的局部比對。本領域的技術人員熟知，許多序列同一性水平可用于鑒定來自其它物種的或經天然修飾或合成法修飾的多肽，其中這種多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分數的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％之間的任何整數百分數。實際上，50％至100％之間的任何整數氨基酸同一性可用于描述本公開，如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％?！盎颉卑ū磉_功能性分子(諸如但不限于特定蛋白質)的核酸片段，包括位于編碼序列之前(5′非編碼序列)和之后(3′非編碼序列)的調控序列?！疤烊换颉敝溉缱匀唤缰姓业侥菢泳哂衅渥陨碚{節(jié)序列的基因?！巴蛔兓颉笔且淹ㄟ^人為干預被改變的天然基因。這種“突變基因”的序列與相應的非突變基因的序列不同之處在于至少一個核苷酸的添加、缺失或替換。在本公開的某些實施例中，突變基因包含由本文所公開的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)引起的改變。突變植物是包含突變基因的植物。本文所用的“靶向突變”是天然基因中的通過如下方式產生的突變：使用涉及本文所公開的或本領域已知的能夠在靶序列的DNA中引起雙鏈斷裂的雙鏈斷裂誘導劑的方法，對天然基因內的靶序列進行改變。在一個實施例中，靶向突變是引導多核苷酸/Cas內切核酸酶誘導的基因編輯的結果，如本文所述。引導多核苷酸/Cas內切核酸酶誘導的靶向突變可發(fā)生于位于基因組靶位點之內或之外的核苷酸序列中，該基因組靶位點由Cas內切核酸酶識別和裂解。術語“基因組”應用于植物細胞時，不僅涵蓋細胞核內存在的染色體DNA，也涵蓋細胞的亞細胞組分(例如線粒體或質體)中存在的細胞器DNA?！懊艽a子修飾的基因”或“密碼子偏好的基因”或“密碼子優(yōu)化的基因”是這樣的基因，其密碼子用法的頻率被設計成模擬宿主細胞的偏好密碼子用法的頻率?！暗任换颉笔腔虻恼紦旧w上特定基因座的幾種另選形式之一。當染色體上特定基因座處存在的所有等位基因都相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果染色體上特定基因座處存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的?！熬幋a序列”指編碼特定氨基酸序列的多核苷酸序列?！罢{控序列”指位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、內部、或下游(3′非編碼序列)并且影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調控序列可包括但不限于：啟動子、翻譯前導序列、5′非翻譯序列、3′非翻譯序列、內含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位點、效應物結合位點和莖環(huán)結構?！爸参飪?yōu)化核苷酸序列”是已經過優(yōu)化以提高在植物中的表達、特別是提高在植物中或一種或多種感興趣的植物中的表達的核苷酸序列。例如，可通過使用一個或多個用于改進表達的植物偏好密碼子，對本文所公開的編碼蛋白質例如雙鏈斷裂誘導劑(例如內切核酸酶)的核苷酸序列進行修飾，來合成植物優(yōu)化核苷酸序列。有關宿主偏好的密碼子使用的討論，參見例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本領域現成的。參見例如美國專利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，這些專利和文獻以引用方式并入本文。已知有另外的序列修飾可增強在植物宿主中的基因表達。這些修飾包括例如消除以下序列：一個或多個編碼假聚腺苷酸化信號、外顯子-內含子剪接位點信號的序列，一個或多個轉座子樣重復序列，以及其他這種得到很好表征的可能對基因表達有害的序列?？蓪⑿蛄械腉-C含量調整到給定的植物宿主的平均水平，這通過參考在宿主植物細胞中表達的已知基因計算得到。當可能時，修飾序列以避免一個或多個預測的發(fā)夾二級mRNA結構。因此，本公開的“植物優(yōu)化核苷酸序列”包含一個或多個這種序列修飾?！皢幼印敝改軌蚩刂凭幋a序列或功能RNA的表達的DNA序列。啟動子序列由近端上游元件和更遠端的上游元件組成，后一類元件經常稱作增強子。因此，“增強子”是這樣的DNA序列，其可以刺激啟動子活性，并且可以是啟動子的固有元件或經插入以增強啟動子的水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以整體源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同啟動子的不同元件構成，或甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領域技術人員應當理解，不同的啟動子可以引導基因在不同組織或細胞類型中或在不同的發(fā)育階段或應答于不同的環(huán)境條件時表達。還認識到，由于在大多數情況下調節(jié)序列的確切界限仍未完全確定，因此存在一定變異的各DNA片段可以具有相同的啟動子活性。造成基因在大多數時間在大多數細胞類型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。已經證實，某些啟動子能夠以高于其他啟動子的速率指導RNA合成。這些被稱為“強啟動子”。已經證實，某些其他啟動子僅在特定類型的細胞或組織中以較高水平指導RNA合成，并且如果啟動子優(yōu)選地在某些組織中指導RNA合成，但在其他組織中以降低的水平指導RNA合成，則其通常被稱為“組織特異性啟動子”或“組織偏好啟動子”。由于引入到植物中的一個或多個嵌合基因的表達模式使用啟動子來控制，因此人們對下述新型啟動子的分離一直有興趣，該新型啟動子能夠在特定組織類型中或在特定植物發(fā)育階段以一定水平控制一個或多個嵌合基因的表達。不斷發(fā)現可用于植物細胞中的各種類型的新啟動子，在以下匯編物中可以找到許多例子：Okamuro和Goldberg，(1989)TheBiochemistryofPlants，第115卷，Stumpf和Conn編輯(NewYork，NY：AcademicPress)，第1-82頁?！胺g前導序列”指位于基因啟動子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導序列存在于翻譯起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻譯前導序列可以影響初級轉錄物加工成mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導序列的例子已有描述(例如Turner和Foster，(1995)MolBiotechnol3：225-236)?！?′非編碼序列”、“轉錄終止子”或“終止序列”指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列和其他編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節(jié)信號的序列。多腺苷酸化信號通常以影響添加多腺苷酸串至mRNA前體3′末端為特征。不同的3′非編碼序列的用途由Ingelbrecht等人，(1989)PlantCell1：671-680例舉?！癛NA轉錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉錄所產生的產物。當RNA轉錄物是DNA序列的完美互補拷貝時，它被稱為初級轉錄物。當RNA轉錄物是由初級轉錄物的轉錄后加工衍生的RNA序列時，它被稱為成熟RNA?！靶攀筊NA”或“mRNA”指沒有內含子且可被細胞翻譯成蛋白質的RNA?！癱DNA”指與mRNA模板互補且用反轉錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可為單鏈的或通過使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉化成雙鏈形式?！坝辛x”RNA是指包含mRNA并且可被翻譯成細胞內或體外的蛋白質的RNA轉錄物?！胺戳xRNA”指與靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分互補，并且能阻斷靶基因的表達的RNA轉錄物(參見例如美國專利5,107,065)。反義RNA的互補性可存在于特定基因轉錄物的任何部分，即在5′非編碼序列、3′非編碼序列、內含子或編碼序列?！肮δ躌NA”指反義RNA、核酶RNA或其他可能不被翻譯但仍對細胞過程具有作用的RNA。術語“互補序列”或“反向互補序列”在本文中可互換地用來指涉mRNA轉錄物，并且意在定義該信息(message)的反義RNA。術語“有效連接”指各核酸序列結合在單一核酸片段上，使得一個核酸序列的功能被另一個核酸序列調節(jié)。例如，當啟動子能夠調節(jié)編碼序列的表達時(即，該編碼序列處于該啟動子的轉錄控制下)，則該啟動子與該編碼序列有效連接。編碼序列可以以有義或反義方向與調節(jié)序列有效連接。在另一個例子中，互補的RNA區(qū)域可以直接或間接地與靶mRNA的上游(5′)有效連接，或與靶mRNA的下游(3′)有效連接，或在靶mRNA內部有效連接，或第一互補區(qū)域在靶mRNA的上游(5′)，并且其互補序列在靶mRNA的下游(3′)。本文所用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域公知的，在以下文獻中有更完全的描述：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)。轉化方法是本領域技術人員公知的，并在下文中描述。“PCR”或“聚合酶鏈反應”是一項用于合成特定DNA區(qū)段的技術，由一系列的重復的變性、退火和延伸循環(huán)組成。通常，將雙鏈DNA進行熱變性，并將兩條與靶區(qū)段的3′邊界互補的引物與該DNA在低溫下退火，然后在中等溫度下延伸。一組這三個連續(xù)步驟稱為一個“循環(huán)”。術語“重組的”指序列的兩個本來分開的區(qū)段例如通過化學合成人工組合在一起，或通過遺傳工程技術對核酸的分離的區(qū)段進行操縱。術語“質粒”、“載體”和“盒”指這樣的染色體外元件，其通常攜帶不是細胞的中心代謝的一部分的基因，并且通常為雙鏈DNA的形式。這種元件可以是衍生自任何來源的、單鏈或雙鏈DNA或RNA的、線狀或環(huán)狀形式的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中多個核苷酸序列已連接或重組成能夠將感興趣的多核苷酸引入到細胞中的獨特構建體。“轉化盒”指含有外來基因并且除該外來基因之外還具有能促進特定宿主細胞的轉化的元件的特定載體?！氨磉_盒”指含有外來基因并且除該外來基因之外還具有使該基因可以在外來宿主中表達的元件的特定載體。術語“重組DNA分子”、“重組構建體”、“表達構建體”、“構建體”、“構建體”和“重組DNA構建體”在本文中可互換使用。重組構建體包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如調節(jié)序列和編碼序列)的人工組合。例如，構建體可以包含源自不同來源的調控序列和編碼序列，或源自相同來源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的調控序列和編碼序列。這種構建體可單獨使用或可與載體結合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于將被用來轉化宿主細胞的方法，這是本領域技術人員公知的。例如，可以使用質粒載體。技術人員熟知為了成功地轉化、選擇和擴增宿主細胞而必須在載體上存在的遺傳元件。技術人員還將認識到，不同的獨立轉化事件可導致不同的表達水平和表達模式(Jones等人，(1985)EMBOJ4：2411-2418；DeAlmeida等人，(1989)MolGenGenetics218：78-86)，因此通常對多個事件進行篩選以獲得顯示所需表達水平和表達模式的細胞系。這種篩選可通過標準的分子生物學測定法、生物化學測定法和其他測定法完成，所述測定法包括DNA印跡分析、mRNA表達的RNA印跡分析、PCR、實時定量PCR(qPCR)、反轉錄PCR(RT-PCR)、蛋白質表達的免疫印跡分析、酶或活性測定和/或表型分析。本文所用的術語“表達”指產生前體形式或成熟形式的功能性最終產物(例如mRNA、引導多核苷酸或蛋白質)。術語“引入”意指向細胞提供核酸(例如表達構建體)或蛋白質。引入包括指代核酸摻入到真核或原核細胞中，其中該核酸可摻入到該細胞的基因組中，并且包括指代核酸或蛋白質短暫提供到細胞。引入包括指代穩(wěn)定的或短暫的轉化方法，以及有性雜交。因此，在將核酸片段(例如，重組DNA構建體/表達構建體)插入細胞中的語境中，“引入”意指“轉染”或“轉化”或“轉導”，并且包括指代將核酸片段摻入到真核或原核細胞中，其中該核酸片段可摻入到細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)?！俺墒臁钡鞍踪|指翻譯后加工的多肽(即，已從初級翻譯產物移除了任何存在的原肽或前肽所得的多肽)?！扒绑w”蛋白質指mRNA的翻譯的初級產物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于胞內定位信號?！