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生產(chǎn)小麥屬轉(zhuǎn)基因植物用的無選擇標記根瘤菌科介導方法與流程

文檔序號:11849964閱讀:453來源:國知局
本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域
,并包括一種改善了的借助于來自根瘤菌科,尤其土壤桿菌屬的細菌細胞生產(chǎn)小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的方法,以及用該改善了的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物或其一部分,
背景技術(shù)
:小麥屬植物,諸如,例如小麥(Triticumaestivum)產(chǎn)品是最重要的原料,并作為世界大部分地區(qū)的基本食物起決定性的作用。近五十年來,例如在小麥上在各種特征,例如,產(chǎn)量方面?zhèn)鹘y(tǒng)栽培所達到的進展,比其他作物類型,諸如玉米、甜菜或油菜明顯地落后。小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的研制提出一種至少部分地再次彌補這些耽誤的進展的可能性。然而轉(zhuǎn)基因小麥屬植物通過根瘤菌科(例如,根癌農(nóng)桿菌)介導轉(zhuǎn)化的生產(chǎn),自古以來就是極其困難的。一般在這里,例如,在小麥上每個分離輸出外植株只達到1%-3%轉(zhuǎn)基因植株的效率。在個別情況下文獻轉(zhuǎn)化方案(Transformationsprotokolle)(Hensel等人,2009;Shrawat和Loerz,2006)中描述高達10%的效率,然而這在實踐中往往不可實現(xiàn)。已知的方案包括差不多只應(yīng)用標記基因在共轉(zhuǎn)化中進行選擇(選擇標記)。這時,該選擇標記通常與要轉(zhuǎn)化的目標基因(goi)耦合。作為標記基因一般不是采用一種抗生素抗體基因,就是采用除草劑抗體基因,轉(zhuǎn)化的細胞在確定的體外條件下才能在再生階段期間獲得存活優(yōu)勢。因此標記基因提供一種區(qū)別非轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物的途徑。最后,應(yīng)用以標記基因選擇使比較有效轉(zhuǎn)化成為可能,或使轉(zhuǎn)化完全成為可能。因為選擇標記只在轉(zhuǎn)基因植物體外階段期間才需要,所以它以后在植物中不再實現(xiàn)任何功能,因此這時是多余的。但因為可供支配的選擇標記數(shù)量有限,所以不再需要的選擇標記的存在惡化用第二目標基因附加對已經(jīng)轉(zhuǎn)基因植物的超級轉(zhuǎn)化。因此,借助于順序轉(zhuǎn)化堆集多個基因只有有限的可能,并且各自的植物種類可供使用的不同的選擇標記受到數(shù)量限制。此外,在轉(zhuǎn)基因植物中,尤其應(yīng)用抗生素抗體基因作為選擇標記,在社會上是受批判的,基本上在法律許可上和在商業(yè)化上只有無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物才可能被接受。然而,排除選擇標記非常費工、費錢和費時間。技術(shù)上今天對專業(yè)人員出現(xiàn)有從轉(zhuǎn)基因植株的基因組中清除選擇標記的不同方法和和輔助劑可供使用。一方面,人們可以利用高特異性核酸酶(例如,鋅指核酸酶)。為此,這樣的核酸酶必須通過與核酸酶表達系在含有要清除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物的基因組雜交導入。此外,在富有成效地排除選擇標記之后,還需要借助于減數(shù)分離從轉(zhuǎn)基因植物基因組排除該核酸酶。以此為了鑒定無選擇標記植物至少需要下兩代。作為這種方法的一個方案,可以考慮使用特異性重組酶(例如,Cre重組酶),然而這總是導致在該轉(zhuǎn)基因植物中殘留重組位點。從法律角度看這是有問題的,因為它在這里也是不需要的,因而在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)部是多余的基序。另一方面,可以用兩個T-DNA的植物轉(zhuǎn)化,其中該一個T-DNA使目標基因和其他T-DNA攜帶選擇標記。在約30%至50%所建立的轉(zhuǎn)基因植物中,這時會在一個細胞中整合這兩個T-DNAs,但處在基因組的不同的位置上。以此可能借助于減數(shù)分裂分離選擇標記,并可能在下一代分離目標基因。然而,只有在輸出轉(zhuǎn)化體的第一子代才可能鑒定無選擇標記植物。然而,由于這兩個轉(zhuǎn)化的T-DNA在接近相鄰的基因組區(qū)域頻繁的共整合,通過析出分離選擇標記和目標基因效率非常低,以致必須建立數(shù)量很大的輸出轉(zhuǎn)化體,以便可以識別出足夠數(shù)量的無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)化過程期間不使用選擇步驟生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物,長時間以來被認為是不可能的(Potrykus等人,1998;Erikson等人,2005;Joersbo等人,2001)。在其2006年回顧文章中Shrawat和Loerz描述生產(chǎn)無選擇標記谷類植物的各種可能性,然而所有方法都基于應(yīng)用上述策略,因而不是實施共轉(zhuǎn)化(目標基因和選擇標記處于兩個單獨的T-DNA上),通過減數(shù)分裂分離選擇標記和目標基因,接著通過特異性重組酶附帶地排除選擇標記。沒有描述無選擇標記轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。在不久以前出現(xiàn)的Tuteja等人(2012)的回顧文章中,同樣提及很多建立無標記基因植物的方法。然而,即使在該文中也只是再一次顯示Shrawat和Loerz(2006)提及的共轉(zhuǎn)化或附加的排除選擇標記的可能性。沒有說明借助于諸如根癌農(nóng)桿菌等根瘤菌科細菌,在小麥屬植物中進行無選擇標記的轉(zhuǎn)化。DeVetten等人,2003,Ahmad等人,2008),煙草(Li等人,2009),橙(Ballester等人,2010)和苜蓿(Ferradini等人,2011)描述對于其他幾種植物種類,此外馬鈴薯借助于土壤桿菌屬的沒有選擇標記存在和應(yīng)用的情況下植物轉(zhuǎn)化。今天已知下列在拒絕采用標記基因選擇時可能出現(xiàn)的不希望出現(xiàn)的現(xiàn)象:轉(zhuǎn)化的外植體通過一般在愈傷階段上的多個選擇步驟。在這種選擇階段期間抗生素或滅草劑的存在使愈傷組織中轉(zhuǎn)基因細胞的富集,它們攜帶相應(yīng)的抗體基因,因而是轉(zhuǎn)基因。非轉(zhuǎn)基因細胞在其生長中受到抑制并死去,這使首先從被選擇的愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因苗的概率明顯提高。于是,F(xiàn)aize等人(2010)表示,在杏轉(zhuǎn)化過程期間,杏苗中轉(zhuǎn)基因組織的比例可以通過在選擇性培養(yǎng)基上多次傳代培養(yǎng)提高,并因此該苗的嵌合特性可以通過應(yīng)用選擇減少或消除。因而選擇步驟失敗,有目共睹地出現(xiàn)這樣來自轉(zhuǎn)基因細胞的非轉(zhuǎn)基因苗在再生期間處于優(yōu)勢的危險。由此得出,通過土壤桿菌屬感染轉(zhuǎn)化的細胞與非轉(zhuǎn)化的細胞相比具有活力劣勢。因此,在無選擇標記轉(zhuǎn)化時,主要非轉(zhuǎn)基因苗再生的概率提高。