胺€(wěn)定轉化”指核酸片段轉移到宿主生物體的基因組中，包括核基因組和細胞器基因組在內，從而導致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。相反，“瞬時轉化”指核酸片段轉移到宿主生物體的細胞核或其他含DNA的細胞器中，導致基因表達，但不存在整合或穩(wěn)定的遺傳。含有轉化的核酸片段的宿主生物體稱作“轉基因”生物體。遺傳改良種質的商業(yè)開發(fā)也已進展到將多種性狀引入作物植物的階段，通常稱為基因堆疊方法。在該方法中，可以將賦予不同感興趣的特性的多個基因引入植物?；蚨询B可通過許多方法實現，包括但不限于共轉化、再轉化以及使具有不同感興趣的基因的株系的雜交。術語“植物”指整株植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、及其種子和子代。植物細胞包括但不限于來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞。植物部分包括分化的和未分化的組織，包括但不限于根、莖、苗、葉、花粉、種子、瘤組織和各種形式的細胞和培養(yǎng)物(例如，單細胞、原生質體、胚和愈傷組織)。植物組織可以在植物中或在植物器官、組織或培養(yǎng)物中。術語“植物器官”指構成植物的形態(tài)上和功能上不同的部分的植物組織或一組植物組織。術語“基因組”指生物體每個細胞或病毒或細胞器中存在的全部互補遺傳材料(基因和非編碼序列)；以及/或者作為(單倍體)單位從一個親本繼承的完整組的染色體?！白哟卑参锏娜魏魏罄m(xù)各代。轉基因植物包括例如這樣的植物，該植物在其基因組內包含通過轉化步驟引入的異源多核苷酸。異源多核苷酸可穩(wěn)定地整合在基因組內，使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨地或作為重組DNA構建體的一部分整合到基因組中。轉基因植物還可在其基因組內包含不止一個異源多核苷酸。每個異源多核苷酸可賦予轉基因植物不同性狀。異源多核苷酸可包括源自外來物種的序列，或者，如果源自相同物種，則可為對其天然形式進行了實質性修飾的序列?！稗D基因”可包括其基因型已因異源核酸的存在而改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初經如此改變的轉基因植物以及通過有性雜交或無性繁殖從最初的轉基因植物產生的那些。通過常規(guī)植物育種方法，通過本文所述的不導致外來多核苷酸插入的基因組編輯程序，或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變不旨在被認為是轉基因的。在本公開的一個實施例中，組合物包括包含重組DNA構建體和引導多核苷酸的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述重組DNA構建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內切核酸酶的核苷酸序列的啟動子，其中所述植物優(yōu)化Cas內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。在本公開的另一個實施例中，組合物還包含整合到所述植物的基因組靶位點中的感興趣的多核苷酸。在本公開的另一個實施例中，組合物還包含在基因組靶位點處的修飾，其中該修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。在本公開的另一個實施例中，組合物包括包含至少一個改變的靶序列的植物或種子，其中所述至少一個改變的靶序列源自由引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物識別和裂解的相應靶序列，其中Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的所述靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。在本公開的另一個實施例中，組合物包括包含修飾的核苷酸序列的植物或種子，其中修飾的核苷酸序列通過向細胞提供引導多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內切核酸酶而產生，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。在本公開的某些實施例中，能育植物是能產生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。這種自身能育植物可在沒有任何其他植物貢獻配子及其中所含的遺傳材料的情況下產生子代植物。本公開的其他實施例可涉及使用不是自身能育的植物，因為該植物不產生活的或能夠授/受精的雄配子或雌配子，或兩者。本文所用的“雄性不育植物”是不產生活的或能夠授精的雄配子的植物。本文所用的“雌性不育植物”是不產生活的或能夠受精的雌配子的植物。應當認識到，雄性不育和雌性不育植物可以分別是雌性能育和雄性能育的。還應認識到，雄性能育(但雌性不育)植物當與雌性能育植物雜交時可產生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物當與雄性能育植物雜交時可產生活的子代?！袄迥Α?cM)或“圖距單位(mapunit)”是兩個連接的基因、標記、靶位點、基因座或它們的任何配對之間的距離，其中1％的減數分裂產物是重組的。因此，一厘摩與等于兩個連接的基因、標記、靶位點、基因座或它們的任何配對之間的1％平均重組頻率的距離相當。使用雙組分引導RNA和Cas內切核酸酶系統(tǒng)的育種方法和選擇植物的方法。本公開可用于培育包含一種或多種轉基因性狀的植物。最通常地，轉基因性狀是作為基于農桿菌法、基因槍法或其他常用程序的轉化系統(tǒng)的結果而隨機插入在植物基因組當中。最近，已開發(fā)出了能夠定向插入轉基因的基因打靶方案。一種重要的技術即位點特異性整合(SSI)能使轉基因靶向與之前插入的轉基因相同的染色體位置。定制的大范圍核酸酶和定制的鋅指大范圍核酸酶使研究者可以設計核酸酶以靶向特定的染色體位置，并且這些試劑使得可以將轉基因靶向于被這些核酸酶裂解的染色體位點。真核基因組(例如，植物基因組)的精確遺傳工程目前所使用的系統(tǒng)依賴于歸巢內切核酸酶、大范圍核酸酶、鋅指核酸酶、以及轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)，這需要對每個新靶基因座進行從頭蛋白質工程改造。本文所述的高度特異性引導多核苷酸/Cas9內切核酸酶系統(tǒng)更易于定制，并且因此在以許多不同靶序列的修飾為目標時更有用。在一個實施例中，本公開進一步利用引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)的多組分性質，其中其恒定蛋白質組分為Cas內切核酸酶，并且其可變和易于重復編程的靶向組分為引導多核苷酸。如本文所述，引導多核苷酸可包含DNA、RNA或DNA-RNA組合序列，從而使其完全可定制并且因此在以一個或許多不同靶序列的修飾為目標時更有用。在其中核酸酶脫靶切割對于靶細胞可能有毒的情況下，本文所述的引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)對于基因組工程(尤其是植物基因組工程)特別有用。在本文所述的引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)的一個實施例中，將表達優(yōu)化的Cas9基因形式的恒定組分穩(wěn)定地整合到靶基因組(諸如植物基因組)中。Cas9基因的表達處于啟動子(例如，植物啟動子)的控制下，該啟動子可為組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子，例如溫度誘導型、脅迫誘導型、發(fā)育階段誘導型、或化學誘導型啟動子。在不存在引導多核苷酸的可變靶向結構域的情況下，Cas蛋白質不能夠識別和切割DNA，并且因此其在植物細胞中的存在應具有很小影響或沒有影響。因此，本文所述的引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)的關鍵優(yōu)點是形成和維護細胞系或轉基因生物體的能力，所述細胞系或轉基因生物體能夠有效地表達對于細胞活力具有很小影響或沒有影響的Cas蛋白質。為了誘導在所需基因組位點處的切割實現靶向遺傳修飾，可通過多種方法將引導多核苷酸引入到包含穩(wěn)定整合和表達的Cas基因的細胞中。例如，引導多核苷酸可通過化學或酶促合成，并且通過直接遞送方法(諸如粒子轟擊或電穿孔)引入到Cas表達細胞中。另選地，能夠在靶細胞中有效地表達引導多核苷酸的基因可通過化學合成、酶促合成或在生物系統(tǒng)中合成，并且這些基因可通過直接遞送方法(諸如粒子轟擊、電穿孔)或生物遞送方法(諸如農桿菌介導的DNA遞送)引入到Cas表達細胞中。本公開的一個實施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導多核苷酸的第二植物，該引導多核苷酸能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物，其中該引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評價(c)的子代的靶位點改變；以及e)選擇具有所述靶位點的所需改變的子代植物。本公開的另一個實施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂的Cas內切核酸酶的第一植物；b)獲得包含引導多核苷酸和供體DNA的第二植物，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評價(c)的子代的靶位點改變；以及e)選擇包含在所述靶位點處插入的感興趣的多核苷酸的子代植物。本公開的另一個實施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括選擇至少一種在其植物基因組中的靶位點處包含改變的子代植物，其中所述子代植物通過使表達至少一種Cas內切核酸酶的第一植物與包含引導多核苷酸和供體DNA的第二植物雜交而獲得，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。如本文所公開，引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)介導的基因靶向可在用于指導轉基因插入和/或用于制備包含多個轉基因的復合轉基因性狀基因座的方法中以類似于WO2013/0198888(2013年8月1日公布)中公開的方式使用，其中使用如本文所公開的引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)代替使用雙鏈斷裂誘導劑來引入感興趣的基因。在一個實施例中，復合轉基因性狀基因座是具有多個彼此遺傳連鎖的轉基因的基因座。通過在彼此0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或甚至5厘摩(cM)的距離內插入獨立的轉基因，轉基因可作為單個遺傳基因座培育(參見例如，美國專利申請13/427,138或PCT申請PCT/US2012/030061)。在選擇包含轉基因的植物之后，包含(至少)一個轉基因的植物可雜交以形成包含兩個轉基因的F1。在來自這些F1的子代(F2或BC1)中，1/500的子代會具有被重組到同一染色體上的兩個不同轉基因。該復合基因座然后可被培育成為具有兩種轉基因性狀的單個遺傳基因座?？芍貜瓦@個過程以按需堆積盡可能多的性狀。蛋白質可以各種方式進行改變，包括氨基酸替換、缺失、截短和插入。用于這類操作的方法是公知的。例如，可通過在DNA中作出突變來制備蛋白質的氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法包括例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92；Kunkel等人，(1987)MethEnzymol154：367-82；美國專利4,873,192；Walker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany，NewYork)以及其中引用的參考文獻。有關不太可能影響蛋白質的生物活性的氨基酸替換的指導，見于例如Dayhoff等人，(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(NatlBiomedResFound，Washington，D.C.)的模型。保守替換，如將一個氨基酸用另一具有相似性質的氨基酸進行交換，可以是優(yōu)選的。保守缺失、插入和氨基酸替換預期不會造成蛋白質特征的根本性變化，并且任何替換、缺失、插入或它們的組合的效應可通過常規(guī)篩選測定法進行評估。測定雙鏈斷裂誘導活性的測定法是已知的，一般是測量該試劑對含有靶位點的DNA底物的總體活性和特異性。已知有多種方法可用來將核苷酸序列和多肽引入到生物體中，包括例如轉化、有性雜交在內，以及將多肽、DNA或mRNA引入細胞中。用于接觸、提供和/或引入組合物到各種生物體中的方法是已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉化方法、瞬時轉化方法、病毒介導的方法和有性育種。穩(wěn)定轉化表示所引入的多核苷酸整合到生物體的基因組中并能夠被其子代遺傳。瞬時轉化表示所引入的組合物僅僅在生物體中暫時表達或存在。用于將多核苷酸或多肽引入得到植物中的方案可根據作為轉化目標的植物或植物細胞的類型(如單子葉植物或雙子葉植物)而異。