因此,與帶有選擇的轉(zhuǎn)化相比,轉(zhuǎn)化效率明顯降低。在無選擇標記馬鈴薯轉(zhuǎn)化時,這進行了很好的研究,其中(DeVetten等人,2003)描述效率為1-4%,而在帶有選擇標記轉(zhuǎn)化時可以獲得約30%的效率(Chang和Chan,1991)。另外,人們一般觀察到,在基于標記子的選擇不存在時,還有這樣的苗再生,它不僅由轉(zhuǎn)基因組織,而且由非轉(zhuǎn)基因組織組成(嵌合苗)。這時,可以存在不同形式的嵌合特性。若應(yīng)該存在平周(periklinale)嵌合,則可能在植物分生組織中出現(xiàn)形成配子所需要的L2細胞層是非轉(zhuǎn)基因的。因此在這種植物中只形成非轉(zhuǎn)基因配子,而在該植物中導入的轉(zhuǎn)基因不傳遞到下一代。這時,在再生要繁殖的植物時,這樣的嵌合轉(zhuǎn)基因植物丟失。在局部嵌合植物上,該植物的幾個區(qū)域是轉(zhuǎn)基因的,其他區(qū)域是非轉(zhuǎn)基因。在該植物非轉(zhuǎn)基因的區(qū)域/部分中,只形成非轉(zhuǎn)基因配子。因此,非轉(zhuǎn)基因配子的比例明顯提高,使得在后代中可以檢測到非轉(zhuǎn)基因的后代的比例增大。在子代中分裂比例不符合孟德爾定律。通過應(yīng)用基于標記子的選擇通常抑制嵌合苗形成,或在部分嵌合中轉(zhuǎn)基因組織的比例通過應(yīng)用選擇壓力這樣高,以致沒有再生轉(zhuǎn)基因植物的嵌合特性的負作用或只有非常小,甚至出現(xiàn)不符合孟德爾定律的遺傳。從技術(shù)現(xiàn)狀看,對于單子葉植物經(jīng)濟作物先有技術(shù)已知只有很少可以應(yīng)用的無標記子基因的植物轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)方法。尤其對于小麥只有Liu等人2011年描述小麥植物富有成效的無選擇標記生產(chǎn)。然而達到的產(chǎn)出率極低,只有0.28%,因此所描述的方法不適宜日常應(yīng)用。此外,該作者為了轉(zhuǎn)化使用微粒轟擊和諸如根癌農(nóng)桿菌等非根瘤菌科細菌。WO2008/028121描述可以不用選擇產(chǎn)生的無選擇標記玉米植物建立。該作者建議,所公開的方法還應(yīng)用于其他禾本科,諸如小麥,然而所顯示的實施例只限于用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物。為此雖然該作者引證,所產(chǎn)生的玉米植物優(yōu)選應(yīng)該是非嵌合的,然而沒有把轉(zhuǎn)基因遺傳到下一代的試驗數(shù)據(jù),以致無法排除所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米植株仍然是嵌合的。在EP2274973中同樣描述借助于土壤桿菌屬介導轉(zhuǎn)化,其間沒有應(yīng)用選擇步驟,產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的單子葉植物,尤其玉米和水稻作物。對于玉米清楚地表示,在嵌合植物上出現(xiàn)的數(shù)目并非無關(guān)緊要,必須費用高昂的鑒別和篩選。嵌合的輸出轉(zhuǎn)化體的比例占所獲得的轉(zhuǎn)基因苗的>50%。只有小于20%產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物是完全非嵌合(一致的)。于是,帶有嵌合特性的轉(zhuǎn)化體數(shù)目,就像想象中的那樣,比帶有相應(yīng)的選擇步驟轉(zhuǎn)化時高出一倍。這樣,例如,在Coussens等人(2012)文中表示,在應(yīng)用選擇標記的情況下產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物時,所建立的植物只有約5%的部分是嵌合的,或所建立的植物95%是非嵌合的,因此按照孟德爾定律轉(zhuǎn)基因傳遞到下一代。此外,作者在EP2274973描述不應(yīng)用選擇標記稻的轉(zhuǎn)化,然而沒有進行在所產(chǎn)生的無選擇標記植物群體中嵌合植物的比例有多高的分析。在這方面,有趣的是,在應(yīng)用選擇壓力的稻轉(zhuǎn)化時已經(jīng)出現(xiàn)嵌合植物(Hiei等人,1994)。因此在這里還可以預(yù)期,無選擇標記轉(zhuǎn)化時稻中嵌合植物的比例明顯的高。作者從EP2274973還建議把所公開的制造方法用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥,然而沒有找到為此的預(yù)期對于小麥何種效率和嵌合趨勢的試驗數(shù)據(jù)。盡管小麥像玉米和稻一樣屬于單子葉植物,但專業(yè)人員知道,這種作物植物類型的細胞在轉(zhuǎn)化和再生過程中,可以具有明顯不同的行為,因此必須懷疑,其他單子葉植物的轉(zhuǎn)化結(jié)果是否可以毫無困難地轉(zhuǎn)移到小麥植物上。于是,例如,Hensel等人在2009年在大麥、玉米、小黑麥屬和小麥轉(zhuǎn)化的比較中表示這樣的區(qū)別。EP2460402A1公開了一種特別有效的借助于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥細胞的方法,在再生時應(yīng)該使產(chǎn)出率為70%和每次分離的輸出外植株較多的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。但是這里應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方案總是包含選擇標記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)或膦基麥黃酮乙?;D(zhuǎn)移酶(PAT/bar)。雖然該作者宣稱,對于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥植物的選擇并不一定需要,然而在這里也缺少相應(yīng)的試驗證據(jù)。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明是在上述先有技術(shù)的背景下進行的,本發(fā)明的任務(wù)是,提供一種根瘤菌科介導生產(chǎn)小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的方法,它不用基于標記子的選擇也行,而且把上述不希望的作用減到最小,或者只在較小的程度上呈現(xiàn)出來。此外,本發(fā)明的任務(wù)是一種小麥屬轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)方法,它不僅從經(jīng)濟上看,而且從法律角度看,比至今的方法都有優(yōu)勢。按照本發(fā)明,該任務(wù)用小麥屬轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)方法解決,包括步驟:(a)通過小麥屬植物外植體細胞與來自根瘤菌科的包括一種基因成分的至少一個細菌細胞共培養(yǎng),用該基因成分轉(zhuǎn)化小麥屬植物的至少一個細胞,和(b)從來自(a)的至少一個轉(zhuǎn)化的細胞再生小麥屬轉(zhuǎn)基因植物,其中從步驟(a)至步驟(b)都沒有根據(jù)一種通過該基因成分或其一部分介導的特性對來自(a)的轉(zhuǎn)化的細胞進行選擇。來自根瘤菌科的細菌細胞,最好是土壤桿菌屬細菌細胞,和特別優(yōu)選根癌農(nóng)桿菌類型的細菌細胞(Broothaerts等人2005)。