將多核苷酸和多肽引入到植物細胞中并隨后插入到植物基因組中的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-34，以及美國專利6,300,543)、分生組織轉化(美國專利5,736,369)、電穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-6)，農桿菌介導的轉化(美國專利5,563,055和5,981,840)，直接基因轉移(Paszkowski等人，(1984)EMBOJ3：2717-22)，以及彈道粒子加速法(美國專利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782；Tomes等人，(1995)“DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment”，PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips編輯(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology6：923-6；Weissinger等人，(1988)AnnRevGenet22：421-77；Sanford等人，(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(洋蔥)；Christou等人，(1988)PlantPhysiol87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)InVitroCellDevBiol27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)TheorApplGenet96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology8：736-40(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-9(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology6：559-63(玉米)；美國專利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)PlantPhysiol91：440-4(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology8：833-9(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature311：763-4；美國專利5,736,369(谷類)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-9(百合科(Liliaceae))；DeWet等人，(1985)，TheExperimentalManipulationofOvuleTissues，Chapman等人編輯，(Longman，NewYork)，第197-209頁(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCellRep9：415-8和Kaeppler等人，(1992)TheorApplGenet84：560-6(觸須介導的轉化)；D′Halluin等人，(1992)PlantCell4：1495-505(電穿孔)；Li等人，(1993)PlantCellRep12：250-5；Christou和Ford(1995)AnnalsBotany75：407-13(稻)以及Osjoda等人，(1996)NatBiotechnol14：745-50(通過根瘤農桿菌轉化的玉米)。另選地，可通過使植物與病毒或病毒核酸接觸來將多核苷酸引入到植物中。一般地講，這種方法涉及將多核苷酸摻入在病毒DNA或RNA分子內。在一些例子中，可最初將感興趣的多肽作為病毒聚蛋白的一部分合成，后者然后在體內或體外通過蛋白水解加工而產生所需的重組蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于將多核苷酸引入到植物中并表達其中所編碼的蛋白質的方法是已知的，參見例如美國專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931。瞬時轉化方法包括但不限于直接引入多肽如雙鏈斷裂誘導劑到生物體中、引入多核苷酸如DNA和/或RNA多核苷酸、引入RNA轉錄物如編碼雙鏈斷裂誘導劑的mRNA到生物體中。這類方法包括(例如)顯微注射法或粒子轟擊法。參見例如Crossway等人，(1986)MolGenGenet202：179-85；Nomura等人，(1986)PlantSci44：53-8；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2176-80；以及Hush等人，(1994)JCellSci107：775-84。術語“雙子葉植物”是指也稱為“雙子葉植物綱”的被子植物的亞類并且包括提及整株植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細胞及其子代。本文所用的植物細胞包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本公開的上下文中的術語“雜交的”或“雜交”或“正在雜交”意指配子通過授粉而融合以產生子代(即，細胞、種子或植物)。該術語既涵蓋有性雜交(一株植物由另一株植物授粉)，也涵蓋自交(自花授粉，即，當花粉和胚珠來自相同植物或遺傳上相同的植物時)。術語“基因滲入”是指遺傳基因座的所需等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現象。例如，所需等位基因在指定基因座處的基因滲入可通過兩個親本植物之間有性雜交傳遞到至少一個子代植物，其中親本植物中的至少一個在其基因組內具有所需等位基因。另選地，例如，等位基因的傳遞可通過例如在融合原生質體中的兩個供體基因組之間的重組而發(fā)生，其中供體原生質體中的至少一個在其基因組中具有所需等位基因。所需等位基因可為例如轉基因或所選的標記或QTL的等位基因。標準的DNA分離、純化、分子克隆、載體構建和驗證/表征方法是確立的，參見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)。載體和構建體包括包含感興趣的多核苷酸和任選其他組分的環(huán)狀質粒和線狀多核苷酸，所述其他組分包括連接子、銜接子、調控區(qū)、內含子、限制位點、增強子、隔離子、選擇性標記、感興趣的核苷酸序列、啟動子和/或其他有助于載體構建或分析的位點。在一些例子中，識別位點和/或靶位點可包含在內含子、編碼序列、5′UTR、3′UTR和/或調控區(qū)內。本公開還提供了表達構建體，所述表達構建體用于在酵母或植物、植物細胞或植物部分中表達能夠結合到靶位點并在靶位點中產生雙鏈斷裂的引導多核苷酸/Cas系統(tǒng)。在一個實施例中，本公開的表達構建體包含可操作地連接至編碼Cas基因的核苷酸序列的啟動子以及可操作地連接至本公開的引導多核苷酸的啟動子。該啟動子能夠驅動有效連接的核苷酸序列在植物細胞中的表達。啟動子是參與RNA聚合酶和其他蛋白質的識別和結合以起始轉錄的DNA區(qū)域。植物啟動子是能夠在植物細胞中起始轉錄的啟動子，有關植物啟動子的綜述參見Potenza等人，(2004)InVitroCellDevBiol40：1-22。組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子以及WO99/43838和美國專利6,072,050中公開的其他組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等人，(1985)Nature313：810-2)；稻肌動蛋白(McElroy等人，(1990)PlantCell2：163-71)；泛素(Christensen等人，(1989)PlantMolBiol12：619-32；Christensen等人，(1992)PlantMolBiol18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)TheorApplGenet81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBOJ3：2723-30)；ALS啟動子(美國專利5,659,026)等。其他組成型啟動子在例如美國專利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中有所描述。在一些例子中，可使用誘導型啟動子。病原體感染后被誘導的病原體誘導型啟動子包括但不限于那些調節(jié)PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶等的表達的啟動子。可將化學調控啟動子用于通過施用外源化學調控劑來調節(jié)基因在植物中的表達。該啟動子可以是化學誘導啟動子，其中化學劑的施加可誘導基因表達，或是化學阻遏啟動子，其中化學劑的施加可阻遏基因表達?；瘜W誘導啟動子包括但不限于玉米In2-2啟動子，其由苯磺酰胺除草劑安全劑激活(DeVeylder等人，(1997)PlantCellPhysiol38：568-77)；玉米GST啟動子(GST-II-27，WO93/01294)，其由用作萌前除草劑的疏水親電子化合物激活；以及煙草PR-1a啟動子(Ono等人，(2004)BiosciBiotechnolBiochem68：803-7)，其由水楊酸激活。其他化學調控啟動子包括類固醇響應性啟動子(參見例如糖皮質類固醇誘導型啟動子(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-5；McNellis等人，(1998)PlantJ14：247-257)；四環(huán)素誘導型和四環(huán)素阻遏型啟動子(Gatz等人，(1991)MolGenGenet227：229-37；美國專利5,814,618和5,789,156)。組織偏好的啟動子可用來靶向特定植物組織內的增強的表達。組織偏好性啟動子包括(例如)下列文獻中提出的那些：Kawamaa等人，(1997)PlantCellPhysiol38：792-803；Hansen等人，(1997)MolGenGenet254：337-43；Russell等人，(1997)TransgenicRes6：157-68；Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol112：1331-41；VanCamp等人，(1996)PlantPhysiol112：525-35；Canevascini等人，(1996)PlantPhysiol112：513-524；Lam，(1994)ResultsProblCellDiffer20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)PlantJ4：495-505。葉偏好的啟動子包括(例如)下列文獻中提出的那些：Yamamoto等人，(1997)PlantJ12：255-65；Kwon等人，(1994)PlantPhysiol105：357-67；Yamamoto等人，(1994)PlantCellPhysiol35：773-8；Gotor等人，(1993)PlantJ3：509-18；Orozco等人，(1993)PlantMolBiol23：1129-38；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：9586-90；Simpson等人，(1958)EMBOJ4：2723-9；Timko等人，(1988)Nature318：57-8。根偏好的啟動子包括(例如)下列文獻中提出的那些：Hire等人，(1992)PlantMolBiol20：207-18(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Miao等人，(1991)PlantCell3：11-22(胞質谷氨酰胺合成酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)PlantCell3：1051-61(法國菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人，(1990)PlantMolBiol14：433-43(根瘤農桿菌甘露氨酸合酶(MAS)的根特異性啟動子)；BoguSz等人，(1990)PlantCell2：633-41(從榆科山黃麻(Parasponiaandersonii)和雞屎藤山麻黃(Trematomentosa)分離的根特異性啟動子)；Leach和Aoyagi，(1991)PlantSci79：69-76(毛根農桿菌(A.rhizogenes)rolC和rolD根誘導基因)；Teeri等人，(1989)EMBOJ8：343-50(農桿菌創(chuàng)傷誘導的TR1′和TR2’基因)；VfENOD-GRP3基因啟動子(Kuster等人，(1995)PlantMolBiol29：759-72)；以及rolB啟動子(Capana等人，(1994)PlantMolBiol25：681-91)；菜豆素基因(Murai等人，(1983)Science23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3320-4)。還可參見美國專利5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。種子偏好的啟動子包括種子發(fā)育過程中活躍的種子特異性啟動子和在種子萌發(fā)過程中活躍的種子萌發(fā)啟動子。參見Thompson等人，(1989)BioEssays10：108。種子偏好的啟動子包括但不限于Cim1(細胞分裂素誘導信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合酶)；(WO00/11177和美國專利6,225,529)。對于雙子葉植物，種子偏好的啟動子包括但不限于豆類β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對于單子葉植物，種子偏好啟動子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白基因啟動子、22kDa玉米醇溶蛋白基因啟動子、27kDaγ玉米醇溶蛋白基因啟動子、waxy基因啟動子、shrunken1基因啟動子、shrunken2基因啟動子、球蛋白1基因啟動子，油質蛋白基因啟動子以及nuc1基因啟動子。另參見WO00/12733，其中公開了來自END1和END2基因的種子偏好啟動子。表型標記是可篩選或可選擇的標記，其包括可視標記和選擇性標記，無論它是陽性還是陰性選擇性標記。可使用任何表型標記。具體地，可選擇的或可篩選的標記包含這樣的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段使得可以常常在特定條件下鑒別或選取或不選取含有它的分子或細胞。這些標記可編碼活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白質的產生，或可為RNA、肽、蛋白質、無機和有機化合物或組合物等提供結合位點。選擇性標記的例子包括但不限于包含限制性酶位點的DNA區(qū)段；編碼提供對于有毒化合物的抗性的產物的DNA區(qū)段，所述有毒化合物包括抗生素，諸如壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Basta、新霉素磷酸轉移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)；編碼另外缺乏受體細胞的產物的DNA區(qū)段(例如，tRNA基因、營養(yǎng)缺陷標記)；編碼可易于鑒定的產物的DNA區(qū)段(例如，表型標記，諸如β-半乳糖苷酶、GUS；熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)，青色熒光蛋白(CFP)，黃色熒光蛋白(YFP)，紅色熒光蛋白(RFP)，以及細胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位點(例如，之前尚未并置的兩個DNA序列的并置)的DNA區(qū)段；包含未受限制性內切核酸酶或其他DNA修飾酶、化學品等作用或受其作用的DNA序列的DNA區(qū)段；以及包含特異性修飾(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA區(qū)段，該特異性修飾使得可以鑒別該DNA序列。另外的選擇性標記包括能賦予對除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。參見例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell71：63-72；Reznikoff,(1992)MolMicrobiol6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell49：603-12；Figge等人，(1988)Cell52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol10：143-62；Degenkolb等人，(1991)AntimicrobAgentsChemother35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgentsChemother36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature334：721-4。可采用常規(guī)條件將具有所引入的序列的細胞生長或再生成植物，參見例如McCormick等人，(1986)PlantCellRep5：81-4。然后可使這些植物生長，并用相同轉化株或用不同轉化株或未轉化株進行授粉，并鑒定出具有所需特性和/或包含所引入的多核苷酸或多肽的所得子代?？缮L兩代或更多代以確保多核苷酸得到穩(wěn)定保持和遺傳，并收獲種子?？墒褂萌魏沃参铮▎巫尤~植物和雙子葉植物。可使用的單子葉植物的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、小麥(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumspp.)、燕麥(Avena)、大麥(Hordeum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、菠蘿(Ananascomosus)、香蕉(Musaspp.)、棕櫚、觀賞植物、草坪草和其他草類?？墒褂玫碾p子葉植物的例子包括但不限于大豆(Glycinemax)、卡諾拉(Brassicanapus和B.campestris)、苜蓿(Medicagosativa)、煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)、棉花(Gossypiumarboreum)和花生(Arachishypogaea)、西紅柿(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等。感興趣的轉基因、重組DNA分子、DNA序列以及感興趣的多核苷酸可包含一個或多個感興趣的基因。這種感興趣的基因可編碼例如為植物提供農藝優(yōu)勢的蛋白質。植物的標記輔助選擇和育種開發(fā)作物物種中的分子標記的主要動機是有可能通過標記輔助選擇(MAS)提高植物育種效率。遺傳標記等位基因，或者另選地，數量性狀基因座(QTL)等位基因用于鑒定如下植物，該植物包含一個或多個基因座處的所需基因型，并且預期將所需基因型連同所需表型傳遞到其子代。遺傳標記等位基因(或QTL等位基因)可用于鑒定如下植物，該植物包含一個基因座或若干非連鎖或連鎖的基因座處的所需基因型(例如，單倍型)，并且預期將所需基因型連同所需表型傳遞到其子代。應當理解，出于MAS的目的，術語標記可涵蓋標記和QTL基因座兩者。在確定所需表型和多態(tài)性染色體基因座(例如，標記基因座或QTL)同時分離之后，可以使用那些多態(tài)性基因座來選擇對應于所需表型的等位基因一稱為標記輔助選擇(MAS)的過程。簡而言之，在來自待選擇的植物的生物樣品中檢測對應于標記核酸的核酸。該檢測可采取探針核酸與標記雜交的形式，例如使用等位基因特異性雜交、DNA印跡分析、RNA印跡分析、原位雜交、引物的雜交然后是PCR擴增標記區(qū)域等。用于檢測標記的各種程序是本領域中已知的。在生物樣品中的特定標記的存在(或不存在)被驗證之后，選擇植物，即，用于通過選擇性育種形成子代植物。植物育種需要結合感興趣的性狀與高產基因并結合其他所需性狀以開發(fā)改良的植物品種。篩選大量樣品可能是昂貴、耗時且不可靠的。使用標記和/或遺傳連鎖的核酸是用于在育種程序中選擇具有所需性狀的植物的有效方法。例如，經過田地評價的標記輔助選擇的一個優(yōu)點在于，MAS可無論生長季節(jié)如何而在一年中的任何時候進行。此外，環(huán)境效應與標記輔助選擇無關。當群體根據影響一種或多種性狀的多個基因座而分離時，MAS的效率與表型篩選相比變得甚至更高，因為在實驗室中可對來自單個DNA樣品的所有基因座一起加工。細胞的DNA修復機制是引入外源DNA或在內源基因中誘導突變的基礎。DNA同源重組是細胞使用同源序列修復DNA損傷的專門DNA修復方式。在植物中，DNA同源重組發(fā)生頻率過低而不能按常規(guī)用于基因靶向或基因編輯，后來發(fā)現該過程可通過DNA雙鏈斷裂刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.CellBiol.21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)Science300：763；Wright等人，(2005)PlantJ.44：693-705)?？s寫含義如下：“sec”指秒，“min”指分鐘，“h”指小時，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升、“L”指升、“μM”指微摩爾濃度、“mM”指毫摩爾濃度、“M”指摩爾濃度、“mmol”指毫摩爾、“μmole”指微摩爾、“g”指克、“μg”指微克、“ng”指納克、“U”指單位、“bp”指堿基對，并且“kb”指千堿基。本文所公開的組合物和方法的非限制性例子如下：1.一種引導多核苷酸，所述引導多核苷酸包含：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域；和(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域，其中第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構成，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。2.根據實施例1所述的引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域位于單個分子上。3.根據實施例1所述的引導多核苷酸，其中第二核苷酸序列結構域包含能夠沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨分子。4.根據實施例1-3中任一項所述的引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域為DNA序列，并且第二核苷酸序列結構域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。5.根據實施例1所述的引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域為DNA序列。6.根據實施例1所述的引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域和/或第二核苷酸序列結構域包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。7.根據實施例1所述的引導多核苷酸，其中第一核苷酸序列結構域和/或第二核苷酸序列結構域包含至少一種提供另外的有益特征的修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟i核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。8.根據實施例7所述的引導多核苷酸，其中所述另外的有益特征選自改變的或調節(jié)的穩(wěn)定性、亞細胞靶向、跟蹤、熒光標記、蛋白質或蛋白質復合物的結合位點、改變的互補靶序列結合親和力、改變的細胞降解抗性、和提高的細胞滲透性。9.一種包含實施例1-8中任一項所述的引導多核苷酸的植物或種子。10.一種引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中引導多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補的第一核苷酸序列結構域；和(ii)與Cas內切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結構域，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。11.根據實施例10所述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域和第二核苷酸序列結構域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構成，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。12.根據實施例10所述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中所述引導多核苷酸的第一核苷酸序列結構域和/或第二核苷酸序列結構域包含至少一種提供另外的有益特征的修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導多核苷酸靶向到亞細胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質結合位點的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價鍵、或它們的任何組合。13.根據實施例10-12中任一項所述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物，其中Cas內切核酸酶為Cas9內切核酸酶。14.