該細菌細胞優(yōu)選在一個載體上,尤其在二元載體、超二元載體上或一個共整合載體系統(tǒng)的一個載體上包括該基因成分。該基因成分優(yōu)選是核酸分子,尤其是一個DNA分子或一個重組體DNA,并包括至少該目標基因。此外該基因成分還可以具有調(diào)節(jié)序列、內(nèi)含子、RNA分子用的識別序列、DNA分子或蛋白質(zhì)或一個5′-或3′-UTR(未翻譯的區(qū)域)。在本發(fā)明的一個方法中,在步驟(a)轉(zhuǎn)化在允許小麥屬植物外植體的至少一個細胞用來自根瘤菌科的細菌細胞富有成效的感染的條件下進行。這樣的轉(zhuǎn)化條件是專業(yè)人員從技術(shù)現(xiàn)狀已知的(Cheng等人,1997)。在步驟(a)使用的外植體是一個胚性組織、細根、胚軸、胚麟或胚芽,或其一部分,而且是未成熟的胚胎或成熟的種子(EP0672752B1)。但還有其他適當?shù)慕M織是已知的,對于諸如小麥等小麥屬植物的轉(zhuǎn)化可以成功使用(Shrawat和Loerz(2006))。此外,來自(a)的至少一個轉(zhuǎn)化的細胞在步驟(b)再生小麥屬轉(zhuǎn)基因植物,也意味著從來自(a)的至少一個轉(zhuǎn)化的細胞再生植物,它從至少一個轉(zhuǎn)化的細胞通過細胞分裂,例如在形成愈傷組織轉(zhuǎn)化為體細胞胚的過程中產(chǎn)生的,以便這時導致苗的再生。專業(yè)人員從先有技術(shù)已知小麥屬植物再生的不同技術(shù)。例如,一種再生可以從未成熟的胚胎進行(Vasil等人,1993)。再生的另一種可能性由Antheren或由Mikrosporen給出(例如:Maluszynski等人,2003)。此外,小麥植物還已經(jīng)由花組織(Amoah等人,2001)以及由成熟胚胎的愈傷組織再生(Wang等人,2009)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中,從步驟(a)至步驟(b)都沒有根據(jù)一個通過該基因成分或其一部分介導的特性選擇來自(a)轉(zhuǎn)化的細胞。這里來自(a)的轉(zhuǎn)化的細胞,同樣可以意味著從至少一個來自(a)的轉(zhuǎn)化的細胞通過細胞分裂產(chǎn)生的一個轉(zhuǎn)化的細胞。最好不根據(jù)一個通過該基因成分或其一部分介導的特性進行選擇,不根據(jù)除草劑或抗生素抗性進行選擇。除草劑抗性可以,例如,通過來自鏈霉菌屬hygroscopicus或鏈霉菌屬viridochromogenes的膦基麥黃酮乙?;D(zhuǎn)移酶的表達,它介導對草丁膦或雙丙氨磷滅草劑的抗性(DeBlock等人,1987)。另一個除草劑抗性,相對于鎮(zhèn)草寧有效成分的抗性可以通過5-烯醇式丙酮酸(Enolpyruvylshikimat)-3-磷酸鹽合酶的過表達達到。通常為此使用一種對鎮(zhèn)草寧不敏感的酶(Comai等人,1983)。此外,對除草劑類,磺胺尿素、磺?;被驶蛲橥⑦溥蛲?、三唑并嘧啶和硫代)苯甲酸嘧啶酯的抗性,可以通過乙酰乳酸合酶(ALS)突變形式的表達達到。這時,不同的變異導致對不同除草劑的抗性。在關(guān)于通常使用的除草劑抗性的總覽可在Tuteja等人(2012)、Kraus(2010)或Shrawat和Loerz(2006)文中找到??股乜剐钥梢酝ㄟ^細菌基因的表達達到,所用的抗生素通過磷酸酯或醋酸基的傳遞失活。為此的示例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt),它介導對氨基糖苷類類別(例如,卡那霉素、巴龍霉素、遺傳霉素)的抗生素的抗性。作為其他經(jīng)常使用的抗生素抗性,例如,使用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,它介導對潮霉素B抗生素的抗性。關(guān)于在植物轉(zhuǎn)化中采用的抗生素抗性的總覽可在Tuteja等人(2012)、Kraus(2010)或Shrawat和Loerz(2006)文中找到。但除了抗生素和除草劑抗性以外,還可以使用其他使轉(zhuǎn)基因細胞和非轉(zhuǎn)基因細胞之間出現(xiàn)差別成為可能的選擇標記。為此的示例是,例如,花色素苷或其他植物染料產(chǎn)品的激勵,通過一定的轉(zhuǎn)錄因子的表達(Kortstee等人,2011)、熒光蛋白的表達(Mussmann等人,2011)或營養(yǎng)缺陷型標記子的表達,諸如磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI),其表達使轉(zhuǎn)基因細胞在甘露糖上作為唯一的糖源的生長成為可能,反之非轉(zhuǎn)基因細胞不能利用這種碳源(Reed等人,2001)。專業(yè)人員認識到,由于在轉(zhuǎn)化上所缺的選擇壓力以及來自根據(jù)本發(fā)明的方法步驟(a)至步驟(b)的非轉(zhuǎn)化的細胞除了轉(zhuǎn)基因植物以外還可以在步驟(b)再生非轉(zhuǎn)基因或嵌合植物。在可用的轉(zhuǎn)基因植物(非嵌合)上產(chǎn)出率低,長期妨礙無標記子基因方法在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟合理的應(yīng)用。一般是帶有根據(jù)一個標記基因進行選擇和緊跟著附加的排除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn),盡管它與工作量、成本和時間消耗相聯(lián)系,此外是建立轉(zhuǎn)基因的無選擇標記植物的選擇方法。為了提高建立轉(zhuǎn)基因的單子葉植物的效率,專家一致認為,這只可以這樣做到,即在外植體細胞與土壤桿菌屬共培養(yǎng)的時刻,必須明顯提高感染率。這時,這應(yīng)該導致轉(zhuǎn)化率增大,亦即,在外植體中存在較多的轉(zhuǎn)化的細胞,這時由此還應(yīng)該再生較多的轉(zhuǎn)基因植物。從技術(shù)現(xiàn)狀看,已知(US2011/0030101A1)這類提高轉(zhuǎn)化效率不同的著手方法。它們還成功用在玉米和稻的無標記子基因的生產(chǎn)方法上。盡管今天轉(zhuǎn)基因的玉米和水稻作物的無標記子基因生產(chǎn)方法在基于標記基因的選擇的方法后面的轉(zhuǎn)化效率仍舊落后,轉(zhuǎn)基因的玉米和水稻作物生產(chǎn)仍舊總是首先應(yīng)用基于標記基因的選擇。此外在拒絕選擇標記及其接著不可避免的鑒別和分選時,在并非無關(guān)緊要的程度上,這還導致存在的嵌合植物產(chǎn)生增大的問題。習慣上在拒絕基于標記子的選擇時,嵌合植物的比例,與應(yīng)用標記基因時達到的比例相比高得多。按照本發(fā)明的方法首次描述在應(yīng)用根瘤菌科介導轉(zhuǎn)化的情況下,小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn),其中沒有根據(jù)一個通過在轉(zhuǎn)化期間引入基因成分或其一部分進行介導的特性選擇轉(zhuǎn)化的細胞。與預(yù)想的相反,本發(fā)明的方法表明轉(zhuǎn)化效率高得令人吃驚,比先有技術(shù)已知的不應(yīng)用諸如根癌農(nóng)桿菌等根瘤菌科細菌的轉(zhuǎn)基因小麥屬植物已知的無標記子基因的制造方法的轉(zhuǎn)化效率高得多。該方法有利地具有至少5%,6%,7%,8%,9%或10%的轉(zhuǎn)化效率,特別優(yōu)選至少11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,或更加特別優(yōu)選的是至少21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%或40%以上。