一種包含實施例10-13中任一項所述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物的植物或種子。15.一種用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括將引導多核苷酸引入到具有Cas內切核酸酶的細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。16.一種用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括將引導多核苷酸和Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物。17.根據實施例15-16中任一項所述的方法，所述方法還包括將供體DNA引入到所述細胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。18.根據實施例15-17中任一項所述的方法，所述方法還包括鑒定至少一個在所述靶標處具有修飾的細胞，其中在所述靶位點處的修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。19.一種用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)將引導多核苷酸、供體DNA和Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸。20.根據實施例19所述的方法，其中供體DNA和Cas內切核酸酶使用至少一個能夠表達供體DNA和/或Cas內切核酸酶的重組DNA構建體引入到所述細胞中。21.根據實施例15-20中任一項所述的方法，其中引導多核苷酸通過粒子轟擊直接引入。22.根據實施例15-20中任一項所述的方法，其中引導多核苷酸通過粒子轟擊或包含U6聚合酶III的重組DNA構建體的農桿菌轉化來引入。23.根據實施例15-20中任一項所述的方法，其中引導多核苷酸為包含可變靶向結構域和cas內切核酸酶識別結構域的單鏈引導多核苷酸。24.根據實施例15-20中任一項所述的方法，其中引導多核苷酸為包含cr核苷酸分子和tracr核苷酸分子的雙鏈引導多核苷酸。25.一種用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)將cr核苷酸、能夠表達tracrRNA的第一重組DNA構建體、和能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA引入到細胞中，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。26.一種用于修飾細胞基因組中的靶位點的方法，該方法包括：a)將tracr核苷酸、能夠表達crRNA的第一重組DNA構建體和能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA引入到細胞中，其中所述tracr核苷酸被選為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；以及b)鑒定至少一個在所述靶位點處具有修飾的細胞，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。27.一種用于將感興趣的多核苷酸引入到細胞基因組的靶位點中的方法，該方法包括：a)將能夠表達引導多核苷酸的第一重組DNA構建體、和能夠表達Cas內切核酸酶的第二重組DNA構建體引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸和Cas內切核酸酶能夠形成使Cas內切核酸酶能夠在所述靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物；b)使(a)的細胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個來自(b)的細胞，該細胞在其基因組中包含在所述靶位點處整合的感興趣的多核苷酸。28.一種用于編輯細胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內切核酸酶引入到細胞中，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中Cas內切核酸酶在所述細胞基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。29.根據實施例15-28中任一項所述的方法，其中細胞選自非人類動物、細菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細胞。30.根據實施例29所述的方法，其中植物細胞選自單子葉植物和雙子葉植物細胞。31.根據實施例29所述的方法，其中植物細胞選自玉米、稻、高粱、黑麥、大麥、小麥、粟、燕麥、甘蔗、草坪草、或柳枝稷、大豆、卡諾拉、苜蓿、向日葵、棉花、煙草、花生、馬鈴薯、煙草、擬南芥、和紅花細胞。32.一種包含引導多核苷酸和Cas9內切核酸酶的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述Cas9內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。33.一種包含重組DNA構建體和引導多核苷酸的植物或種子，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述重組DNA構建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內切核酸酶的核苷酸序列的啟動子，其中所述植物優(yōu)化Cas內切核酸酶和引導多核苷酸能夠形成復合物并且在所述植物的基因組靶位點中產生雙鏈斷裂。34.根據實施例32-33中任一項所述的植物，所述植物還包含整合到所述植物的所述基因組靶位點中的感興趣的多核苷酸。35.根據實施例32-33中任一項所述的植物或種子，所述植物或種子還包含在所述基因組靶位點處的修飾，其中所述修飾選自(i)至少一個核苷酸的替換，(ii)至少一個核苷酸的缺失，(iii)至少一個核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。36.一種包含至少一個改變的靶序列的植物或種子，其中所述至少一個改變的靶序列源自由引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物識別和裂解的相應靶序列，其中Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的所述靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸。37.一種包含修飾的核苷酸序列的植物或種子，其中修飾的核苷酸序列通過向細胞提供引導多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內切核酸酶而產生，其中所述引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。38.根據實施例29所述的植物或植物細胞，其中所述至少一種核苷酸修飾不是在所述靶位點處的修飾。39.根據實施例32-38中任一項所述的植物，其中所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。40.根據實施例39所述的植物，其中所述單子葉植物選自玉米、稻、高粱、黑麥、大麥、小麥、粟、燕麥、甘蔗、草坪草、或柳枝稷。41.根據實施例39所述的植物，其中所述雙子葉植物選自大豆、卡諾拉、苜蓿、向日葵、棉花、煙草、花生、馬鈴薯、煙草、擬南芥、或紅花。42.一種用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導多核苷酸的第二植物，該引導多核苷酸能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物，其中該引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評價(c)的子代的靶位點改變；以及e)選擇具有所述靶位點的所需改變的子代植物。一種用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含能夠在植物基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂的至少一種Cas內切核酸酶的第一植物；b)獲得包含引導多核苷酸和供體DNA的第二植物，其中引導多核苷酸不單獨包含核糖核酸，其中所述引導多核苷酸能夠與(a)的Cas內切核酸酶形成復合物，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評價(c)的子代的靶位點改變；以及e)選擇包含在所述靶位點處插入的感興趣的多核苷酸的子代植物。實例以下實例進一步說明本公開，其中份和百分數是以重量計，度是指攝氏度，除非另有規(guī)定。應理解，這些實例雖然說明本公開的各實施例，但僅以舉例說明的方式給出。根據以上討論和這些實例，本領域技術人員可確定本公開的必要特征，并且在不脫離本公開的實質和范圍的情況下，可對本公開作出各種變化和修改以使其適合于各種應用和條件。此類修改形式也旨在落入所附實施例的范圍內。實例1用于對玉米植物基因組修飾的雙鏈引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的玉米優(yōu)化表達盒在該實例中，將Cas9內切核酸酶和成熟的經完全加工的天然CRISPR-RNA(crRNA)以及如以下文獻所述屬于II型適應性病毒免疫系統(tǒng)的來自釀膿鏈球菌的反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的表達盒進行玉米優(yōu)化以檢測其在玉米中作為基因組工程工具的用途：Deltcheva等人(2011)Nature471：602-7和Jinek等人(2012)Science337：816-21。如圖1A所示，在該實例中完全由RNA核苷酸構成的cr核苷酸和tracr核苷酸分子形成由稱為“可變靶向”(VT)結構域的第一核苷酸序列結構域和稱為“Cas內切核酸酶識別”(CER)結構域的第二核苷酸序列結構域構成的雙鏈體。crRNA和tracrRNA多核苷酸雙鏈體的CER結構域包含沿著互補區(qū)域雜交的兩個單獨的分子(位于cr核苷酸和tracr核苷酸上的VT結構域的核苷酸序列3’)(圖1A)。VT結構域有助于促進DNA靶位點識別，而CER結構域通過Cas9蛋白質促進識別。連同所需的原間隔序列相鄰基元(PAM)序列，crRNA/tracrRNA多核苷酸雙鏈體的兩個結構域用于引導Cas內切核酸酶DNA靶位點裂解并且將在本文中稱為“雙鏈引導多核苷酸”、“雙鏈引導RNA”或“crRNA/tracrRNA雙鏈體”，如2013年8月22日提交的美國臨時申請61/868706的實例1所述。為了測試玉米中的雙鏈引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)，將來自釀膿鏈球菌M1GAS(SF370)的Cas9基因(SEQIDNO：1)按本領域所知的標準技術進行玉米密碼子優(yōu)化，并且引入馬鈴薯ST-LS1內含子(SEQIDNO：2)以便消除其在大腸桿菌和農桿菌中的表達(圖2A)。為了有利于Cas9蛋白質在玉米細胞中的核定位，將猿猴病毒40(SV40)單分體(MAPKKKRKV，SEQIDNO：3)和根瘤農桿菌雙分體VirD2T-DNA邊界內切核酸酶(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQIDNO：4)核定位信號分別摻入到Cas9開放閱讀框的氨基末端和羧基末端處(圖2A)。將玉米優(yōu)化Cas9基因通過標準分子生物學技術可操作地連接至玉米組成型啟動子或調節(jié)型啟動子。玉米優(yōu)化的Cas9表達盒(SEQIDNO：5)的例子示于圖2A中，該表達盒包含玉米優(yōu)化的Cas9基因、以及ST-LS1內含子、SV40氨基末端核定位信號(NLS)和VirD2羧基末端NLS，該表達盒由植物泛素啟動子驅動。為了賦予玉米細胞高效的crRNA和tracrRNA表達以使得crRNA/tracrRNA多核苷酸雙鏈體可引導Cas9蛋白質裂解體內DNA靶位點，使用標準分子生物學技術將位于8號染色體上的玉米U6聚合酶III啟動子(SEQIDNO：6)和玉米U6聚合酶III終止子(TTTTTTTT)分離并且將二者分別作為5’端融合體和3’端融合體有效融合到crRNA和tracrRNADNA編碼序列兩者，從而生成如圖2B和圖2C所示的表達盒。所得玉米優(yōu)化的crRNA和tracrRNA表達盒的序列可見于SEQIDNO：8(crRNA表達盒，其中VT結構域靶向LIGCas-3靶位點(表1))和SEQIDNO：9(tracrRNA表達盒)。如圖3A所示，crRNA分子需要與DNA靶標互補的區(qū)域(VT結構域)，其長度為大約12-30個核苷酸并且在用于靶位點識別和裂解的PAM序列的上游(Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science337：816-21，Mali等人(2013)Science339：823-26，以及Cong等人(2013)Science339：819-23)。為了有利于將玉米基因組DNA靶序列快速引入到crRNA表達構建體中，將兩個IIS型BbsI限制性內切核酸酶靶位點以反向串聯(lián)取向引入，其中裂解以向外方向取向，如Cong等人(2013)Science339：819-23所述。在裂解時，IIS型限制性內切核酸酶將其靶位點從crRNA表達質粒切除，生成突出端，以便允許將包含所需玉米基因組DNA靶位點的雙鏈寡核苷酸框內定向克隆到VT結構域中。在示出的實例中，僅將開始于G核苷酸的靶序列用于促進crRNA的聚合酶III的有利表達。然后Cas內切核酸酶基因以及crRNA和tracrRNA分子兩者的表達允許示于圖3A中的雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)(也稱為crRNA/tracrRNA/Cas內切核酸酶復合物)的形成(SEQIDNO：10-11)。實例2雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米中的染色體DNA并且通過不完整非同源末端連接引入突變?yōu)榱藴y試實例1中描述的玉米優(yōu)化的雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)是否可識別、裂解以及通過不精確的非同源末端連接(NHEJ)修復途徑突變玉米染色體DNA，對三個不同的基因組靶序列進行裂解(參見表1)并且通過深度測序來檢測NHEJ突變的存在。表1.引入到crRNA表達盒中的玉米基因組靶序列。LIG＝在無葉舌1基因起始密碼子上游的大約600bp處將玉米優(yōu)化的Cas9內切核酸酶表達盒、包含與表1中列出的玉米基因組靶序列的反義鏈互補的特定玉米VT結構域的crRNA表達盒、以及tracrRNA表達盒在BBM和WUS2基因的存在下通過粒子介導的遞送(參見實例7)共同遞送到60-90Hi-II未成熟玉米胚(參見實例8)。用靶向LIGCas-3基因組靶位點進行裂解的Cas9和長鏈引導RNA表達盒(如2013年8月22日提交的美國臨時專利申請61/868706中所述)轉化的Hi-II玉米胚用作陽性對照，而僅用Cas9表達盒轉化的胚用作陰性對照。在7天之后，合并來自每個處理的20-30個最均勻轉化的胚并且提取總基因組DNA。用高保真PCR擴增預混試劑(NewEnglandBiolabs，M0531L)對預期靶位點周圍的區(qū)域進行PCR擴增，從而添加上擴增子特異性條形碼所必需的序列，由此使用“加尾”引物通過兩輪PCR進行Illumnia測序。用于一級PCR反應中的引物示于表2中，用于二級PCR反應中的引物為AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(正向，SEQIDNO：21)和CAAGCAGAAGACGGCATA(反向，SEQIDNO：22)。表2.PCR引物序列所得PCR擴增用QiagenPCR純化離心柱進行純化，采用基于Hoechst染料的熒光測定法，以等摩爾比結合測量濃度，并且在Illumina的MiSeq個人測序儀上用PhiX對照v3(Illumina，FC-110-3001)的30-40％(v/v)加標(用于抵消序列偏差)來進行100核苷酸長度的深度單端(singleread)測序。只有在以預期的裂解位點為中心的10核苷酸窗內出現的核苷酸插入與缺失(indel)≥1，并且不以類似的水平存在于陰性對照中的那些讀段(read)才被歸類為NHEJ突變。對具有相同突變的NHEJ突變讀段計數并將其折合成單個讀段，并且前10個最普遍的突變經目視確認為出現在預期的裂解位點內。然后使用經目視確認的NHEJ突變的總數，基于包含與條形碼和正向引物的完全匹配的適當長度讀段的總數來計算突變讀段的百分比(％)。將靶向三個LIGCas靶標(SEQIDNO：12-14)的雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)與靶向相同基因座的單個長鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)相比，通過深度測序恢復的NHEJ突變的頻率示于表3中?；陔p鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)恢復的前十個最普遍類型的NHEJ突變示于圖4A(對應于SEQIDNO：24-33，其中SEQIDNO：23為包含LIGCas-1靶位點的參考玉米序列)、圖4B(對應于SEQIDNO：34-43，其中SEQIDNO：23為包含LIGCas-2靶位點的參考玉米序列)和圖4C(對應于SEQIDNO：45-54，其中SEQIDNO：44為包含LIGCas-3靶位點的參考玉米序列)中。綜合上述內容的數據表明，本文所述的玉米優(yōu)化的雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米染色體DNA并且生成不完整NHEJ突變。表3.與長鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)相比在由雙鏈引導RNA/Cas內切核酸酶系統(tǒng)在玉米無葉舌1靶基因座處產生的突變讀段的百分比(％)實例3脫氧核糖核酸(DNA)可用于引導Cas9蛋白質裂解玉米染色體DNA并且通過不完整非同源末端連接引入突變如之前在以下文獻中所述：Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science337：816-21，Mali等人(2013)Science339：823-26，以及Cong等人(2013)Science339：819-23，核糖核酸或RNA已成為被描述為引導Cas9內切核酸酶識別和裂解特定DNA靶位點的僅有分子。在該實例中，我們提供了以下證據：一類新的分子即脫氧核糖核酸(DNA)也可用于引導Cas內切核酸酶識別和裂解染色體DNA靶位點，從而可恢復不完整NHEJ突變。在該實例中，我們使用包含稱為“可變靶向”(VT)結構域的第一核苷酸序列結構域以及稱為“Cas內切核酸酶識別”(CER)結構域的第二核苷酸序列結構域的雙鏈引導多核苷酸，其中可變靶向結構域為脫氧核糖核酸(DNA)的連續(xù)片段。雙鏈引導多核苷酸的CER結構域包含兩個單獨的分子、一個DNA分子，該DNA分子連接到cr核苷酸分子的VT結構域(圖1B)并且沿著互補區(qū)域與由核糖核酸(RNA)核苷酸(稱為tracrRNA)的連續(xù)片段組成的第二分子(tracr核苷酸，圖1A)雜交。在該實例中，雙鏈引導多核苷酸的cr核苷酸(圖1A)單獨地由DNA核苷酸組成并且在本文中稱為crDNA。將包含靶向LIGCas-3靶位點的VT結構域的crDNA序列(表1)(SEQIDNo：55)在IntegratedDNATechnologies，Inc.用5’磷酸基團合成并且通過PAGE純化，然后用于測試如圖5所示的雙鏈引導crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物是否可識別和裂解玉米染色體DNA靶位點，從而恢復NHEJ突變。為了確定用于合成crDNA分子的最佳遞送濃度，將crDNA以不同濃度(20ng、50ng、100ng、1μg和5μg)連同玉米優(yōu)化的tracrRNA和Cas9表達盒共同遞送到60-90Hi-II未成熟玉米胚，然后測定NHEJ突變的存在，如實例2所述。僅用Cas9和tracrRNA表達盒轉化的胚用作陰性對照。如表4所示，用接近50ng的最佳crDNA遞送濃度檢測NHEJ突變。為了比較雙鏈引導crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物(圖5)與雙鏈引導RNA(crRNA-tracrRNA)/Cas內切核酸酶復合物(圖3A)的NHEJ突變活性，將包含靶向LIGCas-3靶位點的VT結構域的crRNA(表1)在Bio-Synthesis，Inc.用5’磷酸基團合成并且通過PAGE純化(SEQIDNO：10)。然后將50ng的合成crDNA和crRNA二者獨立地連同玉米優(yōu)化的tracrRNA和Cas9DNA表達盒共同遞送，并且測定NHEJ突變，如前所述。進行兩次轉化實驗以證實重現性。陰性對照由用50ng的crDNA、Cas9表達盒或50ng的crDNA加tracrRNA表達盒轉化的Hi-II玉米胚組成。如表4和表5所示，與僅使用Cas9的對照、僅使用crDNA的對照、僅使用crDNA加tracrRNA的對照和僅使用tracrRNA加Cas9的對照中不存在NHEJ突變相比，當與tracrRNA和Cas9DNA表達盒一起遞送crDNA時，鑒定出由雙鏈引導crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)產生的NHEJ突變。前3個最豐富的crRNANHEJ突變示于圖6A(SEQIDNO：56、57、58，其中SEQIDNO：44為LIGCas-3基因座的未修飾參考序列)中，并且前3個最豐富的crDNANHEJ突變示于圖6B(SEQIDNO：59、60、61，其中SEQIDNO：44為LIGCas-3基因座的未修飾參考序列)中，比較鑒定出的這些NHEJ突變并且示于圖6(SEQIDNO：44、56-61)中。綜合上述內容的數據表明，脫氧核糖核酸(DNA)也可用于引導雙鏈引導crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物中的Cas內切核酸酶(圖4)裂解玉米染色體DNA，產生不精確的NHEJ突變。表4.在由與tracrRNA和Cas9DNA表達盒共同遞送的瞬時遞送的crDNA分子以不同濃度在玉米無葉舌1靶基因座處產生的突變讀段的百分比(％)遞送的crDNA的量遞送的DNA表達盒讀段的總數突變讀段的數目0Cas9，tracrRNA1,046,553020ngCas9，tracrRNA926,915050ngCas9，tracrRNA1,032,08018100ngCas9，tracrRNA860,56581μgCas9，tracrRNA398,99605μgCas9，tracrRNA394,9590表5.在由與tracrRNA和Cas9DNA表達盒共同遞送的瞬時遞送的crDNA或crRNA分子在玉米無葉舌1靶基因座處產生的突變讀段的百分比(％)的比較實例4修飾引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分以提高裂解活性和特異性。在該實例中，描述了通過修飾引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的引導核酸組分的核苷酸堿基、磷酸二酯鍵鍵合或分子形貌來提高裂解活性和特異性。如圖1A和圖1B所示，引導多核苷酸的核酸組分包含可變靶向(VT)結構域和Cas內切核酸酶識別(CER)結構域。VT結構域負責通過核苷酸-核苷酸直接堿基配對與DNA靶位點相互作用，而CER結構域是正確識別Cas內切核酸酶所需的(圖3A和圖3B)。引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的兩個結構域連同所需PAM序列用于將DNA靶位點識別與Cas內切核酸酶靶位點裂解相關聯(lián)(圖3A和圖3B)。鑒于VT結構域與DNA靶位點的直接相互作用，VT結構域內的核苷酸堿基修飾可用于改變核苷酸-核苷酸堿基配對關系，從而有利于Cas內切核酸酶靶位點識別。此類修飾可用于加強與互補DNA靶序列的結合親和力，從而增強引導多核苷酸/Cas內切核酸酶靶位點識別和/或特異性。當引入到引導多核苷酸的VT結構域中時可增強靶位點結合親和力和/或特異性的核苷酸堿基修飾的非限制性例子列于表6中。這些修飾可單獨使用或在VT結構域內結合使用。表6.用于增強與互補DNA靶序列的核苷酸堿基配對的核苷酸堿基修飾類似于表6中示出的那些的核苷酸修飾也可在單鏈或雙鏈引導多核苷酸的CER結構域中形成(圖1A和圖1B)。這些修飾可用于加強或穩(wěn)定雙鏈cr核苷酸分子(例如，但不限于crRNA、crDNA、或它們的組合)和tracr核苷酸分子(例如，tracrRNA、tracrDNA、或它們的組合)的CER結構域中分子間的相互作用(圖3A)。這些修飾還可幫助重現在由單個分子構成的引導多核苷酸的二級結構中正確識別Cas內切核酸酶所需的cr核苷酸和tracr核苷酸(諸如但不限于crRNA/tracrRNA、crDNA/tracrRNA、crRNA/tracrDNA、crDNA/tracrDNA)結構(圖3A和圖3B)。表達或瞬時遞送到細胞的核酸經受周轉或降解。為了提高體內引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的有效壽命或穩(wěn)定性，可引入核苷酸和/或磷酸二酯鍵修飾以減少不希望的降解?？购怂崦负塑账岷土姿岫ユI修飾的例子示于表7中并且可引入到引導多核苷酸的VT和/或CER結構域中的任一者中?？稍诎琕T或CER結構域的任一個核酸殘基的5’端和3’端處引入修飾以抑制外切核酸酶裂解活性，可在包含VT或CER結構域的核酸序列中間引入修飾以降低內切核酸酶裂解活性，或可在包含VT或CER結構域的整個核酸序列中引入修飾以提供對外切核酸酶和內切核酸酶的保護。表7.用于減少不希望的核酸酶降解的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾。為了提供對細胞中周轉和降解的抗性，引導多核苷酸的核酸組分還可被環(huán)化，其中5’端和3’端共價連接在一起。環(huán)狀RNA可具有比線性RNA更強的對核酸酶降解的抗性并且可在相應線性轉錄之后在細胞中存留很長時間(Jeck等人(2013)RNA19：141-157)。還可引入對引導多核苷酸核酸組分中任一者的修飾以提高其細胞滲透性或遞送到細胞中的能力。此類修飾將包括但不限于鍵合到膽固醇、聚乙二醇和間隔區(qū)18(六乙二醇鏈)。許多上述經修飾的引導多核苷酸可被合成并且通過基因槍粒子介導的轉化、轉染或電穿孔瞬時遞送。