在根據(jù)本發(fā)明的方法一個推薦的設(shè)計方案中,轉(zhuǎn)化效率可與相應(yīng)對比方法的轉(zhuǎn)化效率相比,其差別在于,根據(jù)一個通過基因成分或其一部分介導的特性,因而根據(jù)至少一個選擇標記選擇轉(zhuǎn)化的細胞。此外,根據(jù)本發(fā)明的方法的轉(zhuǎn)化效率,具有一種根據(jù)通過該基因成分或其一部分介導的特性選擇,因而根據(jù)至少一個選擇標記選擇的等效方法的轉(zhuǎn)化效率的至少95%,至少90%,至少85%,至少80%,至少75%,至少70%,至少65%,至少60%,至少55%,至少50%,至少45%,至少40%,至少35%,至少30%或至少25%。由于與附加的從穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物排除選擇標記相聯(lián)系的工作量消耗大,即使當在根據(jù)本發(fā)明的方法中達到這樣的轉(zhuǎn)化效率時,專業(yè)人員仍然注意到,按照本發(fā)明的方法仍舊是有利的,并比先有技術(shù)有優(yōu)勢。另外,這樣高的轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該使專業(yè)人員感到意外,因為他從,例如,轉(zhuǎn)基因的玉米和水稻作物無標記子基因生產(chǎn)的實踐經(jīng)驗預(yù)期轉(zhuǎn)化效率低得多。在根據(jù)本發(fā)明的方法另一個推薦的實施中,上面描述的方法的特征在于,通過一個提高轉(zhuǎn)化效率的處理提高轉(zhuǎn)化效率。提高轉(zhuǎn)化效率用的處理,可以實現(xiàn)至少5%,6%,7%,8%,9%或10%,的轉(zhuǎn)化效率,最好至少11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,或特別優(yōu)選至少21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%或大于40%。在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法,尤其生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法中,提高轉(zhuǎn)化效率用的不同的處理是在先有技術(shù)中描述的。提高轉(zhuǎn)化效率用的處理,可以包括至少一個由下列選定的處理:i.在共培養(yǎng)期間或共培養(yǎng)之后,使組織或其一部分受到物理和/或化學損傷(EP2460402),ii.共培養(yǎng)之前、在共培養(yǎng)期間或共培養(yǎng)之后的離心處理(Hiei等人,2006,WO2002/012520),iii.在共培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中添加硝酸銀和/或硫酸銅(Zhao等人,2002;Ishida等人,2003;WO2005/017152),iv.共培養(yǎng)之前或在共培養(yǎng)期間外植體的熱處理(WO1998/054961),v.共培養(yǎng)之前或在共培養(yǎng)期間或共培養(yǎng)之后的壓力處理(WO2005/017169),vi.在粉劑存在的情況下用土壤桿菌屬接種(WO2007/069643)和vii.在共培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中添加半胱氨酸(Frame等人,2002)。此外,在本發(fā)明的方法中可以采用先有技術(shù)已知的其他提高轉(zhuǎn)化效率用的處理。為此提高轉(zhuǎn)化效率用的處理,還可以是已知的提高轉(zhuǎn)化效率用的處理的結(jié)合。在根據(jù)本發(fā)明的方法另一個推薦的實施中,上面描述的方法不是其特征在于,在步驟(b)中小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的再生是非嵌合的、轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生至少15%,至少16%,至少17%,至少18%,至少19%,至少20%,至少22%,至少24%,至少26%,至少28%,至少30%,至少32%,至少34%,至少36%,至少38%或至少40%,最好至少45%,至少50%,至少55%,至少60%,至少65%或至少70%,特別優(yōu)選至少75%,至少80%,至少85%或至少90%的出現(xiàn)頻率,就是其特征在于,小麥屬轉(zhuǎn)基因植物在步驟(b)的再生產(chǎn)生小于70%,65%,60%,55%,50%,45%,40%,35%,30%,28%,26%,24%,22%,20%,18%16%,15%,14%,13%,12%,11%,10%,9%,8%,7%,6%或5%嵌合轉(zhuǎn)基因植物。在根據(jù)本發(fā)明的方法一個特別推薦的設(shè)計方案中,來自步驟(b)小麥屬非嵌合的轉(zhuǎn)基因植物的比例,可與用相應(yīng)的對比方法再生的小麥屬非嵌合的轉(zhuǎn)基因植物的比例相比較,差別在于,根據(jù)一個通過該基因成分或其一部分介導的特性,因而根據(jù)至少一個選擇標記選擇轉(zhuǎn)化的細胞。這同樣令是人吃驚的,因為專業(yè)人員從,例如,無標記子基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的玉米植物的方法的實踐經(jīng)驗指望,非嵌合小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的比例要低得多。盡管來自步驟(b)的小麥屬非嵌合轉(zhuǎn)基因植物的比例,比對比方法的低,但由于帶有上述附加的移除選擇標記基因的無選擇標記小麥屬植物的建立工作量消耗大,專業(yè)人員仍會注意到,按照本發(fā)明的方法仍舊是有利的并比先有技術(shù)有優(yōu)勢。這時,該比例可以低出最多一個因數(shù)(倍)10、最多一個因數(shù)9、最多一個因數(shù)8、最多一個因數(shù)7、最多一個因數(shù)6、最多一個因數(shù)5、最多一個因數(shù)4.5、最多一個因數(shù)4、最多一個因數(shù)3.5、最多一個因數(shù)3、最多一個因數(shù)2.5、最多一個因數(shù)2。如上所述,當再生苗由其中這些細胞的一部分是轉(zhuǎn)基因的,而另一部分是非轉(zhuǎn)基因的多個原始細胞形成時,可能出現(xiàn)嵌合的轉(zhuǎn)基因植物。這時,例如,可能出現(xiàn)局部嵌合或平周嵌合(Periklinalchimaere)。通過非轉(zhuǎn)基因組織在嵌合植物中的比例,例如,這可以通過定量PCR鑒別出來(Faize等人,2010)。嵌合的轉(zhuǎn)基因植物的另一個測試方法乃是分析輸出轉(zhuǎn)化體的第一子代。導入輸出轉(zhuǎn)化體的基因成分或其一部分可以按照孟德爾定律傳遞到下一代。在該植物細胞基因組中整合一個基因成分或其一部分的副本時,它只整合在二倍體基因組的單個染色體中。這時在一個非嵌合植物中在減數(shù)分裂中,該基因成分或其一部分可以在所形成的配子的50%找到。但是,在嵌合轉(zhuǎn)基因植物中還由植物配子的非轉(zhuǎn)基因零件形成。在這些組織中只形成不含有該基因成分或其一部分的配子。因此,在整個植物看來,在嵌合轉(zhuǎn)基因植物中非轉(zhuǎn)基因配子的比例提高到50%以上。在嵌合輸出轉(zhuǎn)化體Selbstungs后代中,非轉(zhuǎn)基因后代的比例因此還提高到>25%的數(shù)值,因此大于按照孟德爾定律的期望值。在嵌合的轉(zhuǎn)基因植物第一子代中不遵循孟德爾定律的分離的示例見于Coussens等人(2012)的論文。在根據(jù)本發(fā)明的方法另一個特別推薦的設(shè)計方案中,來自步驟(b)的小麥屬嵌合轉(zhuǎn)基因植物的比例,可與以相應(yīng)的對比方法再生的小麥屬嵌合轉(zhuǎn)基因植物的比例相比較,差別在于根據(jù)一個通過該基因成分或其一部分介導的特性,因而根據(jù)至少一個選擇標記,選擇轉(zhuǎn)化的細胞。這同樣令人吃驚,因為專業(yè)人員從,例如,無標記基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的玉米植物的方法的實踐經(jīng)驗中預(yù)期,小麥屬嵌合轉(zhuǎn)基因植物的比例會高得多。由于為了建立帶有上述附加的移除選擇標記基因的無選擇標記小麥屬植物的工作量消耗大,盡管來自步驟(b)的小麥屬嵌合轉(zhuǎn)基因植物的比例高于對比方法,專業(yè)人員也會注意到,按照本發(fā)明的方法仍舊是有利的而且比先有技術(shù)有優(yōu)勢。這時,該比例可能高出最多一個因數(shù)10、最多一個因數(shù)8、最多一個因數(shù)6、最多一個因數(shù)5、最多一個因數(shù)4、最多一個因數(shù)3.5、最多一個因數(shù)3、最多一個因數(shù)2.5、最多一個因數(shù)2、最多一個因數(shù)1.8、最多一個因數(shù)1.6、最多一個因數(shù)1.4、最多一個因數(shù)1.2、最多一個因數(shù)1.1。在一個特別推薦的設(shè)計方案中,按照本發(fā)明的方法的特征在于,在步驟(b)之后包括另一步驟(c),選擇來自步驟(b)的再生轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選進行根據(jù)該基因成分或其一部分的分子結(jié)構(gòu)或根據(jù)特性,尤其通過基因成分直接或間接地介導的表型特性(例如,除草劑抗性、病原體抗性、株高、產(chǎn)量、葉子結(jié)構(gòu))進行選擇?;虺煞只蚱湟徊糠值姆肿咏Y(jié)構(gòu)意味著,尤其該基因成分或其一部分的核苷酸的順序。步驟(c)用來檢測小麥屬植物細胞中基因成分或其一部分富有成效的轉(zhuǎn)化,亦即,還檢測植物基因組中基因成分或其一部分的傳遞。為此專業(yè)人員有很多先有技術(shù)的分子生物學的不同方法可供使用。這樣導入細胞的基因成分的檢測,例如,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(Mullis,1988)、通過與所導入的基因成分互補的可檢測單鏈核酸、與轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA的雜交,例如,所謂DNA印跡(Southern,1975),或轉(zhuǎn)基因植物基因組序列測定(Kovalic等人,2012)成為可能。此外,該基因成分或其一部分的分子結(jié)構(gòu)還可以意味著,例如,通過從該基因成分轉(zhuǎn)錄、處理和/或翻譯給出的衍生成分的分子結(jié)構(gòu)。這樣轉(zhuǎn)基因植物中導入的基因成分或其一部分的轉(zhuǎn)錄物或編碼的肽/多肽/蛋白質(zhì)的檢測同樣作為基因成分或其一部分成功轉(zhuǎn)化的證明,因而適宜于選擇。專業(yè)人員已知的可以用于轉(zhuǎn)錄物檢測目的方法的示例是:由該基因成分或其一部分形成的RNA重寫為cDNA,和緊跟著聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR;Sambrook等人,2001)、對導入基因成分的互補的可檢測單鏈核酸與該轉(zhuǎn)基因植物RNA的雜交(NorthernBlot,Sambrook等人,2001)、或由基因成分或其一部分形成的RNA重寫為cDNA,并緊跟著的對所獲得的cDNA整個庫的序列測定。所編碼的肽/多肽/蛋白質(zhì),例如,可以借助于免疫檢測通過不同的方法,諸如蛋白質(zhì)印跡或ELISA鑒定。另外,為了進行選擇,可以檢測一種通過該基因成分直接或間接介導的表型特性。這樣的表型檢測還可以包括檢測植物細胞改變了的化學成份。這時,這個改變了的化學成份可以借助于已知的化學分析方法檢測。在根據(jù)本發(fā)明的方法另一個特別推薦的設(shè)計方案中,在步驟(a)小麥屬植物的該至少一個細胞與該完全基因成分轉(zhuǎn)化,尤其穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。完全意味著,小麥屬植物至少一個細胞優(yōu)選與該基因成分轉(zhuǎn)化,其中該基因成分不經(jīng)歷損害小麥屬植物細胞中基因成分想要的功能的截短(例如,從5′-或3′-端),而且小麥屬植物的至少一個細胞特別優(yōu)選與該基因成分的全部核苷酸轉(zhuǎn)化。在根據(jù)本發(fā)明的方法另一個特別推薦的設(shè)計方案中,在步驟(a)轉(zhuǎn)化之后,該基因成分表現(xiàn)出小麥屬植物的使該基因成分想要的功能成為可能的細胞中的表達高度。按照本發(fā)明的方法優(yōu)選特征在于來自步驟(a)轉(zhuǎn)化的細胞的10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或100%具有一個可檢測的表達高度,最好具有使該基因成分想要的功能成為可能的表達高度,或來自步驟(b)再生小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或100%包括具有可檢測表達高度的細胞,最好具有使該基因成分想要的功能成為可能的表達高度。反而上面描述的生產(chǎn)小麥屬轉(zhuǎn)基因植物的方法允許有利地采用,因為從該轉(zhuǎn)基因植物可以研制出質(zhì)量較高的無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植株。為了生產(chǎn)質(zhì)量可比的轉(zhuǎn)基因植株,目前只有借助于共轉(zhuǎn)化和緊跟著的分離產(chǎn)生無選擇標記植物的可能性。若比較以下運行通過應(yīng)用共轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株所必須的消耗,與采用本發(fā)明的方法時的消耗,則研制純合的無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株的成本約高50倍。圖1表示在采用共轉(zhuǎn)化時以及在無選擇標記轉(zhuǎn)化時,產(chǎn)生100TO轉(zhuǎn)基因的植株的成本估算。在下一代中進一步分析所產(chǎn)生的輸出轉(zhuǎn)化體,目的是獲得純合的無選擇標記種子庫。應(yīng)用共轉(zhuǎn)化時單副本無選擇標記植株的產(chǎn)出率由只有30-50%的共轉(zhuǎn)化率,和不僅目標基因而且該選擇標記都必須存在單副本事件,以便收到足夠高的這兩個轉(zhuǎn)基因的分離概率的要求決定,只有2純合的種子庫,而在按照本發(fā)明的無選擇標記轉(zhuǎn)化時可以從100輸出轉(zhuǎn)化體出發(fā),以30純合的種子庫計算。此外,本發(fā)明還包括用上述方法生產(chǎn)的小麥屬的轉(zhuǎn)基因植物,以及后代,其一部分或由此而得的種子,其中該后代、該部分或該種子具有在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(a)傳遞的基因成分作為轉(zhuǎn)基因的。這時,一部分可以意味著一個細胞、一個組織或一個器官。在下文中首先較詳細地說明在本申請書中使用的某些概念:“目標基因”可以是每個類型的DNA或RNA-分子,例如,編碼蛋白質(zhì)的或者是一個核酸分子?!