形成能夠結合和/或裂解染色體DNA靶位點的功能性復合物所需的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的剩余組分可作為DNA表達盒、RNA、mRNA(5′加帽和聚腺苷酸化)或蛋白質的任意組合共同遞送。還可建立如下細胞系或轉化體，所述細胞系或轉化體穩(wěn)定表達形成功能性引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物所需的全部組分(其中的一種或兩種組分除外)，使得在瞬時遞送上述經修飾的引導核酸時，可形成功能性引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物。上述經修飾的引導多核苷酸還可多路同時遞送，以靶向用于裂解或產生切口的多個染色體DNA序列。上述經修飾的引導多核苷酸可用于植物、動物、酵母和細菌中或用于接受利用引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)進行的基因組修飾的任何生物體中，以及用于將不精確NHEJ突變引入到染色體DNA中，切除由轉基因或內源DNA中任一者構成的染色體DNA片段，通過用供體DNA修復模板的同源重組修復來編輯天然或轉基因的基因的密碼子構成，通過用供體DNA修復模板的同源重組修復來位點特異性插入轉基因或內源DNA序列。實例5檢測玉米中引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的引導多核苷酸組分的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾的效應在該實例中，將實例4中所述的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾中的一些引入到cr核苷酸的VT結構域和/或CER結構域中，并且將討論用于評價這些修飾對雙鏈引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米染色體DNA的能力的影響。如表8中所示，將核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾單獨地或以組合形式引入到靶向LIGCas-3位點(參見表1)進行裂解的雙鏈引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的cr核苷酸(crRNA或crDNA)組分的VT結構域和CER結構域中。雖然在此處檢測了多個不同組合形式的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾，但可預期還有其他可能的組合。引入形成于VT結構域中的鎖核酸(+)、5-甲基dC(iMe-dC)和2，6-二氨基嘌呤(i6diPr)核苷酸堿基修飾以提高與互補DNA靶序列的結合親和力，并且就鎖核酸修飾而言還提高對體內核酸酶的抗性。在crRNA或crDNA序列的5’端和3’端處或在整個crRNA或crDNA序列中引入在VT和CER結構域二者中設計的所有其他修飾，以降低體內核酸酶的效應，并且延長crRNA或crDNA組分的有效壽命。為了檢測表8中所述的經修飾crRNA或crDNA組分對其相關聯(lián)的經修飾引導多核苷酸/Cas內切核酸酶復合物識別和裂解LIGCas-3位點(參見表1)的能力的效應，將經修飾的crRNA和crDNA分子與tracrRNA和Cas9表達盒共同遞送到HiII未成熟玉米胚，如實例3中所述。與tracrRNA和Cas9表達盒共同遞送的未修飾crRNA或crDNA分子用作比較物。陰性對照由僅用相應經修飾的crRNA或crDNA或Cas9表達盒轉化的未成熟玉米胚組成。如實例2中所述測定的不完整NHEJ突變的頻率用于評價相對于進行比較的未修飾crRNA或crDNA實驗，每個crRNA或crDNA修飾對Cas內切核酸酶裂解活性的效應。表8.crRNA和crDNA核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾。1：核苷酸之前的“+”表示鎖核酸堿基修飾，核苷酸之后的“*”表示硫代磷酸酯鍵主鏈修飾，核苷酸之前的“m”表示2’-0-甲基RNA堿基修飾，“iMe-dC”表示5-甲基dC堿基修飾，并且“i6diPr”表示2，6-二氨基嘌呤堿基修飾實例6用于檢測酵母中引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)核酸組分的修飾的效應的方法在該實例中，酵母篩選方法被設計為鑒定對引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的導致裂解活性增強的最佳修飾。A.ADE：URA3：DE2酵母篩選菌株為了鑒定對實例4中概述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的最佳修飾或其組合，培育出用于仔細監(jiān)測引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的裂解活性的釀酒酵母菌株。這通過將酵母菌株BY4247的15號染色體上的天然ADE2基因替換為由酵母URA3基因破壞的非功能性的部分重復ADE2基因(ADE：URA3：DE2)而實現，如圖7所示。然后針對插入的URA3基因設計與適當PAM序列相鄰的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶靶位點，使得在裂解時，包含305bp重疊序列的被破壞的ADE2基因可通過分子內同源重組途徑而被修復，從而去掉URA3基因并獲得功能性ADE2基因，如圖8所示。然后可將包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基或缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基用于選擇其中已發(fā)生裂解的細胞。然后可將選擇之后酵母細胞的恢復頻率用于在檢測對引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的不同修飾時定量引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的裂解效率。還可對包含由于裂解和修復ADE：URA3：DE2基因座而產生的功能性ADE2基因的酵母細胞進行有關裂解活性的目測表型篩選。在不存在5-FOA或缺乏腺嘌呤的選擇的情況下，功能性ADE2基因產物產生白色表型，而非功能性產物產生紅色表型(Ugolini等人(1996)Curr.Genet.30：485-492)。為了能夠觀察到白色或紅色表型，可將單獨酵母細胞轉化體接種在固體培養(yǎng)基上并且使其生長成足夠大以供目視檢查的菌落。白色到紅色扇形菌落的量提供了關于裂解活性的量的指示。由于扇形菌落表型是定性度量，因此可實施0-4數值評分系統(tǒng)。如圖9所示，0分表示未觀察到白色扇形菌落(無靶位點裂解)；4分表示完全白色菌落(識別位點的完全切割)；1-3分表示中間白色扇形菌落表型(以及中等程度的靶位點裂解)。B.引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的Cas9組分為了穩(wěn)定地表達用于與實例4中所述的瞬時遞送的經修飾核酸組分配對的Cas內切核酸酶，可將來自釀膿鏈球菌M1GAS(SF370)的Cas9基因按本領域中已知的標準技術進行釀酒酵母密碼子優(yōu)化(SEQIDNO：88)，并且可將SV40(猿猴病毒40)核定位信號(SRADPKKKRKV，SEQIDNO：7)摻入到羧基末端處以有利于核定位。然后將所得Cas9開放閱讀框有效融合到酵母誘導型GAL1啟動子和CYC1終止子。然后將所得Cas9表達盒置于包含LEU2選擇性標記的CEN6自主復制酵母載體中。為了能夠測試實例4中所述的Cas9組分和經修飾核酸組分的瞬時遞送，還可將Cas9基因作為mRNA遞送。為了生成釀酒酵母優(yōu)化的Cas9mRNA，可使用PCR擴增釀酒酵母優(yōu)化的Cas9開放閱讀框以及在所需T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQIDNO：89)上加尾(剛好在翻譯ATG起始位點的5’端)的相關聯(lián)核定位信號。然后可將包含T7啟動子的所得線性模板用于在進行或未進行體外多腺苷酸化的情況下轉錄未加帽或加帽的Cas9mRNA。Cas9組分還可作為蛋白質瞬時遞送并且與經修飾的核酸組分配對。具有相關聯(lián)的羧基末端核定位信號的Cas9蛋白質可按照類似于以下文獻所述的標準技術或通過其他方法表達和純化：Fonfara等人(2013)Nucl.AcidsRes.doi：10.1093/nar/gkt1074。C.引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分將瞬時遞送的經修飾crRNA或tracrRNA組分與相應穩(wěn)定表達的未修飾crRNA或tracrRNA配對可為有利的。為了促進酵母中crRNA和tracrRNA的穩(wěn)定表達，可生成釀酒酵母優(yōu)化的crRNA和tracrRNA表達盒。酵母RNA聚合酶IIISNR52啟動子和SUP4終止子可以有效融合到DNA片段的端部，所述DNA片段編碼通過釀膿鏈球菌Cas9蛋白質進行的識別所需的適當crRNA和tracrRNA序列。所有crRNA表達盒將包含VT結構域中的ADE：URA3：DE2靶序列(GCAGACATTACGAATGCACA，SEQIDNO：90)并且靶向ADE：URA3：DE2基因座進行裂解。然后將所得表達盒置于包含HIS3選擇性標記的CEN6自主復制酵母載體中。為了遞送未修飾的crRNA、tracrRNA或引導RNA，可使用PCR擴增在所需T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQIDNO：89)上加尾(剛好在轉錄起始位點的5′端)的相應crRNA、tracrRNA或引導RNA序列。然后可將包含T7啟動子的所得線性模板用于轉錄相應的crRNA、tracrRNA或長鏈引導RNA。還將瞬時遞送如實例4中概述的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的經修飾核酸組分?？蓪㈩愃朴趯嵗?表8中示出的那些的核苷酸堿基和/或磷酸二酯鍵修飾單獨地或以組合形式引入到引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的crRNA、crDNA、tracrRNA、tracrDNA、長鏈引導RNA或長鏈引導DNA核酸組分并且按照標準技術合成。另外在實例4中討論的包含能夠與Cas內切核酸酶形成功能性復合物的必要VT和CER結構域的環(huán)狀RNA可在體外生成，如Diegleman等人(1998)Nucl.AcidsRes.26：3235-3241所述，并且瞬時遞送到酵母細胞。D.將引導多核苷酸/Cas內切核酸酶組分轉化到ADE：URA3：DE2酵母菌株中可使用標準乙酸鋰、聚乙二醇(PEG)、電穿孔或基因槍轉化方法將引導多核苷酸/Cas內切核酸酶系統(tǒng)的組分遞送到ADE：URA3：DE2酵母細胞并且監(jiān)測其裂解ADE：URA3：DE2靶標的能力。實例6的B節(jié)和C節(jié)中討論的酵母優(yōu)化的引導多核苷酸/Cas內切核酸酶組分可作為低拷貝自主復制質粒DNA載體上的表達盒、作為非復制瞬時分子(諸如mRNA、蛋白質、RNA或經修飾的引導核酸)或以質粒DNA載體表達盒和瞬時分子的任意組合遞送。實例7玉米不成熟胚的轉化可通過各種已知在植物中有效的方法來完成轉化，包括粒子介導的遞送、農桿菌介導的轉化、PEG介導的遞送和電穿孔。a.粒子介導的遞送如下使用粒子遞送進行玉米不成熟胚的轉化。培養(yǎng)基配方見下文。將穗去殼并在30％Clorox漂白劑加0.5％Micro洗滌劑中表面滅菌20分鐘，然后用無菌水漂洗兩次。將不成熟胚分離，并以胚軸一側朝下(盾片一側朝上)放置，每板25個胚，在560Y培養(yǎng)基上放置4小時，然后在2.5cm靶區(qū)內排成一行準備進行轟擊。另選地，將分離的胚放在560L(起始培養(yǎng)基)上，并在暗處在26℃至37℃溫度下放置8-24小時，然后在560Y上26℃下放置4小時后如上所述進行轟擊。使用標準分子生物學技術構建包含雙鏈斷裂誘導劑和供體DNA的質粒并且與包含發(fā)育基因ODP2(AP2結構域轉錄因子ODP2(胚珠發(fā)育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel(US2011/0167516)的質粒共轟擊。使用水溶性陽離子脂質轉染試劑按如下方式將感興趣的質粒和DNA沉淀到0.6μm(平均直徑)金丸上。使用1μg的質粒DNA以及任選地使用用于共轟擊的其他構建體在冰上制備DNA溶液，所述其他構建體諸如50ng(0.5μl)的包含發(fā)育基因ODP2(AP2結構域轉錄因子ODP2(胚珠發(fā)育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel的每個質粒。為了得到預混的DNA，將20μl的制備的金粒子(15mg/ml)和5μl的水溶性陽離子脂質轉染試劑添加在水中并且仔細混合。將金粒子在微量離心機中以10,000rpm離心1分鐘并且移除上清液。用100ml的100％EtOH在不使小丸重懸的情況下仔細清洗所得小丸，然后小心移除EtOH洗液。添加105μl的100％EtOH并且通過短暫超聲處理使粒子重懸。然后，將10μl點滴到每個巨載體的中央上，讓其干燥約2分鐘后進行轟擊。