靶←湆僦参铩币馕吨?,Triticumaestivum(小麥種)植物、Triticumdurum(小麥種)植物或Triticumspelta(小麥種)植物?!罢{(diào)節(jié)序列”與本發(fā)明相聯(lián)系是控制目標基因表達的一個核酸序列。示例是啟動子、操縱子、增強子元件、減弱子、順式元件等。概念“選擇標記”與本發(fā)明相聯(lián)系,與選擇標記基因或標記基因同義使用。可供使用的選擇標記的示例如上述?!稗D(zhuǎn)化效率”可以意味著帶有陽性轉(zhuǎn)基因的苗的外植體數(shù)目對輸出外植株數(shù)目的比率。轉(zhuǎn)化效率優(yōu)選作為百分數(shù)給出。概念“可比較”表示與兩個或多個面對面的數(shù)字數(shù)據(jù)一起,使得這些數(shù)據(jù)彼此偏離最高+/-5%。附圖說明現(xiàn)將參照附圖和序列以舉例的方式描述本發(fā)明的配置和實施方式:圖1:借助于共轉(zhuǎn)化(左)和借助于本發(fā)明的方法產(chǎn)生100T0植物,和純合無選擇標記種子庫的進一步鑒定的成本對比;圖2:帶有用根癌農(nóng)桿菌感染之后5天tDT轉(zhuǎn)化小麥胚胎的胚麟的景色(左:熒光下;右:日光下);箭頭表示舉例提示通過土壤桿菌屬給出的輸出外植株中的熒光區(qū)域;圖3:二元載體pLH70SubiintrontDT(tDT(tDT是串聯(lián)二聚體西紅柿,一種紅熒光蛋白質(zhì));圖4:各植株的基因組DNA的轉(zhuǎn)化研究WA1.20ug選定的無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株的DNA印跡,完全用酶Hindlll消化,在0.8%的瓊脂糖凝膠中分離,在尼龍薄膜上轉(zhuǎn)印,并接著用DIG標記出的PCR產(chǎn)物(tDTrev/tDT-for)雜交;圖5所導入的tDT基因借助于qRT-PCR在選定的轉(zhuǎn)基因小麥植物的表達分析;圖6:借助于qPCR在所導入的轉(zhuǎn)基因tDT上以及在所導入的nos終止子上受精卵狀態(tài)的測定(見圖3)。具體實施方式Taifun栽培品種小麥植物無選擇標記轉(zhuǎn)化:Taifun品種小麥植物在暖室中栽培。培養(yǎng)條件是白天18℃和晚上16℃,其中光照時間等于16小時。作為照明光源使用鈉燈(MasterSON-TAgro400W)。胚胎尺寸一般在發(fā)育穗中測試,而包含帶胚胎的麥粒的麥穗具有1.5-2.5mm大小,收獲并存放在4℃水中避光備用。作為分離未成熟的麥胚胎的準備,麥粒從麥穗分離,并接著表面消毒。為此麥粒首先在70%乙醇中孵育45秒,接著,在1%次氯化鈉溶液中孵育10分鐘。消毒之后麥粒通過在無菌水中多次洗滌,釋放仍舊粘附的次氯化鈉。消毒后的麥粒這時避光存放在4℃下儲存待用。轉(zhuǎn)化用的根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)菌株從根癌農(nóng)桿菌菌株AGL1的甘油培養(yǎng)基出發(fā),它在二元載體pLH70SublitrontDT(圖3)中攜帶要轉(zhuǎn)化的基因構(gòu)建物。在選擇性LB培養(yǎng)基上鋪平板之后(用100mg/L利福平、100mg/L羧芐青霉素、50mg/L奇霉素、25mg/L放線壯觀素)以單個菌落在2ml液體培養(yǎng)基在MG/L-培養(yǎng)基(Wu等人,2009)帶有100mg/L利福平、100mg/L羧芐青霉素、50mg/L奇霉素、25mg/L放線壯觀素接種,并在28℃和200rpm下生長過夜。在次日為了接種50ml新鮮MG/L培養(yǎng)基(100mg/L利福平、100mg/L羧芐青霉素、50mg/L奇霉素、25mg/L放線壯觀素)使用250μl液體培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基在28℃和200rpm下生長過夜。接著,一小份過夜培養(yǎng)基離心(4℃下和3500xg5分鐘),棄去上清液,細菌沉淀在相同容積的lnf液體培養(yǎng)基(表1)以100μM乙酰丁香酮重懸浮。這樣制造的根瘤土壤桿菌懸浮液可以用來感染該未成熟的胚胎。從消毒的麥粒分離未成熟的胚胎,并在Inf液體培養(yǎng)基中收集(表1)。接著,該胚胎用新鮮液體培養(yǎng)基沖洗一次,這時通過離心處理在15.000rpm預(yù)處理10分鐘。為了用土壤桿菌屬感染,制備好的根瘤土壤桿菌懸浮液給到該胚胎上,該胚胎在該根瘤土壤桿菌懸浮液擺動30秒。接著,其上該胚胎在室溫下在該根瘤土壤桿菌懸浮液中再孵育5分鐘。這時該未成熟的胚胎放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(表1)上使胚麟面朝上。這樣處理的外植體在23℃下避光孵育兩天。圖2表示用根癌農(nóng)桿菌感染之后多天轉(zhuǎn)化小麥胚胎的胚麟。小麥胚胎用報告基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,它導致在轉(zhuǎn)化細胞中紅色熒光蛋白質(zhì)的形成。左圖表示日光下的胚麟,右圖表示熒光下的胚麟??梢悦黠@看出,大部分胚麟細胞表達轉(zhuǎn)基因,并因此成功用根癌農(nóng)桿菌感染。未成熟的小麥胚胎與土壤桿菌屬共培養(yǎng)兩天之后,借助于一個鋒利小刀把該胚軸從每個胚胎移開,并將剩余的胚麟置設(shè)在靜息培養(yǎng)基上(表1)。接著,帶有胚麟的平板在25℃下避光孵育5天。接著,成長的愈傷組織再一次在25℃下在靜息培養(yǎng)基上(表1)避光繼代培養(yǎng)21天。所誘生的愈傷組織在LSZ培養(yǎng)基上完全轉(zhuǎn)化(表1),并在光照下放置14天。所形成的綠苗與愈傷組織分離,并在LSF培養(yǎng)基上(表1)扎根轉(zhuǎn)化。這時,該苗只要它已經(jīng)可能,就彼此分離,以便獲得單苗。該苗從初始外植體發(fā)源(胚麟),這時捆綁在一起。苗生長到足夠的高度之后,從這些葉子樣本萃取DNA,緊跟著進行PCR測試。表1:可用培養(yǎng)基成份結(jié)果:小麥的三個獨立轉(zhuǎn)化實驗,如上所述,不用選擇標記進行。在所有三個實驗中,轉(zhuǎn)基因植物都是不用選擇子獲得的(見表2)。令人吃驚的是導致轉(zhuǎn)基因苗的外植體的高比例。在實驗WA1中,151個被感染的胚胎激活苗的再生。PCR分析用的再生苗首先合計總共341苗庫。視每個輸出外植株的再生苗的數(shù)量而定,為此一個外植體各2-3苗用于DNA萃取目的匯集到樣品容器中。若每個輸出外植株再生大于三根苗,則從輸出外植株要求更多苗庫。然而,葉子樣本絕不從多個輸出外植株的苗提取。從所分析的苗庫陽性的數(shù)量高得驚人(78或約23%)。從89外植體的341苗庫中可以鑒定出42外植體78轉(zhuǎn)基因的苗庫。這時單獨測試了基于78苗庫的111苗,這時單獨實驗,并重新研究了轉(zhuǎn)基因的存在。為了檢測再生苗中的轉(zhuǎn)基因,從苗庫或從單苗分離的DNA借助于PCR在重組體DNA存在的情況下進行研究。為此使用引物tDT-1(SEQIDNO:1)和tDT-2(SEQIDNO:2)。其中287bp碎片可以被擴增的DNA,表明導入的重組體DNA的存在并被視為轉(zhuǎn)基因。為了測定在小麥基因組中導入轉(zhuǎn)基因副本的數(shù)量,用引物nosTxxxf01(SEQIDNO:3)和nosTxxxr03(SEQIDNO:4)以及探針nosTxxxMGB(SEQIDNO:5)進行定量PCR。定量PCR確認用經(jīng)典的PCR首先獲得的結(jié)果。在實驗WA1中總共可以檢測82苗轉(zhuǎn)基因。該82苗源于首先用根癌農(nóng)桿菌感染的37個外植體/胚胎。據(jù)此,在實驗WA1中盡管放棄基于標記子的選擇,轉(zhuǎn)化效率仍達到約25%。這個效率是從原有151所使用的外植體中37個外植體陽性苗算出的。在實驗WA2和WA3中直接借助于PCR研究所有從外植體再生的單苗,因為在實驗WA1中高得令人吃驚的轉(zhuǎn)基因苗的產(chǎn)出率,并因此應(yīng)用庫PCR策略(Pool-PCR-Strategie)是多余的。在再生苗的直接分析中,鑒定出56%(WA2)或75%(WA3)可再生外植體轉(zhuǎn)基因單苗。若轉(zhuǎn)化效率是根據(jù)所使用的輸出外植株數(shù)量算出的,則對于實驗WA2給出27%的轉(zhuǎn)化效率,而實驗WA3給出40%。對所有三個不應(yīng)用基于標記子選擇的小麥轉(zhuǎn)化研究求平均給出,突出平均55%可再生外植體轉(zhuǎn)基因的單苗,而平均轉(zhuǎn)化效率達到約30%。平行地進行了對比試驗WA1K,WA2K和WA3K,其中選擇標記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)與目標基因一起整合進小麥屬Taifun基因組中。該轉(zhuǎn)化正如在EP2460402中描述地進行,亦即,在愈傷組織和再生階段期間以15mg/L或30mg/L濃度加入培養(yǎng)基潮霉素。在WAK1時,這時可以達到37%的轉(zhuǎn)化效率(204輸出外植株中75外植體陽性苗)。在試驗WAK2中轉(zhuǎn)化效率等于24%(153輸出外植株中37外植體陽性苗),而在WAK3中轉(zhuǎn)化效率等于27%(175輸出外植株中47外植體陽性苗)。因此,平均在這些轉(zhuǎn)化實驗中可以達到30%的效率(ΦWAK)。因此,不應(yīng)用選擇時所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化效率對應(yīng)于在帶有基于標記基因的選擇的小麥轉(zhuǎn)化實驗中通常達到的效率,部分地該效率甚至更高。表2:小麥(品種Taifun)不應(yīng)用基于標記基因的選擇的三個轉(zhuǎn)化研究結(jié)果;WAKx表示帶有基于標記基因的選擇的對比試驗,WAx表示不帶基于標記基因的選擇的實驗所生產(chǎn)的無選擇標記轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)基因性檢測,如上所述,通過qPCR進行。同時這個分析允許估計對商業(yè)目的其他用途特殊感興趣的單副本植株的比例。這里還表明,該在應(yīng)用和不應(yīng)用選擇標記的轉(zhuǎn)化之間的結(jié)果并無區(qū)別。這樣在實驗WA2中通過qPCR附加物可以鑒別出十二個獨立的單副本植株。因為總共產(chǎn)生了27個獨立轉(zhuǎn)基因事件,這對應(yīng)于44%的單副本事件比率。在實驗WA3中同樣產(chǎn)生12個獨立的單副本事件,在總共42個產(chǎn)生的獨立事件中,這對應(yīng)于比率29%。為了進一步證實所建立的植株的轉(zhuǎn)基因性,從實驗WA1的選出的植物中進行DNA印跡。專業(yè)人員知道,在T-DNA從根癌農(nóng)桿菌傳遞到植物基因組時,往往只有傳遞縮短了的T-DNA碎片。這個在LB(左邊沿)側(cè)被刪除。因此,應(yīng)用于帶有標記基因轉(zhuǎn)化的T-DNA往往這樣設(shè)計,使得該選擇所使用的選擇標記定位在T-DNA的LB-側(cè)。因此,這時只有帶有完整的T-DNA的事件,因而還有完整傳遞的標記基因才可以被選擇。因為在無標記子基因轉(zhuǎn)化時,只有作為T-DNA的目標基因存在,因此該目標基因可能在傳遞時無意中被縮短,這一般導致要向植物基因組傳遞的目標基因有缺陷的表達。為了檢查所傳遞的T-DNA的完整性進行雜交試驗。這時,所導入的tDT-基因作為雜交探針使用?;蚪MDNA用HindlIl消化,以便完整整合的T-DNA給出大于3.0kb的雜交片段。如圖4所示,在所有測試的PCR-陽性植株中發(fā)現(xiàn)雜交片段。陰性對照(Taifun)的基因組DNA不與探針雜交。因為所獲得的全部雜交片段具有>3.0kb的大小,因此檢測表明,在所有顯示的植株中T-DNA都是完整整合的。這表明,傳遞之后轉(zhuǎn)基因的質(zhì)量,可與在應(yīng)用帶有LB側(cè)標記基因的轉(zhuǎn)化時的質(zhì)量相比較。這是專業(yè)人員預(yù)先沒有想到的。此外,在所整合的轉(zhuǎn)基因的表達高度方面,準確研究了用無標記子基因的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株。在應(yīng)用帶有選擇標記的T-DNA時,為了富有成效地選擇轉(zhuǎn)基因植株,需要表達選擇標記的基因,因此形成功能蛋白質(zhì)。因此,使讀不出所導入的基因構(gòu)建物成為可能的基因組區(qū)域中T-DNA-整合不作為轉(zhuǎn)基因植株鑒定。在應(yīng)用無選擇標記轉(zhuǎn)化時,整合在使讀不出轉(zhuǎn)基因成為可能的基因組區(qū)域的事件,借助于諸如PCR等分子生物學方法同樣作為轉(zhuǎn)基因植株鑒定。因此,存在這樣的危險,生產(chǎn)絲毫不表達所導入的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植株的比例增高。因此,借助于qRT-PCR確定轉(zhuǎn)化實驗WA1的隨機選定的植株所導入的轉(zhuǎn)基因的表達高度(圖5)。在所分析的13個轉(zhuǎn)基因植株中,只有3個可以確認不表達轉(zhuǎn)基因。當在各植株之間表達高度也有明顯的差異時,所有其他植株表明明顯的轉(zhuǎn)基因表達。但即使在應(yīng)用選擇標記的情況下轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株也是如此。因此,在借助于選擇標記建立的和沒有選擇標記建立的轉(zhuǎn)基因植株之間,還沒有給出轉(zhuǎn)基因質(zhì)量上的差異。為了檢測嵌合的轉(zhuǎn)基因植物的形成,研究了所導入的轉(zhuǎn)基因是否按照孟德爾定律傳遞給下一代。為此,擺出6個轉(zhuǎn)基因植株的種子(各30粒/植株),并借助于qPCR在所導入的轉(zhuǎn)基因tDT上以及在所引入的nos-終止子上,確定轉(zhuǎn)基因的存在以及其受精卵狀態(tài)。作為示例在圖6顯示一個子代的分析結(jié)果。唯有要觀察經(jīng)典的單基因遺傳經(jīng)典的1∶2∶1遺傳模式。子代分析結(jié)果的摘要列于表3。6個被分析的子代中有5個表示按照孟德爾定律遺傳(對應(yīng)于83%)。因此,出發(fā)點可以是,所建立的轉(zhuǎn)基因的輸出轉(zhuǎn)化體最大部分在轉(zhuǎn)基因方面是均勻的。在轉(zhuǎn)基因植株WA1-T-014非孟德爾遺傳,一方面可以歸因于非各向同性,因而歸因于嵌合轉(zhuǎn)基因植物,另一方面但還可以在該植物重要的基因中轉(zhuǎn)基因的整合。以此導致部分致命的植物/胚胎,這還解釋該子代低劣的發(fā)芽力(30粒種子只有20粒發(fā)芽)。表3:檢測嵌合轉(zhuǎn)基因的子代分析結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株單性合子半合子純合子合計分裂比Chi2WA1-T-0068163271∶2∶10.25WA1-T-0088147291∶2∶10.95WA1-T-0094169291∶2∶10.36WA1-T-014116320?0.01WA1-T-0248139301∶2∶10.74WA1-T-0289174301∶2∶10.33參考文獻Ahmad,R.,Kim,Y.H.,Kim,M.D.,Phung,M.N.,Chung,W.I.,Lee,H.S.,...&Kwon,S.Y.