另選地，使用氯化鈣(CaCl2)沉淀程序，通過混合100μl在水中制備的鎢粒子、10μl(1μg)DNA/TrisEDTA緩沖液(1μg總DNA)、100μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亞精胺，將感興趣的質粒和DNA沉淀到1.1μm(平均直徑)鎢丸上。每種試劑依序加到鎢粒子懸浮液，同時進行混合。將最終的混合物進行短暫超聲處理，并且讓其在恒定漩渦混合下溫育10分鐘。在沉淀期間，將管短暫離心，移除液體，將粒子用500ml100％乙醇洗滌，然后進行30秒離心。再次移除液體，將105μL100％乙醇加至最終的鎢粒子小丸。對于粒子槍轟擊，將鎢/DNA粒子進行短暫超聲處理。將10μl的鎢/DNA粒子點滴到每個巨載體(macrocarrier)的中央上，然后讓點滴的粒子干燥約2分鐘再進行轟擊。用Biorad氦槍以水平#4對樣品板進行轟擊。所有樣品接受450PSI的單次射擊，每管的制備粒子/DNA共取十個等分試樣。在轟擊后，將胚在560P(維持培養(yǎng)基)上在26℃至37℃的溫度下溫育12-48小時，然后置于26℃下。在5-7天后，將胚轉移到含有3mg/L雙丙氨膦的560R選擇培養(yǎng)基，每隔2個星期在26℃下進行傳代培養(yǎng)。在進行大約10個星期的選擇后，將抗選擇的愈傷組織克隆轉移到288J培養(yǎng)基以引發(fā)植物再生。在體細胞胚成熟后(2-4個星期)，將發(fā)育良好的體細胞胚轉移到培養(yǎng)基中進行發(fā)芽并轉移到有光照的培養(yǎng)室。大約7-10天后，將發(fā)育的小植株轉移到管中的272V無激素培養(yǎng)基7-10天，直到小植株完全長好。然后將植物轉移到含有盆栽土的淺箱嵌塊(insertsinflats)(相當于2.5英寸盆)，在生長室中生長1個星期，隨后在溫室中另外生長1-2個星期，然后轉移到Classic600盆(1.6加侖)并生長至成熟。對植物進行監(jiān)測并進行轉化效率的打分和/或進行再生能力的修飾的打分。起始培養(yǎng)基(560L)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調至pH5.8后用去離子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。維持培養(yǎng)基(560P)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l2，4-D和0.69g/lL-脯氨酸(用KOH調至pH5.8后用去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調至pH5.8后用去離子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH調至pH5.8后用去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸銀和3.0mg/l雙丙氨膦(兩者均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺、0.10g/l鹽酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去離子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脫落酸(在調至pH5.6后用精制去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l雙丙氨膦(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到60℃后加入)。無激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素母液(0.100g/l煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺素、0.10g/l鹽酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去離子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在調至pH5.6后用精制去離子水定容)和6g/l細菌培養(yǎng)用瓊脂(在用精制去離子水定容后加入)，滅菌并冷卻至60℃。b.農桿菌介導的轉化農桿菌介導的轉化基本上如Djukanovic等人(2006)PlantBiotechJ4：345-57中所述進行。簡單地講，從經滅菌的種仁切下10-12日齡的不成熟胚(尺寸0.8-2.5mm)并放入液體培養(yǎng)基(4.0g/lN6基礎鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson維生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/l鹽酸硫胺、1.5mg/l2，4-D、0.690g/lL-脯氨酸、68.5g/l蔗糖、36.0g/l葡萄糖、pH5.2)中。在收集胚后，用1ml濃度為0.35-0.45OD550的農桿菌更換培養(yǎng)基。將玉米胚與農桿菌在室溫下溫育5分鐘，然后將該混合物倒到培養(yǎng)基板上，該培養(yǎng)基板含有4.0g/lN6基礎鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson維生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/l鹽酸硫胺、1.5mg/l2，4-D、0.690g/lL-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.85mg/l硝酸銀、0.1nM乙酰丁香酮和3.0g/lGelrite，pH5.8。將胚以胚軸朝下在暗處20℃下溫育3天，然后在暗處28℃下溫育4天，然后轉移到新的培養(yǎng)基板上，該培養(yǎng)基板含有4.0g/lN6基礎鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson復合維生素(SigmaE-1511)、1.0mg/L鹽酸硫胺、1.5mg/L2，4-D、0.69g/LL-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.5g/LMES緩沖液、0.85mg/L硝酸銀、3.0mg/L雙丙氨膦、100mg/L羧芐西林和6.0g/L瓊脂，pH5.8。將胚每隔三個星期進行傳代培養(yǎng)，直到鑒定到轉基因事件。通過將小量的組織轉移到再生培養(yǎng)基(4.3g/LMS鹽(Gibco11117)、5.0ml/LMS維生素母液、100mg/L肌醇、0.1μMABA、1mg/LIAA、0.5mg/L玉米素、60.0g/L蔗糖、1.5mg/L雙丙氨膦、100mg/L羧芐西林、3.0g/LGelrite、pH5.6)并且在暗處在28℃下溫育兩個星期來誘導體細胞胚胎發(fā)生。將具有可見苗和根的所有材料轉移到含有4.3g/LMS鹽(Gibco11117)、5.0ml/LMS維生素母液、100mg/L肌醇、40.0g/L蔗糖、1.5g/LGelrite，pH為5.6的培養(yǎng)基上，并且在人造光下28℃溫育。一星期之后，將小植株移到含有相同培養(yǎng)基的玻璃管中并且生長直到將其取樣以及/或者移植到土壤中。實例8BBM的瞬時表達能增強轉化可對轉化方案的參數進行修改以確保BBM活性是瞬時的。一個這種方法涉及例如使用化學品PEL將含BBM的質粒進行沉淀，使得可以進行轉錄和表達，但又排除隨后DNA釋放。在一個例子中，將BBM質粒用PEI沉淀到金粒子上，同時將待整合的轉基因表達盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT為玉米優(yōu)化的PAT基因)使用標準氯化鈣方法沉淀到金粒子上。簡單地講，如下用PEI包覆金粒子。首先，洗滌金粒子。稱取35mg平均直徑為1.0的金粒子(A.S.I.#162-0010)到微量離心管中，加入1.2ml無水乙醇并漩渦混合一分鐘。將管在室溫下溫育15分鐘，然后使用微量離心機在4℃下高速離心15分鐘。棄去上清液，加入新鮮的1.2ml乙醇等分試樣，漩渦混合一分鐘，離心一分鐘，再次棄去上清液(重復這一操作兩次)。加入新鮮的1.2ml乙醇等分試樣，將此懸浮液(金粒子在乙醇中)在-20℃下保存數星期。為了用聚乙基亞胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆粒子，將250μl的經洗滌的金粒子/乙醇混合物離心，然后棄去乙醇。將粒子在100μl雙蒸水中洗滌一次以除去殘余乙醇，加入250μl的0.25mMPEI，接著進行脈沖超聲處理以使粒子懸浮，然后將管投入干冰/乙醇浴中以將懸浮液快速冷凍，然后將懸浮液冷凍干燥過夜。此時，干燥的涂覆粒子可在-80℃下保存至少3個星期。在使用前，將粒子用2.5mMHEPES緩沖液(pH7.1)的250μl等分試樣漂洗3次，進行1次脈沖超聲處理，然后每次離心前進行快速漩渦混合。然后將粒子懸浮于最終體積250μlHEPES緩沖液中。將25μl粒子等分試樣加到新鮮管中，以便隨后連接DNA。為連接未包覆的DNA，將粒子進行脈沖超聲處理，然后加入1μg的DNA(在5μl水中)，接著用Pipetteman上下吹吸幾次進行混合，然后溫育10分鐘。將粒子短暫離心(即，10秒)，移除上清液，并且添加60μl乙醇。將具有PEI沉淀的DNA-1的粒子在60μl乙醇中洗滌兩次。將粒子離心，棄去上清液，然后將粒子重新懸浮于45μl水中。為連接第二DNA(DNA-2)，利用水溶性陽離子脂質轉染試劑進行沉淀。將45μl的粒子/DNA-1懸浮液稍作超聲處理，然后加入5μl的100ng/μlDNA-2和2.5μl的水溶性陽離子脂質轉染試劑。將溶液置于旋轉搖蕩器上10分鐘，在10,000g下離心1分鐘。去除上清液，將粒子重新懸浮于60μl的乙醇中。將溶液點滴到巨載體上，使用用于PDS-1000的標準方案將其上依序連接了DNA-1和DNA-2的金粒子遞送到10DAPHi-II不成熟胚的小盾片細胞中。對于這個實驗，DNA-1質粒含有UBI：：RFP：：pinII表達盒，DNA-2含有UBI：：CFP：：pinII表達盒。轟擊后兩天，觀察到CFP和RFP熒光標記都有瞬時表達，因為在未成熟胚表面上有許多紅色和藍色細胞。然后將胚放在非選擇性培養(yǎng)基上，讓其生長3個星期后對穩(wěn)定集落進行打分。在這個3星期期間后，觀察到10個多細胞的穩(wěn)定表達的藍色集落，相比之下只有一個紅色集落。這證明PEI沉淀可用來有效引入DNA進行瞬時表達，同時大大減少PEI引入的DNA的整合，從而減少表達RFP的轉基因事件的恢復。這樣，PEI沉淀可用來遞送BBM和/或WUS2的瞬時表達。例如，首先使用PEI使粒子包覆上UBI：：BBM：：pinII，接著使用水溶性陽離子脂質轉染試劑包覆上UBI：：moPAT～YFP，然后轟擊到不成熟胚的表面上的小盾片細胞中。PEI介導的沉淀導致在未成熟胚表面上瞬時表達細胞的高頻率以及恢復穩(wěn)定轉化體的極低頻率。因此，預期PEI沉淀的BBM盒瞬時表達并且刺激組織的轟擊表面(即，小盾片表面)上的胚發(fā)生生長的突發(fā)，但該質粒將不會整合。從Ca++/金粒子釋放的PAT～GFP質粒預期會發(fā)生整合并以會導致轉基因事件的實質上改進的恢復的頻率表達選擇性標記。作為對照處理，將含有UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI沉淀的粒子與PAT～GFP/Ca++粒子混合。將來自兩個處理的不成熟胚移到含有3mg/l雙丙氨膦的培養(yǎng)基上。6-8個星期后，預期在PEI/BBM處理中觀察到的GFP+、雙丙氨膦抗性愈傷組織的頻率要比對照處理(PEI/GUS)高得多。作為一個可供選擇的方法，用PEI將BBM質粒沉淀到金粒子上，然后引入到不成熟胚的表面上的小盾片細胞中，隨后BBM基因的瞬時表達引發(fā)胚發(fā)生生長的快速增殖。在這個誘導的生長期間，使用用于玉米的標準方法(參見實例1)，用農桿菌處理外植體，T-DNA遞送到細胞中，引入轉基因表達盒如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在進行了共培養(yǎng)后，讓外植體在正常生長培養(yǎng)基上恢復，然后移到含有3mg/l雙丙氨膦的培養(yǎng)基上。6-8個星期后，預期在PEI/BBM處理中觀察到的GFP+、雙丙氨膦抗性愈傷組織的頻率要比對照處理(PEI/GUS)高得多。通過瞬時表達BBM和/或WUS2多核苷酸產物來“啟動”愈傷組織生長可能是合宜的。這可通過遞送BBM和WUS25′加帽的聚腺苷酸化RNA、含有BBM和WUS2DNA的表達盒或BBM和/或WUS2蛋白來完成。所有這些分子可用生物射彈粒子槍來遞送。例如，5′加帽的聚腺苷酸化BBM和/或WUS2RNA可容易地使用Ambion公司的mMessagemMachine試劑盒在體外制備。將RNA與含有感興趣的多核苷酸和用于選擇/篩選的標記如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII的DNA一起進行共遞送。預期接受了RNA的細胞將立即開始更快速地分裂，并且這些細胞中有很大一部分將整合了該農藝基因。這些事件可進一步被確認為轉基因克隆集落，因為它們也將表達PAT～GFP融合蛋白(從而將在適當的照明下顯示綠色熒光)。然后可對從這些胚再生的植物篩選感興趣的多核苷酸的存在。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3