(2008).Developmentofselectionmarker-freetransgenicpotatoplantswithenhancedtolerancetooxidativestress.JournalofPlantBiology,51(6),401-407.Amoah,B.K.,Wu,H.,Sparks,C.,&Jones,H.D.(2001).FactorsinfluencingAgrobacterium-mediatedtransientexpressionofuidAinwheatinflorescencetissue.JournalofExperimentalBotany,52(358),1135-1142.Ballester,A.,Cervera,M.,&L.(2010).Selectablemarker-freetransgenicorangeplantsrecoveredundernon-selectiveconditionsandthroughPCRanalysisofallregenerants.PlantCell,TissueandOrganCulture(PCTOC),102(3),329-336.Broothaerts,W.,Mitchell,H.J.,Weir,B.,Kaines,S.,Smith,L.M.,Yang,W.,...&Jefferson,R.A.(2005).Genetransfertoplantsbydiversespeciesofbacteria.Nature,433(7026),629-633.Chang,H.H.,&Chan,M.T.(1991).Improvementofpotato(SolanumtuberosumL.)transformationefficiencybyAgrobacteriuminthepresenceofsilverthiosulfate.Bot.Bull.Acad.Sin,32,63-70.Cheng,M.,F(xiàn)ry,J.E.,Pang,S.,Zhou,H.,Hironaka,C.M.,Duncan,D.R.,...&Wan,Y.(1997).GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiology,115(3),971-980.Comai,L.,Sen,L.C.,&Stalker,D.M.(1983).AnalteredaroAgeneproductcoffersresistancetotheherbicideglyphosate.Science,221(4608),370-371.Coussens,G.,Aesaert,S.,Verelst,W.,Demeulenaere,M.,DeBuck,S.,Njuguna,E.,...&VanLijsebettens,M.(2012).Brachypodiumdistachyonpromotersasefficientbuildingblocksfortransgenicresearchinmaize.Journalofexperimentalbotany,63(11),4263-4273.DeBlock,M.,Botterman,J.,Vandewiele,M.,Dockx,J.,Thoen,C.,Gossele,V.,...&Leemans,J.(1987).Engineeringherbicideresistanceinplantsbyexpressionofadetoxifyingenzyme.TheEMBOjournal,6(9),2513.DeVetten,N.,Wolters,A.M.,Raemakers,K.,vanderMeer,I.,terStege,R.,Heeres,E.,...&Visser,R.(2003).Atransformationmethodforobtainingmarker-freeplantsofacross-pollinatingandvegetativelypropagatedcrop.Naturebiotechnology,21(4),439442.Erikson,O.,Hertzberg,M.,&T.(2005).ThedsdAgenefromEscherichiacoliprovidesanovelselectablemarkerforplanttransformation.Plantmolecularbiology,57(3),425-433.Faize,M.,F(xiàn)aize,L.,&Burgos,L.(2010).Usingquantitativereal-timePCRtodetectchimerasintransgenictobaccoandapricotandtomonitortheirdissociation.BMCbiotechnology,10(1),53.Ferradini,N.,Nicolia,A.,Capomaccio,S.,Veronesi,F(xiàn).,&Rosellini,D.(2011).Assessmentofsimplemarker-freegenetictransformationtechniquesinalfalfa.Plantcellreports,30(11),1991-2000.Frame,B.R.,Shou,H.,Chikwamba,R.K.,Zhang,Z.,Xiang,C.,F(xiàn)onger,T.M.,...&Wang,K.(2002).Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem.PlantPhysiology,129(1),13-22.Hiei,Y.,Ohta,S.,Komari,T.,&Kumashiro,T.(1994).Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.ThePlantJournal,6(2),271-282.Hiei,Y.,Ishida,Y.,Kasaoka,K.,&Komari,T.(2006).ImprovedfrequencyoftransformationinriceandmaizebytreatmentofimmatureembryoswithcentrifugationandheatpriortoinfectionwithAgrobacteriumtumefaciens.Plantcell,tissueandorganculture,87(3),233-243.Hensel,G.,Kastner,C.,Oleszczuk,S.,Riechen,J.,&Kumlehn,J.(2009).Agrobacterium-mediatedgenetransfertocerealcropplants:currentprotocolsforbarley,wheat,triticale,andmaize.InternationalJournalofPlantGenomics,2009.Ishida,Y.,Saito,H.,Hiei,Y.,&Komari,T.(2003).Improvedprotocolfortransformationofmaize(ZeamaysL.)mediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantBiotechnology,20(1),57-66.Ishida,Y.,Hiei,Y.,&Komari,T.(2007).Agrobacterium-mediatedtransformationofmaize.Natureprotocols,2(7),1614-1621.Joersbo,M.(2001).Advancesintheselectionoftransgenicplantsusingnon-antibioticmarkergenes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